JP6165143B2 - 血漿由来の免疫グロブリン組成物の血栓塞栓症の可能性を軽減する方法 - Google Patents
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Description
本出願は、あらゆる目的でその全体が参照によって明白に本明細書に組み入れられる2011年8月26日に出願された米国仮特許出願第61/527,974号の利益を主張する。
[本発明1001]
血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第XI因子(FXI)及び/又は第XIa因子(FXIa)の含量を低減する方法であって
(a)IgG免疫グロブリンとFXI及び/又はFXIaとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、
(b)6.0を超えないpHと11mS/cmを超えない導電率を含む第1の溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、IgG免疫グロブリンとFXI及び/又はFXIaの少なくとも一部とをカチオン交換樹脂に結合させるステップと、
(c)少なくとも7.5のpHと少なくとも15mS/cmの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からIgG免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、
(d)溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップと
を含み、溶出液の先行部分が溶出液の80%以下を含む、方法。
[本発明1002]
溶出緩衝液が少なくとも20mS/cmの導電率を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
溶出緩衝液が少なくとも25mS/cmの導電率を含む、本発明1001又は1002の方法。
[本発明1004]
ステップ(c)にてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、6.0を超えないpHと11mS/cm未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとFXI及び/又はFXIaとが結合したカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
カチオン交換樹脂が弱いカチオン交換樹脂である、本発明1001〜1004のいずれかの方法。
[本発明1006]
弱いカチオン交換樹脂がカルボキシメチルカチオン交換樹脂である、本発明1005の方法。
[本発明1007]
溶出緩衝液が7.5〜8.5の間のpHを含む、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
溶出緩衝液が8.0±0.2のpHを含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
溶出緩衝液が200〜300mMの間の塩化ナトリウムを含む、本発明1001〜1008のいずれかの方法。
[本発明1010]
溶出緩衝液が240〜260mMの間の塩化ナトリウムを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
溶出緩衝液が100mM〜300mMの間のグリシンを含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
溶出緩衝液が175mM〜225mMの間のグリシンを含む、本発明1011の方法。
[本発明1013]
溶出液の先行部分が溶出液の70%以下から成る、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、7.0を上回るpHを有する溶出液とは別に7.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、6.5を上回るpHを有する溶出液とは別に6.5を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1016]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、6.0を上回るpHを有する溶出液とは別に6.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1017]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.5を上回るpHを有する溶出液とは別に5.5を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1018]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.0を上回るpHを有する溶出液とは別に5.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1019]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、溶出液のpHをモニターすることを含む、本発明1001〜1018のいずれかの方法。
[本発明1020]
溶出液の先行部分を回収するステップが、
(i)280nm(OD 280 )にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、
(ii)溶出液のOD 280 が少なくとも50mAUの第1の閾値OD 280 よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、
(iii)溶出液のOD 280 が500mAUを下回らない第2の閾値OD 280 よりも低下したら回収を停止する副ステップと
を含む、本発明1001〜1019のいずれかの方法。
[本発明1021]
第2の閾値OD 280 が1AUを下回らない、本発明1020の方法。
[本発明1022]
第2の閾値OD 280 が2AUを下回らない、本発明1020の方法。
[本発明1023]
洗浄緩衝液が5.0〜6.0の間のpHを含む、本発明1004〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
洗浄緩衝液が5.5±0.2のpHを含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
ステップ(b)でカチオン交換樹脂に結合したFXI及び/又はFXIaの50%未満が、ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在する、本発明1001〜1024のいずれかの方法。
[本発明1026]
ステップ(b)でカチオン交換樹脂に結合したFXI及び/又はFXIaの25%未満が、ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在する、本発明1025の方法。
[本発明1027]
ステップ(b)でカチオン交換樹脂に結合したFXI及び/又はFXIaの10%未満が、ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在する、本発明1025の方法。
[本発明1028]
FXI及び/又はFXIaの量が、FXIa特異的な基質を用いたアミド分解活性アッセイを行うことによって決定される、本発明1025又は1027の方法。
[本発明1029]
ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、画分Iの沈殿物、画分I+II+IIIの沈殿物、画分II+IIIの沈殿物、画分IV−1、キストラー/ニッチェマンの沈殿物A、キストラー/ニッチェマンの沈殿物B及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である、本発明1001〜1028のいずれかの方法。
[本発明1030]
ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、懸濁された画分IIの沈殿物である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性(ACA)を低減させる方法であって、
(a)IgG免疫グロブリンと第1の量のACAとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、
(b)6.0を超えないpHと11mS/cmを超えない導電率を含む第1の溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置されたカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、カチオン交換樹脂にIgG免疫グロブリンと第1の量のACAの少なくとも一部とを結合させるステップと、
(c)少なくとも7.5のpHと少なくとも15mS/cmの導電率を含む溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させることによってカチオン交換樹脂からIgG免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、
