KR101949553B1 - 혈장 유래 면역글로빈 조성물의 혈전색전성 가능성을 감소시키는 방법 - Google Patents

혈장 유래 면역글로빈 조성물의 혈전색전성 가능성을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피의 사용을 통한 면역글로빈 조성물의 아미도분해 및 항보체 활성(ACA) 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 본 발명은 양이온 교환 용리물의 전연부를 수집하여 면역글로빈 조성물의 XI 인자 및/또는 XIa 인자 및/또는 ACA 함량을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 아미도분해 활성, XI 인자 및/또는 XIa 인자 및/또는 ACA 함량의 수준이 감소된 면역글로빈 조성물을 제공한다.

Description

혈장 유래 면역글로빈 조성물의 혈전색전성 가능성을 감소시키는 방법{METHOD FOR REDUCING THE THROMBOEMBOLIC POTENTIAL OF A PLASMA-DERIVED IMMUNOGLOBULIN COMPOSITION}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2011년 8월 26일자에 출원된 미국 가출원 제61/527,974호의 이익을 주장하고, 이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함된다.
혈장 유래 혈액 제품은 다양한 혈액 장애뿐만 아니라, 다른 기원의 질환을 치료하기 위해 사용된다. 예를 들면, 인간 혈장 유래의 면역글로빈(IgG) 제품은 면역 결핍증을 치료하기 위해 1952년에 처음 사용되었다. 이후, IgG 제제는 (1) 면역 결핍증, 예컨대 X염색체 연관 무감마글로불린혈증, 저감마글로부민혈증(1차 면역 결핍증) 및 낮은 항체 수준을 특징으로 하는 후천성 손상 면역 병증(이차 면역 결핍증); (2) 염증성 및 자가면역 질환; 및 (3) 급성 감염의 의학 병증의 적어도 3가지 주요 카테고리에서 널리 사용되고 있다.
혈장 유래 생물학적 치료제를 제조하고 제제화할 때 다양한 안전성 예방을 취해야 한다. 이러한 예방은 수혈된 혈장 사용으로부터 생기는 혈액성 병원균(예를 들면, 바이러스 및 박테리아 병원균), 항보체 활성 및 다른 원치않는 오염물질을 제거하고/하거나 불활성화하는 방법을 포함한다. 연구에 의하면 높은 수준의 아미도분해 활성(amidolytic activity)의 투여가 원치않는 혈전색전성 사건을 발생시킨다는 것이 제시되었다(Wolberg AS et al., Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am J Hematol 2000;65:30-34; 및 Alving BM et al., Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980; 96:334-346; 이의 개시내용이 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨).
이러한 관심의 흥미로운 부분은 증가된 혈전색전성 사건 보고에 따라 미국이 옥타감(Octagam)(등록상표)(옥타파마(Octapharma))을 자발적으로 철수시키고 유럽 연합이 옥타감(등록상표) 및 옥타감 10%에 대한 시판 허가를 중지한 것이다. 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 지모겐 불순물, 예컨대 XI 인자, XIa 인자, XII 인자 및 XIIa 인자에 의해 야기되는 생물제제에서 높은 수준의 아미도분해 활성에 의해 증가된 혈전성 사건이 야기된다는 것이 제시되어 있다(FDA 논평: 자발적인 시장 철수 - 2010년 9월 23일, 옥타감[정맥내(인간) 면역글로빈] 5% 액체 제제; 옥타감 50㎎/㎖, 용액 푸어 관류 - 옥타파마 프랑스(Octapharma France) - Mise en quarantaine de tous les lots, AFSSAPS이 2010년 9월 9일에 온라인으로 발표; 및 옥타감(인간 정상 면역글로빈 5% 및 10%)에 대한 시장 허가 중단에 대한 질문 및 해답, 유럽 의약국이 2010년 9월 23일에 온라인으로 발표).
EDQM(유럽 의약품질위원회: European Directorate on the Quality of Medicines & Health Care)은 면역글로빈 제품에서 잠재적 응고촉진 활성을 해결하기 위해 2012년 1월 1일에 신속한 실행을 위해 정맥내 투여용 인간 정상 면역글로빈에 대한 모노그래프의 개정안(0918)을 발표하였다. 이 개정안은 "제조 방법은 또한 혈전증 발생 물질을 제거하는 것으로 보이는 단계 또는 단계들을 포함한다. 활성화된 응고 인자 및 이의 지모겐의 확인 및 이의 활성화를 발생시킬 수 있는 과정 단계가 강조된다. 제조 공정에 의해 도입되는 다른 응고촉진제를 또한 고려한다"라고 기술하고 있다.
