TWI610937B - 用於降低血漿來源免疫球蛋白組成物之血栓性栓塞可能性的方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供經由使用陽離子交換層析來降低免疫球蛋白組成物之醯胺分解及抗補體活性(ACA)水準的方法。在一個特定具體實例中，本發明提供藉由收集陽離子交換洗出液之前導部分來降低免疫球蛋白組成物之因子XI及/或因子XIa及/或ACA含量的方法。本發明亦提供具有醯胺分解活性水準、因子XI及/或因子XIa及/或ACA含量降低的免疫球蛋白組成物。

Description

用於降低血漿來源免疫球蛋白組成物之血栓性栓塞可能性的方法 【相關申請案之交叉引用】

本申請案主張2011年8月26日申請之美國臨時申請案第61/527,974號的權益，該案之內容係以全文引用的方式明確併入本文中以用於所有目的。

本發明提供降低免疫球蛋白組成物之醯胺分解及抗補體活性(ACA)水準的方法。本發明亦提供具有醯胺分解活性水準、因子XI及/或因子XIa及/或ACA含量降低的免疫球蛋白組成物。

血漿來源血液產品不僅用於治療多種血液病症，而且用於治療其他根源之疾病。舉例而言，1952年首次使用來源於人類血漿之免疫球蛋白(IgG)產品治療免疫缺乏症。之後，IgG製品廣泛用於至少三類主要醫學病狀中：(1)免疫缺乏症，諸如性聯無γ球蛋白血症、低γ球蛋白血症(原發性免疫缺乏症)、及後天性免疫功能降低病狀(繼發性免疫缺乏症)、特徵性低抗體含量；(2)發炎及自身免疫疾病；及(3)急性感染。

製備及調配血漿來源生物療法時，必須考慮各種安全預防措施。此等預防措施包括移除及/或不活化血液傳播病原體(例如病毒性及細菌性病原體)、抗補體活性及因使用捐贈血漿所產生之其他非所需污染物的方法。研究已指出，投予醯胺分解活性水準高的藥物可能導致非所需的血 栓性栓塞事件(Wolberg AS等人，Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations.Am J Hematol 2000；65：30-34；及Alving BM等人，Contact-activated factors：contaminants of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties.J Lab Clin Med 1980；96：334-346；該等文獻之揭示內容係以全文引用的方式併入本文中用於所有目的)。

血栓性栓塞事件報導增加後，Octagam^®(Octapharma)在美國自願退市及歐洲委員會中止Octagam^®及10% Octagam之行銷許可突出了此擔憂。已提出，血栓性栓塞事件的增加歸因於生物體內高水準的醯胺分解活性，此係由絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶酶原雜質造成，諸如因子XI、因子XIa、因子XII及因子XIIa(FDA通告：自願退市-2010年9月23日，5% Octagam[靜脈內免疫球蛋白(人類)]液體製劑；Octagam 50 mg/ml灌注溶液，Octapharma France-Mise en quarantaine de tous les lots，2010年9月9日AFSSAPS線上公佈；及歐洲藥物管理局(European Medicines Agency)於2010年9月23日線上公佈之關於中止Octagam(5%及10%人類正常免疫球蛋白)之行銷特許的問答)。

EDQM(European Directorate on the Quality of Medicines & Health Care(歐洲醫藥及健康照護品質管理理事會))公佈了一篇關於靜脈內投予人類正常免疫球蛋白之專論修訂版，以便於2012年1月1日快速實施，從而解決免疫球蛋 白產品之潛在促凝血活性。修訂版說明，「該製備方法亦包括顯示可移除血栓生成劑的步驟。重點是鑑別活化凝血因子及其酶原及可能引起其活化的過程步驟。亦關注可能由製造過程引入的其他促凝血劑。」

2011年3月18日，Swissmedic報導，FDA已注意到血栓性栓塞不利事件與多批Vivaglobin產品有關。由CSL製造之Vivaglobin(160 mg/mL人類正常免疫球蛋白皮下注射溶液)已獲准為患有原發性免疫缺乏症候群、骨髓瘤或慢性淋巴性白血病之成人及兒童的替代療法。血栓性栓塞不利事件之風險直至此次由於此投藥途徑才得以認識到。調查揭示，至少一些批次中存在促凝血活性。結果，Vivaglobin退出市場且被新產品Hizentra(20%人類正常免疫球蛋白皮下注射溶液)替代。由於關於Vivaglobin之不利事件的報導，因此皮下投予之免疫球蛋白產品現在必須具有低水準的促凝血活性，類似於對於靜脈內免疫球蛋白產品之要求。

總稱為凝血因子的專門絲胺酸蛋白酶為凝血級聯之接觸活化與組織因子途徑的整體組分。一旦刺激凝血途徑，作為失活酶前驅體的絲胺酸蛋白酶酶原即變成催化下一個蛋白酶酶原活化的活化蛋白酶，從而產生活化級聯。此凝血級聯使凝血酶(因子IIa)及因子XIIIa之活化達到頂點，凝血酶及因子XIIIa的作用分別為使血纖維蛋白原(因子I)轉變成血纖維蛋白(因子Ia)及與血纖維蛋白交聯形成血纖維蛋白凝塊。

亦稱為固有凝血途徑的接觸活化途徑始於前激肽釋放 酶及因子XII分別活化為激肽釋放酶及因子XIIa(FXIIa)。活化絲胺酸蛋白酶FXIIa使因子XI(FXI)分解，從而使酶原轉變成因子XIa(FXIa)，因子XIa為一種參與因子Xa(FXa)隨後活化絲胺酸蛋白酶。

由於愈發擔心血漿來源蛋白質組成物中存在絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶酶原，因此，此項技術中仍需要降低此等污染物(且特別是FXI及FXIa)於免疫球蛋白製劑中之含量的方法。

本發明尤其提供降低IgG免疫球蛋白組成物之醯胺分解性水準(例如FXI及/或FXIa)的方法及醯胺分解活性水準(例如FXI及/或FXIa)低於市面上可獲得之類似組成物的IgG免疫球蛋白組成物。

在第一態樣中，本發明提供降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)含量的方法，該方法包含步驟：(a)提供包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物；(b)使該血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使IgG免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(c)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15mS/cm的洗提緩衝液接觸以形成包含前導部分及滯後部分的洗出液來使IgG免疫球蛋白自陽離子交換樹脂中洗提； 及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分佔不超過80%洗出液。

在上文提供之方法的一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少20mS/cm。在上文提供之方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少22mS/cm。在上文提供之方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少25mS/cm。

在上文提供之方法的一個具體實例中，該方法在步驟(c)中使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提之前另外包含用pH值不超過6.0及電導率小於11mS/cm的洗滌緩衝液洗滌結合有免疫球蛋白及FXI及/或FXIa之陽離子交換樹脂的步驟。

在上文提供之方法的一個具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在上文提供之方法的一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基陽離子交換樹脂。

在上文提供之方法的一個具體實例中，洗提緩衝液的pH值介於7.5與8.5之間。在上文提供之方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液的pH值為8.0±0.2。

在上文提供之方法的一個具體實例中，洗提緩衝液包含200mM與300mM之間的氯化鈉。在上文提供之方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含240mM與260mM之間的氯化鈉。

在上文提供之方法的一個具體實例中，洗提緩衝液包含100mM與300mM之間的甘胺酸。在上文提供之方法的 另一個具體實例中，洗提緩衝液包含175 mM與225 mM之間的甘胺酸。

在上文提供之方法的一個具體實例中，洗出液之前導部分由不超過70%的洗出液組成。

在上文提供之方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過7.0的洗出液及pH值超過7.0的洗出液。

在上文提供之方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.5的洗出液及pH值超過6.5的洗出液。

在上文提供之方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.0的洗出液及pH值超過6.0的洗出液。

在上文提供之方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.5的洗出液及pH值超過5.5的洗出液。

在上文提供之方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.0的洗出液及pH值超過5.0的洗出液。

在上文提供之方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含監測洗出液之pH值。

在上文提供之方法的一個具體實例中，收集洗出液之前導部分的步驟包含以下子步驟：(i)監測洗出液在280 nm 下的光學密度(OD₂₈₀)；(ii)當洗出液OD₂₈₀上升超過至少50 mAU之第一臨限值OD₂₈₀時，開始收集；及(iii)當洗出液OD₂₈₀下降低於不小於500 mAU之第二臨限值OD₂₈₀時，終止收集。在一個特定具體實例中，第二臨限值OD₂₈₀不小於1 AU。在另一個特定具體實例中，第二臨限值OD₂₈₀不小於2 AU。

在上文提供之方法的一個具體實例中，洗滌緩衝液的pH值介於5.0與6.0之間。在上文提供之方法的另一個具體實例中，洗滌緩衝液的pH值為5.5±0.2。

在上文提供之方法的一個具體實例中，步驟(b)中結合至陽離子交換樹脂的FXI及/或FXIa有不到50%存在於步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中。

在上文提供之方法的一個具體實例中，步驟(b)中結合至陽離子交換樹脂的FXI及/或FXIa有不到25%存在於步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中。

在上文提供之方法的一個具體實例中，步驟(b)中結合至陽離子交換樹脂的FXI及/或FXIa有不到10%存在於步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中。

在上文提供之方法的一個具體實例中，FXI及/或FXIa之量係藉由使用FXIa特異性受質執行醯胺分解活性檢定來測定。

在上文提供之方法的一個具體實例中，步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的血漿分離份沈澱物，其選自由以下組成之群：分離份I沈澱物、分離份 I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、及其經修飾之沈澱物。

在上文提供之方法的一個具體實例中，步驟(a)中提供的血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的分離份II沈澱物。

在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物之抗補體活性(ACA)的方法，該方法包含步驟：(a)提供包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物；(b)使該血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA之至少一部分結合至陽離子交換樹脂；(c)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸以形成包含前導部分及滯後部分的洗出液來使IgG免疫球蛋白自陽離子交換樹脂中洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分佔不超過80%洗出液。

在上述方法的一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少20 mS/cm。在上述方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少22 mS/cm。在上述方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少25 mS/cm。

在上述方法的一個具體實例中，該方法在步驟(c)中 使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提之前另外包含用pH值不超過6.0及電導率小於11 mS/cm的洗滌緩衝液洗滌結合有免疫球蛋白及ACA之陽離子交換樹脂的步驟。

在上述方法的一個具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在上述方法的一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基陽離子交換樹脂。

在上述方法的一個具體實例中，洗提緩衝液的pH值介於7.5與8.5之間。在上述方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液的pH值為8.0±0.2。

在上述方法的一個具體實例中，洗提緩衝液包含200 mM與300 mM之間的氯化鈉。在上述方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含240 mM與260 mM之間的氯化鈉。

在上述方法的一個具體實例中，洗提緩衝液包含100 mM與300 mM之間的甘胺酸。在上述方法的另一個具體實例中，洗提緩衝液包含175 mM與225 mM之間的甘胺酸。

在上述方法的一個具體實例中，洗出液之前導部分係由不超過70%的洗出液組成。

在上述方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過7.0的洗出液及pH值超過7.0的洗出液。

在上述方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.5的洗出液及pH值超過6.5的洗出液。

在上述方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前 導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.0的洗出液及pH值超過6.0的洗出液。

在上述方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.5的洗出液及pH值超過5.5的洗出液。

在上述方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.0的洗出液及pH值超過5.0的洗出液。

在上述方法的一個具體實例中，分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含監測洗出液之pH值。

在上述方法的一個具體實例中，收集洗出液之前導部分的步驟包含子步驟：(i)監測洗出液在280 nm下的光學密度(OD₂₈₀)；(ii)當洗出液OD₂₈₀上升超過至少50 mAU之第一臨限值OD₂₈₀時，開始收集；及(iii)當洗出液OD₂₈₀下降低於不小於500 mAU之第二臨限值OD₂₈₀時，終止收集。

在上述方法的一個具體實例中，第二臨限值OD₂₈₀不小於1 AU。在上述方法的另一個具體實例中，第二臨限值OD₂₈₀不小於2 AU。

在上述方法的一個具體實例中，洗滌緩衝液的pH值介於5.0與6.0之間。在上述方法的另一個具體實例中，洗滌緩衝液的pH值為5.5±0.2。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(d)中所收集之 洗出液之前導部分中存在的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低於步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物中ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率比步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物中ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低至少25%。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率比步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物中ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低至少50%。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低於步驟(d)中所收集之洗出液之滯後部分中的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率小於步驟(d)中所收集之洗出液之滯後部分中的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率的50%。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率小於步驟(d)中所收集之洗出液之滯後部分中的ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率的25%。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(a)中所提供之 血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的血漿分離份沈澱物，其選自由以下組成之群：分離份I沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、及其經修飾之沈澱物。

在上述方法的一個具體實例中，步驟(a)中提供的血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的分離份II沈澱物。

I.導言

鑒於治療性血漿來源靜脈內免疫球蛋白組成物的廣泛使用，因此確保此等組成物之安全性至關重要。對免疫球蛋白組成物之醯胺分解性水準與投予血漿來源免疫球蛋白之患者中發生之血栓性栓塞事件關聯的擔憂，突顯了對於在免疫球蛋白製造期間有效減少絲胺酸蛋白酶(例如FXIa及FXIIa)及絲胺酸蛋白酶酶原(例如FXI及FXII)的方法之需要。

本發明至少部分基於以下驚人發現：藉由僅收集陽離子交換洗出液之前導部分便可移除免疫球蛋白組成物中的大量醯胺分解活性(例如FXI及/或FXIa)及/或抗補體活性(ACA)。因此，本文提供在血漿來源蛋白質組成物製造期間降低絲胺酸蛋白酶及絲胺酸蛋白酶酶原之濃度的方法。

在一個態樣中，本發明係基於以下發現：在自陽離子交換樹脂單步洗提期間，IgG免疫球蛋白自樹脂釋放，隨後 洗提醯胺分解活性(例如至少由FXI及/或FXIa引起)及/或ACA之大量洗提份。特定而言，已發現，結合有IgG免疫球蛋白及促成醯胺分解活性之蛋白質的陽離子交換樹脂一旦與pH值大於至少7.0的洗提緩衝液接觸，自管柱回收的初始洗出液即具有低pH值(例如pH值低於5.0)。過一段時間後，自管柱回收之洗出液的pH值移位至超過7.0。已驚人地發現，pH值低的初始洗出液含有低水準的醯胺分解活性、低含量的FXI及/或FXIa、及/或ACA，而pH值移位之後回收的洗出液含有顯著更高水準之醯胺分解活性、顯著更高含量之FXI及/或FXIa、及/或ACA。

因此，在一個態樣中，本發明係基於一種如下自IgG免疫球蛋白組成物中分離大部分醯胺分解活性(例如因子XI及/或因子XIa)及/或ACA的方法：使IgG免疫球蛋白、醯胺分解活性及/或ACA結合至陽離子交換樹脂，以單步洗提法洗提IgG免疫球蛋白、醯胺分解活性及/或ACA，及收集洗出液之前導部分，該前導部分之特徵為與洗出液之滯後部分分離後的高IgG產率、低醯胺分解活性及/或低ACA含量，該滯後部分之特徵為低IgG產率、高醯胺分解活性及/或高ACA含量。

本發明方法之優點尤其為提供(1)藉由陽離子交換層析，以單步洗提法自IgG免疫球蛋白組成物移除醯胺分解活性的簡單方法；(2)基於監測洗出液之pH值來快速鑑別具有高醯胺分解活性(亦即高FXI及/或FXIa含量)之IgG免疫球蛋白陽離子交換洗出液之洗提份的簡單方法； (3)自IgG免疫球蛋白組成物移除醯胺分解活性而不受裝載於陽離子交換樹脂上之蛋白質濃度影響同時允許針對大規模製造製程按比例簡單擴大的方法；(4)允許基於pH值監測來快速測定用於進一步處理之IgG免疫球蛋白陽離子交換洗提份的方法；(5)使醯胺分解活性(例如FXI及/或FXIa含量)顯著降低而IgG免疫球蛋白產率損失最小的方法；(6)製造具有較低IgG聚集物濃度、較低PKA活性、較低醯胺分解活性(如利用顯色受質(包括(但不限於)受質PL-1)所量測)、較高IgG單體濃度及較理想IgG亞類分佈之IgG免疫球蛋白組成物的方法；(7)允許基於層析步驟之洗提體積來快速確定用於進一步處理之陽離子交換IgG免疫球蛋白洗提份的方法；(8)允許基於特定洗提份之蛋白質吸光度來快速確定用於進一步處理之IgG免疫球蛋白陽離子交換洗提份的方法；(9)能夠在大規模製造製程中使用本發明之有利特徵；(10)增濃醯胺分解活性用於鑑別及定量；(11)藉由陽離子交換層析，以單步洗提法自IgG免疫球蛋白組成物移除抗補體活性(ACA)的簡單方法；(12)基於監測洗出液之pH值來快速鑑別具有高抗補體活性(ACA)之IgG免疫球蛋白陽離子交換洗出液之洗提份的簡單方法；(13)自IgG免疫球蛋白組成物移除抗補體活性(ACA)而不受裝載於陽離子交換樹脂上之蛋白質濃度影響同時允許針對大規模製造製程按比例簡單擴大的方法；(14)使抗補體活性(ACA)顯著降低而IgG免疫球蛋白產率損失最小的方法；(15)製造具有較低 IgG聚集物濃度、較低抗補體活性(ACA)、較高IgG單體濃度及較理想IgG亞類分佈之IgG免疫球蛋白組成物的方法；及(16)增濃抗補體活性(ACA)用於鑑別及定量。

II.定義

如本文所用，術語「靜脈內IgG(Intravenous IgG)」或「IVIG」治療通常係指向患者靜脈內、皮下或肌肉內投予IgG免疫球蛋白組成物以便治療諸如免疫缺乏症、發炎疾病及自體免疫疾病之多種病狀的治療方法。典型地自血漿彙集並製備IgG免疫球蛋白。可使用完整抗體或片段。IgG免疫球蛋白可針對皮下投藥以較高濃度(例如大於10%)調配，或針對肌肉內投藥加以調配。對於以針對特定抗原(例如Rho D因子、百日咳毒素、破傷風毒素、肉毒桿菌毒素、狂犬病等)之平均效價更高之效價製備的專門IgG製劑，此尤其常見。為便於論述，在本申請案中，術語「IVIG」亦包括此等針對皮下或肌肉內投藥調配之IgG組成物。