(d)溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップと
を含み、溶出液の先行部分が溶出液の80%以下を含む、方法。
[本発明1032]
溶出緩衝液が少なくとも20mS/cmの導電率を含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
溶出緩衝液が少なくとも25mS/cmの導電率を含む、本発明1031又は1032の方法。
[本発明1034]
ステップ(c)にてカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、6.0を超えないpHと11mS/cm未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとACAとが結合したカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む、本発明1031〜1033のいずれかの方法。
[本発明1035]
カチオン交換樹脂が弱いカチオン交換樹脂である、本発明1031〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
弱いカチオン交換樹脂がカルボキシメチルカチオン交換樹脂である、本発明1035の方法。
[本発明1037]
溶出緩衝液が7.5〜8.5の間のpHを含む、本発明1031〜1036のいずれかの方法。
[本発明1038]
溶出緩衝液が8.0±0.2のpHを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
溶出緩衝液が200〜300mMの間の塩化ナトリウムを含む、本発明1031〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
溶出緩衝液が240〜260mMの間の塩化ナトリウムを含む、本発明1039の方法。
[本発明1041]
溶出緩衝液が100mM〜300mMの間のグリシンを含む、本発明1031〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
溶出緩衝液が175mM〜225mMの間のグリシンを含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
溶出液の先行部分が溶出液の70%以下から成る、本発明1031〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、7.0を上回るpHを有する溶出液とは別に7.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1031〜1043のいずれかの方法。
[本発明1045]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、6.5を上回るpHを有する溶出液とは別に6.5を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1031〜1043のいずれかの方法。
[本発明1046]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、6.0を上回るpHを有する溶出液とは別に6.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1031〜1043のいずれかの方法。
[本発明1047]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.5を上回るpHを有する溶出液とは別に5.5を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1031〜1043のいずれかの方法。
[本発明1048]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.0を上回るpHを有する溶出液とは別に5.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、本発明1031〜1043のいずれかの方法。
[本発明1049]
溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、溶出液のpHをモニターすることを含む、本発明1031〜1048のいずれかの方法。
[本発明1050]
溶出液の先行部分を回収するステップが、
(i)280nm(OD 280 )にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、
(ii)溶出液のOD 280 が少なくとも50mAUの第1の閾値OD 280 よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、
(iii)溶出液のOD 280 が500mAUを下回らない第2の閾値OD 280 よりも低下したら回収を停止する副ステップと
を含む、本発明1031〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
第2の閾値OD 280 が1AUを下回らない、本発明1050の方法。
[本発明1052]
第2の閾値OD 280 が2AUを下回らない、本発明1050の方法。
[本発明1053]
洗浄緩衝液が5.0〜6.0の間のpHを含む、本発明1034〜1052のいずれかの方法。
[本発明1054]
洗浄緩衝液が5.5±0.2のpHを含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも低い、本発明1031〜1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも少なくとも25%低い、本発明1055の方法。
[本発明1057]
ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも少なくとも50%低い、本発明1055の方法。
[本発明1058]
ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(d)で回収される溶出液の遅行部分におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも低い、本発明1031〜1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(d)で回収される溶出液の遅行部分におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度の50%未満である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(d)で回収される溶出液の遅行部分におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度の25%未満である、本発明1058の方法。
[本発明1061]
ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、画分Iの沈殿物、画分I+II+IIIの沈殿物、画分II+IIIの沈殿物、画分IV−1、キストラー/ニッチェマンの沈殿物A、キストラー/ニッチェマンの沈殿物B及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である、本発明1031〜1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、懸濁された画分IIの沈殿物である、本発明1061の方法。
治療用の血漿由来の静注用免疫グロブリン組成物の広い用途を考えると、これら組成物の安全性を確保することが最重要である。血漿由来の免疫グロブリンを投与された患者における血栓塞栓症事象の発生と対となる、免疫グロブリン組成物のアミド分解性内容物についての懸念から、免疫グロブリンの製造中にセリンプロテアーゼ(たとえば、FXIa及びFXIIa)及びセリンプロテアーゼ酵素前駆体(たとえば、FXI及びFXII)を効果的に減らす方法に対するニーズが強調されている。
本明細書で使用されるとき、「静注用IgG」又は「IVIG」治療という用語は一般に、免疫不全、炎症性疾患及び自己免疫疾患のような多数の状態を治療するために患者に対してIgG免疫グロブリンの組成物を静脈内に、皮下に、又は筋肉内に投与する治療法を指す。IgG免疫グロブリンは通常、血漿からプールされて調製される。抗体全体又は断片を使用することができる。IgG免疫グロブリンは皮下投与のために(たとえば、10%を超える)高い濃度で製剤化することができ、また筋肉内投与用に製剤化することができる。これは、特定の抗原(たとえば、RhoD因子、百日咳毒素、破傷風毒素、ボツリヌス毒素、狂犬病)に対して平均よりも高い力価で調製される特殊IgG製剤の場合に特に一般的である。考察し易くするために、そのような皮下又は筋肉内投与用に製剤化されたIgG組成物も本出願では「IVIG」という用語に含められる。