2011년 3월 18일에, 스위스 의료제품청(Swissmedic)은 FDA에 의하면 혈전색전성 부작용이 다양한 비바글로빈(Vivaglobin) 제품 롯트와 관련되는 것이 보인다고 보고하였다. CSL에 의해 제조된 비바글로빈(피하 주사용 160㎎/㎖의 인간 정상 면역글로빈 용액)은 1차 면역결핍 증후군, 골수종 또는 만성 림프구성 백혈병을 앓고 있는 성인 및 어린이에 대한 대체 치료로서 승인받았다. 혈전색전성 부작용의 위험은 이 투여 경로에 대해 이때까지 공지되지 않았다. 조사자들은 적어도 몇몇 배취(batch)에서 응고촉진 활성을 밝혀냈다. 그 결과, 비바글로빈은 시장으로부터 철수되었고, 새로운 제품 하이제트라(Hizentra)(피하 주사용 20%의 인간 정상 면역글로빈 용액)로 대체되었다. 비바글로빈에 보고된 부작용으로 인해, 피하 투여용 면역글로빈 제품이 정맥내 면역글로빈 제품에 대한 요건과 유사한 낮은 수준의 응고촉진 활성을 가질 것을 요한다.
일반적으로 공지된 응고 인자로 공지된 전용 세린 프로테아제는 응고 캐스케이드의 접촉 활성화 및 조직 인자 경로 둘 다의 내부 성분이다. 응고 경로의 자극 시, 불활성 효소 전구체인 세린 프로테아제 지모겐은 활성화된 프로테아제가 되어 다음 프로테아제 지모겐의 활성화를 촉진하여, 활성화 캐스케이드를 발생시킨다. 이 응고 캐스케이드는 트롬빈(IIa 인자) 및 XIIIa 인자의 활성화에 이르고, 이 인자들은 각각 피브리노겐(I 인자)을 피브린(Ia 인자)으로 전환시키고 피브린을 가교결합시켜 피브린 혈전을 형성하도록 작용한다.
고유한 응고 경로로도 공지된 접촉 활성화 경로는 각각 프리칼리크레인(Prekallikrein) 및 XII 인자로부터 칼리크레인(Kallikrein) 및 XIIa 인자(FXIIa)의 활성화로 시작한다. 활성화된 세린 프로테아제 FXIIa는 XI 인자(Factor XI: FXI)를 절단하여, Xa 인자(FXa)의 후속 활성화에 참여하는 활성 세린 프로테아제인 XIa 인자(Factor XIa: FXIa)로 전환시킨다.
혈장 유래 단백질 조성물에서 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 지모겐의 존재에 대한 관심 증가로, 면역글로빈 제제에서 이 오염물질, 특히 FXI 및 FXIa의 수준을 감소시키는 방법에 대한 수요가 당해 분야에 존재한다.
본 발명은, 다른 양태 중에서, IgG 면역글로빈 조성물의 아미도분해 함량(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa)을 감소시키는 방법 및 시장에서 구입 가능한 필적하는 조성물보다 더 낮은 수준의 아미도분해 활성(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa)을 갖는 IgG 면역글로빈 조성물을 제공한다.