如本文所用，術語「醯胺分解活性(amidolytic activity)」係指多肽催化另一多肽中之至少一個肽鍵水解的能力。IgG免疫球蛋白組成物之醯胺分解活性特徵可藉由使用各種顯色受質進行分析來測定，此等顯色受質對人類血漿中發現之蛋白酶具有不同特異性，包括(但不限於)：PL-1(廣譜)、S-2288(廣譜)、S-2266(FXIa，腺性激肽釋放酶)、S-2222(FXa，胰蛋白酶)、S-2251(纖維蛋白溶酶)及S-2302(激肽釋放酶、FXIa及FXIIa)。用於測定組成物之醯胺分解活性的方法在此項技術中已熟知，例如如M.Etscheid等 人所述(Identification of kallikrein and FXIa as impurities in therapeutic immunoglobulins：implications for the safety and control of intravenous blood products,Vox Sang 2011；該文獻之揭示內容係以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的)。

如本文所用，術語「抗補體活性(anti-complement activity/anticomplementary activity)」及「ACA」可互換使用且係指蛋白質組成物(例如IgG免疫球蛋白組成物)在補體檢定中消耗潛在補體的能力，例如實質上根據以下文獻所述之方法的方法：「Public Health Monograph」第74期；Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adaptation to Microtest,Washington,1965；以及E.A.Kabat及M.Mayer,Experimental Immunochemistry；第二版，Thomas Springfield 1961，該文獻之內容係以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的。補體活性之典型單位為以本文所述之補體活性使總共5×10⁸個經最佳致敏之紅血球中有2.5×10⁸個發生溶解的補體之量。

在一個具體實例中，使用抗體致敏羊紅血球標準化懸浮液量測ACA，抗體致敏羊紅血球標準化懸浮液與充當補體來源之天竺鼠血清的不同稀釋液一起培育。以分光光度法量測溶血程度。舉例而言，為測定免疫球蛋白產品之抗補體活性，製備含有不同量之免疫球蛋白產品及每毫升2 C'H₅₀單位之天竺鼠血清的測試溶液。在一個特定具體實例中，藉由將限定量之測試物質(例如10 mg IgG免疫球蛋白) 與限定量之天竺鼠補體(例如20 C'H₅₀)一起培育來量測抗補體活性並滴定剩餘補體。抗補體活性表示為相對於補體對照物(視為100%)的補體消耗百分比。在一個具體實例中，根據以下文獻中所述之標準來量測ACA：European Pharmacopoeia：Human normal immunoglobulin for intravenous administration.European Pharmacopoeia 6.3，專論2.6.17,4166-4168.Council of Europe，Strasbourg Cedex,France，該文獻之內容係以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的。

降低預定靜脈內投予之組成物之抗補體活性的方法描述於以下文獻中(Schultz,H.E.及Schwick,G.,Dtsch.med.Wochenschrift 87(1962),1643；Barandun,S.等人，Vox Sang.28(1957),157；Barandun,S.等人，Vox Sang.7(1962),187；及Stephen,W.,Z.Klin.Chem.Klin.Biochem.7(1969),282，其內容係以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的)。

如本文所用，「冷貧血漿(cryo-poor plasma)」係指血漿或彙集之血漿在接近冷凍之溫度(例如低於約10℃之溫度)下冷沈澱(低溫沈澱)之後所形成的上層清液。在本發明之上下文中，血漿可互換地指代回收之血漿(亦即已與全血活體外分離的血漿)或源血漿(亦即經由血漿清除術收集之血漿)。冷沈澱通常藉由例如將先前經冷凍之彙集血漿解凍來執行，先前經冷凍之彙集血漿出於安全及品質考慮已加以檢定，但亦可使用新鮮血漿。解凍典型地 在不高於6℃之溫度下進行。冷凍血漿在低溫下完全解凍之後，在冷卻下(例如

6℃)執行離心，以自液體上層清液中分離固體冷沈澱物。或者，可藉由過濾而非離心來執行分離步驟。

如本文所用，「科恩池(Cohn pool)」係指用於分離血漿樣品或血漿樣品池之起始物質。科恩池包括可能已或可能尚未經受預處理步驟的全血漿、冷貧血漿樣品及冷貧血漿樣品池。在某些具體實例中，科恩池為已在預處理步驟(例如吸附於固相上(例如氫氧化鋁、精細粉碎的二氧化矽等))或層析步驟(例如離子交換或肝素親和層析)中移除一或多種血液因子的冷貧血漿樣品。可自冷貧血漿樣品中分離各種血液因子，包括(但不限於)因子XIII抑制劑旁路活性(FEIBA)、因子IX複合物、因子VII濃縮物或抗凝血酶III複合物，以形成科恩池。

如本文所用，術語「洗出液之前導部分(leading portion of the eluate)」係指免疫球蛋白組成物自陽離子交換樹脂洗提之第一洗提份，該洗提份之特徵為免疫球蛋白產率高及醯胺分解活性低於洗提之前結合至樹脂的總醯胺分解活性。洗出液之前導部分為洗出液自陽離子交換管柱釋放之第一洗提份，其出現先於免疫球蛋白組成物之第二洗提份(稱為「洗出液之滯後部分」)之釋放(亦即洗提)。洗出液之滯後部分僅含有少量免疫球蛋白(典型地不超過結合至管柱之免疫球蛋白的25%，較佳不超過結合至管柱之免疫球蛋白的10%)且特徵為醯胺分解活性濃度高於洗出 液之前導部分。在不同具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分可由不同特徵定義，包括(但不限於)洗出液之pH值、洗出液之蛋白質產率(例如表示為結合至樹脂之蛋白質百分比)、蛋白質濃度(例如依據光學密度所測定)、洗出液體積及其類似特徵。

如本文所用，術語「超濾(ultrafiltration：UF)」涵蓋流體靜壓力逆著半透膜壓迫液體的多種膜濾方法。懸浮的固體及高分子量溶質滯留，而水及低分子量溶質穿過薄膜。此分離方法常用於純化及濃縮高分子(10³-10⁶ Da)溶液，尤其是蛋白質溶液。有多種超濾膜可供使用，視其滯留之分子尺寸而定。超濾典型地以1 kDa與1000 kDa之間的孔尺寸之膜及0.01巴與10巴之間的操作壓力為特徵，且特別適用於將蛋白質自小分子(如糖及鹽)中分離。

如本文所用，術語「滲濾(diafiltration)」係用與超濾相同的膜執行且可以切向流過濾或死端過濾方式操作。在滲濾期間，向再循環槽中引入緩衝液，同時自單元操作移除濾液。在產物(例如IgG免疫球蛋白)存在於滯留物中的過程中，滲濾可將產物池中的組分洗入濾液中，從而進行緩衝液交換且降低非所要物質之濃度。

如本文所用，術語「清潔劑(detergent)」在本申請案中可與術語「界面活性劑(surfactant)」或「表面活性劑(surface acting agent)」互換使用。界面活性劑典型地為含有疏水基(「尾」)與親水基(「頭」)的兩親媒性有機化合物，疏水基與親水基使得界面活性劑可溶於有機溶 劑與水中。界面活性劑可依據其頭部存在的形式上帶電荷之基團分類。非離子型界面活性劑的頭部無帶電荷基團，而離子型界面活性劑的頭部攜帶淨電荷。兩性離子型界面活性劑的頭部具有兩個帶相反電荷的基團。常見界面活性劑之一些實例包括：陰離子型(根據硫酸根、磺酸根或羧酸根陰離子)：全氟辛酸鹽(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、月桂基硫酸銨、及其他烷基硫酸鹽、月桂醇醚硫酸鈉(亦稱為月桂基醚硫酸鈉或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽離子型(根據四級銨陽離子)：溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)(亦稱為十六烷基三甲基溴化銨)、及其他烷基三甲基銨鹽、氯化十六烷基吡錠(CPC)、聚乙氧基化牛油胺(POEA)、氯化苯甲烴銨(BAC)、苄索氯銨(BZT)；長鏈脂肪酸及其鹽：包括辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽、己酸、庚酸、壬酸、癸酸及其類似物；兩性離子型(兩性)：十二基甜菜鹼；椰油醯胺基丙基甜菜鹼；椰油醯胺兩性基甘胺酸鹽；非離子型：烷基聚(氧化乙烯)、烷基酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)與聚(氧化丙烯)之共聚物(商業上被稱為泊洛沙姆(Poloxamers)或泊洛沙胺(Poloxamines))、烷基聚葡糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麥芽糖苷)、脂肪醇(例如鯨蠟醇及油醇)、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、聚山梨醇酯(吐溫(Tween)20、吐溫80等)、曲通清潔劑(Triton detergents)及氧化十二烷基二甲基胺。

如本申請案中所使用，術語「噴霧(spraying)」係指 使液體物質以液體物質之霧滴或薄霧形式遞送至系統內的手段，例如在醇法沈澱步驟期間，諸如經修改之科恩份化I或II+III沈澱步驟。噴霧可由任何加壓裝置完成，諸如容器(例如噴霧瓶)，其具有噴頭或噴嘴且可手動或自動操作以便自液體產生細霧。典型地，執行噴霧的同時，連續攪拌或以其他方式混合接收液體物質的系統以確保液體快速且均勻分佈於系統內部。

「治療有效量或劑量(therapeutically effective amount or dose)」或「足量/有效量或劑量(sufficient/effective amount or dose)」意謂投予其而產生效果的劑量。精確劑量將視治療目的而定，且可由熟習此項技術者利用已知技藝確定(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy,第20版，2003,Gennaro,Ed.,Lippincott,Williams & Wilkins)。

III.降低醯胺分解活性

在一個態樣中，本發明提供降低血漿來源IgG免疫球蛋白組成物之醯胺分解活性(例如藉由降低FXI/FXIa及/或FXII/FXIIa含量)的層析法。同樣，本發明亦提供根據本文提供之方法製備的含有低水準之醯胺分解活性(例如低含量之FXI/FXIa及/或FXII/FXIIa)的血漿來源IgG免疫球蛋白組成物。有利的是，本文所述方法提供安全特徵改良的血漿來源IgG免疫球蛋白組成物。特定而言，此等方 法所提供之組成物引起非所需血栓性栓塞事件的可能性低於目前製造之IgG免疫球蛋白組成物。

A.份化方法

本發明部分地基於以下發現：存在於血漿來源免疫球蛋白組成物中的醯胺分解活性大部分在由一步洗提產生之洗出液之滯後部分中自陽離子交換樹脂洗提，而洗提份中所含之免疫球蛋白大部分在該洗出液之前導部分中洗提。因此，藉由分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，可顯著降低所得免疫球蛋白製劑之醯胺分解活性。特定而言，本文顯示，在根據本文提供之方法製備的免疫球蛋白組成物中，因子XIa含量及因此與因子XIa含量有關的醯胺分解活性顯著降低。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之醯胺分解活性之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性(亦即具有醯胺分解活性之蛋白質污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含醯胺分解活性之量低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物且洗出液之滯後部分含有高濃度之醯胺分解活性。在一個特定具體實例中，醯胺分解活性為存在於組成物中的因子XIa活性。在一個較佳具體實例中，陽離子交 換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含醯胺分解活性之量低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有高濃度之醯胺分解活性。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在pH值介 於4.8與5.6之間及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含醯胺分解活性之量低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有高濃度之醯胺分解活性。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH 值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)用電導率低得足以使免疫球蛋白不能自樹脂洗提及pH值介於5.1與5.9之間的緩衝液洗滌結合有免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的樹脂；(c)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含醯胺分解活性之量低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有高濃度之醯胺分解活性。在一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.3。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.2。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.1。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5。在其他具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，該方法包含步驟：(a)使包 含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與pH值為7.8±0.4及電導率為至少20 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含醯胺分解活性之量低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有高濃度之醯胺分解活性。在一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.3。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.2。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.1。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8。在其他具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.0、7.1、7.2、7.36、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

一般而言，本文提供之方法所用的起始物質包括包含IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性的任何血漿分離份或組成物。因而，在一個具體實例中，根據此項技術中已知的任 一種純化方案對血漿進行部分或完全份化。在一個特定具體實例中，血漿經份化產生分離份I沈澱物、分離份II沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、或其經修飾之沈澱物，其可用作本文提供之方法的起始物質。

在一個較佳具體實例中，藉由一或多個乙醇沈澱步驟份化血漿。乙醇沈澱步驟可用於使所要免疫球蛋白自溶液沈澱，同時使至少一種非免疫球蛋白滯留於上層清液中，或使至少一種非免疫球蛋白自溶液沈澱，同時使所要免疫球蛋白滯留於上層清液中。以此方式份化免疫球蛋白的方法在此項技術中係熟知的。例示性乙醇沈澱物包括(但不限於)分離份I沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B及其經修飾之沈澱物。在一個特別較佳具體實例中，存在於冷貧血漿中的免疫球蛋白藉由四步乙醇法增濃，包含分離份I+II+III沈澱步驟、A沈澱步驟、B沈澱步驟及分離份II沈澱步驟。

在一個具體實例中，本文提供之降低醯胺分解活性之方法所用的起始物質係藉由乙醇份化彙集之人類血漿(例如冷貧血漿)來製備。在一個特定具體實例中，乙醇份化包括冷貧血漿之分離份I+II+III沈澱、懸浮之分離份I+II+III沈澱物之分離份A沈澱、懸浮之分離份A沈澱物之分離份B沈澱、及分離份A上層清液之分離份II沈澱，如 下文所述。在另一個特定具體實例中，乙醇份化包括冷貧血漿之分離份I沈澱、分離份I上層清液之分離份II+III沈澱、及懸浮之分離份II+III沈澱物之分離份II沈澱。

如本文所證明，本文提供之方法在應用於大規模製造程序時保留其有利特徵。就製備IgG免疫球蛋白組成物而言，大規模製造係指自至少100 L彙集血漿(例如冷貧血漿)起始物質中增濃免疫球蛋白的製程。一般而言，大規模免疫球蛋白製造製程每批次可份化100 L與20,000 L之間的彙集血漿。在某些具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少100 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在另一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少500 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在另一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少1,000 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在另一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少5,000 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在又一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少10,000 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。

一般而言，涵蓋包含上述裝載條件、洗滌條件與洗提條件之所有組合的方法。此外，涵蓋包含特定層析條件之所有組合的方法以及用於定義及收集洗出液之前導部分之所有可能方案，如下文所述。

1.陽離子交換洗出液之前導部分及滯後部分

在一個態樣中，本發明提供藉由收集陽離子交換洗出 液之前導部分來降低醯胺分解活性(且特別是存在於免疫球蛋白製劑中之FXIa雜質所引起之醯胺分解活性)的方法。有利的是，本文顯示，藉由陽離子交換層析步驟之單步洗提所形成的洗出液之前導部分含有大部分所要免疫球蛋白內容物，而洗出液之滯後部分含有大部分非所需醯胺分解活性。因為洗提之免疫球蛋白及醯胺分解活性無法完全分離，所以必須確定洗出液之前導部分與滯後部分之間的分配。有兩個主要考慮因素可決定何時作出此分配，亦即：(i)取決於如何定義洗出液之前導部分及滯後部分，前導部分中將回收較多或較少的醯胺分解活性，亦即當洗出液之前導部分被定義為總洗出液之較小部分時，可自免疫球蛋白內容物分離較大部分之醯胺分解活性，反之亦然；及(ii)取決於如何定義洗出液之前導部分及滯後部分，前導部分中將存在較大或較小的免疫球蛋白回收率，亦即當洗出液之前導部分被定義為總洗出液之較小部分時，實現較低免疫球蛋白產率，反之亦然。

因此，熟習此項技術者將根據其個別需要，就在何處劃分陽離子交換洗出液之前導部分與滯後部分之間的邊界作出決定。舉例而言，當為了研究或專門治療目的而準備小規模純化時，熟習此項技術者可藉由收集洗出液之較小前導部分同時犧牲最終免疫球蛋白產率來最佳化該方法之分離能力。相比之下，當進行大規模製造(例如處理超過500 L冷貧血漿)時，機會成本可能要求收集洗出液之較大前導部分以提高免疫球蛋白回收率，但以組成物之醯胺分 解活性之較小降低為代價。