1つの態様では、本開示は血漿由来の免疫グロブリンIgG組成物のアミド分解活性を低下させる(たとえば、FXI/FXIa及び/又はFXII/FXIIaの含量を減らす)ためのクロマトグラフィ法を提供する。同様に、本開示はまた、本明細書で提供される方法に従って調製される低レベルのアミド分解活性(たとえば、低レベルのFXI/FXIa及び/又はFXII/FXIIa)を含有する血漿由来の免疫グロブリンIgG組成物も提供する。有利なことに、本明細書で記載される方法は改善された安全性プロフィールを持つ血漿由来の免疫グロブリンIgG組成物を提供する。具体的には、これらの方法によって提供される組成物は、現在製造されている免疫グロブリンIgG組成物に比べて望ましくない血栓塞栓症事象を引き起こす可能性が低い。
本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物に存在するアミド分解活性の大半がカチオン交換樹脂から溶出されて、1段階溶出によって生成される溶出液の遅行部分に入る一方で、画分の免疫グロブリン含量の大半は前記溶出液の先行部分に溶出するという発見に部分的に基づく。従って、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収することによって、得られる免疫グロブリン製剤のアミド分解活性が有意に低減される。具体的には、本明細書で提供される方法に従って調製される免疫グロブリン製剤にて第XIa因子の含量、および従って第XIa因子の含量に関連するアミド分解活性が有意に低減されることが本明細書で示される。
1つの態様では、本発明は、カチオン交換溶出液の先行部分を回収することによって、免疫グロブリン製剤に存在するアミド分解活性、特にFXIa混入物が寄与するアミド分解活性を低減する方法を提供する。有利なことに、カチオン交換クロマトグラフィステップの単一段階溶出によって形成される溶出液の先行部分が所望の免疫グロブリン含量の大半を含有する一方で、溶出液の遅行部分は望ましくないアミド分解活性の大半を含有することが、本明細書で示される。免疫グロブリンとアミド分解活性の溶出を完全に分離することはできないので、溶出液の先行部分と遅行部分の境界が定義されなければならない。この決定を行う際、以下の2つの主な考慮事項が考慮され得る:(i)溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ないアミド分解活性が先行部分にて回収される、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、アミド分解活性のより大きな部分を免疫グロブリン含量から分離することができ、逆もまた同様である;及び(ii)溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ない免疫グロブリンの回収収量が先行部分に存在する、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、より少ない免疫グロブリンの収量が達成され、逆もまた同様である。
本明細書で提供される実施例にて実証されるように、カチオン交換溶出ステップの開始は、カラム負荷及び洗浄ステップ(一般に5.0〜6.0)よりも高いpH(一般に>7.0)を溶出緩衝液が有するにもかかわらず、カラムから出てくる溶液のpHが5.0を下回るpHまで低下することによって特徴付けられる。pHのこの低下は低いアミド分解活性及び第XIa因子含量を有する免疫グロブリンIgG組成物の溶出と一致する(たとえば、それぞれ表4及び表11を参照)。溶出の後の時点では、カラムから出てくる溶液のpHは6.0〜8.0を上回って鋭く上昇する。pHにおけるこのシフトは溶出液のアミド分解活性及び第XIa因子含量の有意な上昇に一致する(たとえば、それぞれ表4及び表11を参照)。従って、単一の高pHの溶出緩衝液(一般に7.0より高い)の適用によって1段階溶出を行うが、溶出プロフィールは、IgG免疫グロブリンが先ずカラムから溶出された後にアミド分解活性(たとえば、第XI因子及び/又は第XIa因子)が付随する、2段階溶出に類似している。従って、ある特定の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカラム出口での溶出液のpHに基づいて定義される。
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカチオン交換カラムから溶出される免疫グロブリンの濃度によって定義される。たとえば、大規模製造の間、免疫グロブリン組成物は、ピーク溶出物が高度に濃縮されるように十分に高いタンパク質負荷量(たとえば、樹脂1ml当たり80mg超のタンパク質)でカチオン交換樹脂に負荷され得る。これらの例では、溶出液の先行部分は、OD280が閾値よりも低下する時点の前に溶出する溶出液の画分として定義することができる。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例9で実証するように、大規模製造法へのこの回収スキームの適用は、TGA及びアミド分解活性の含量が有意に低下したIgG免疫グロブリン組成物の高収率での回収をもたらす。
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は溶出液の総タンパク質含量に対する(たとえば、総タンパク質の体積の)比率として定義される。先行部分で回収する溶出液の比率(%)を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができる。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、ならびに、免疫グロブリン収率の低下によるコストをアミド分解活性ならびに第XI因子及び/又は第XIa因子の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例8で実証するように、この回収スキームの適用は、TGA及びアミド分解活性の含量が有意に低下したIgG免疫グロブリン組成物の高収率の回収をもたらすことができる。
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、カチオン交換カラムのサイズに対する溶出液ピークの体積として(たとえば、規定数のカラム容積によって)定義される。先行部分で回収する溶出液の体積を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができ、再現可能である。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、ならびに、免疫グロブリン収率の低下によるコストをアミド分解活性ならびに第XI因子及び/又は第XIa因子の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例11〜13で実証するように、この回収スキームの適用は、TGA及びアミド分解活性の含量が有意に低下したIgG免疫グロブリン組成物の高収率の回収をもたらすことができる。
1つの態様では、本開示は血漿由来の免疫グロブリンIgG組成物の抗補体活性(ACA)含量を低下させるクロマトグラフィ法を提供する。同様に、本開示は、本明細書で提供される方法に従って調製される低レベルの抗補体活性(ACA)を含有する血漿由来の免疫グロブリンIgG組成物も提供する。有利なことに、本明細書で提供される方法は改善された安全性プロフィールを持つ血漿由来の免疫グロブリンIgG組成物も提供する。特に、これらの方法によって提供される組成物は、現在製造されている免疫グロブリンIgG組成物に比べて抗補体活性に関連する有害反応を起こす可能性が低い(たとえば、Buchacher A. et al., Vox Sang. 2010 Apr; 98(3 Pt 1):e209−18を参照のこと。その内容はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる)。
本発明は、血漿由来の免疫グロブリン組成物に存在する抗補体活性(ACA)の大半がカチオン交換樹脂から溶出されて、1段階溶出によって生成される溶出液の遅行部分に入る一方で、画分の免疫グロブリン含量の大半が前記溶出液の先行部分で溶出するという発見に部分的に基づく。従って、溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収することによって、得られる免疫グロブリン製剤の抗補体活性が有意に低下する。具体的には、本明細書で提供される方法に従って調製される免疫グロブリン組成物ではACA含量が有意に低下することが本明細書で示される。