제1 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(FXI) 및/또는 XIa 인자(FXIa) 함량을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 제공하는 단계; (b) 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율(conductivity)을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 IgG 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (c) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 IgG 면역글로빈을 용리시켜 전연부(leading portion) 및 후연부(lagging portion)를 포함하는 용리물을 형성하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 용리물 중 80% 이하를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c)에서 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시키기 전에 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa가 결합된 양이온 교환 수지를 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 미만의 전도율을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지(weak cation exchange resin)이다. 상기 제공된 방법의 특정 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸 양이온 교환 수지이다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 7.5 내지 8.5의 pH를 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 8.0±0.2의 pH를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 200mM 내지 300mM 염화나트륨을 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 240mM 내지 260mM 염화나트륨을 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 100mM 내지 300mM 글라이신을 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 175mM 내지 225mM 글라이신을 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 전연부는 상기 용리물 중 70% 이하로 이루어진다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 7.0 초과인 용리물로부터 pH가 7.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.5 초과인 용리물로부터 pH가 6.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.0 초과인 용리물로부터 pH가 6.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.5 초과인 용리물로부터 pH가 5.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.0 초과인 용리물로부터 pH가 5.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 용리물의 pH를 모니터링하는 단계를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 전연부를 수집하는 단계는 (ⅰ) 280㎚에서의 용리물의 광학 밀도(OD280)를 모니터링하는 하위단계; (ⅱ) 용리물의 OD280이 적어도 50mAU의 제1 역치(threshold) OD280 초과로 상승할 때 수집을 시작하는 하위단계; 및 (ⅲ) 용리물의 OD280이 500mAU 이상의 제2 역치 OD280 미만으로 하강할 때 수집을 종료하는 하위단계를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제2 역치 OD280은 1AU 이상이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제2 역치 OD280은 2AU 이상이다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 세척 완충제는 5.0 내지 6.0의 pH를 포함한다. 상기 제공된 방법의 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 5.5±0.2의 pH를 포함한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (b)에서 양이온 교환 수지에 결합된 FXI 및/또는 FXIa 중 50% 미만은 단계 (d)에서 수집된 용리물의 전연부에 존재한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (b)에서 양이온 교환 수지에 결합된 FXI 및/또는 FXIa 중 25% 미만은 단계 (d)에서 수집된 용리물의 전연부에 존재한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (b)에서 양이온 교환 수지에 결합된 FXI 및/또는 FXIa 중 10% 미만은 단계 (d)에서 수집된 용리물의 전연부에 존재한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, FXI 및/또는 FXIa의 양을 FXIa 특이적 기질을 사용하는 아미도분해 활성 검정을 수행하여 결정한다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만(Kistler-Nitschmann) A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물로 이루어진 군으로부터 선택되는 현탁된 혈장 분획 침전물이다.
상기 제공된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 현탁된 II 분획 침전물이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내에 항보체 활성(anti-complement activity: ACA)을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 제공하는 단계; (b) 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 IgG 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (c) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 IgG 면역글로빈을 용리시켜 전연부 및 후연부를 포함하는 용리물을 형성하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 용리물 중 80% 이하를 포함하는 방법을 제공한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함한다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 포함한다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 상기 방법은 단계 (c)에서 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시키기 전에 면역글로빈 및 ACA가 결합된 양이온 교환 수지를 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 미만의 전도율을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 상기 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸 양이온 교환 수지이다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 7.5 내지 8.5의 pH를 포함한다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 8.0±0.2의 pH를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 200mM 내지 300mM 염화나트륨을 포함한다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 240mM 내지 260mM 염화나트륨을 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리 완충제는 100mM 내지 300mM 글라이신을 포함한다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 용리 완충제는 175mM 내지 225mM 글라이신을 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 전연부는 상기 용리물 중 70% 이하로 이루어진다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 7.0 초과인 용리물로부터 pH가 7.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.5 초과인 용리물로부터 pH가 6.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.0 초과인 용리물로부터 pH가 6.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.5 초과인 용리물로부터 pH가 5.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.0 초과인 용리물로부터 pH가 5.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 용리물의 pH를 모니터링하는 단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 용리물의 전연부를 수집하는 단계는 (ⅰ) 280㎚에서의 상기 용리물의 광학 밀도(OD280)를 모니터링하는 하위단계; (ⅱ) 용리물의 OD280이 적어도 50mAU의 제1 역치 OD280 초과로 상승할 때 수집을 시작하는 하위단계; 및 (ⅲ) 용리물의 OD280이 500mAU 이상의 제2 역치 OD280 미만으로 하강할 때 수집을 종료하는 하위단계를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 제2 역치 OD280은 1AU 이상이다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 제2 역치 OD280은 2AU 이상이다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 세척 완충제는 5.0 내지 6.0의 pH를 포함한다. 상기 기재된 방법의 다른 실시양태에서, 세척 완충제는 5.5±0.2의 pH를 포함한다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내의 ACA의 농도보다 낮다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내의 ACA의 농도보다 적어도 25% 낮다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내의 ACA의 농도보다 적어도 50% 낮다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 후연부 내의 ACA의 농도보다 낮다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 후연부 내의 ACA의 농도보다 50% 낮다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 후연부 내의 ACA의 농도보다 25% 낮다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물로 이루어진 군으로부터 선택되는 현탁된 혈장 분획 침전물이다.
상기 기재된 방법의 일 실시양태에서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 현탁된 II 분획 침전물이다.
도 1은 실시예 1에 기재된 CM 세파로스 고속 유동(ff) 크로마토그래피 단계의 크로마토그램을 나타낸다. 라인 숫자 1은 UV 흡광도를 나타내고, 라인 숫자 2는 pH를 나타내고, 라인 숫자 3은 칼럼 출구의 유출물의 전도율 나타낸다. 280나노미터에서의 광학 밀도는 CM 세파로스 ff 칼럼으로부터 단백질의 용리 동안 2개의 분획의 부분 분리를 나타낸다. 칼럼 출구에서의 pH는 용리 동안 UV 흡광도의 재상승 시작 직전 상승하기 시작한다. 이때, 2개의 용리물 분획을 하기에서 E1 및 E2라 칭하는 F4 및 F5(4 분획 및 5 분획)로서 크로마토그램에 나타낸 바대로 분리한다.