在不同具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分可藉由不同特徵定義，包括(但不限於)洗出液之pH值、洗出液之蛋白質產率(例如表示為結合至樹脂之蛋白質百分比)、蛋白質濃度(例如由光學密度所測定)、洗出液體積及其類似特徵。

a.洗出液之pH值

如本文提供之實施例所證明，陽離子交換洗提步驟開始之標誌為來自管柱之溶液之pH值下降至pH值低於5.0，儘管洗提緩衝液的pH值(通常>7.0)高於管柱裝載及洗滌步驟的pH值(通常為5.0-6.0)。pH值之此降低對應於具有低醯胺分解活性及因子XIa含量之IgG免疫球蛋白組成物之洗提(分別參見例如表4及表11)。在洗提之後期，來自管柱之溶液之pH值急劇上升至大於6.0-8.0。pH值之此移位與洗出液之醯胺分解活性及因子XIa含量的顯著增加同時發生(分別參見例如表4及表11)。因此，雖然一步洗提係藉由使用單一高pH值洗提緩衝液(通常大於7.0)來執行，但洗提特徵類似於首先自管柱洗提IgG免疫球蛋白、隨後洗提伴隨醯胺分解活性(例如因子XI及/或因子XIa)之兩步洗提。因此，在某些具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分係根據洗出液在管柱出口處之pH值來定義。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之醯胺分解活性之量的方法，該方法 包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性(亦即具有醯胺分解活性之蛋白質污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由pH值不超過7.0之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.5之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.0之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.5之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.0之洗出液部分組成。在其他具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下pH值之洗出液部分組成：不超過7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或小於5.0。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過 6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由pH值不超過7.0之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.5之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.0之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.5之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.0之洗出液部分組成。在其他具體實例中，在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下pH值之洗出液部分組成：不超過7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或小於5.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

b.洗出液之吸光度

在又一個特別適合大規模製造免疫球蛋白組成物的具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分係根據自陽離子交換管柱洗提之免疫球蛋白濃度來定義。舉例而言，在大規模製造期間，免疫球蛋白組成物可以足夠高的蛋白質負荷(例如每毫升樹脂>80 mg蛋白質)裝載於陽離子交換樹脂上，使得洗出液峰經高度濃縮。在此等情況下，洗出液之前導部分可定義為先於OD₂₈₀降至臨限值以下洗提的洗出液之洗提份。以此方式，可以大致相同產率將免疫球蛋白自一個製劑再生式回收至下一個製劑中，不考慮製造輪次之間的微小差異。如實施例9中所證明，將此收集方案應用於大規模製造過程可以高產率回收其中TGA及醯胺分解活性水準顯著降低的IgG免疫球蛋白組成物。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之醯胺分解活性之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性(亦即具有醯胺分解活性之蛋白質污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少0.5 AU之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.0 AU的洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.5 AU的洗出液部分組成。在 另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少2.0 AU的洗出液部分組成。在其他特定具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下OD₂₈₀之洗出液部分組成：至少0.1 AU、0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少2.0 AU之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.5 AU的洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.0 AU的洗出液部分組 成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少0.5 AU的洗出液部分組成。在其他特定具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下OD₂₈₀之洗出液部分組成：至少0.1 AU、0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

c.總洗出液之百分比

在又一個特別適合大規模製造免疫球蛋白組成物的具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分被定義為洗出液之總蛋白質含量之百分比(例如以體積或總蛋白質計)。藉由預先確定以前導部分收集之洗出液之百分比，可嚴格控制免疫球蛋白之回收率。用於定義洗出液之前導部分及滯後部分之此方法特別適用於需要最少步驟產率之製造製程及根據免疫球蛋白產率降低之成本與製造具有醯胺分解活性及因子XI及/或因子XIa含量降低之組成物之收益的權衡來作出決定的製程。以此方式，可以大致相同產率將免疫球蛋白自一個製劑再生式回收至下一個製劑中，不考慮 製造輪次之間的微小差異。如實施例8中所證明，應用此收集方案可以高產率回收其中TGA及醯胺分解活性水準顯著降低的IgG免疫球蛋白組成物。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之醯胺分解活性之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性(亦即具有醯胺分解活性之蛋白質污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過80%之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至75%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之75%至80%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔總洗出液之至多70%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗 出液之50%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至65%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之65%至70%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔總洗出液之至多60%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至60%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至55%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之55%至60%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出 液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過80%之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至75%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之75%%至80%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔總洗出液之至多70%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至65%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之65%%至70%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔總洗出液之至多60%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至60%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗 出液之50%至55%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之55%至60%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

d.總洗出液之體積

在另一個特別適合大規模製造免疫球蛋白組成物的具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分被定義為洗出液峰之體積與陽離子交換管柱之尺寸(例如設定管柱體積數目)之比率。藉由預先確定以前導部分收集之洗出液體積，免疫球蛋白之回收率可加以嚴格控制且可再現。用於定義洗出液之前導部分及滯後部分之此方法特別適用於需要最少步驟產率之製造製程及根據免疫球蛋白產率降低之成本與製造具有醯胺分解活性及因子XI及/或因子XIa含量降低之組成物之收益的權衡來作出決定的製程。以此方式，可以大致相同產率將免疫球蛋白自一個製劑再生式回收至下一個製劑中，不考慮製造輪次之間的微小差異。如實施例11至13中所證明，應用此收集方案可以高產率回收其中TGA及醯胺分解活性水準顯著降低的IgG免疫球蛋白組成 物。

在一個具體實例中，前導部分之開始係藉由基線吸光度定義。在一些具體實例中，洗出液峰之吸光度一旦跨越第一臨限值，即開始收集前導部分。在一個具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少2.0 AU時，開始收集前導部分。在一個特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少1.5 AU時，開始收集前導部分。在另一個特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少1.0 AU時，開始收集前導部分。在另一個特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少0.5 AU時，開始收集前導部分。在其他特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少0.1 AU、0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU時，開始收集前導部分。

在一些具體實例中，一旦開始收集前導部分，即先收集預定數目個管柱體積，隨後切換為收集(或處置)洗出液之滯後部分。在一個具體實例中，以前導部分收集不超過5個管柱體積(CV)之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過4個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過3個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過2.7個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過2.5個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過2個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不 超過1個CV之洗出液。在其他具體實例中，以前導部分收集不超過0.5個CV、0.6個CV、0.7個CV、0.8個CV、0.9個CV、1.0個CV、1.1個CV、1.2個CV、1.3個CV、1.4個CV、1.5個CV、1.6個CV、1.7個CV、1.8個CV、1.9個CV、2.0個CV、2.1個CV、2.2個CV、2.3個CV、2.4個CV、2.5個CV、2.6個CV、2.7個CV、2.8個CV、2.9個CV、3.0個CV、3.1個CV、3.2個CV、3.3個CV、3.4個CV、3.5個CV、3.6個CV、3.7個CV、3.8個CV、3.9個CV、4.0個CV、4.1個CV、4.2個CV、4.3個CV、4.4個CV、4.5個CV、4.6個CV、4.7個CV、4.8個CV、4.9個CV、5.0個CV、5.1個CV、5.2個CV、5.3個CV、5.4個CV、5.5個CV、5.6個CV、5.7個CV、5.8個CV、5.9個CV、6.0個CV或大於6.0個管柱體積之洗出液。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之醯胺分解活性之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性(亦即具有醯胺分解活性之蛋白質污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過4個管柱體積(CV)之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前 導部分為2.0個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.5個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至4.0個CV之總洗出液。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.5個CV之總洗出液。在其他具體實例中，洗出液之前導部分為0.5個CV、0.6個CV、0.7個CV、0.8個CV、0.9個CV、1.0個CV、1.1個CV、1.2個CV、1.3個CV、1.4個CV、1.5個CV、1.6個CV、1.7個CV、1.8個CV、1.9個CV、2.0個CV、2.1個CV、2.2個CV、2.3個CV、2.4個CV、2.5個CV、2.6個CV、2.7個CV、2.8個CV、2.9個CV、3.0個CV、3.1個CV、3.2個CV、3.3個CV、3.4個CV、3.5個CV、3.6個CV、3.7個CV、3.8個CV、3.9個CV、4.0個CV、4.1個CV、4.2個CV、4.3個CV、4.4個CV、4.5個CV、4.6個CV、4.7個CV、4.8個CV、4.9個CV、5.0個CV、5.1個CV、5.2個CV、5.3個CV、5.4個CV、5.5個CV、5.6個CV、5.7個CV、5.8個CV、5.9個CV或6.0個CV之總洗出液。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物 與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過4個管柱體積(CV)之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.5個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至4.0個CV之總洗出液。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.5個CV之總洗出液。在其他具體實例中，洗出液之前導部分為0.5個CV、0.6個CV、0.7個CV、0.8個CV、0.9個CV、1.0個CV、1.1個CV、1.2個CV、1.3個CV、1.4個CV、1.5個CV、1.6個CV、1.7個CV、1.8個CV、1.9個CV、2.0個CV、2.1個CV、2.2個CV、2.3個CV、2.4個CV、2.5個CV、2.6個CV、2.7個CV、2.8個CV、2.9個CV、3.0個CV、3.1個CV、3.2個CV、3.3個CV、3.4個CV、3.5個CV、3.6個CV、3.7個CV、3.8個CV、3.9個CV、4.0個CV、4.1個CV、4.2個CV、4.3個CV、4.4個CV、4.5 個CV、4.6個CV、4.7個CV、4.8個CV、4.9個CV、5.0個CV、5.1個CV、5.2個CV、5.3個CV、5.4個CV、5.5個CV、5.6個CV、5.7個CV、5.8個CV、5.9個CV或6.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

IV.降低抗補體活性(ACA)

在一個態樣中，本發明提供降低血漿來源IgG免疫球蛋白組成物之抗補體活性(ACA)水準的層析方法。同樣，本發明亦提供根據本文提供之方法製備的含有低水準之抗補體活性(ACA)的血漿來源IgG免疫球蛋白組成物。有利的是，本文所述方法提供安全特徵改良的血漿來源IgG免疫球蛋白組成物。特定而言，此等方法所提供之組成物引起與抗補體活性有關之不良反應的可能性低於目前製造之IgG免疫球蛋白組成物(參見例如Buchacher A.等人，Vox Sang.2010年4月；98(3 Pt 1)：e209-18，該文獻之內容係以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的)。

A.份化方法

本發明部分地基於以下發現：存在於血漿來源免疫球蛋白組成物中的抗補體活性(ACA)大部分在由一步洗提 產生之洗出液之滯後部分中自陽離子交換樹脂洗提，而洗提份中所含之免疫球蛋白大部分在該洗出液之前導部分中洗提。因此，藉由分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，可顯著降低所得免疫球蛋白製劑之抗補體活性。特定而言，本文顯示，在根據本文提供之方法製備的免疫球蛋白組成物中，ACA水準顯著降低。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及抗補體活性(亦即具有抗補體活性之污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及ACA執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含其中ACA之量低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有高濃度之ACA活性。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過 11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含其中ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有相對於IgG免疫球蛋白濃度較高濃度之ACA。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。

在一個特定具體實例中，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在pH值介於4.8與5.6之間及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部 分，其中洗出液之前導部分包含ACA之量對IgG免疫球蛋白之量的比率低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有相對於IgG免疫球蛋白之量較高量之ACA。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)用電導率低得足以使免疫球蛋白不能自樹脂洗提及pH值介於5.1與5.9之間的緩衝液洗滌結合有免疫球蛋白及ACA的樹脂；(c)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的 洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含其中ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有相對於IgG免疫球蛋白濃度較高濃度之ACA。在一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.3。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.2。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.1。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5。在其他具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與pH值為7.8±0.4及電導率為至少20 mS/cm的洗提緩衝液接觸形 成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分包含其中ACA濃度對IgG免疫球蛋白濃度之比率低於起始組成物的IgG免疫球蛋白組成物，且洗出液之滯後部分含有相對於IgG免疫球蛋白濃度較高濃度之ACA。在一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.3。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.2。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.1。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8。在其他具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.0、7.1、7.2、7.36、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

一般而言，本文提供之方法所用的起始物質包括包含IgG免疫球蛋白及抗補體活性的任何血漿分離份或組成物。因而，在一個具體實例中，根據此項技術中已知的任一種純化方案將血漿部分地或完全地份化。在一個特定具體實例中，血漿經份化而產生分離份I沈澱物、分離份II沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、或其經修飾之沈澱物，其可用作本文提供之方法 的起始物質。

在一個較佳具體實例中，藉由一或多個乙醇沈澱步驟份化血漿。乙醇沈澱步驟可用於使所要免疫球蛋白自溶液沈澱，同時使至少一種非免疫球蛋白滯留於上層清液中，或使至少一種非免疫球蛋白自溶液沈澱，同時使所要免疫球蛋白滯留於上層清液中。以此方式份化免疫球蛋白的方法在此項技術中已熟知。例示性乙醇沈澱物包括(但不限於)分離份I沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B及其經修飾之沈澱物。在一個特別較佳具體實例中，存在於冷貧血漿中的免疫球蛋白藉由四步乙醇法增濃，包含分離份I+II+III沈澱步驟、A沈澱步驟、B沈澱步驟及分離份II沈澱步驟。

如本文所證明，本文提供之方法在應用於大規模製造程序時保留其有利特徵。就製備IgG免疫球蛋白組成物而言，大規模製造係指自至少100 L彙集血漿(例如冷貧血漿)起始物質中增濃免疫球蛋白的製程。一般而言，大規模免疫球蛋白製造製程每批次可份化100 L與20,000 L之間的彙集血漿。在某些具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少100 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在另一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少500 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在另一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少1,000 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在另一個具體實例中， 大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少5,000 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。在又一個具體實例中，大規模IgG免疫球蛋白製造製程係指份化至少10,000 L彙集血漿(例如冷貧血漿)。

在一個具體實例中，本文提供之降低抗補體活性(ACA)之方法所用的起始物質係藉由乙醇份化彙集之人類血漿(例如冷貧血漿)來製備。在一個特定具體實例中，乙醇份化包括冷貧血漿之分離份I+II+III沈澱、懸浮之分離份I+II+III沈澱物之分離份A沈澱、懸浮之分離份A沈澱物之分離份B沈澱、及分離份A上層清液之分離份II沈澱，如下文所述。在另一個特定具體實例中，乙醇份化包括冷貧血漿之分離份I沈澱、分離份I上層清液之分離份II+III沈澱、及懸浮之分離份II+III沈澱物之分離份II沈澱。

一般而言，涵蓋包含上述裝載條件、洗滌條件與洗提條件之所有組合的方法。此外，涵蓋包含特定層析條件之所有組合的方法以及用於定義及收集洗出液之前導部分之所有可能方案，如下文所述。

1.陽離子交換洗出液之前導部分及滯後部分

在一個態樣中，本發明提供藉由收集陽離子交換洗出液之前導部分來降低存在於免疫球蛋白製劑中之抗補體活性(ACA)的方法。有利的是，本文顯示，藉由陽離子交換層析步驟之單步洗提所形成的洗出液之前導部分含有大部分所要免疫球蛋白內容物，而洗出液之滯後部分含有大部分的非所需ACA。因為洗提之免疫球蛋白與ACA無法完 全分離，所以必須確定洗出液之前導部分與滯後部分之間的分配。有兩個主要考慮因素可決定何時作出此分配，亦即：(i)取決於洗出液之前導部分及滯後部分如何定義，前導部分中將回收較多或較少的ACA，亦即當洗出液之前導部分被定義為總洗出液之較小部分時，可自免疫球蛋白內容物中分離較大部分之ACA，反之亦然；及(ii)取決於洗出液之前導部分及滯後部分如何定義，前導部分中將存在較大或較小的免疫球蛋白回收率，亦即當洗出液之前導部分被定義為總洗出液之較小部分時，實現較低免疫球蛋白產率，反之亦然。

因此，熟習此項技術者將根據其個別需要，就在何處劃分陽離子交換洗出液之前導部分與滯後部分之間的邊界作出決定。舉例而言，當為了研究或專門治療目的而準備小規模純化時，熟習此項技術者可藉由收集洗出液之較小前導部分同時犧牲最終免疫球蛋白產率來最佳化該方法之分離能力。相比之下，當進行大規模製造(例如處理超過500 L冷貧血漿)時，機會成本可能要求收集洗出液之較大前導部分以提高免疫球蛋白回收率，但以組成物之ACA之較小降低為代價。

在不同具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分可藉由不同特徵定義，包括(但不限於)洗出液之pH值、洗出液之蛋白質產率(例如表示為結合至樹脂之蛋白質百分比)、蛋白質濃度(例如由光學密度所測定)、洗出液體積及其類似特徵。

a.洗出液之pH值

如本文提供之實施例所證明，陽離子交換洗提步驟開始之標誌為來自管柱之溶液之pH值下降至pH值低於5.0，儘管洗提緩衝液的pH值(通常>7.0)高於管柱裝載及洗滌步驟之pH值(通常為5.0-6.0)。pH值之此降低對應於具有低ACA之IgG免疫球蛋白組成物之洗提(參見例如表3、表11及表15)。在洗提之後期，來自管柱之溶液之pH值急劇上升至大於6.0-8.0。pH值之此移位與洗出液之ACA含量的顯著增加同時發生(參見例如表3、表11及表15)。因此，雖然一步洗提係藉由使用單一高pH值洗提緩衝液(通常大於7.0)來執行，但洗提特徵類似於其中IgG免疫球蛋白首先自管柱洗提、隨後洗提伴隨抗補體活性的兩步洗提。因此，在某些具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分係根據洗出液在管柱出口處之pH值來定義。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及抗補體活性(亦即具有抗補體活性之污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有IgG免疫球蛋白及ACA之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及ACA執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由pH值不超過7.0之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.5之洗 出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.0之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.5之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.0之洗出液部分組成。在其他具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下pH值之洗出液部分組成：不超過7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或小於5.0。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由pH值不超過7.0之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.5之洗出液部分組成。在另一個 特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過6.0之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.5之洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由pH值不超過5.0之洗出液部分組成。在其他具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下pH值之洗出液部分組成：不超過7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或小於5.0。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

b.洗出液之吸光度

在又一個特別適合大規模製造免疫球蛋白組成物的具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分係根據自陽離子交換管柱洗提之免疫球蛋白濃度來定義。舉例而言，在大 規模製造期間，免疫球蛋白組成物可以足夠高的蛋白質負荷(例如每毫升樹脂>80 mg蛋白質)裝載於陽離子交換樹脂上，使得洗出液峰經高度濃縮。在此等情況下，洗出液之前導部分可定義為先於OD₂₈₀降至臨限值以下洗提的洗出液之洗提份。以此方式，可以大致相同產率將免疫球蛋白自一個製劑再生式回收至下一個製劑中，不考慮製造輪次之間的微小差異。如實施例9中所證明，將此收集方案應用於大規模製造過程可以高產率回收其中抗補體活性(ACA)水準顯著降低的IgG免疫球蛋白組成物。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及抗補體活性(亦即具有抗補體活性之污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及ACA執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少0.5 AU之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.0 AU的洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.5 AU的洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少2.0 AU的洗出液部分組成。在其他特定具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下OD₂₈₀之洗出液部分組成：至少0.1 AU、 0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少0.5 AU之洗出液部分組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.0 AU的洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少1.5 AU的洗出液部分組成。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分係由OD₂₈₀為至少2.0 AU的洗出液部分組成。在其他特定具體實例中，洗出液之前導部分係由具有以下OD₂₈₀之洗出液部分組成：至少0.1 AU、0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

c.總洗出液之百分比

在又一個特別適合大規模製造免疫球蛋白組成物的具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分被定義為洗出液之總蛋白質含量之百分比(例如以體積或總蛋白質計)。藉由預先確定以前導部分收集之洗出液百分比，可嚴格控制免疫球蛋白之回收率。用於定義洗出液之前導部分及滯後部分之此方法特別適用於需要最少步驟產率之製造製程及根據免疫球蛋白產率降低之成本與製造抗補體活性(ACA)水準降低之組成物之收益的權衡來作出決定的製 程。以此方式，可以大致相同產率將免疫球蛋白自一個製劑再生式回收至下一個製劑中，不考慮製造輪次之間的微小差異。如實施例8中所證明，應用此收集方案可以高產率回收其中抗補體活性水準顯著降低的IgG免疫球蛋白組成物。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及抗補體活性(亦即具有抗補體活性之污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b)視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及ACA執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過80%之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至75%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之75%%至80%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之70%。在一個特定具體實例中， 洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至65%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之65%至70%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之60%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至60%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至55%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之55%至60%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之抗補體活性(ACA)的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換 樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過80%之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至75%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之75%%至80%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之70%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至65%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之65%至70%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之60%。在一 個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至60%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至55%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之55%至60%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

d.總洗出液之體積

在另一個特別適合大規模製造免疫球蛋白組成物的具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分被定義為洗出液峰之體積與陽離子交換管柱之尺寸(例如設定數目之管柱體積)之比率。藉由預先確定以前導部分收集之洗出液體積，免疫球蛋白之回收率可加以嚴格控制且可再現。用於 定義洗出液之前導部分及滯後部分之此方法特別適用於需要最少步驟產率之製造製程及根據免疫球蛋白產率降低之成本與製造抗補體活性(ACA)水準降低之組成物之收益的權衡來作出決定的製程。以此方式，可以大致相同產率將免疫球蛋白自一個製劑再生式回收至下一個製劑中，不考慮製造輪次之間的微小差異。如實施例11至13中所證明，應用此收集方案可以高產率回收其中抗補體活性水準降低的IgG免疫球蛋白組成物。