1つの態様では、本発明は、カチオン交換溶出液の先行部分を回収することによって、免疫グロブリン製剤に存在する抗補体活性(ACA)を低減する方法を提供する。有利なことに、カチオン交換クロマトグラフィステップの単一段階溶出によって形成される溶出液の先行部分が所望の免疫グロブリン含量の大半を含有する一方で、溶出液の遅行部分は望ましくないACAの大半を含有することが、本明細書で示される。免疫グロブリンとACAの溶出を完全に分離することはできないので、溶出液の先行部分と遅行部分の境界が確定されなければならない。この決定を行う際、以下の2つの主な考慮事項が考慮され得る:(i)溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ないACAが先行部分にて回収される、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、ACAのより大きな部分を免疫グロブリン含量から分離することができ、逆もまた同様である;及び(ii)溶出液の先行部分と遅行部分がどのように定義されるかに応じて、より多い又はより少ない免疫グロブリンの回収収量が先行部分に存在する、すなわち、溶出液の先行部分が溶出液全体のより小さな部分として定義されればされるほど、より少ない免疫グロブリンの収量が達成され、逆もまた同様である。
本明細書で提供される実施例にて実証されるように、カチオン交換溶出ステップの開始は、カラム負荷及び洗浄ステップ(一般に5.0〜6.0)よりも高いpH(一般に7.0超)を溶出緩衝液が有するにもかかわらず、カラムから出てくる溶液のpHが5.0を下回るpHまで低下することによって特徴付けられる。pHのこの低下は低いACAを有する免疫グロブリンIgG組成物の溶出と一致する(たとえば、それぞれ表3、表11、及び表15を参照)。溶出の後の時点では、カラムから出てくる溶液のpHは6.0〜8.0を上回って鋭く上昇する。pHにおけるこのシフトは溶出液のACA含量の有意な上昇に一致する(たとえば、それぞれ表3、表11及び表15を参照)。従って、単一の高pHの溶出緩衝液(一般に7.0より高い)の適用によって1段階溶出を行うが、溶出プロフィールは、IgG免疫グロブリンが先ずカラムから溶出された後に抗補体活性が付随する、2段階溶出に類似している。従って、ある特定の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカラム出口での溶出液のpHに基づいて定義される。
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分はカチオン交換カラムから溶出される免疫グロブリンの濃度によって定義される。たとえば、大規模製造の間、免疫グロブリン組成物は、ピーク溶出物が高度に濃縮されるように十分に高いタンパク質負荷量(たとえば、樹脂1ml当たり80mg超のタンパク質)でカチオン交換樹脂に負荷され得る。これらの例では、溶出液の先行部分は、OD280が閾値よりも低下する時点の前に溶出する溶出液の画分として定義することができる。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例9で実証されるように、大規模製造法へのこの回収スキームの適用は、抗補体活性(ACA)含量が有意に低下したIgG免疫グロブリン組成物の高収率での回収をもたらす。
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は溶出液の総タンパク質含量に対する(たとえば、総タンパク質の体積の)比率(%)として定義される。先行部分で回収する溶出液の比率(%)を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができる。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、ならびに、免疫グロブリン収率の低下によるコストを抗補体活性(ACA)の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例8で実証されるように、この回収スキームの適用は、抗補体活性の含量が有意に低下したIgG免疫グロブリン組成物の高収率の回収をもたらすことができる。
免疫グロブリン組成物の大規模製造に特に良好に適合したさらに別の実施形態では、溶出液の先行部分と遅行部分は、カチオン交換カラムのサイズに対する溶出液ピークの体積として(たとえば、規定数のカラム容積によって)定義される。先行部分で回収する溶出液の体積を予め定めることによって、免疫グロブリンの回収収率を厳密に制御することができ、再現可能である。溶出液の先行部分と遅行部分を定義するこの方法は、最少段階での収率を必要とする製造法に、及び免疫グロブリン収率の低下によるコストを抗補体活性(ACA)の含量が低下した組成物を製造する利益と比較検討することに基づいて決定を行う方法に、特に有用である。この方式では、製造実行間の軽微な変動に関わりなく、ほぼ同一収量の免疫グロブリンを調製物の次から次へと再現良く回収することができる。実施例11〜13で実証するように、この回収スキームの適用は、抗補体活性の含量が低下したIgG免疫グロブリン組成物の高収率での回収をもたらすことができる。
濃縮したIgG組成物の調製に使用される出発物質は一般に、回収血漿(すなわち、生体外で全血から分離された血漿)又は原料血漿(すなわち、プラズマフェレーシスを介して採取された血漿)のいずれかから成る。精製工程は通常、安全性と品質の問題についてすでにアッセイ済みの予め凍結されたプール血漿を融解することで開始する。融解は通常、6℃を超えない温度、好ましくは−1℃〜6℃の間で行われる。低温での凍結血漿の完全な融解の後、冷所(たとえば、6℃以下、好ましくは2.5±3.5℃)で遠心分離を行い、液体上清から固体のクリオ沈殿物を分離する。或いは、分離ステップは遠心分離ではなく濾過によって実施することができる。次いで、液体上清(新鮮な融解血漿から遠心分離によって低温不溶性タンパク質を取り除いた後の「脱クリオ血漿」とも呼ばれる)を次のステップで処理する。第8因子阻害剤バイパス活性(FEIBA)、第IX因子複合体、第VII因子濃縮物又はアンチトロンビンIII複合体の単離のためにこの時点で種々の追加のステップが利用され得る。たとえば、免疫グロブリン含有溶液をさらに濃縮するのに先立って、1種以上の血液因子を脱クリオ血漿から吸着させてもよい。
IgG免疫グロブリン組成物を調製するために、一般に脱クリオ血漿を分画して、存在する他のタンパク質及び不純物から所望の免疫グロブリンを分離する。アルコール(たとえば、エタノール)分画、高分子(たとえば、PEG)沈殿、脂肪酸及びエステル(たとえば、カプリレート)沈殿、クロマトグラフィ等を含む血漿の分画のための多数の方法が当該技術で既知である。これらの分画方法の例には、非限定的に、Cohn分画(J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459−475; J. Am. Chem. Soc. 72:465−474 (1950))、Oncley分画(J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541−550)、Deutsch精製(J. Biol. Chem. 164:109−118)、Hoppe精製(Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749−1752)、Falksveden精製(スウェーデン特許第348942号)、Falksveden及びLundblad精製(Methods of Plasma Protein Fractionation、1980)、Lebing精製(Vox Sang 2003 (84):193−201)、Tanaka精製(Braz J Med Biol Res 2000 (33)37−30))、Teschner精製(Vox Sang, 2007 (92):42−55)、Nitschmann分画(Helv. Chim. Acta 37:866−873)、Kistler/Nitschmann分画(Vox Sang. 7:414−424 (1962))、Barundern精製(Vox Sang. 7:157−74 (1962))、Koblet精製(Vox Sang. 13:93−102 (1967))、米国特許第5,122,373号又は同第5,177,194号にて開示された精製手順が挙げられ、その開示はあらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
当業者は、多数の異なる出発物質(たとえば、異なる血漿画分)を用いてアミド分解活性(たとえば、第XI因子及び/又は第XIa因子の含量)及び/又は抗補体活性(ACA)を低減するために本明細書で提供される方法を実施し得ることを十分に理解するであろうが、例示的分画スキームを以下に提供する。例示的分画スキームでは4つのエタノール沈殿反応を用いて画分II沈殿が調製され、これが再懸濁された後、本明細書で提供される出発物質として使用され得る。得られる濃縮されたIgG免疫グロブリン組成物は、たとえば、アニオン交換クロマトグラフィ、限外/透析濾過、ウイルス不活化及び/又は除去ステップ、および当該技術で周知である他の濃縮ステップのような技法を用いる下流の処理によってさらに濃縮され得る。
第1の例示的上流精製スキームでは、免疫グロブリンIgGを含有する血漿を以下で記載するようなアルコール分画(たとえば、エタノール分画)に供する。一実施形態では、この第1の上流分画スキームは、画分I+II+IIIの沈殿ステップ、画分Aの沈殿ステップ及び画分Bの沈殿ステップの後に画分IIの沈殿ステップを含み、これにより、アミド分解活性(たとえば、第XI/XIa因子)及び/又は抗補体活性(ACA)の低減のための本明細書で提供されるカチオン交換クロマトグラフィ法のための出発物質を最終的に提供する。