도 2는 실시예 2에 기재된 CM 세파로스 ff 실행의 크로마토그래프를 나타낸다. CM 세파로스 ff(출발 물질: 콘(콘) II 분획 페이스트 경로 II; P24701IV; 흡착 단계: FIX; FVII; AT III)로부터의 IgG 분획의 용리 동안 pH 및 OD 280의 코스를 예시한다.
도 3은 실시예 11에 기재된 CM 세파로스 고속 유동(ff) 크로마토그래피 단계의 크로마토그램을 나타낸다. 라인 숫자 1은 UV 흡광도를 나타내고, 라인 숫자 3은 pH를 나타내고, 라인 숫자 2는 칼럼 출구의 유출물의 전도율 나타낸다.
도 4는 실시예 12에 기재된 CM 세파로스 고속 유동(ff) 크로마토그래피 단계의 크로마토그램을 나타낸다. 라인 숫자 1은 UV 흡광도를 나타내고, 라인 숫자 3은 pH를 나타내고, 라인 숫자 2는 칼럼 출구의 유출물의 전도율 나타낸다.
도 5는 실시예 13에 기재된 CM 세파로스 고속 유동(ff) 크로마토그래피 단계의 크로마토그램을 나타낸다. 라인 숫자 1은 UV 흡광도를 나타내고, 라인 숫자 3은 pH를 나타내고, 라인 숫자 2는 칼럼 출구의 유출물의 전도율 나타낸다.
Ⅰ. 도입
치료학적 혈장 유래 정맥내 면역글로빈 조성물의 광범위한 사용을 고려할 때, 이 조성물의 안전성 보장이 제일 중요하다. 혈장 유래 면역글로빈이 투여된 환자에서 혈전색전성 사건의 발병률과 관련되는 면역글로빈 조성물의 아미도분해 함량에 대한 관심은 면역글로빈의 제조 동안 세린 프로테아제(예를 들면, FXIa 및 FXIIa) 및 세린 프로테아제 지모겐(예를 들면, FXI 및 FXII)을 효과적으로 감소시키는 방법에 대한 요건을 강조한다.
본 발명은 양이온 교환 용리물의 전연부만을 수집하여 유의적인 양의 아미도분해 활성(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa) 및/또는 항보체 활성(ACA)이 면역글로빈 조성물로부터 제거될 수 있다는 놀라운 발견에 적어도 부분적으로 기초한다. 그러므로, 혈장 유래 단백질 조성물의 제조 동안 세린 프로테아제 및 세린 프로테아제 지모겐의 농도를 감소시키기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 양이온 교환 수지로부터 단일 단계 용리 동안, (예를 들면, 적어도 FXI 및/또는 FXIa에 기인하는) 아미도분해 활성 및/또는 ACA의 유의적인 분획의 용리 전에 수지로부터 IgG 면역글로빈이 방출된다는 발견에 기초한다. 구체적으로, IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성에 기여하는 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 pH가 적어도 7.0 초과인 용리 완충제와 접촉 시, 칼럼으로부터 회수된 초기 용리물의 pH가 낮다(예를 들면, 5.0 미만의 pH)는 것을 발견하였다. 일정 기간 후, 칼럼으로부터 회수된 용리물의 pH는 7.0 초과로 이동한다. 놀랍게도, pH가 낮은 초기 용리물이 낮은 수준의 아미도분해 활성, FXI 및/또는 FXIa 함량 및/또는 ACA 함량을 포함하는 반면, pH 이동 후 회수된 용리물이 유의적으로 더 높은 수준의 아미도분해 활성, FXI 및/또는 FXIa 함량 및/또는 ACA 함량을 포함한다는 것을 발견하였다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 IgG 면역글로빈, 아미도분해 활성 및/또는 ACA를 양이온 교환 수지에 결합시키고, 단일 단계 용리로 IgG 면역글로빈, 아미도분해 활성 및/또는 ACA를 용리시키고 높은 IgG 수율, 낮은 아미도분해 활성 및/또는 낮은 ACA 함량을 특징으로 하는 용리물의 전연부를 낮은 IgG 수율, 높은 아미도분해 활성 및/또는 높은 ACA 함량을 특징으로 하는 용리물의 후연부를 분리하여 수집함으로써 IgG 면역글로빈 조성물로부터 유의적인 분획의 아미도분해 활성(예를 들면, XI 인자 및/또는 XIa 인자) 및/또는 ACA를 분리하는 방법에 기초한다.