在一個具體實例中，前導部分之開始係藉由基線吸光度定義。在一些具體實例中，洗出液峰之吸光度一旦跨越第一臨限值時，即開始收集前導部分。在一個具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少0.5 AU時，開始收集前導部分。在一個特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少1.0 AU時，開始收集前導部分。在另一個特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少1.5 AU時，開始收集前導部分。在另一個特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少2.0 AU時，開始收集前導部分。在其他特定具體實例中，當洗出液之OD₂₈₀達到至少0.1 AU、0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU時，開始收集前導部分。

在一些具體實例中，一旦開始收集前導部分，即先收集預定數目個管柱體積，隨後切換為收集(或處置)洗出液之滯後部分。在一個具體實例中，以前導部分收集不超 過5個管柱體積(CV)之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過4個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過3個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過2.7個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過2.5個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過2個CV之洗出液。在另一個具體實例中，以前導部分收集不超過1個CV之洗出液。在其他具體實例中，以前導部分收集不超過0.5個CV、0.6個CV、0.7個CV、0.8個CV、0.9個CV、1.0個CV、1.1個CV、1.2個CV、1.3個CV、1.4個CV、1.5個CV、1.6個CV、1.7個CV、1.8個CV、1.9個CV、2.0個CV、2.1個CV、2.2個CV、2.3個CV、2.4個CV、2.5個CV、2.6個CV、2.7個CV、2.8個CV、2.9個CV、3.0個CV、3.1個CV、3.2個CV、3.3個CV、3.4個CV、3.5個CV、3.6個CV、3.7個CV、3.8個CV、3.9個CV、4.0個CV、4.1個CV、4.2個CV、4.3個CV、4.4個CV、4.5個CV、4.6個CV、4.7個CV、4.8個CV、4.9個CV、5.0個CV、5.1個CV、5.2個CV、5.3個CV、5.4個CV、5.5個CV、5.6個CV、5.7個CV、5.8個CV、5.9個CV、6.0個CV或大於6.0個管柱體積之洗出液。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之醯胺分解活性之量的方法，該方法包含步驟：(a)使IgG免疫球蛋白及抗補體活性(亦即具有抗補體活性之污染物)結合於陽離子交換樹脂上；(b) 視情況用洗滌緩衝液洗滌結合有蛋白質之陽離子交換樹脂以移除鬆散締合之污染物；(c)對IgG免疫球蛋白及ACA執行單步洗提；及(d)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過4個管柱體積(CV)之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.5個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至4.0個CV之總洗出液。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.5個CV之總洗出液。在其他具體實例中，洗出液之前導部分為0.5個CV、0.6個CV、0.7個CV、0.8個CV、0.9個CV、1.0個CV、1.1個CV、1.2個CV、1.3個CV、1.4個CV、1.5個CV、1.6個CV、1.7個CV、1.8個CV、1.9個CV、2.0個CV、2.1個CV、2.2個CV、2.3個CV、2.4個CV、2.5個CV、2.6個CV、2.7個CV、2.8個CV、2.9個CV、3.0個CV、3.1個CV、3.2個CV、3.3個CV、3.4個CV、3.5個CV、3.6個CV、3.7個CV、3.8個CV、3.9個CV、4.0個CV、4.1個CV、4.2個CV、4.3個CV、4.4個CV、4.5個CV、4.6個CV、4.7個CV、4.8個CV、4.9個CV、5.0個CV、5.1個CV、5.2個CV、5.3個CV、5.4個CV、5.5個CV、5.6個CV、5.7個CV、5.8個CV、5.9個CV或6.0個CV之總洗出液。在 一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)之量的方法，該方法包含步驟：(a)使包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使免疫球蛋白及至少一部分第一種量之ACA結合至陽離子交換樹脂；(b)藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸形成洗出液來使免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(c)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分，其中洗出液之前導部分係由不超過4個管柱體積(CV)之總洗出液組成。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.0個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至3.5個CV之總洗出液。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.0個CV至4.0個CV之總洗出液。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分為2.5個CV至3.5個CV之總洗出液。在其他具體實例中，洗出液之前導部分為0.5個CV、0.6個CV、0.7個CV、0.8個CV、0.9個CV、1.0個CV、1.1 個CV、1.2個CV、1.3個CV、1.4個CV、1.5個CV、1.6個CV、1.7個CV、1.8個CV、1.9個CV、2.0個CV、2.1個CV、2.2個CV、2.3個CV、2.4個CV、2.5個CV、2.6個CV、2.7個CV、2.8個CV、2.9個CV、3.0個CV、3.1個CV、3.2個CV、3.3個CV、3.4個CV、3.5個CV、3.6個CV、3.7個CV、3.8個CV、3.9個CV、4.0個CV、4.1個CV、4.2個CV、4.3個CV、4.4個CV、4.5個CV、4.6個CV、4.7個CV、4.8個CV、4.9個CV、5.0個CV、5.1個CV、5.2個CV、5.3個CV、5.4個CV、5.5個CV、5.6個CV、5.7個CV、5.8個CV、5.9個CV或6.0個CV之總洗出液。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

V.製備冷貧血漿

用於製備經濃縮之IgG組成物的起始物質通常由回收 之血漿(亦即已自全血活體外分離的血漿)或源血漿(亦即經由血漿清除術收集的血漿)組成。純化製程典型地以解凍先前經冷凍之彙集血漿開始，出於安全及品質之考慮，該彙集血漿已加以檢定。解凍典型地在不高於6℃、較佳介於-1℃與6℃之間的溫度下進行。冷凍血漿在低溫下完全解凍之後，在冷卻下(例如

6℃，較佳為2.5±3.5℃)執行離心，以自液體上層清液中分離固體冷沈澱物。或者，可藉由過濾而非離心來執行分離步驟。接著在下一步中處理已藉由離心自剛剛解凍之血漿移除冷不溶性蛋白之後的液體上層清液(亦稱為「冷貧血漿」)。此時可採取各種其他步驟以便分離因子VIII抑制劑旁路活性(FEIBA)、因子IX複合物、因子VII濃縮物或抗凝血酶III複合物。舉例而言，在對含有免疫球蛋白之溶液進一步增濃之前，可吸附冷貧血漿中的一或多種血液因子。

VI.份化冷貧血漿

為了製備IgG免疫球蛋白組成物，通常對冷貧血漿進行份化，以將所要免疫球蛋白與存在的其他蛋白質及雜質分離。此項技術中已知多種用於份化血漿的方法，包括醇(例如乙醇)份化、聚合物(例如PEG)沈澱、脂肪酸及酯(例如辛酸酯)沈澱、層析及其類似方法。此等份化方法之實例包括(但不限於)科恩份化法(J.Am.Chem.Soc.,1946,68(3)：459-475；J.Am.Chem.Soc.72：465-474(1950))、Oncley份化法(J.Am.Chem.Soc.,1949,71(2)：541-550)、Deutsch純化法(J.Biol.Chem.164：109-118)、Hoppe純化 法(Munch Med Wochenschr 1967(34)：1749-1752)、Falksveden純化法(Swedish專利第348942號)、Falksveden及Lundblad純化法(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)、Lebing純化法(Vox Sang 2003(84)：193-201)、Tanaka純化法(Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30))、Teschner純化法(Vox Sang,2007(92)：42-55)、Nitschmann份化法(Helv.Chim.Acta 37：866-873)、Kistler/Nitschmann份化法(Vox Sang.7：414-424(1962))、Barundern純化法(Vox Sang.7：157-74(1962))、Koblet純化法(Vox Sang.13：93-102(1967))、美國專利第5,122,373號或第5,177,194號中所揭示之純化程序、其經修改之程序、及此項技術中已知的類似或等效純化程序，該等文獻之揭示內容以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。

一般而言，本文提供之方法適合上文所述之任何純化方案。因而，在一個具體實例中，根據上述任一種純化方案將冷貧血漿部分或完全份化。在一個特定具體實例中，根據上述教示內容中所揭示之一或多個份化步驟對冷貧血漿進行份化，產生份化中間物組成物。在一個更特定具體實例中，冷貧血漿經份化而產生分離份I沈澱物、分離份II沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、或其經修飾之沈澱物。

在一個較佳具體實例中，藉由一或多個乙醇沈澱步驟份化冷貧血漿。乙醇沈澱步驟可用於使所要免疫球蛋白自 溶液沈澱出來，同時使至少一種非免疫球蛋白蛋白質滯留於上層清液中，或使至少一種非免疫球蛋白蛋白質自溶液沈澱出來，同時使所要免疫球蛋白滯留於上層清液中。以此方式份化免疫球蛋白的方法在此項技術中已熟知。例示性乙醇沈澱物包括(但不限於)分離份I沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B及其經修飾之沈澱物。在一個特別較佳具體實例中，存在於冷貧血漿中的免疫球蛋白藉由四步乙醇法增濃，包含分離份I+II+III沈澱步驟、A沈澱步驟、B沈澱步驟及分離份II沈澱步驟，如下文所述。

VII.例示性份化方案

雖然熟習此項技術者將瞭解到可使用許多不同起始物質(例如不同血漿分離份)執行本文提供之降低醯胺分解活性(例如因子XI及/或因子XIa含量)及/或抗補體活性(ACA)的方法，但下文提供例示性份化方案。例示性份化方案使用四個乙醇沈澱反應來製備分離份II沈澱物，分離份II沈澱物可再懸浮且隨後用作本文提供之方法的起始物質。所得增濃的IgG免疫球蛋白組成物可藉由下游處理，使用諸如以下技術進一步增濃：陰離子交換層析、超濾/滲濾、病毒滅活及/或移除步驟，及此項技術中熟知的其他增濃步驟。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種製造IgG免疫球蛋白組成物的方法，該方法包含步驟：(a)提供冷 貧血漿分離份；(b)藉由將乙醇與冷貧血漿分離份以17%與23%(v/v)之間的最終濃度，在6.5與7.3之間的pH值及-8℃至-2℃之間的溫度下混合，以第一沈澱反應使免疫球蛋白自冷貧血漿分離份中沈澱，從而形成第一沈澱物及第一上層清液；(c)使存在於第一沈澱物中的免疫球蛋白再懸浮，從而形成第一懸浮液；(d)藉由將乙醇與冷貧血漿分離份以17%與23%(v/v)之間的最終濃度，在6.8與7.6之間的pH值及-8℃至-2℃之間的溫度下混合，以第二沈澱反應使免疫球蛋白自第一懸浮液中沈澱，從而形成第二沈澱物及第二上層清液；(e)使存在於第二沈澱物中的免疫球蛋白再懸浮，從而形成第二懸浮液；(f)藉由將乙醇與冷貧血漿分離份以14%與20%(v/v)之間的最終濃度，在5.0與5.8之間的pH值及-8℃至-2℃之間的溫度下混合，以第三沈澱反應使免疫球蛋白自第二懸浮液中沈澱，從而形成第三沈澱物及第三上層清液；(g)藉由將乙醇與冷貧血漿分離份以22%與28%(v/v)之間的最終濃度，在6.7與7.5之間的pH值及-8℃至-2℃之間的溫度下混合，以第四沈澱反應使免疫球蛋白自第三上層清液中沈澱，從而形成第四沈澱物及第四上層清液；(h)使第四沈澱物再懸浮，以形成第三懸浮液；(i)使第三懸浮液與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11 mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使IgG免疫球蛋白及以下至少一者結合至陽離子交換樹脂：(i)一部分FXI及/或FXIa，及(ii)第一種量之抗補體活性(ACA)；(j) 藉由使陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15 mS/cm的洗提緩衝液接觸以形成包含前導部分及滯後部分的洗出液來使IgG免疫球蛋白自陽離子交換樹脂洗提；及(k)分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分。在一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，第一溶液條件之pH值為5.2。在其他具體實例中，第一溶液條件之pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少20 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少22 mS/cm。在又一個特定具體實例中，洗提緩衝液的電導率為至少25 mS/cm。在一個較佳具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。在一個特定具體實例中，弱陽離子交換樹脂為羧甲基(CM)樹脂。

A.上游份化方案I

在第一例示性上游純化方案中，如下文所述對含有IgG免疫球蛋白的血漿進行醇份化(例如乙醇份化)。在一個具體實例中，第一上游份化方案包括分離份I+II+III沈澱步驟、分離份A沈澱步驟、及先為分離份B沈澱步驟、隨後為分離份II沈澱步驟，從而最終向本文提供之用於降低醯胺分解活性(例如因子XI/XIa)及/或抗補體活性(ACA)的陽離子交換層析方法提供起始物質。

涵蓋含有分離份I+II+III、分離份A、分離份B及分離份II沈澱步驟每一者之沈澱條件(例如乙醇濃度、pH值、溫度、分離技術)之所有組合的方法。此外，涵蓋包含特定沈澱條件之所有組合的方法以及用於定義及收集洗出液之前導部分之所有可能方案，如下文所述。

1.分離份I+II+III沈澱

在一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱係藉由在6.5與7.3之間的pH值下以17%與23%(v/v)之間的最終濃度向冷貧血漿中添加乙醇來形成。接著在-8℃至-2℃下攪拌的同時培育混合物。藉由離心或過濾混合物可將所得分離份I+II+III沈澱物與分離份I+II+III上層清液分離，此通常在冷卻下執行。免疫球蛋白內容物大部分存在於分離份I+II+III沈澱物中，其可再懸浮且可進一步增濃。

在一個特定具體實例中，在分離份I+II+III沈澱步驟中，乙醇之最終濃度為20±3%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為20±2%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為20±1%(v/v)。在又一個具體實例中，乙醇之最終濃度為20%(v/v)。在其他具體實例中，乙醇之最終濃度為17%、18%、19%、20%、21%、22%或23%(v/v)。

在一個特定具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之pH值為6.9±0.4。在另一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之pH值為6.9±0.3。在另一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之pH值為6.9±0.2。在另一個具體實 例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之pH值為6.9±0.1。在又一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之pH值為6.9。在其他具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之pH值為6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。

在一個特定具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之溫度為-5±3℃。在另一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之溫度為-5±2℃。在另一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之溫度為-5±1℃。在又一個具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之溫度為-5℃。在其他具體實例中，分離份I+II+III沈澱步驟中之溫度為-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一個特定具體實例中，藉由添加含有三水合乙酸鈉、冰乙酸及注射用水(pH 4.0)之再懸浮緩衝液及變性乙醇(式SDA-3A)將冷貧血漿調節至pH值為6.9±0.2及醇濃度經計算為20%(v/v)。緩衝液在充分混合下添加有所要量之醇。醇在添加至冷貧血漿中之前冷卻至-15℃或低於-15℃之溫度。向血漿中添加緩衝液及醇，同時將懸浮液槽冷卻至-5±2℃之溫度。完成添加之後，檢驗溶液之pH值且必要時用pH 4.0緩衝液或碳酸氫鈉溶液調節至6.9±0.2。所得分離份I+II+III懸浮液接著離心以使沈澱物與上層清液分離。

2.分離份A沈澱

為進一步增濃IgG含量及純度，在一個具體實例中，使分離份I+II+III沈澱物再懸浮且執行第二沈澱步驟(分離 份A沈澱)。藉由在6.8與7.6之間的pH值下向分離份I+II+III懸浮液中添加乙醇至最終濃度介於17%與23%(v/v)之間來執行分離份A沈澱。接著在-8℃至-2℃下攪拌的同時培育混合物。藉由離心或過濾混合物可將所得分離份A沈澱物與分離份A上層清液分離，此通常在冷卻下執行。免疫球蛋白內容物大部分存在於分離份A沈澱物中，其可再懸浮且可進一步增濃。

在一個特定具體實例中，在分離份A沈澱步驟中，乙醇之最終濃度為20±3%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為20±2%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為20±1%(v/v)。在又一個具體實例中，乙醇之最終濃度為20%(v/v)。在其他具體實例中，乙醇之最終濃度為17%、18%、19%、20%、21%、22%或23%(v/v)。

在一個特定具體實例中，分離份A沈澱步驟中之pH值為7.2±0.4。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之pH值為7.2±0.3。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之pH值為7.2±0.2。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之pH值為7.2±0.1。在又一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之pH值為7.2。在其他具體實例中，分離份A沈澱步驟中之pH值為6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5或7.6。