一実施形態では、画分I+II+IIIの沈殿は、17%〜23%(v/v)の間の最終濃度にて6.5〜7.3の間のpHで脱クリオ血漿にエタノールを添加することによって形成される。次いで撹拌しながら混合物を−8℃〜−2℃でインキュベートする。得られた画分I+II+IIIの沈殿物を混合物の遠心分離又は濾過によって画分I+II+IIIの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分I+II+IIIの沈殿物に存在し、それを再懸濁してさらに濃縮することができる。
IgGの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分I+II+IIIの沈殿物を再懸濁し、第2の沈殿ステップ(画分Aの沈殿)を実施する。画分Aの沈殿は、17%〜23%(v/v)の間の最終濃度にて6.8〜7.6の間のpHで画分I+II+IIIの懸濁液にエタノールを添加することによって実施される。次いで混合物を−8℃〜−2℃の間で撹拌しながらインキュベートする。得られた画分Aの沈殿物を、混合物の遠心分離又は濾過によって画分Aの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Aの沈殿物に存在し、それを再懸濁し、さらに濃縮することができる。
IgGの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分Aの沈殿物を再懸濁し、第3の沈殿ステップ(画分Bの沈殿)を実施する。画分Bの沈殿は、14%〜20%(v/v)の間の最終濃度にて5.0〜5.8の間のpHで画分Aの懸濁液にエタノールを添加することによって実施される。次いで撹拌しながら、混合物を−8℃〜−2℃の間でインキュベートする。混合物の遠心分離又は濾過によって、得られた画分Bの沈殿物を画分Bの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Bの上清に存在し、それを回収し、さらに濃縮することができる。
第2の例示的上流精製スキームでは、以下に記載されるように、免疫グロブリンIgGを含有する血漿をアルコール分画(たとえば、エタノール分画)に供する。一実施形態では、この第1の上流分画スキームは、画分Iの沈殿ステップ及び画分II+IIIの沈殿ステップの後に画分IIの沈殿ステップを含み、これにより、アミド分解活性(たとえば、第XI/XIa因子)及び/又は抗補体活性(ACA)の低減のための本明細書で提供されるカチオン交換クロマトグラフィ法のための出発物質を最終的に提供する。
一実施形態では、画分Iの沈殿は、6%〜10%(v/v)の最終濃度にて6.7〜7.3のpHで脱クリオ血漿にエタノールを添加することによって形成される。次いで、撹拌しながら−4℃〜2℃で混合物をインキュベートする。混合物の遠心分離又は濾過によって、得られた画分Iの沈殿物を画分Iの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分Iの上清に存在し、それを回収してさらに濃縮することができる。
IgGの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分Iの上清を第2の沈殿ステップ(画分II+IIIの沈殿)の材料として使用する。画分II+IIIの沈殿は、22%〜28%(v/v)の最終濃度にて6.7〜7.3のpHで画分Iの上清にエタノールを添加することによって実施される。次いで撹拌しながら、混合物を−10℃〜−4℃の間でインキュベートする。得られた画分II+IIIの沈殿物を、混合物の遠心分離又は濾過によって画分II+IIIの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分II+IIIの沈殿物に存在し、それを再懸濁してさらに濃縮することができる。
IgGの含量及び純度をさらに濃縮するために、一実施形態では、第4(上流分画スキームIの後)又は第3(上流分画スキームIIの後)のアルコール沈殿ステップ(画分IIの沈殿)を実施する。画分IIの沈殿は、画分Bの濾液又は画分II+IIIの沈殿物懸濁液のpHを6.7〜7.5の間に調整し、エタノールを22%〜28%(v/v)の間の最終濃度まで添加することによって実施される。次いで、混合物を撹拌しながら−13℃〜−2℃の間でインキュベートする。混合物の遠心分離又は濾過によって、得られた画分IIの沈殿物を画分Bの上清から分離することができ、それは一般に冷所で実施される。免疫グロブリン含量の大半は画分IIの沈殿物に存在し、それを再懸濁してさらに濃縮することができる。
免疫グロブリン組成物をさらに濃縮するために、一実施形態では、画分IIの沈殿物を水又はイオン強度の低い緩衝液に再懸濁し、カチオン交換クロマトグラフィに供してもよい。一実施形態では、6.0を下回るpHで画分IIの沈殿物を水又はイオン強度の低い緩衝液に再懸濁する。通常、再懸濁した画分IIの沈殿物のpHは5.2±0.2であり、懸濁液の導電率は低く、通常1mS/cmを超えない。次に、画分IIの懸濁液を濾過して非可溶性物質を取り除いた後、6.0を下回るpHで平衡化したカチオン交換樹脂に負荷する。免疫グロブリンをカチオン交換樹脂(たとえば、カチオン交換カラム)に負荷した後、6.0を下回るpHを有する洗浄緩衝液で樹脂を洗浄し得る。免疫グロブリンを溶出するには、次いで、少なくとも15mS/cm(たとえば、少なくとも150mMのNaCl又は同等のその塩の塩濃度を伴う)の導電率及び7.0を上回るpHを有する溶出緩衝液にカチオン交換樹脂を接触させる。特定の実施形態では、カチオン交換クロマトグラフィを実施するのに先立って、懸濁した画分IIの沈殿物を溶媒・界面活性剤(S/D)処理に供する。本明細書で提示される例示的分画スキームの再懸濁した画分IIの沈殿物を、本明細書で提供されるカチオン交換法の出発物質として使用するが、IgG免疫グロブリンとアミド分解活性(たとえば、FXI及び/又はFXIa)及び/又は抗補体活性(ACA)とを含有する任意の血漿由来の免疫グロブリン組成物(すなわち、画分)を本明細書で提供される方法にて使用してもよいことが、十分に理解されるであろう。
IgG組成物は限外濾過/透析濾過によってさらに濃縮され得る。一実施形態では、限外濾過によってIgG組成物を2%〜10%(w/v)の間のタンパク質濃度に濃縮し得る。ある特定の実施形態では、限外濾過は、開口チャンネルスクリーンを持つカセットにて行われ、限外濾過膜は、100kDaを超えない、又は90、80、70、60、50、40、30kDaもしくはそれ未満を超えない公称分子量カットオフ(NMWCO)を有する。好ましい実施形態では、限外濾過膜は50kDa以下のNMWCOを有する。
一実施形態では、次いで平衡化したANXセファロース(登録商標)4ファストフローカラムにタンパク質を負荷し、血漿由来の混入物を取り除く。負荷が完了した後、平衡化緩衝液(25mMのトリス、20mMのNaCl、pH7.8±0.2)でカラムを洗浄する。負荷ステップ及び洗浄ステップからのカラムフロースルー(IgG溶液)をプールする。
ある特定の実施形態では、濃縮された免疫グロブリン組成物の調製のために本明細書で提供される方法にはさらに、少なくとも1種の、好ましくは少なくとも2種の、最も好ましくは少なくとも3種のウイルス不活化又は除去ステップが含まれる。本明細書で提供される方法と共に採用され得るウイルス不活化又は除去ステップの非限定例には、溶媒・界面活性剤処理(双方ともその全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるHorowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21−S28 and Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023−1028)、ナノ濾過(双方ともその全体があらゆる目的で参照によって本明細書に組み入れられるHamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230−236 and Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021−2024)及び高温での低pHインキュベート(Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423−427 and Louie et al., Biologicals 1994 (22):13−19)が挙げられる。
血漿由来の生成物に存在し得る種々のウイルス性混入物を不活化するために、1種以上の免疫グロブリン製造中間体を溶媒・界面活性剤(S/D)処理に供し得る。好ましい実施形態では、画分IIの沈殿物を再懸濁し、S/D処理する。血漿由来の画分の界面活性剤処理の方法は当該技術で周知である(概説についてはPelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205−42を参照)。一般に、本明細書で提供される方法と併せて標準のS/D処理が使用され得る。たとえば、S/D処理の例示的プロトコールが以下で提供される。