在一個特定具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5±3℃。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5±2℃。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟 中之溫度為-5±1℃。在又一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5℃。在其他具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一個特定具體實例中，將分離份I+II+III沈澱物懸浮於含有三水合乙酸鈉、冰乙酸及注射用水(pH 4.0)的再懸浮冷緩衝液中且混合。懸浮液用WFI稀釋以達成1.0±0.3%(w/v)之計算蛋白質濃度。連續攪拌直至懸浮液均勻。溶液用緩衝液(pH 4.0)或用0.25 M磷酸二鈉調節至pH值為7.2±0.2且達成20%(v/v)之計算醇濃度。醇在添加至溶液中之前冷卻至-15℃或低於-15℃之溫度。在將槽冷卻至-5±2℃的同時添加冷醇。添加完成之後，檢驗懸浮液之pH值且必要時調節至7.2±0.2。接著過濾所形成的沈澱物(稱為分離份A沈澱物)，以使沈澱物與上層清液分離。

3.分離份B沈澱

為進一步增濃IgG含量及純度，在一個具體實例中，使分離份A沈澱物再懸浮且執行第三沈澱步驟(分離份B沈澱)。藉由在5.0與5.8之間的pH值下向分離份A懸浮液中添加乙醇直至最終濃度介於14%與20%(v/v)之間來執行分離份B沈澱。接著在-8℃至-2℃下攪拌的同時培育混合物。藉由離心或過濾混合物可將所得分離份B沈澱物與分離份B上層清液分離，此通常在冷卻下執行。免疫球蛋白內容物大部分存在於分離份B上層清液中，此可回收且可進一步增濃。

在一個特定具體實例中，在分離份B沈澱步驟中，乙醇之最終濃度為17±3%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為17±2%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為17±1%(v/v)。在又一個具體實例中，乙醇之最終濃度為17%(v/v)。在其他具體實例中，乙醇之最終濃度為14%、15%、16%、17%、18%、19%或20%(v/v)。

在一個特定具體實例中，分離份B沈澱步驟中之pH值為5.4±0.4。在另一個具體實例中，分離份B沈澱步驟中之pH值為5.4±0.3。在另一個具體實例中，分離份B沈澱步驟中之pH值為5.4±0.2。在另一個具體實例中，分離份B沈澱步驟中之pH值為5.4±0.1。在又一個具體實例中，分離份B沈澱步驟中之pH值為5.4。在其他具體實例中，分離份B沈澱步驟中之pH值為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7或5.8。

在一個特定具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5±3℃。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5±2℃。在另一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5±1℃。在又一個具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-5℃。在其他具體實例中，分離份A沈澱步驟中之溫度為-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一個特定具體實例中，將分離份A沈澱物懸浮於冷的注射用水(WFI)中且攪拌至少一小時。當沈澱物充分懸浮時，添加含有乙酸鈉的緩衝液。連續攪拌直至懸浮液均 勻。用pH 4.0緩衝液(109 g/L三水合乙酸鈉、240 g/L冰乙酸及WFI)或0.25 M磷酸二鈉將pH值調節至5.4±0.2。懸浮液用冷WFI稀釋，經計算可達成1.2±0.3%(w/v)之蛋白質濃度。連續攪拌直至懸浮液均勻。藉由添加預冷卻至-15℃或低於-15℃的醇來使醇含量達到17%(v/v)之計算濃度。在將槽冷卻至-5±2℃的同時添加冷醇。必要時，用pH 4.0緩衝液或0.25 M磷酸二鈉將pH值再調節至5.4±0.2。藉由使用深度過濾器過濾來分離所形成的沈澱物，即分離份B沈澱物。回收分離份B濾液(亦即上層清液)用於進一步增濃。

B.上游份化方案II

在第二例示性上游純化方案中，如下文所述對含有IgG免疫球蛋白的血漿進行醇份化(例如乙醇份化)。在一個具體實例中，第一上游份化方案包括分離份I沈澱步驟及分離份II+III沈澱步驟，隨後為分離份II沈澱步驟，從而最終向本文提供之用於降低醯胺分解活性(例如因子XI/XIa)及/或抗補體活性(ACA)的陽離子交換層析方法提供起始物質。

涵蓋含有下述分離份I、分離份II+III及分離份II沈澱步驟每一者之沈澱條件(例如乙醇濃度、pH值、溫度、分離技術)之所有組合的方法。此外，涵蓋含有特定沈澱條件之所有組合的方法以及用於定義及收集洗出液之前導部分之所有可能方案，如下文所述。

1.分離份I沈澱

在一個具體實例中，分離份I沈澱係藉由在6.7至7.3的pH值下以6%至10%(v/v)的最終濃度向冷貧血漿中添加乙醇來形成。接著在-4℃至2℃下攪拌的同時培育混合物。藉由離心或過濾混合物可將所得分離份I沈澱物與分離份I上層清液分離，此通常在冷卻下執行。免疫球蛋白內容物大部分存在於分離份I上層清液中，此可回收且可進一步增濃。

在一個特定具體實例中，在分離份I沈澱步驟中，乙醇之最終濃度為8±2%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為8±1%(v/v)。在又一個具體實例中，乙醇之最終濃度為8%(v/v)。在其他具體實例中，乙醇之最終濃度為6%、7%、8%、9%或10%(v/v)。

在一個特定具體實例中，分離份I沈澱步驟中之pH值為7.0±0.4。在另一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之pH值為7.0±0.3。在另一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之pH值為7.0±0.2。在另一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之pH值為7.0±0.1。在又一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之pH值為7.0。在其他具體實例中，分離份I沈澱步驟中之pH值為6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或7.3。

在一個特定具體實例中，分離份I沈澱步驟中之溫度為-1±3℃。在另一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之溫度為-1±2℃。在另一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之溫度為-1±1℃。在又一個具體實例中，分離份I沈澱步驟中之溫度為-1℃。在其他具體實例中，分離份I沈澱步驟中之溫 度為-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃或2℃。

在一個特定具體實例中，冷貧血漿經調節至pH值為7.0±0.1且醇濃度經計算為8%(v/v)。在充分混合下添加用於調節pH值及醇濃度的溶液。降低沈澱反應之溫度且始終保持在-1±1℃。所得分離份I懸浮液接著離心或過濾以使沈澱物與上層清液分離。

2.分離份II+III沈澱

為進一步增濃IgG含量及純度，在一個具體實例中，使用分離份I上層清液作為第二沈澱步驟(分離份II+III沈澱)之物質。分離份II+III沈澱係藉由在6.7與7.3之間的pH值下向分離份I上層清液中添加乙醇直至最終濃度為22%至28%(v/v)來執行。接著在-10℃至-4℃下攪拌的同時培育混合物。藉由離心或過濾混合物可將所得分離份II+III沈澱物與分離份II+III上層清液分離，此通常在冷卻下執行。免疫球蛋白內容物大部分存在於分離份II+III沈澱物中，其可再懸浮且可進一步增濃。

在一個特定具體實例中，在分離份II+III沈澱步驟中，乙醇之最終濃度為25±3%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±2%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±1%(v/v)。在又一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25%(v/v)。在其他具體實例中，乙醇之最終濃度為22%、23%、24%、25%、26%、27%或28%(v/v)。

在一個特定具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之pH值為7.0±0.4。在另一個具體實例中，分離份II+III沈澱 步驟中之pH值為7.0±0.3。在另一個具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之pH值為7.0±0.2。在另一個具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之pH值為7.0±0.1。在又一個具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之pH值為7.0。在其他具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之pH值為6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4。

在一個特定具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之溫度為-7±3℃。在另一個具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之溫度為-7±2℃。在另一個具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之溫度為-7±1℃。在又一個具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之溫度為-7℃。在其他具體實例中，分離份II+III沈澱步驟中之溫度為-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃或-4℃。

在一個特定具體實例中，分離份I上層清液經調節至pH值為7.0±0.1且醇濃度經計算為25%(v/v)。在充分混合下添加用於調節pH值及醇濃度的溶液。降低沈澱反應之溫度且始終保持在-6±2℃。所得分離份II+III懸浮液接著離心或過濾以使沈澱物與上層清液分離。

C.分離份II沈澱

為進一步增濃IgG含量及純度，在一個具體實例中，執行第四(依據上游份化方案I)或第三(依據上游份化方案II)醇沈澱步驟(分離份II沈澱)。分離份II沈澱係藉由將分離份B濾液或分離份II+III沈澱物懸浮液之pH值調節至介於6.7與7.5之間且添加乙醇直至最終濃度介於22% 與28%(v/v)之間來執行。接著在-13℃至-2℃下攪拌的同時培育混合物。藉由離心或過濾混合物可將所得分離份II沈澱物與分離份B上層清液分離，此通常在冷卻下執行。免疫球蛋白內容物大部分存在於分離份II沈澱物中，其可再懸浮且可進一步增濃。

在一個特定具體實例中，在分離份II沈澱步驟中，乙醇之最終濃度為25±3%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±2%(v/v)。在另一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±1%(v/v)。在又一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25%(v/v)。在其他具體實例中，乙醇之最終濃度為22%、23%、24%、25%、26%、27%或28%(v/v)。

在一個特定具體實例中，分離份II沈澱步驟中之pH值為7.1±0.4。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之pH值為7.1±0.3。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之pH值為7.1±0.2。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之pH值為7.1±0.1。在又一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之pH值為7.1。在其他具體實例中，分離份II沈澱步驟中之pH值為6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

在一個特定具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-5±3℃。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-5±2℃。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-5±1℃。在又一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-5℃。在另一個特定具體實例中，分離份 II沈澱步驟中之溫度為-10±3℃。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-10±2℃。在另一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-10±1℃。在又一個具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-10℃。在其他具體實例中，分離份II沈澱步驟中之溫度為-13℃、-12℃、-11℃、-10℃、-9℃、-8℃、-7℃、-6℃、-5℃、-4℃、-3℃或-2℃。

在一個特定具體實例中，分離份B濾液之pH值係使用1.0 M碳酸氫鈉溶液調節至7.1±0.2。在混合下添加額外的醇以使計算濃度達到25%(v/v)。檢驗pH值且必要時使用1 M碳酸氫鈉或pH 4.0緩衝液再調節至7.3±0.2。完成醇添加之後，在-5±2℃之溫度下攪拌懸浮液至少2小時。完成攪拌之後，必要時將pH值再調節至7.3±0.2。將懸浮液離心且分離沈澱物，即分離份II沈澱物。

D.陽離子交換層析

為進一步增濃免疫球蛋白組成物，在一個具體實例中，可將分離份II沈澱物再懸浮於水或低離子強度緩衝液中且進行陽離子交換層析。在一個具體實例中，將分離份II沈澱物再懸浮於pH值低於6.0的水或低離子強度緩衝液中。典型地，再懸浮之分離份II沈澱物之pH值為5.2±0.2且懸浮液之電導率較低，典型地不超過1 mS/cm。接著過濾分離份II懸浮液以移除非溶解性物質，隨後裝載於在低於6.0之pH值下平衡的陽離子交換樹脂上。將免疫球蛋白裝載於陽離子交換樹脂(例如陽離子交換管柱)上之後，可 用pH值低於6.0的洗滌緩衝液洗滌樹脂。為洗提免疫球蛋白，接著使陽離子交換樹脂與電導率為至少15 mS/cm(例如至少150 mM NaCl或其等效鹽之鹽濃度)且pH值大於7.0的洗提緩衝液接觸。在一個特定具體實例中，對懸浮之分離份II沈澱物進行溶劑及清潔劑(S/D)處理，隨後執行陽離子交換層析。雖然使用本文呈現之例示性份化方案中之再懸浮分離份II沈澱物作為本文提供之陽離子交換方法的起始物質，但應瞭解，含有IgG免疫球蛋白及醯胺分解活性(例如FXI及/或FXIa)及/或抗補體活性(ACA)的任何血漿來源免疫球蛋白組成物(亦即分離份)可用於本文提供之方法中。

已發現可將高水準之醯胺分解活性(例如FXI及/或FXIa)及/或抗補體活性(ACA)與IgG一起自陽離子交換樹脂共洗提。不能將大量此等雜質與所要免疫球蛋白分離導致最終IgG組成物具有高醯胺分解活性及/或高抗補體活性。鑒於血栓性栓塞事件之風險增大歸因於醫藥免疫球蛋白製劑中之高醯胺分解活性且不良反應與抗補體活性有關，因此在此領域中仍需要移除導致許多IgG產品中存在醯胺分解活性(例如FXI/FXIa)及/或抗補體活性(ACA)的雜質。有利的是，已發現當使用pH值超過7.0的緩衝液自陽離子交換樹脂洗提免疫球蛋白時，醯胺分解活性及抗補體活性(ACA)僅於洗出液之滯後部分中洗提出。醯胺分解活性及ACA於洗出液之滯後部分中洗提顯著地對應於洗出液之pH值自低於6.0移位至超過7.0。因而，洗出液 之前導部分含有高濃度之免疫球蛋白及低濃度之醯胺分解活性及ACA，而洗出液之滯後部分具有較低濃度之免疫球蛋白及較高醯胺分解活性及ACA。因此，在本文提供之方法的較佳具體實例中，分別收集陽離子交換洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分。

在某些具體實例中，陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。例示性弱陽離子交換樹脂包括具有羧酸配位體的樹脂，例如羧甲基(CM)樹脂。在一個較佳具體實例中，本文提供之方法中使用的陽離子交換樹脂為羧甲基樹脂，例如CM瓊脂糖。

在一個具體實例中，使分離份II沈澱物再懸浮於pH值介於4.8與5.6之間的冷水或低離子強度緩衝液中。在一個特定具體實例中，用於再懸浮之水或緩衝液的pH值為5.2±0.3。在另一個特定具體實例中，用於再懸浮之水或緩衝液的pH值為5.2±0.2。在另一個特定具體實例中，用於再懸浮之水或緩衝液的pH值為5.2±0.1。在又一個特定具體實例中，用於再懸浮之水或緩衝液的pH值為5.2。在其他具體實例中，用於再懸浮之水或緩衝液的pH值為4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

在一個具體實例中，陽離子交換樹脂經預平衡至pH值介於4.6與5.6之間。在一個特定具體實例中，樹脂經預平衡至pH值介於4.6與5.5之間。在另一個特定具體實例中，樹脂經預平衡至pH 5.0±0.4。在另一個特定具體實例中，樹脂經預平衡至pH 5.0±0.3。在另一個特定具體實例中，樹脂 經預平衡至pH 5.0±0.2。在另一個特定具體實例中，樹脂經預平衡至pH 5.0±0.1。在另一個特定具體實例中，樹脂經預平衡至pH 5.0。在其他具體實例中，樹脂經預平衡至pH 4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

在一個具體實例中，將澄清的分離份II懸浮液裝載於陽離子交換樹脂上之後，用電導率低得足以使免疫球蛋白不能自樹脂洗提且pH值介於5.1與5.9之間的緩衝液洗滌樹脂。在一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.3。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.2。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5±0.1。在另一個特定具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.5。在其他具體實例中，洗滌緩衝液之pH值為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。

在一個具體實例中，洗提緩衝液之pH值大於7.5。在另一個具體實例中，洗提緩衝液之pH值介於7.4與8.2之間。在一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.3。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.2。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8±0.1。在另一個特定具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.8。在其他具體實例中，洗提緩衝液之pH值為7.0、7.1、7.2、7.36、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4或8.5。

在一個特定具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至 少10 mS/cm。在一個較佳具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少15 mS/cm。在另一個較佳具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為至少20 mS/cm。在一個特定具體實例中，洗提緩衝液包含電導率介於10 mS/cm與40 mS/cm之間。在另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率介於15 mS/cm與30 mS/cm之間。在另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率介於20 mS/cm與30 mS/cm之間。在另一個具體實例中，洗提緩衝液包含電導率介於25 mS/cm與30 mS/cm之間。在其他具體實例中，洗提緩衝液包含電導率為約5 mS/cm或約6 mS/cm、7 mS/cm、8 mS/cm、9 mS/cm、10 mS/cm、11 mS/cm、12 mS/cm、13 mS/cm、14 mS/cm、15 mS/cm、16 mS/cm、17 mS/cm、18 mS/cm、19 mS/cm、20 mS/cm、21 mS/cm、22 mS/cm、23 mS/cm、24 mS/cm、25 mS/cm、26 mS/cm、27 mS/cm、28 mS/cm、29 mS/cm、30 mS/cm、31 mS/cm、32 mS/cm、33 mS/cm、34 mS/cm、35 mS/cm、36 mS/cm、37 mS/cm、38 mS/cm、39 mS/cm、40 mS/cm或高於40 mS/cm。

在一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之80%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至80%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%至75%。在又 一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之75%%至80%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。

在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之70%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至70%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%至65%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之65%%至70%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%或70%。

在另一個具體實例中，洗出液之前導部分(亦即所收集或彙集之有關洗提份)佔不超過總洗出液之60%。在一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至60%。在另一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%至55%。在又一個特定具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之55%至60%。在其他具體實例中，洗出液之前導部分佔總洗出液之50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%或60%。

在另一個具體實例中，洗出液之前導部分及滯後部分係根據溶液之pH值定義。在一個具體實例中，前導部分為 pH值不超過7.0的洗出液。在另一個具體實例中，前導部分為pH值不超過6.5的洗出液。在另一個具體實例中，前導部分為pH值不超過6.0的洗出液。在另一個具體實例中，前導部分為pH值不超過5.5的洗出液。在另一個具體實例中，前導部分為pH值不超過5.0的洗出液。在其他具體實例中，前導部分為具有以下pH值的洗出液：不超過7.0、6.9、6.8、6.7、6.6、6.5、6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0或小於5.0。

在一個具體實例中，洗出液之前導部分被定義為洗出液之OD₂₈₀下降低於2.0 AU之前自陽離子交換樹脂洗提之洗出液的洗提份。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分被定義為洗出液之OD₂₈₀下降低於1.5 AU之前自陽離子交換樹脂洗提之洗出液的洗提份。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分被定義為洗出液之OD₂₈₀下降低於1.0 AU之前自陽離子交換樹脂洗提之洗出液的洗提份。在另一個具體實例中，洗出液之前導部分被定義為洗出液之OD₂₈₀下降低於0.5 AU之前自陽離子交換樹脂洗提之洗出液的洗提份。在其他具體實例中，洗出液之前導部分被定義為洗出液之OD₂₈₀下降低於2.0 AU、1.9 AU、1.8 AU、1.7 AU、1.6 AU、1.5 AU、1.4 AU、1.3 AU、1.2 AU、1.1 AU、1.0 AU、0.9 AU、0.8 AU、0.7 AU、0.6 AU、0.5 AU、0.4 AU、0.3 AU、0.2 AU、0.1 AU或小於0.1 AU之前自陽離子交換樹脂洗提之洗出液的洗提份。在某些具體實例中，洗出液之前導部 分另外被定義為洗出液之OD₂₈₀上升超過臨限值(例如0.1 AU、0.2 AU、0.3 AU、0.4 AU、0.5 AU、0.6 AU、0.7 AU、0.8 AU、0.9 AU、1.0 AU、1.1 AU、1.2 AU、1.3 AU、1.4 AU、1.5 AU、1.6 AU、1.7 AU、1.8 AU、1.9 AU、2.0 AU或大於2.0 AU)之後自陽離子交換樹脂洗提之洗出液部分。

E.超濾/滲濾(UF/DF)

IgG組成物可另外藉由超濾/滲濾濃縮。在一個具體實例中，IgG組成物可藉由超濾濃縮至蛋白質濃度介於2%與10%(w/v)之間。在某些具體實例中，在具有開孔通道篩的暗匣中進行超濾且超濾膜具有不超過100 kDa或不超過90 kDa、80 kDa、70 kDa、60 kDa、50 kDa、40 kDa、30 kDa或小於30 kDa之標稱分子量截斷(NMWCO)。在一個較佳具體實例中，超濾膜具有不超過50 kDa之NMWCO。

如美國專利申請公開案第2010/0330071號中所述(該文獻之內容係以全文引用的方式併入本文中用於所有目的)，開孔通道膜可以經特別設計的後洗滌及調配方式在生產製程快結束時使用，以使得所得IgG組成物中的蛋白質濃度(200 mg/mL)高達先前技術IVIG(例如GAMMAGARD^® LIQUID)的約2倍而不會影響產率及儲存穩定性。大部分市售超濾膜無法在不損失大量蛋白質的情況下達到200 mg/mL IgG之濃度。此等膜在早期被阻塞且因此難以實現充分的後洗滌。因此必須使用開孔通道膜組態。即便使用開孔通道膜，亦須使用經特別設計的後洗滌程序來獲得所需濃度而無顯著蛋白質損失(小於2%損失)。 更驚人的是，200 mg/mL之較高蛋白質濃度對低pH值儲存步驟之病毒滅活能力無影響。

超濾步驟一旦完成，即可經由對於適於靜脈內或肌肉內投予之溶液進行的滲濾來將濃縮物進一步濃縮。在某些具體實例中，滲濾溶液可包含穩定劑及/或緩衝劑。在一個較佳具體實例中，穩定劑及緩衝劑為適當濃度(例如0.20 M至0.30 M，或0.22 M至0.28 M，或0.24 M至0.26 mM，或2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0之濃度)的甘胺酸。在一個較佳具體實例中，滲濾緩衝液含有0.25 M甘胺酸。

典型地，最小交換體積為最初濃縮物體積的至少約3倍或為最初濃縮物體積的至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或超過9倍。IgG溶液可經濃縮至最終蛋白質濃度介於3%與25%(w/v)之間，或介於3%與7%之間，或介於6%與18%(w/v)之間，或介於7%與16%(w/v)之間，或介於8%與14%(w/v)之間，或介於9%與12%之間，或至最終濃度為5%或6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%或高於25%。在一個具體實例中，在不向濃縮溶液中添加後洗滌洗提份的情況下實現至少23%之最終蛋白質濃度。在另一個具體實例中，在不向濃縮溶液中添加後洗滌洗提份的情況下實現至少24%之最終蛋白質濃度。在又一個具體實例中，在不向濃縮溶液中添加後洗滌洗提份的情況下實現至少25%之最終蛋白質濃度。典型地， 在濃縮製程結束時，溶液之pH值為約4.6至5.1。

在一個例示性具體實例中，IgG組成物之pH值係使用1 M鹽酸調節至5.2±0.2且藉由超濾(100 kDa或小於100 kDa之標稱分子量截斷臨限值)濃縮至5±1 g%蛋白質。接著使濃縮物相對於滲濾溶液(0.02 M NaCl，0.05%(w/v)PEG)滲濾。滲濾液冷卻至5±2℃。使用2.0 M Tris將溶液之Tris緩衝液濃度調節至0.025 M且將pH值再調節至7.8±0.2。

F.陰離子交換層析

在一個具體實例中，接著將蛋白質裝載於經平衡之ANX Sepharose® 4快速流管柱上以移除血漿來源污染物。裝載完成之後，用平衡緩衝液(25 mM Tris，20 mM NaCl，pH 7.8±0.2)洗滌管柱。將裝載步驟及洗滌步驟中之管柱下降液(IgG溶液)合併。

G.病毒滅活及/或移除

在某些具體實例中，本文提供之用於製備增濃免疫球蛋白組成物的方法將另外包括至少一個，較佳至少兩個，最佳至少三個病毒滅活或移除步驟。可供本文提供之方法使用的病毒滅活或移除步驟之非限制性實例包括溶劑清潔劑處理(Horowitz等人，Blood Coagul Fibrinolysis 1994(5增刊3)：S21-S28及Kreil等人，Transfusion 2003(43)：1023-1028，兩文獻均以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的)、奈米過濾(Hamamoto等人，Vox Sang 1989(56)230-236及Yuasa等人，J Gen Virol.1991(72(pt 8))：2021-2024，兩 文獻均以全文引用的方式明確併入本文中用於所有目的)、及高溫低pH值培育(Kempf等人，Transfusion 1991(31)423-427及Louie等人，Biologicals 1994(22)：13-19)。

可針對在製造過程中產生的任何中間免疫球蛋白分離份執行病毒滅活或移除步驟。舉例而言，在一個具體實例中，可針對分離份I+II+III懸浮液、分離份A懸浮液、分離份B濾液、分離份II懸浮液、陽離子交換洗出液、陰離子交換洗出液及其類似物執行病毒滅活或移除步驟。

在一個具體實例中，針對分離份II懸浮液執行病毒滅活或移除步驟。在一個較佳具體實例中，對分離份II懸浮液進行溶劑及清潔劑(S/D)處理。

1.溶劑清潔劑(S/D)處理

為了將可能存在於血漿來源產品中的各種病毒污染物滅活，可對一或多種免疫球蛋白製造中間物進行溶劑清潔劑(S/D)處理。在一個較佳具體實例中，將分離份II沈澱物再懸浮且進行S/D處理。用於清潔劑處理血漿來源分離份的方法在此項技術中已熟知(關於綜述，參見Pelletier JP等人，Best Pract Res Clin Haematol.2006；19(1)：205-42)。一般而言，任何標準S/D處理可配合本文提供之方法使用。舉例而言，下文提供用於S/D處理的例示性方案。

簡言之，分別以約1.0%、0.3%及0.3%之最終濃度向澄清的PptG濾液中添加曲通(Triton)X-100、吐溫-20及三(正丁基)磷酸酯(TNBP)。接著在約18℃與約25℃之間的溫度下攪拌混合物至少約1小時。

在一個具體實例中，藉由噴霧而非藉由流暢添加來添加S/D試劑(例如曲通X-100、吐溫-20及TNBP)。在其他具體實例中，清潔劑試劑可以固體形式添加至免疫球蛋白中間物溶液中，加以混合以確保S/D組分快速分佈。在某些具體實例中，添加固體試劑較佳為將固體潑灑在濾液之非定域表面區域上，以使得不會(諸如在流暢添加中)發生局部過度濃縮。在另一個具體實例中，藉由將含有免疫球蛋白的溶液抽入已存在呈濃縮形式或稀釋形式之SD試劑的槽中來實現製程改良。

2.奈米過濾

為了進一步降低本文提供之免疫球蛋白組成物的病毒負荷，可使用適當奈米過濾裝置對免疫球蛋白中間物分離份進行奈米過濾。在某些具體實例中，奈米過濾裝置具有介於15 nm與200 nm之間或約15 nm與200 nm之間的平均孔隙尺寸。適於此用途之奈米過濾器之實例包括(但不限於)DVD、DV 50、DV 20(Pall)、Viresolve NFP、Viresolve NFR(Millipore)、Planova 15N、20N、35N及75N(Planova)。在一個特定具體實例中，奈米過濾器可具有介於15 nm與72 nm之間或約15 nm與72 nm之間的平均孔隙尺寸，或介於19 nm與35 nm之間或約19 nm與35 nm之間的平均孔隙尺寸，或15 nm、19 nm、35 nm或72 nm或約15 nm、19 nm、35 nm或72 nm之平均孔隙尺寸。在一個較佳具體實例中，奈米過濾器具有35 nm或約35 nm之平均孔隙尺寸，諸如Asahi PLANOVA 35N過濾器或其等效物。

視需要可執行超濾/滲濾以進一步濃縮奈米濾液。在一個具體實例中，開孔通道膜係在製造過程快結束時以特別設計的後洗滌及調配方式使用，從而產生高濃度之免疫球蛋白組成物。

奈米過濾之後，可藉由超濾進一步濃縮濾液且/或藉由滲濾調節緩衝液組成。在一個具體實例中，可藉由超濾將奈米濾液濃縮至0.5%與10%(w/v)之間或約0.5%與10%(w/v)之間的蛋白質濃度。在某些具體實例中，在具有開孔通道篩的暗匣中進行超濾且超濾膜具有小於或小於約150 kDa、或小於或小於約140 kDa、130 kDa、120 kDa、100 kDa、90 kDa、80 kDa、70 kDa、60 kDa、50 kDa、40 kDa、30 kDa或30 kDa以下之標稱分子量截斷(NMWCO)。在一個具體實例中，超濾膜具有不超過50 kDa之NMWCO。

3.在低pH值下培育

在某些具體實例中，可處理含有免疫球蛋白的溶液以降低或滅活組成物之病毒負荷。在一個具體實例中，此係藉由如下操作實現：將組成物之pH值調節至低pH值，例如小於或小於約6.0，及培育至少約一週，隨後釋放組成物。在一個較佳具體實例中，培育之前，將本體溶液之pH值調節至小於或小於約5.5。在一個更佳具體實例中，培育之前，將溶液之pH值降低至小於或小於約5.0。在某些具體實例中，在培育之前，將溶液之pH值降低至小於或小於約6.0，或小於或小於約5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、5.2、5.1、5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1、 4.0或4.0以下。

在某些具體實例中，接著將溶液培育至少1週，或至少2週、3週、4週或4週以上，或至少1個月、2個月、3個月或3個月以上。在較佳具體實例中，組成物在超過20℃、或超過25℃、或超過30℃的溫度下培育。在特定具體實例中，組成物在20℃或21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃或40℃以上的溫度下培育。

4.凍乾及熱處理

在其他具體實例中，本發明提供根據此項技術中已知之方法凍乾的凍乾型免疫球蛋白組成物。可藉由熱處理凍乾組成物來進一步降低此等凍乾組成物之病毒活性，此等凍乾組成物先前已經受其他病毒滅活或移除步驟，諸如S/D處理或奈米過濾。用於滅活血液因子中之病毒負荷的熱處理法在此項技術中已熟知(參見例如Piszkiewicz等人，Thromb Res.1987年7月15日；47(2)：235-41；Piszkiewicz等人，Curr Stud Hematol Blood Transfus.1989；(56)：44-54；Epstein及Fricke,Arch Pathol Lab Med.1990年3月；114(3)：335-40)。

H.調配

滲濾步驟一旦完成，即用滲濾緩衝液將溶液之蛋白質濃度調節至最終濃度介於約3%與約20%(w/v)之間，或介於3%與7%之間，或介於約6%與約18%(w/v)之間， 或介於約7%與約16%(w/v)之間，或介於約8%與約14%(w/v)之間，或介於約9%與約12%之間，或至最終濃度為約5%或6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%或高於25%。在一個較佳具體實例中，溶液之最終蛋白質濃度介於約9%與約11%之間，更佳為約10%。

經調配之本體溶液藉由絕對孔隙尺寸不超過約0.22微米(例如約0.2微米)之膜濾器過濾來進一步滅菌。接著將溶液無菌分配至最終容器中以便適當密封，取樣測試。

在一個具體實例中，用滲濾緩衝液將IgG組成物進一步調節至濃度為約10.2±0.2%(w/v)。必要時，將pH值調節至約4.4至約4.9。最後，將溶液無菌過濾且在30℃或約30℃下培育三週。

在一個例示性具體實例中，所得IgG溶液用NaCl(最大0.15 M)、甘胺酸(最大0.3 M)、葡萄糖(最大0.11 M)及人類白蛋白(最大3 mg/mL)穩定。使用1 M鹽酸將pH值調節至7.0±0.2。藉由超濾將溶液濃縮至所要濃度且使用1 M鹽酸或1 M氫氧化鈉將pH值再調節至7.15±0.1。使用0.2微米孔隙尺寸之過濾器或等效物無菌過濾本體溶液。

無菌IgG溶液可經無菌分配至容器中，塞緊以便凍乾，冷凍，凍乾，在無菌條件下密封且加蓋。

VIII.實施例

實施例1至7尤其論證：(1)自陽離子交換樹脂(例如CM瓊脂糖)一步洗提免疫球蛋白產生蛋白質之雙峰式分 佈，其中醯胺分解活性(PL-1)的洗提遲於IgG，從而可以IgG產率損失最小的方式移除醯胺分解活性；(2)自陽離子交換樹脂(例如CM瓊脂糖)洗提醯胺分解活性(PL-1)與以下相關且可能歸因於以下：在根據本文提供之方法洗提期間，CM管柱中的pH值移位；(3)陽離子交換樹脂(例如CM瓊脂糖)上負載的蛋白質之量在至少每毫升樹脂60 mg至120 mg蛋白質之範圍內不影響醯胺分解活性之移除；(4)監測管柱出口處之pH值且當上升明顯時停止洗提，從而可部分移除醯胺分解活性(PL-1)活性，原因可能為管柱頂端之pH值平衡已被打亂；(5)藉由收集小於3個CV之初始洗提池可以最小的IgG產率損失(

10%)顯著降低醯胺分解活性，因此，監測CM瓊脂糖洗提步驟之體積為將根據本文提供之方法製備之免疫球蛋白組成物之醯胺分解活性顯著降低的簡單方法；及(6)藉由收集CM瓊脂糖洗提步驟之「第一峰」可使組成物具有較低IgG聚集物濃度、較低PKA活性、較低PL-1活性、較高IgG單體濃度及較理想的IgG亞類分佈。

此外，實施例8及實施例9至少證明：(1)導致FXIa及TGA提高的蛋白質可藉由CM層析分離洗出液之最後25%部分來分離；(2)上述優點可在大規模製造過程中重現；及(3)大規模製造過程中產生之陽離子交換(亦即CM瓊脂糖)洗出液可藉由監測OD來彙集，例如洗出液可收集於第一池中直至洗出液之OD下降低於2.0，從而將實現導致FXIa及TGA值提高的非所需蛋白質之大量分離。

實施例1

此實施例描述TGA、FXIa值提高及NAPTT值減小之非所需蛋白質在根據經修改之Kistler-Nitschmann醇份化法所製備之分離份II免疫球蛋白組成物中的分佈。此等雜質可在陽離子交換層析步驟(例如CM瓊脂糖快速流層析)洗提期間分離。

此實施例證明在陽離子交換層析之洗提期間醯胺分解性水準(例如FXI及/或FXIa)顯著降低。該方法使最終免疫球蛋白產物含有顯著減少的TGA及FXIa活性。此降低係藉由CM洗提步驟之特定份化來實現，CM洗提步驟可將醯胺分解活性(存在於洗出液之滯後部分中)與主要IgG分離份(見於洗出液之前導部分中)有效分離。此實施例顯示，藉由將陽離子交換洗出液分成前導部分及滯後部分，可將非所要的痕量蛋白質與大部分IgG內容物分離。此外，此實施例證明，該方法對於大規模製造而言有效且經濟可行。

簡言之，如下製備分離份II沈澱物。對彙集之人類血漿進行冷沈澱之後，藉由以20%醇在pH 6.9下沈澱來形成分離份I+II+III沈澱物。使沈澱物I+II+III再懸浮之後，添加醇直至最終濃度為20%，pH值為7.2，形成沈澱物A。藉由離心執行沈澱物A之分離。分離份I+III(亦稱為懸浮液B沈澱物)係藉由以17%醇使懸浮沈澱物A沈澱來形成。藉由過濾或離心回收沈澱物。接著處理懸浮液B濾液而形成分離份II，分離份II含有經部分純化之γ球蛋白(例如 IgG)血漿蛋白質分離份。

經澄清之分離份II之懸浮液接著用溶劑清潔劑(SD)混合物處理且裝載於CM瓊脂糖ff管柱上。洗去殘餘SD試劑之後，將結合至樹脂上的IgG分離份洗提。隨後，將免疫球蛋白溶液超濾/滲濾且接著裝載於陰離子交換劑上以移除痕量雜質。經另一個濃縮步驟之後，進行最後調配，隨後凍乾。

接著將分離份II沈澱物溶於4℃及pH 5.2±0.2之冷水中。藉由CWSS過濾澄清之後，調節溶液以便SD處理。將蛋白質濃度調節至2%且在SD培育期間的溫度保持在20℃至25℃範圍內。接著將蛋白質溶液裝載於經平衡之CM-瓊脂糖快速流管柱(平衡緩衝液：0.025 M乙酸鈉，pH 5.0±0.2)上。裝載之後，管柱用30個管柱體積之乙酸鹽緩衝液(0.01 M乙酸鈉，pH 5.5±0.2)洗滌以洗去SD試劑，隨後用洗提緩衝液(0.25 M NaCl，0.2 M甘胺酸，0.1% PEG 3350，25 mM Tris，pH 8.00)洗提所吸附的蛋白質。在OD 400 mAU時開始收集洗出液之第一部分(E1)且在恰好2.7個管柱體積之後停止(圖1)。收集洗提峰之第二分離份(E2)，直至OD再下降至400 mAU。接著單獨處理所洗提之分離份以供製程之剩餘部分用。