本明細書で提供される免疫グロブリン組成物のウイルス負荷量をさらに低減するために、適切なナノ濾過装置を用いて免疫グロブリン中間体画分をナノ濾過してもよい。ある特定の実施形態では、ナノ濾過装置は15nm〜200nmの間又は約15nm〜約200nmの間の平均孔サイズを有するであろう。この用途に好適なナノフィルターの例には、非限定的に、DVD、DV50、DV20(Pall)、Viresolve NFP、Viresolve NFR(Millipore)、Planova15N、20N、35N及び75N(Planova)が挙げられる。特定の実施形態では、ナノフィルターは、15nm〜72nmの間若しくは約15nm〜約72nmの間、又は19nm〜35nmの間若しくは約19nm〜約35nmの間、又は、15nm、19nm、35nm、若しくは72nm、若しくは約15nm、約19nm、約35nm、若しくは約72nmの平均孔サイズを有し得る。好ましい実施形態では、ナノフィルターはAsahi PLANOVA35N又はその同等物のように35nm又は約35nmの平均孔サイズを有するであろう。
特定の実施形態では、免疫グロブリン含有溶液を処理して組成物のウイルス負荷量を減らすか又は不活化させてもよい。一実施形態では、このことは、組成物のpHを低pH、たとえば、6.0又は約6.0を下回るpHに調整し、組成物を放出する前に少なくとも約1週間インキュベートすることによって達成される。好ましい実施形態では、バルク溶液のpHはインキュベート前に5.5又は約5.5を下回るように調整される。さらに好ましい実施形態では、溶液のpHはインキュベート前に5.0又は約5.0を下回るように下げられる。ある特定の実施形態では、溶液のpHはインキュベート前に6.0若しくは約6.0を下回るように又は5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、4.0又は約5.9、約5.8、約5.7、約5.6、約5.5、約5.4、約5.3、約5.2、約5.1、約5.0、約4.9、約4.8、約4.7、約4.6、約4.5、約4.4、約4.3、約4.2、約4.1、約4.0、若しくはそれ未満を下回るように下げられる。
さらに他の実施形態では、本発明は当該技術で既知の方法に従って凍結乾燥された凍結乾燥免疫グロブリン組成物を提供する。たとえば、S/D処理又はナノ濾過のような他のウイルス不活化又は除去ステップに予め供されていてもよいこれらの凍結乾燥組成物のウイルス活性を、凍結乾燥組成物の熱処理によってさらに低減させることができる。血液因子におけるウイルス負荷の不活化のための熱処理は当該技術で周知である(たとえば、Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235−41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44−54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar; 114(3):335−40を参照)。
透析濾過ステップが完了したら、溶液のタンパク質濃度は透析濾過緩衝液によって、約3%〜約20%(w/v)の間、若しくは3%〜7%の間、若しくは約6%〜約18%(w/v)の間、若しくは約7%〜約16%(w/v)の間、若しくは約8%〜約14%(w/v)の間、若しくは約9%〜約12%の間の最終濃度に、又は、約5%、若しくは6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、若しくはそれ以上の最終濃度に調整される。好ましい実施形態では、溶液のタンパク質の最終濃度は約9%〜約11%の間、さらに好ましくは約10%である。
幾つかある利点の中で特に、実施例1〜7は、(1)カチオン交換樹脂(たとえば、CMセファロース)からの免疫グロブリンの段階溶出がタンパク質の二峰性分布を生じ、ここで、アミド分解活性(PL−1)はIgGより遅く溶出され、これによって、IgG収量の最小限の損失でアミド分解活性を取り除くことが可能になることと;(2)カチオン交換樹脂(たとえば、CMセファロース)からのアミド分解活性(PL−1)の溶出が、本明細書で提供される方法に係る溶出の際のCMカラムにおけるpHシフトに相関しかつおそらくそれによって引き起こされることと;(3)カチオン交換樹脂(たとえば、CMセファロース)に負荷されるタンパク質の量が、樹脂1ml当たり少なくとも60〜120mgのタンパク質の範囲にわたって、アミド分解活性(PL−1)の除去に影響しないことと;(4)おそらくカラム上部でのpH平衡がすでに乱れているために、カラム出口でのpHのモニタリング及び上昇が現れた時の溶出の停止が、アミド分解活性(PL−1)の部分的な除去をもたらすことと;(5)3CV未満の最初の溶出プールを回収することによって、IgG収率の最小限の損失(10%以下)でアミド分解活性を有意に低減することができること、したがってCMセファロース溶出ステップの体積をモニターすることが、本明細書で提供される方法に従って調製される免疫グロブリン組成物のアミド分解活性を有意に低減するための簡単な方法であることと;(6)CMセファロース溶出ステップの「第1のピーク」を回収することによって、より低いIgG凝集体濃度、より低いPKA活性、より低いPL−1活性、より高いIgG単量体濃度及びより望ましいIgGサブクラスの分布を有する組成物を達成することができることを実証する。
本実施例は、改変キストラー/ニッチェマンのアルコール分画に従って調製された画分IIの免疫グロブリン組成物に由来する高いTGA、FXIa及び短縮されたNAPTTの値の原因となる望ましくないタンパク質の分布を記載する。これらの不純物はカチオン交換クロマトグラフィステップ(たとえば、CMセファロースファストフロークロマトグラフィ)の溶出中に分離することができる。
製造規模の免疫グロブリン製剤に存在するアミド分解活性の量を減らすために、カチオン交換クロマトグラフィを溶出および分画するのに使用する条件を検討した。これらの検討の詳細を以下に提供する。
実施例1及び実施例2で見られた二峰性のCMセファロース溶出現象及びpHシフトをさらに検討するために、別のCMセファロースファストフロークロマトグラフィ実験の間に個々の溶出画分を回収した。手短には、上述のようにCMセファロースファストフロークロマトグラフィを実施し、画分を回収して別々に分析した後、画分A〜Nをプールし、限外濾過によって濃縮した。クロマトグラフィステップの出発物質はCohn画分IIのペースト(P25001ivLE;FIX及びAT−IIIを吸着した)であった。5.2のpHを有する緩衝液でCMセファロースカラムを平衡化し、5.7のpHで洗浄を行った。クロマトグラフィステップの流速は0.64cm/分で維持した。
CMセファロースff樹脂からのアミド分解活性溶出の境界をさらに定義するために、CM溶出液がpHの境界で定義される画分にて回収されることを除いては上記と同様に、別の実験を実施した。具体的には、カラム出口でモニターした規定のpH(4.3、4.8、6.0、7.5)まで、CM溶出液を回収した。この実験では、クロマトグラフィステップの出発物質は、実施例3と同様に、Cohn画分IIのペースト(P25001ivLE;FIX及びAT−IIIを吸着した)であった。4.8のpHでCMセファロースカラムを平衡化し、5.3のpHで洗浄した。溶出液画分を限外濾過/透析濾過し、分析の前にトリスでpHを調整した。この実験では、溶出ステップの開始時に溶出液のpHは4.1に低下した。回収された溶出液の画分の分析を表5に示す。
次に、単位CMセファロース樹脂当たりのタンパク質の量の低下が図2で示すピーク分離をさらに向上させるかどうかを判定した。これを調べるために、樹脂1ml当たり118mgのタンパク質から樹脂1ml当たり57mgのタンパク質に低下する範囲でタンパク質負荷量を低下させて、一連のCMセファロースffクロマトグラフィ実行を行った。実施例2と同様に、実験用の出発物質はCohn画分IIペースト経路II;P24701IVであり、それは吸着による脱クリオ血漿からのFIX、FVII及びATIIIの除去を含む(表6)。樹脂をpH5.2で平衡化し、pH5.7で洗浄ステップを行った。実施例2のように、CMセファロース溶出液をプールして、第1の部分(第1のピーク)及び第2の部分(第2の部分)とした。図2は、例示的クロマトグラフを提供するが、ここで、溶出液のUV吸光度が2つのピークの間のおよそOD280=1.6±0.2にて底を打つ時に第1のプールが終了し、第2のプールが開始する。
上述の実験の知見をさらに実証するために、様々な流速及び溶出プール形成スキームにてCMセファロースクロマトグラフィ精製を行った。手短には、高いアミド分解活性含量(6%タンパク質にて100ナノモル/ml.分)を含有するCohn画分IIペーストを本明細書で記載されるように処理して、ANXクロマトグラフィ前の画分とした。CMセファロースの実行すべてについて、UVが上昇し始めたら溶出液を回収し、3CVの後又は4CVの後に回収を停止した。
上で提供される結果が工業的な製造規模に拡大できることを実証するために360gのCohn画分II出発物質を上記実験のように処理した。2.9CVのCMセファロース溶出液を第1のプールで回収し、溶出液の残りを第2のプールで回収した。次いで、得られた溶出液プールを、本明細書で記載されるように、個体への投与に好適な最終容器組成物に処理した。このさらなる処理には、ANXクロマトグラフィ、限外濾過/透析濾過及び最終製剤からの凍結乾燥が含まれた。次いで各最終製剤の生化学的な特徴を分析し、結果を表9に提示する。