接著將E1及E2組成物的pH值調節至5.2且相對於滲濾緩衝液(0.02 M NaCl，0.05% PEG 3350)超濾/滲濾以濃縮至5%蛋白質(w/v)。向組成物中添加0.025 M Tris且將pH值調節至7.7。接著將IgG分離份裝載於經緩衝液(0.025 M Tris，0.02 M NaCl，pH 7.7)平衡之ANX-瓊脂糖快速流管柱上。收集所得ANX流下液，且補充8.5 g/L NaCl、16.5 g/L甘胺酸、21.7 g/L葡萄糖酸酐及1 g/L白蛋白(20%)。接著調節pH值且藉由超濾將E1及E2組成物濃縮至10%(w/v)蛋白質。濃縮之後，向濃縮溶液中再次補充NaCl及甘胺酸(而非白蛋白)且必要時在無菌過濾之前將pH值調節至7.1。

顯示層析步驟之吸光度(mAU)、電導率及pH值的層析圖提供於圖1中。正如所見，用上述洗提緩衝液進行單步洗提可產生雙峰洗提。顯然，在添加洗提緩衝液之後，洗出液之pH值隨著第一峰脫離管柱而顯著下降，且接著隨著第二峰之洗提而急劇上升。正如所述，藉由收集2.7個管柱體積之第一洗提份E1(圖1所示之垂直線左側)及第二洗提份(圖1所示之垂直線右側)來分離洗提峰。

如下文所述，分別處理所洗提之洗提份(E1及E2)，以產生最終免疫球蛋白製劑。為此，將洗提份E1及E2之pH值調節至5.2且使樣品相對於滲濾緩衝液(0.02 M NaCl，0.05% PEG 3350)滲濾，以使組成物濃縮至5%之最終蛋白質濃度。滲濾之後，向各蛋白質溶液中添加0.025 M Tris且將pH值調節至7.7。接著將IgG洗提份裝載於經平衡之ANX-瓊脂糖快速流管柱(平衡緩衝液0.025 M Tris，0.02M NaCl，pH 7.7)上且收集流下的洗提份。接著向ANX流下液中補充8.5 g/L NaCl、16.5 g/L甘胺酸、21.7 g/L葡萄糖酸酐及1 g/L白蛋白(20%)。接著將溶液pH值調節 至7.00且藉由超濾將免疫球蛋白樣品濃縮至10%蛋白質。濃縮之後，再次添加NaCl、甘胺酸及葡萄糖酸酐且必要時在無菌過濾之前將pH值調節至7.1。

為特性化層析步驟，測定質量平衡，其結果顯示於表1中。在洗提峰之第二部分中發現約10%之總蛋白質。此為收集2.7個管柱體積之洗出液之後停止彙集組成物時發生的產率損失。

接著對利用兩個CM洗提之洗提份製備的最終容器進行分子尺寸分佈、抗補體活性、醯胺分解活性(使用PL-1與TGA作為受質)、FXIa活性及NAPTT活性方面的分析。結果顯示於表2及表3中。來源於所洗提之IgG分離份之第一及第二部分之最終容器的生物化學特徵揭示，第一洗提部分基本上不含FXIa及導致TGA提高及NAPTT值縮小的其他非所要蛋白質。相比之下，第二部分中之FXIa及醯 胺分解活性增濃，其中聚集物及寡二聚物含量亦較高。有趣的是，洗出液之第一部分中的ACA值極低，而洗出液之第二部分顯示高得多的值。

總之，自CM瓊脂糖ff管柱分離洗出液可產生兩個分離份且能夠製造實質上不含FXIa的IgG組成物。

實施例2

為了減少存在於製造規模之免疫球蛋白製劑中的醯胺分解活性之量，研究用於洗提及份化陽離子交換層析的條件。此等研究之詳情提供於下文中。

進行一系列實驗以尋找在根據本文所述之Gammagard SID生產方法的下游處理期間降低/移除醯胺分解活性的適當方法。簡言之，將科恩分離份糊劑溶於4℃及pH 5.2±0.2之冷水中。藉由CWSS過濾澄清之後，將樣品無菌過濾且在4℃下儲存或用水稀釋至2%之蛋白質濃度以便即時處理。接著使溶液達到20-25℃且用溶劑/清潔劑混合物(1% 曲通X-100，0.3%吐溫80；0.3% TNBP)培育1小時，隨後將蛋白質溶液裝載於經平衡之CM瓊脂糖快速流管柱(平衡緩衝液：25 mM乙酸鈉，pH 5.0±0.2)上。裝載之後，用乙酸鹽緩衝液(0.01 M乙酸鈉，pH 5.5±0.2)洗滌管柱且用洗提緩衝液(0.25 M NaCl，0.2 M甘胺酸，0.1% PEG 3350，25 mM Tris，pH 7.8)洗提所吸附之IgG。在CM瓊脂糖ff操作期間，監測以下參數以份化CM洗出液(限定點)：OD 280；pH值；及洗提體積(以管柱體積CV計)。接著用滲濾緩衝液(0.02 M NaCl，0.05% PEG 3350)超濾/滲濾洗出液，或立即用於分析。執行此濃縮步驟以便在亦對應於10%最終容器組成物的蛋白質值下量測醯胺分解活性。

洗提期間，洗出液快速達到CM洗提緩衝液包含電導率值。然而，如圖2所示，在管柱出口處所量測之洗出液的pH值自5.5(如在洗滌緩衝液中)下降至5.0以下(4.3-4.8)且最開始的4個CV之pH值保持不變，儘管洗提緩衝液具有7.8之pH值。在洗出液收集結束時觀察到pH值增至約7.8。監測管柱出口處之OD 280顯示，此pH值移位對應於第二峰之釋放，其中偵測到大部分醯胺分解活性(如經由PL-1檢定所量測)。

實施例3

為進一步研究實施例1及實施例2中所觀測到之雙峰CM-瓊脂糖洗提現象及pH值移位，在另一個CM-瓊脂糖快速流層析實驗期間收集個別洗提份。簡言之，如上所述執行CM-瓊脂糖快速流層析，其中收集洗提份且單獨分析， 隨後彙集洗提份A-N及藉由超濾濃縮。用於層析步驟之起始物質為科恩分離份II糊劑(P25001ivLE；吸附FIX及AT-III)。CM-瓊脂糖管柱用pH值為5.2的緩衝液平衡且在pH 5.7下執行洗滌。層析步驟之流速維持在0.64 cm/min。

pH值移位之後，在分離份中發現醯胺分解活性(PL-1)之量增加。即使在濃縮池中，亦觀測到醯胺分解活性降低。超濾/滲濾之後可偵測到PL1活性的實情係因為CM洗出液之稀釋或因為其在濃縮期間產生。

如表4中所示，以低於5.5之pH值洗提的洗提份(洗提份A-N)含有濃度比以較高pH值洗提之洗提份(洗提份O及P)低得多的醯胺分解活性。醯胺分解活性之定量顯示，洗提份O及P中洗提的活性大於所合併之全部洗提份A-N。pH值移位之後，在洗提份中發現醯胺分解活性(PL-1)之量增加。即使在濃縮池中，亦觀測到醯胺分解活性降低。超濾/滲濾之後可偵測到PL1活性的實情係因為CM洗出液之稀釋或因為其在濃縮期間產生。

實施例4

為進一步確定醯胺分解活性自CM-瓊脂糖ff樹脂洗提之邊界，如上所述進行另一個實驗，但CM-洗出液收集於根據pH值邊界定義的洗提份中。特定而言，如在管柱出口處所監測，收集CM-洗出液直至預定pH值(4.3、4.8、6.0、7.5)。在此實驗中，用於層析步驟的起始物質為如在實施例3中的科恩分離份II糊劑(P25001ivLE；吸附FIX及AT-III)。CM-瓊脂糖管柱在pH 4.8下平衡且在pH 5.3下洗滌。將洗出液之分離份超濾/滲濾且在分析之前用Tris調節pH值。在此實驗中，在洗提步驟開始時，洗出液之pH值下降至4.1。對所收集之洗出液分離份的分析顯示於表5中。

實施例5

接下來判定每單位CM-瓊脂糖樹脂之蛋白質之量之降低是否會進一步增強圖2中所示之峰分離。為了對此進行測試，在蛋白質負荷遞減下(範圍為每毫升樹脂118 mg蛋白質降至57 mg蛋白質)執行一系列CM-瓊脂糖ff層析操作。如同實施例2，用於實驗的起始物質為科恩分離份II糊劑途徑II；P24701IV；其包括藉由吸附自冷貧血漿移除FIX、FVII及ATIII(表6)。樹脂在pH 5.2下平衡且洗滌步驟在pH 5.7下執行。如同實施例2，彙集CM-瓊脂糖洗出液，分成第一部分(第一峰)及第二部分(第二峰)。圖2提供例示性層析圖，其中當洗出液之UV吸光度在兩個峰之間的約OD₂₈₀=1.6±0.2處達最低點時，第一池結束且第二池開始。

如表7中所示，降低樹脂之蛋白質負荷顯示對峰分離無影響，但對回收率有影響。根據上述實施例所呈現之結果，各層析操作輪次之第一洗出液池中存在極低水準的醯胺分解活性。

實施例6

為進一步驗證上述實驗結果，以可變流速及洗提彙集方案執行CM-瓊脂糖層析純化。簡言之，如本文中所述，將含有高水準之醯胺分解活性(100 nmol/mL.min，6%蛋白質)的科恩分離份II糊劑處理成分離份後進行ANX層析。對於所有CM-瓊脂糖操作，當UV開始上升時收集洗出液且在3個CV之後或4個CV之後停止。

如下執行三次CM瓊脂糖層析純化。如本文中所述將所收集之洗出液分離份濃縮且接著進一步濃縮，以避免PL-1值低於PL-1檢定之偵測限值。

第一次操作：沖洗CM-瓊脂糖樹脂且在1 cm/min流速下平衡。蛋白質裝載、洗滌及洗提步驟之流速保持恆定在0.64 cm/min。主池中收集3個管柱體積(3 CV)之洗出液。

第二次操作：沖洗CM-瓊脂糖樹脂且在1.2 cm/min流速下平衡。蛋白質裝載步驟之流速為0.64 cm/min。洗滌步驟之流速對於最開始的1.2個管柱體積(CV)而言為0.64 cm/min且對於接下來的28.8個CV而言為1.8 cm/min。洗提步驟以0.64 cm/min執行。主池中收集3個管柱體積(3 CV)之洗出液。

第三次操作：沖洗CM-瓊脂糖樹脂且在1.2 cm/min流速下平衡。蛋白質裝載步驟之流速為0.64 cm/min。洗滌步驟之流速對於最開始1.2個管柱體積(CV)而言為0.64 cm/min且對於接下來的28.8個CV而言為1.8 cm/min。洗提步驟以0.64 cm/min執行。主池中收集4個管柱體積之洗 出液。

將各CM-瓊脂糖層析操作之主池濃縮且分析醯胺分解活性(PL-1)、總蛋白質濃度及HPLC特徵。如表8中所示，洗滌步驟之流速增大導致主池中之醯胺分解活性之量降低(比較第1次操作與第2次操作)。收集4個CV(而非3個CV)得到標稱總蛋白質產量(2.55 g/L血漿相對於2.5 g/L血漿；比較第3次操作與第2次操作)，然而，其為最終組成物中存在之醯胺分解活性之總量的兩倍(384.7 PL-1 nmol/min．g蛋白質相比於188.5 PL-1 nmol/min．g蛋白質)。彙集4個CV亦使最終免疫球蛋白組成物之聚集物含量增加(0.52%相比於0.12%；比較第3次操作與第2次操作)。顯然，第2次操作製備之組成物之最終醯胺分解水準及聚集物含量與上文所示一致(參見表2、表4及表5)。

實施例7

為證明上文提供之結果可按比例擴大成工業製造規模，如以上實驗中處理360 g科恩分離份II起始物質。第一池中收集2.9個CV之CM-瓊脂糖且第二池中收集剩餘洗出液。接著將所得洗出液池處理成如本文中所述之適於投予個體的最終容器組成物。此進一步處理包括ANX層析、超濾/滲濾及最終調配物凍乾。接著分析各最終製劑之生物化學特性且結果呈現於表9中。

如表9中所示，來源於CM-瓊脂糖之第一洗提部分的最終組成物所含醯胺分解活性為來源於CM-瓊脂糖之第二洗提部分的50分之一(402 nmol PL-1/min.g蛋白質相比於18,446.6 nmol PL-1/min.g蛋白質)。與來源於CM-瓊脂糖之第二洗提部分的最終組成物相比，來源於CM-瓊脂糖之第一洗提部分的最終組成物亦含有較少白蛋白(1.2%相對於2.3%)、α/β球蛋白(未偵測到，相對於0.2%)、PKA活性(<0.6 IE/mL相對於41.2 IE/mL)及IgG 3(4.6%相對於10.8%)。此外，與來源於CM-瓊脂糖之第二洗提部分的最終組成物相比，來源於CM-瓊脂糖之第一洗提部分的組成物含有高得多的IgG單體含量(94.81%相對於87.86%)。

實施例8

為進一步驗證上文提供之結果，根據本文提供之方法製備分離份II糊劑(RI10XD142；離心之沈澱物A)的一部分。接著將糊劑再懸浮且如本文中所述裝載於CM-瓊脂糖陽離子交換管柱上且如上文所述洗提。洗出液(總體積：4743 mL)分成含有75%總洗出液的第一分離份(3530 mL)及含有25%總洗出液的第二分離份(1213 mL)。接著將CM-瓊脂糖洗出液之第一分離份與第二分離份處理成如本文中所述之最終容器且分析FXIa、TGA、NAPTT及醯胺分解(PL-1)活性、IgG聚集物及ACA含量。結果提供於表10中。根據上文提供之結果，CM-瓊脂糖洗出液分離成第一池及第二池引起最終免疫球蛋白製劑中之FXIa及TGA活性降低。

實施例9

為進一步評估本文提供之方法按規模擴大的可行性，監測大規模製造過程之CM-瓊脂糖洗出液的蛋白質含量、pH值及FXIa活性。簡言之，如本文所述處理約19,000 L冷貧血漿，形成約220 kg之分離份II糊劑，其含有約70 kg蛋白質。將分離份II糊劑再懸浮且裝載於製造規模之CM-瓊脂糖管柱上，洗滌且洗提，如上文所述。收集洗出液樣品且在洗提每一個CV(約350 L)之後分析。如表11中所示，在洗出液pH值移位之後，在CM-瓊脂糖洗提結束時，僅發現FXIa值升高。監測洗出液在OD₂₈₀下之蛋白質濃度且收集第一洗提部分且彙集直至OD₂₈₀下降低於2.0。接著收集第二洗提部分且分別彙集直至OD₂₈₀下降低於0.2。接著對第一及第二洗出液池進行分析且比較，如表12中所示。顯然，在CM洗出液之第一部分中發現IgG產率為98%且在CM洗出液之第二部分中發現IgG產率為2%。因此，藉由在洗出液之OD₂₈₀下降低於2.0之後終止收集CM-瓊脂 糖洗提池，可自製劑中移除大量TGA及FXIa活性，同時使IgG產率損失最小化。

實施例10

為進一步評估所揭示之降低免疫球蛋白組成物之醯胺分解性水準的方法，使用分離份II沈澱物作為起始物質來進行第二次大規模實驗。簡言之，如實施例1中所述製備分離份II沈澱物，但藉由過濾而非離心來分離沈澱物A。

如實施例1中所述，對分離份II沈澱物進行CM-陽離子層析。如同實施例1，將CM洗出液收集於兩個池中，亦 即含有大部分IgG內容物的前導部分(E1)及含有大部分醯胺分解活性的滯後部分(E2)。在OD 400 mAU處開始收集洗出液之第一部分(E1)且在恰好2.7個管柱體積之後停止。收集洗提峰之第二分離份(E2)，直至OD再下降至400 mAU。接著單獨處理所洗提之分離份以供製程之剩餘部分用。純化製程之質量平衡顯示於表13中。

如同實施例1，在洗提峰之第二部分中發現約10%之總蛋白質。此為若在2.7個管柱體積之後停止洗提而證實的產率損失。

使用受質SN13a且使用TGA、FXIa及NAPTT檢定，對由兩個CM洗提分離份(E1及E2)製備的最終容器分析分子尺寸分佈、抗補體活性、醯胺分解活性。結果顯示於表14及表15中。

來源於所洗提之IgG分離份之第一及第二部分之最終容器的生物化學特性揭示，第一洗提部分基本上不含FXIa及導致TGA升高及NAPTT值縮小的其他非所要蛋白質。相比之下，第二部分中之FXIa及醯胺分解活性增濃，其中即使藉由過濾分離懸浮液A，聚集物及寡聚物/二聚物含量亦較高。有趣的是，洗出液之第一部分中的ACA值甚至更低，而洗出液之第二部分中的ACA值較高。

在此實驗中，在上游處理中使用過濾分離懸浮液A的情況下，第二洗提部分中之殘餘FXIa少得多且此洗提部分之最終容器之TGA值處於正常範圍內。

與實施例1合起來看，將來自CM瓊脂糖ff管柱之洗出液分離成兩個分離份(E1及E2)容許製造實質上不含FXIa的IgG組成物。對於分離份A之分離方案(亦即離心及過濾)而言確是如此，但藉由過濾分離沈澱物A時，FXIa顯著更低。

實施例11

此實施例證明本發明方法適合在用於製造皮下投予之免疫球蛋白組成物的大規模製造過程中藉由陽離子交換層析分離促凝血活性。用於此實驗之起始物質為由在歐洲收集之經彙集之人類來源血漿形成的分離份II沈澱物，其經冷沈澱且經由吸附用於回收抗凝血酶III(ATIII)。

簡言之，冷沈澱及吸附ATIII之後，冷醇份化以血纖維蛋白原及殘餘凝血因子(例如因子XIII)之分離開始，此分離係藉由使分離份I沈澱物在8%醇及pH 7.0下沈澱來達成。上層清液中之醇濃度調節至25%，以便使分離份II+III沈澱且使白蛋白分離。使沈澱物II+III再懸浮之後，添加醇直至12%、pH值為約5.2，形成沈澱物III。分離沈澱物III之後，添加0.04 g DEAE葡聚糖凝膠/g蛋白質，溶液經由Cuno 90深度過濾器過濾，且含有經純化之γ球蛋白分離份的科恩分離份II係藉由25%醇在中性pH值下沈澱。