上で提供される結果をさらに実証するために、画分IIペースト(RI10XD142;遠心分離した沈殿物A)の一部を本明細書で提供される方法に従って調製した。次いでペーストを再懸濁し、本明細書で記載されるようにCMセファロースカチオン交換カラムに負荷し、上述のように溶出した。溶出液(総量:4743ml)を、溶出液全体の75%(3530ml)を含有する第1の画分と溶出液全体の25%(1213ml)を含有する第2の画分に分割した。次いで、第1と第2のCMセファロース溶出液画分を本明細書で記載されるように処理して最終容器に入れ、FXIa、TGA、NAPTT、及びアミド分解(PL−1)活性、IgG凝集体及びACAの含量について分析した。結果を表10に提供する。上で提供される結果に一致して、CMセファロース溶出液の第1のプールと第2のプールへの分離は、最終的な免疫グロブリン製剤におけるFXIa及びTGAの活性の低減を生じた。
本明細書で提供される方法の規模拡大の実行可能性をさらに評価するために、大規模製造法からのCMセファロース溶出液をタンパク質含量、pH及びFXIa活性についてモニターした。手短には、およそ19,000Lの脱クリオ血漿を本明細書で記載されるように処理して約70kgのタンパク質を含有する約220kgの画分IIペーストを形成した。画分IIペーストを再懸濁し、上述のようにCMセファロースカラムに負荷し、洗浄し、溶出した。溶出液の試料を回収し、各CV(およそ350L)の溶出の後、分析した。表11に示すように、高いFXIa値は、溶出液のpHがシフトした後、CMセファロース溶出の終了時にのみ見出された。溶出液のタンパク質濃度はOD280にてモニターし、OD280が2.0を下回るまで溶出の第1の部分を回収し、プールした。次いで、OD280が0.2を下回るまで溶出液の第2の部分を回収し、別にプールした。次いで、表12に示すように第1と第2の溶出液プールを分析し、比較した。注目すべきことに、IgG収量の98%がCM溶出液の第1の部分で見いだされ、IgG収量の2%がCM溶出液の第2の部分で見いだされた。従って、溶出液のOD280が2.0を下回った後CMセファロース溶出プールの回収を終了することによって、IgG収量の損失をできるだけ抑えながら、有意な量のTGA及びFXIaの活性をこの製剤から取り除くことができる。
免疫グロブリン組成物のアミド分解含量を減らすための開示された方法をさらに評価するために、画分IIの沈殿物を出発物質として用いて第2の大規模実験を行った。手短には、沈殿物Aの分離が遠心分離ではなく濾過によって行われたことを除いては実施例1で記載されたのと同様に、画分IIの沈殿物を調製した。
本実施例は、皮下投与用の免疫グロブリン組成物の製造のために設計された大規模製造工程におけるカチオン交換クロマトグラフィによる凝血促進活性の分離に対する本方法の好適性を実証する。この実験の出発材料はヨーロッパで採取され、プールされたヒト起源の血漿から形成された画分IIの沈殿物であり、これはクリオ沈殿され、吸着を介して抗トロンビンIII(ATIII)を回収するのに使用された。
免疫グロブリン組成物のアミド分解性含量を減らすための開示された方法をさらに評価するために、出発材料として画分IIの沈殿物を用いる別の大規模実験を行った。手短には、この実験の出発材料が、ヨーロッパで採取され、プールされたヒト起源の血漿から形成された画分IIの沈殿物でありかつこれがクリオ沈殿され、吸着を介してFEIBA及び抗トロンビンIII(ATIII)を回収するのに使用されたことを除いては実施例11で記載されたのと同様に、画分IIの沈殿物を調製した。CMセファロースカチオン交換クロマトグラフィ及び下流の処理も実施例11で記載されたように行った。
免疫グロブリン組成物のアミド分解性含量を減らすための開示された方法をさらに評価するために、出発材料として画分IIの沈殿物を用いて別の大規模実験を行った。手短には、この実験の出発材料が、米国で採取され、プールされたヒト起源の血漿から形成された画分IIの沈殿物でありかつこれがクリオ沈殿され、吸着を介してFEIBA及び抗トロンビンIII(ATIII)を回収するのに使用されたことを除いては実施例11で記載されたのと同様に、画分IIの沈殿物を調製した。CMセファロースカチオン交換クロマトグラフィ及び下流の処理も実施例11で記載されたように行った。
Claims (54)
- 血漿由来の免疫グロブリン組成物にて第XI因子(FXI)及び/又は第XIa因子(FXIa)の含量を低減させるための、単一段階溶出方法であって
(a)IgG免疫グロブリンとFXI及び/又はFXIaとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、
(b)6.0を超えないpHと11mS/cmを超えない導電率を含む溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置された弱いカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、IgG免疫グロブリンとFXI及び/又はFXIaの少なくとも一部とを弱いカチオン交換樹脂に結合させるステップと、
(c)少なくとも7.5のpHと少なくとも15mS/cmの導電率を含む単一の溶出緩衝液に弱いカチオン交換樹脂を接触させることによって、弱いカチオン交換樹脂からIgG免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、
(d)溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップと
を含み、
溶出液の先行部分が、出発組成物に比べて低下した量のアミド分解活性を有するIgG免疫グロブリン組成物を含み、および溶出液の遅行部分が、溶出液の先行部分に比べてより多い量のアミド分解活性を有し、かつ溶出液の先行部分が、6.0を超えないpHを有する溶出液の部分からなる、方法。 - 溶出緩衝液が少なくとも20mS/cmの導電率を含む、請求項1に記載の方法。
- 溶出緩衝液が少なくとも25mS/cmの導電率を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- ステップ(c)にて弱いカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、6.0を超えないpHと11mS/cm未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとFXI及び/又はFXIaとが結合した弱いカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 弱いカチオン交換樹脂がカルボキシメチルカチオン交換樹脂である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が7.5〜8.5の間のpHを含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が8.0±0.2のpHを含む、請求項6に記載の方法。
- 溶出緩衝液が200〜300mMの間の塩化ナトリウムを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が240〜260mMの間の塩化ナトリウムを含む、請求項8に記載の方法。
- 溶出緩衝液が100mM〜300mMの間のグリシンを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が175mM〜225mMの間のグリシンを含む、請求項10に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、6.0を上回るpHを有する溶出液とは別に6.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.5を上回るpHを有する溶出液とは別に5.5を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.0を上回るpHを有する溶出液とは別に5.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、溶出液のpHをモニターすることを含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の先行部分を回収するステップが、
(i)280nm(OD280)にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、
(ii)溶出液のOD280が少なくとも50mAUの第1の閾値OD280よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、
(iii)溶出液のOD280が500mAUを下回らない第2の閾値OD280よりも低下したら回収を停止する副ステップと
を含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の閾値OD280が1AUを下回らない、請求項16に記載の方法。