將分離份II沈澱物溶於4℃及pH 5.2±0.2之冷水中。藉由CWSS過濾澄清之後，調節溶液至2%之蛋白質濃度以便SD處理。SD培育期間之溫度保持在20℃至25℃範圍內。將蛋白質溶液裝載於經平衡之CM-瓊脂糖快速流管柱(平衡緩衝液：0.025 M乙酸鈉，pH 5.0±0.2)上。裝載之後，管柱用30個管柱體積之乙酸鹽緩衝液(0.01 M乙酸鈉，pH 5.5±0.2)洗滌以洗去SD試劑，隨後用洗提緩衝液(0.25 M NaCl，0.2 M甘胺酸，0.1% PEG 3350，25 mM Tris，pH 8.00)洗提所吸附的蛋白質。在OD 400 mAU下開始收集洗出液 之第一部分(E1)且在恰好2.7個管柱體積之後停止。收集洗提峰之第二分離份(E2)，直至OD再下降至400 mAU。根據以下步驟將所洗提之分離份單獨處理成最終主體。

將洗出液分離份之pH值調節至5.2且接著將濃度調節至5%，相對於滲濾緩衝液(0.02 M NaCl，0.05% PEG 3350)滲濾且隨後濃縮至10%蛋白質。向溶液中添加0.055 g甘胺酸/g蛋白質且將pH值調節至7.0，隨後進行無菌過濾。

陽離子交換洗滌及洗提步驟之層析圖顯示於圖3中。行1顯示UV吸光度，行2顯示電導率，且行3顯示管柱出口處之pH值。280 nm下之光學密度指示，在蛋白質自CM瓊脂糖ff管柱洗提期間，兩個分離份出現部分分離。洗提期間，管柱出口處之pH值在UV吸光度剛開始再上升之後開始上升。此時，將洗出液之兩個分離份分離(F4及F5，本文中稱為E1及E2)。下游純化操作之質量平衡顯示於表16中。

在洗提峰之第二部分(E2)中發現約15%之總蛋白質。此係由於2.7個管柱體積之後停止收集E1而造成的產率損失。使用受質SN13a且使用TGA、FXIa及NAPTT檢定，對由兩個CM洗提分離份(E1及E2)製備的最終容器分析分子尺寸分佈、抗補體活性、醯胺分解活性。結果顯示於表17及表18中。

CM-洗出液(E1)之第一部分使得最終主體的聚集物、二聚物及片段含量較低，FXIa含量低、TGA結果接近於正常血漿、PKA及醯胺分解活性如使用SN-13所測低於偵測限值且NAPTT未縮小。第二部分中之FXIa、PKKA及FXIa樣活性增濃，其中IgG聚合物、片段及寡聚物/二聚物含量亦較高。有趣的是，洗出液(E1)之前導部分中的ACA值低於洗出液(E2)之滯後部分中的ACA值。

實施例12

為進一步評估所揭示之降低免疫球蛋白組成物之醯胺 分解性水準的方法，使用分離份II沈澱物作為起始物質來進行另一個大規模實驗。簡言之，如實施例11中所述製備分離份II沈澱物，但用於此實驗的起始物質為由在歐洲收集之經彙集之人類來源血漿形成的分離份II沈澱物，其經冷沈澱且經由吸附用於回收FEIBA及抗凝血酶III(ATIII)。如實施例11中所述，另外執行CM-瓊脂糖陽離子交換層析及下游處理。

陽離子交換洗滌及洗提步驟之層析圖顯示於圖4中。行1顯示UV吸光度，行2顯示電導率，且行3顯示管柱出口處之pH值。280 nm下之光學密度指示，在蛋白質自CM瓊脂糖ff管柱洗提期間，兩個分離份出現部分分離。洗提期間，管柱出口處之pH值在UV吸光度剛開始再上升之後開始上升。此時，將洗出液之兩個分離份分離(F4及F5，本文中稱為E1及E2)。下游純化操作之質量平衡顯示於表19中。

如同實施例11，在洗提峰之第二部分中發現約15%之總蛋白質。此係由於2.7個管柱體積之後停止收集E1造成的產率損失。使用受質SN13a且使用TGA、FXIa及NAPTT檢定，對由兩個CM洗提分離份(E1及E2)製備的最終容器分析分子尺寸分佈、抗補體活性、醯胺分解活性。結果顯示於表20及表21中。

來源於所洗提之IgG分離份之第一及第二部分的穩定化主體之生物化學特徵揭示，第一洗提部分基本上不含FXIa及導致TGA升高及NAPTT值縮小的其他非所要蛋白質，而第二部分中之PKKA、FXIa及FXIa樣活性增濃，其中IgG片段、聚合物及寡聚物/二聚物含量亦較高。洗出液之第一部分及第二部分之主體的ACA值差異不顯著。結果總體上證實實施例11之研究結果。

實施例13

為進一步評估所揭示之降低免疫球蛋白組成物之醯胺 分解性水準的方法，使用分離份II沈澱物作為起始物質來進行另一個大規模實驗。簡言之，如實施例11中所述製備分離份II沈澱物，但用於此實驗的起始物質為由在美國收集之經彙集之人類來源血漿形成的分離份II沈澱物，其經冷沈澱且經由吸附用於回收FEIBA及抗凝血酶III(ATIII)。如實施例11中所述，另外執行CM-瓊脂糖陽離子交換層析及下游處理。

陽離子交換洗滌及洗提步驟之層析圖顯示於圖5中。行1顯示UV吸光度，行2顯示電導率，且行3顯示管柱出口處之pH值。280 nm下之光學密度指示，在蛋白質自CM瓊脂糖ff管柱洗提期間，兩個分離份出現部分分離。洗提期間，管柱出口處之pH值在UV吸光度剛開始再上升之後開始上升。此時，將洗出液之兩個分離份分離(F4及F5，本文中稱為E1及E2)。下游純化操作之質量平衡顯示於表22中。

如同實施例11，在洗提峰之第二部分中發現約15%之總蛋白質。此係由於2.7個管柱體積之後停止收集E1而造成的產率損失。使用受質SN13a且使用TGA、FXIa及NAPTT檢定，對由兩個CM洗提分離份(E1及E2)製備的最終容器再次分析分子尺寸分佈、抗補體活性、PKKA、FXIa樣活性。結果顯示於表23及表24中。

最終主體之生物化學特性證實實施例11及12之結果。第一洗提部分(E1)基本上不含FXIa及導致TGA升高及NAPTT值縮小的其他非所要蛋白質，而第二部分(E2)中之FXIa及醯胺分解活性增濃，其中即使藉由過濾分離懸浮液A，片段、聚合物及寡聚物/二聚物含量亦較高。有趣的是，洗出液之第一部分之穩定化主體中的ACA值再次低於洗出液之第二部分之主體中的ACA值。

綜合而言，上述實施例得到之結果證明，將來自CM瓊脂糖ff管柱之洗出液分離成兩個分離份容許製造實質上不 含促凝血活性的免疫球蛋白組成物。對於不同血漿來源(EU及US)及上游處理方案而言確實如此。

針對實施例11至13所述之免疫球蛋白製劑測定的產品損失高於實施例1至10中所示之損失。在實施例11至13中，2.7個管柱體積之後分離洗提峰將導致總蛋白質損失約15%。由於實施例11至15中洗出液之pH值移位更遲，因此更遲的洗提分割將改良總產率而不會顯著影響促凝血活性之分離。

上文所示之資料證明，分離陽離子交換層析洗出液為製造促凝血活性實質上降低之免疫球蛋白組成物的有力方法。

應瞭解，本文所述之實施例及具體實例僅具說明性目的，且熟習此項技術者可根據其提出不同修改或變更，且該等修改或變更包括於本申請案之精神及範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。本文中引述之所有公開案、專利及專利申請案皆以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。

圖1顯示實施例1中所述之CM瓊脂糖快速流(ff)層析步驟之層析圖。行號1顯示UV吸光度，行號2顯示pH值，且行號3顯示管柱出口處之流出液之電導率。280奈米下之光學密度指示，在蛋白質自CM瓊脂糖ff管柱洗提期間，兩個洗提份出現部分分離。洗提期間，管柱出口處之pH值在UV吸光度剛開始再上升之前開始上升。此時，兩 種洗提份分離，如層析圖中展示為F4及F5(洗提份4及洗提份5)，上文中稱為E1及E2。

圖2顯示實施例2中所述之CM瓊脂糖ff操作之層析圖。說明pH值及OD 280在IgG洗提份自CM瓊脂糖ff(起始物質：科恩分離份II糊劑途徑II(Cohn fraction II paste pathway)；P24701IV；吸附步驟：FIX；FVII；AT III)洗提期間的進程。

圖3顯示實施例11中所述之CM瓊脂糖快速流(ff)層析步驟之層析圖。行號1顯示UV吸光度，行號3顯示pH值，且行號2顯示管柱出口處之流出液之電導率。

圖4顯示實施例12中所述之CM瓊脂糖快速流(ff)層析步驟之層析圖。行號1顯示UV吸光度，行號3顯示pH值，且行號2顯示管柱出口處之流出液之電導率。

圖5顯示實施例13中所述之CM瓊脂糖快速流(ff)層析步驟之層析圖。行號1顯示UV吸光度，行號3顯示pH值，且行號2顯示管柱出口處之流出液之電導率。

Claims (58)

1. 一種用於降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之因子XI(FXI)及/或因子XIa(FXIa)含量的方法，該方法包含步驟：(a)提供包含IgG免疫球蛋白及FXI及/或FXIa的血漿來源免疫球蛋白組成物；(b)使該血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使該等IgG免疫球蛋白及至少一部分FXI及/或FXIa結合至該陽離子交換樹脂；(c)藉由使該陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15mS/cm的洗提緩衝液接觸以形成包含前導部分及滯後部分的洗出液來使該等IgG免疫球蛋白自該陽離子交換樹脂洗提；及(d)分別收集該洗出液之前導部分及該洗出液之滯後部分，其中該洗出液之前導部分包含相較於起始組成物具有降低量的醯胺分解活性之IgG免疫球蛋白組成物，且該洗出液之滯後部分含有相較於該洗出液之前導部分較高濃度之醯胺分解活性。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該洗提緩衝液包含電導率為至少20mS/cm。
3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該洗提緩衝液包含電導率為至少25mS/cm。
4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，該方法在步驟(c)中使該等免疫球蛋白自該陽離子交換樹脂洗提之前另外包含用包含pH值不超過6.0及電導率小於11mS/cm的洗滌緩衝液洗滌結合有該等免疫球蛋白及FXI及/或FXIa之陽離子交換樹脂的步驟。
5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。
6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該弱陽離子交換樹脂為羧甲基陽離子交換樹脂。
7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該洗提緩衝液包含介於7.5與8.5之間之pH值。
8. 如申請專利範圍第7項之方法，其中該洗提緩衝液包含8.0±0.2之pH值。
9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該洗提緩衝液包含200mM與300mM之間的氯化鈉。
10. 如申請專利範圍第9項之方法，其中該洗提緩衝液包含240mM與260mM之間的氯化鈉。
11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該洗提緩衝液包含100mM與300mM之間的甘胺酸。
12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該洗提緩衝液包含175mM與225mM之間的甘胺酸。
13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該洗出液之前導部分係由不超過70%之該洗出液組成。
14. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分別收集洗 出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過7.0的洗出液及pH值超過7.0的洗出液。
15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.5的洗出液及pH值超過6.5的洗出液。
16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.0的洗出液及pH值超過6.0的洗出液。
17. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.5的洗出液及pH值超過5.5的洗出液。
18. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.0的洗出液及pH值超過5.0的洗出液。
19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含監測該洗出液之pH值。
20. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該收集洗出液之前導部分的步驟包含子步驟：(i)監測該洗出液在280nm下的光學密度(OD₂₈₀)；(ii)當該洗出液之OD₂₈₀上升超過至少50mAU之第一臨限值OD₂₈₀時，開始收集；及(iii)當該洗出液之OD₂₈₀下降低於不小於1或2AU之第二臨限值OD₂₈₀時，終止收集。
21. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該洗滌緩衝液包含介於5.0與6.0之間之pH值。
22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該洗滌緩衝液包含為5.5±0.2之pH值。
23. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(b)中結合至陽離子交換樹脂的FXI及/或FXIa有不到50%存在於步驟(d)中所收集之該洗出液之前導部分中。
24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該步驟(b)中結合至陽離子交換樹脂的FXI及/或FXIa有不到25%存在於步驟(d)中所收集之該洗出液之前導部分中。
25. 如申請專利範圍第23項之方法，其中該步驟(b)中結合至陽離子交換樹脂的FXI及/或FXIa有不到10%存在於步驟(d)中所收集之該洗出液之前導部分中。
26. 如申請專利範圍第23項之方法，其中FXI及/或FXIa之量係藉由使用FXIa特異性受質執行醯胺分解活性檢定來測定。
27. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的血漿分離份沈澱物，其選自由以下組成之群：分離份I沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、及其經修飾之沈澱物。
28. 如申請專利範圍第27項之方法，其中該步驟(a)中提供的血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的分離份II沈 澱物。
29. 一種用於降低血漿來源免疫球蛋白組成物中之抗補體活性(ACA)的方法，該方法包含步驟：(a)提供包含IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA的血漿來源免疫球蛋白組成物；(b)使該血漿來源免疫球蛋白組成物與安置於層析管柱中的陽離子交換樹脂在包含pH值不超過6.0及電導率不超過11mS/cm的第一溶液條件下接觸，以使該等IgG免疫球蛋白及第一種量之ACA之至少一部分結合至該陽離子交換樹脂；(c)藉由使該陽離子交換樹脂與包含pH值為至少7.5及電導率為至少15mS/cm的洗提緩衝液接觸以形成包含前導部分及滯後部分的洗出液來使該等IgG免疫球蛋白自該陽離子交換樹脂洗提；及(d)分別收集該洗出液之前導部分及該洗出液之滯後部分，其中該洗出液之前導部分包含相較於起始組成物具有降低量的醯胺分解活性之IgG免疫球蛋白組成物，且該洗出液之滯後部分含有相較於該洗出液之前導部分較高濃度之醯胺分解活性。
30. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該洗提緩衝液包含電導率為至少20mS/cm。
31. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該洗提緩衝液包含電導率為至少25mS/cm。
32. 如申請專利範圍第29項至第31項中任一項之方 法，該方法在步驟(c)中使該等免疫球蛋白自該陽離子交換樹脂洗提之前另外包含用包含pH值不超過6.0及電導率小於11mS/cm的洗滌緩衝液洗滌結合有該等免疫球蛋白及ACA之陽離子交換樹脂的步驟。
33. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該陽離子交換樹脂為弱陽離子交換樹脂。
34. 如申請專利範圍第33項之方法，其中該弱陽離子交換樹脂為羧甲基陽離子交換樹脂。
35. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該洗提緩衝液包含介於7.5與8.5之間之pH值。
36. 如申請專利範圍第35項之方法，其中該洗提緩衝液包含為8.0±0.2之pH值。
37. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該洗提緩衝液包含200mM與300mM之間的氯化鈉。
38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該洗提緩衝液包含240mM與260mM之間的氯化鈉。
39. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該洗提緩衝液包含100mM與300mM之間的甘胺酸。
40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該洗提緩衝液包含175mM與225mM之間的甘胺酸。
41. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該洗出液之前導部分係由不超過70%該洗出液組成。
42. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集 pH值不超過7.0的洗出液及pH值超過7.0的洗出液。
43. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.5的洗出液及pH值超過6.5的洗出液。
44. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過6.0的洗出液及pH值超過6.0的洗出液。
45. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.5的洗出液及pH值超過5.5的洗出液。
46. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含分別收集pH值不超過5.0的洗出液及pH值超過5.0的洗出液。
47. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該分別收集洗出液之前導部分及洗出液之滯後部分的步驟包含監測該洗出液之pH值。
48. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該收集洗出液之前導部分的步驟包含子步驟：(i)監測該洗出液在280nm下的光學密度(OD₂₈₀)；(ii)當該洗出液之OD₂₈₀上升超過至少50mAU之第一臨限值OD₂₈₀時，開始收集；及(iii)當該洗出液之OD₂₈₀下降低於不小於1或2AU之第二臨限值OD₂₈₀時，終止收集。
49. 如申請專利範圍第32項之方法，其中該洗滌緩衝液 包含介於5.0與6.0之間之pH值。
50. 如申請專利範圍第49項之方法，其中該洗滌緩衝液包含為5.5±0.2之pH值。
51. 如申請專利範圍第29項之方法，其中步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度低於步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物中相對於IgG免疫球蛋白濃度之ACA濃度。
52. 如申請專利範圍第51項之方法，其中步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度比步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物中相對於IgG免疫球蛋白濃度之ACA濃度低至少25%。
53. 如申請專利範圍第51項之方法，其中步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度比步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物中相對於IgG免疫球蛋白濃度之ACA濃度低至少50%。
54. 如申請專利範圍第29項之方法，其中步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度低於步驟(d)中所收集之洗出液之滯後部分中相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度。
55. 如申請專利範圍第54項之方法，其中步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度小於步驟(d)中所收集之洗出液之滯後 部分中相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度之50%。
56. 如申請專利範圍第54項之方法，其中步驟(d)中所收集之洗出液之前導部分中存在相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度小於步驟(d)中所收集之洗出液之滯後部分中相對於IgG免疫球蛋白濃度的ACA濃度之25%。
57. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該步驟(a)中所提供之血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的血漿分離份沈澱物，其選自由以下組成之群：分離份I沈澱物、分離份I+II+III沈澱物、分離份II+III沈澱物、分離份IV-1、Kistler-Nitschmann沈澱物A、Kistler-Nitschmann沈澱物B、及其經修飾之沈澱物。
58. 如申請專利範圍第57項之方法，其中該步驟(a)中提供的血漿來源免疫球蛋白組成物為懸浮的分離份II沈澱物。