- 第2の閾値OD280が2AUを下回らない、請求項16に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が5.0〜6.0の間のpHを含む、請求項4〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が5.5±0.2のpHを含む、請求項19に記載の方法。
- ステップ(b)で弱いカチオン交換樹脂に結合したFXI及び/又はFXIaの50%未満が、ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在する、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)で弱いカチオン交換樹脂に結合したFXI及び/又はFXIaの25%未満が、ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在する、請求項21に記載の方法。
- ステップ(b)で弱いカチオン交換樹脂に結合したFXI及び/又はFXIaの10%未満が、ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在する、請求項21に記載の方法。
- FXI及び/又はFXIaの量が、FXIa特異的な基質を用いたアミド分解活性アッセイを行うことによって決定される、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、画分Iの沈殿物、画分I+II+IIIの沈殿物、画分IIの沈殿物、画分II+IIIの沈殿物、画分IV−1、キストラー/ニッチェマンの沈殿物A、キストラー/ニッチェマンの沈殿物B、Cohn画分II、Cohnプール、Cohn画分IまたはII+III、及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、懸濁された画分IIの沈殿物である、請求項25に記載の方法。
- 血漿由来の免疫グロブリン組成物にて抗補体活性(ACA)を低減させるための、単一段階溶出方法であって、
(a)IgG免疫グロブリンとACAとを含む血漿由来の免疫グロブリン組成物を提供するステップと、
(b)6.0を超えないpHと11mS/cmを超えない導電率を含む溶液条件下でクロマトグラフィカラム中に配置された弱いカチオン交換樹脂に血漿由来の免疫グロブリン組成物を接触させて、弱いカチオン交換樹脂にIgG免疫グロブリンとACAの少なくとも一部とを結合させるステップと、
(c)少なくとも7.5のpHと少なくとも15mS/cmの導電率を含む単一の溶出緩衝液に弱いカチオン交換樹脂を接触させることによって、弱いカチオン交換樹脂からIgG免疫グロブリンを溶出して、先行部分と遅行部分を含む溶出液を形成するステップと、
(d)溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップと
を含み、
溶出液の先行部分が、出発組成物に比べて低下した量のACAを有するIgG免疫グロブリン組成物を含み、および溶出液の遅行部分が、溶出液の先行部分に比べてより多い量のACAを有し、かつ溶出液の先行部分が、6.0を超えないpHを有する溶出液の部分からなる、方法。 - 溶出緩衝液が少なくとも20mS/cmの導電率を含む、請求項27に記載の方法。
- 溶出緩衝液が少なくとも25mS/cmの導電率を含む、請求項27又は28に記載の方法。
- ステップ(c)にて弱いカチオン交換樹脂から免疫グロブリンを溶出する前に、6.0を超えないpHと11mS/cm未満の導電率を含む洗浄緩衝液によって、免疫グロブリンとACAとが結合した弱いカチオン交換樹脂を洗浄するステップをさらに含む、請求項27〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 弱いカチオン交換樹脂がカルボキシメチルカチオン交換樹脂である、請求項27〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が7.5〜8.5の間のpHを含む、請求項27〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が8.0±0.2のpHを含む、請求項32に記載の方法。
- 溶出緩衝液が200〜300mMの間の塩化ナトリウムを含む、請求項27〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が240〜260mMの間の塩化ナトリウムを含む、請求項34に記載の方法。
- 溶出緩衝液が100mM〜300mMの間のグリシンを含む、請求項27〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出緩衝液が175mM〜225mMの間のグリシンを含む、請求項36に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、6.0を上回るpHを有する溶出液とは別に6.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、請求項27〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.5を上回るpHを有する溶出液とは別に5.5を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、請求項27〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、5.0を上回るpHを有する溶出液とは別に5.0を超えないpHを有する溶出液を回収することを含む、請求項27〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の遅行部分とは別に溶出液の先行部分を回収するステップが、溶出液のpHをモニターすることを含む、請求項27〜40のいずれか1項に記載の方法。
- 溶出液の先行部分を回収するステップが、
(i)280nm(OD280)にて溶出液の光学密度をモニターする副ステップと、
(ii)溶出液のOD280が少なくとも50mAUの第1の閾値OD280よりも上昇したら回収を開始する副ステップと、
(iii)溶出液のOD280が500mAUを下回らない第2の閾値OD280よりも低下したら回収を停止する副ステップと
を含む、請求項27〜41のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の閾値OD280が1AUを下回らない、請求項42に記載の方法。
- 第2の閾値OD280が2AUを下回らない、請求項42に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が5.0〜6.0の間のpHを含む、請求項30〜44のいずれか1項に記載の方法。
- 洗浄緩衝液が5.5±0.2のpHを含む、請求項45に記載の方法。
- ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも低い、請求項27〜46のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも少なくとも25%低い、請求項47に記載の方法。
- ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも少なくとも50%低い、請求項47に記載の方法。
- ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(d)で回収される溶出液の遅行部分におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度よりも低い、請求項27〜49のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(d)で回収される溶出液の遅行部分におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度の50%未満である、請求項50に記載の方法。
- ステップ(d)で回収される溶出液の先行部分に存在するIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度が、ステップ(d)で回収される溶出液の遅行部分におけるIgG免疫グロブリンの濃度に対するACAの濃度の25%未満である、請求項50に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、画分Iの沈殿物、画分I+II+IIIの沈殿物、画分IIの沈殿物、画分II+IIIの沈殿物、画分IV−1、キストラー/ニッチェマンの沈殿物A、キストラー/ニッチェマンの沈殿物B、Cohn画分II、Cohnプール、Cohn画分IまたはII+III、及びそれらの改変された沈殿物から成る群から選択される、懸濁された血漿画分沈殿物である、請求項27〜52のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(a)で提供される血漿由来の免疫グロブリン組成物が、懸濁された画分IIの沈殿物である、請求項53に記載の方法。
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