다른 이점 중에서, 본 발명의 방법은 (1) 단일 단계 용리에 의한 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 IgG 면역글로빈 조성물로부터 아미도분해 활성을 제거하는 단순한 방법; (2) 용리물의 pH의 모니터링에 기초하여 아미도분해 활성이 높은 IgG 면역글로빈 양이온 교환 용리물의 분획(즉, 높은 FXI 및/또는 FXIa 함량)을 신속히 확인하는 단순한 방법; (3) 대규모 제조 공정을 위한 단순한 규모확장을 허용하는, 양이온 교환 수지로 로딩된 단백질의 농도에 의해 영향을 받지 않는 IgG 면역글로빈 조성물로부터 아미도분해 활성을 제거하는 방법; (4) IgG 면역글로빈 양이온 교환이 pH 모니터링에 기초하여 추가의 공정처리에 사용되는 분획을 용리하는 신속한 결정을 허용하는 방법; (5) IgG 면역글로빈 수율의 최소 손실로 유의적인 아미도분해 활성(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa 함량) 감소를 허용하는 방법; (6) 더 낮은 IgG 응집물 농도, 더 낮은 PKA 활성, 색소 기질(기질 PL-1을 포함하지만, 이것으로 제한되지는 않음)로 측정되는 더 낮은 아미도분해 활성, 더 높은 IgG 단량체 농도 및 더 바람직한 IgG 하위종류 분포를 갖는 IgG 면역글로빈 조성물의 제조 방법; (7) 양이온 교환 IgG 면역글로빈이 크로마토그래프 단계의 용리 용적에 기초하여 추가의 공정처리에 사용되는 분획을 용리하는 신속한 결정을 허용하는 방법; (8) IgG 면역글로빈 양이온 교환이 특정한 분획의 단백질 흡광도에 기초하여 추가의 공정처리에 사용되는 분획을 용리하는 신속한 결정을 허용하는 방법; (9) 대규모 제조 공정에서 본 발명의 유리한 특징을 이용하는 능력; (10) 동정 및 정량화를 위한 아미도분해 활성의 농후화; (11) 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 단일 단계 용리로 IgG 면역글로빈 조성물로부터 항보체 활성(ACA)을 제거하는 단순한 방법; (12) 용리물의 pH의 모니터링에 기초하여 높은 항보체 활성(ACA)을 갖는 IgG 면역글로빈 양이온 교환 용리물의 분획을 신속히 동정하는 단순한 방법; (13) 양이온 교환 수지에 로딩된 단백질의 농도에 영향을 받지 않는 IgG 면역글로빈 조성물로부터 항보체 활성(ACA)을 제거하는 방법(대규모 제조 공정에 대한 단순한 규모 확대를 허용); (14) IgG 면역글로빈 수율의 최소 손실과 함께 유의적인 항보체 활성(ACA) 감소를 허용하는 방법; (15) 더 낮은 IgG 응집물 농도, 더 낮은 항보체 활성(ACA), 더 높은 IgG 단량체 농도 및 더 바람직한 IgG 하위종류 분포를 갖는 IgG 면역글로빈 조성물의 제조 방법; 및 (16) 동정 및 정량화를 위한 항보체 활성(ACA)의 농후화를 제공한다.
Ⅱ. 정의
본 명세서에 사용되는 용어 "정맥내 IgG" 또는 "IVIG" 치료는 일반적으로 면역 결핍증, 염증성 질환 및 자가면역 질환과 같은 여러 병증을 치료하기 위해 환자에게 IgG 면역글로빈의 조성물을 정맥내, 피하 또는 근육내 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 의미한다. IgG 면역글로빈은 통상적으로 혈장으로부터 풀에 넣어지고 제조된다. 전체 항체 또는 단편을 사용할 수 있다. IgG 면역글로빈은 피하 투여를 위해 더 높은 농도(예를 들면, 10% 초과)로 제제화되거나 근육내 투여를 위해 제제화될 수 있다. 이는 특이적 항원(예를 들면, Rho D 인자, 페르투시스 독소, 테타누스 독소, 보툴리누스 중독증 독소, 광견병 등)에 대한 평균 역가보다 더 높게 제조되는 특수 IgG 제제에 특히 흔하다. 논의의 편의를 위해, 이러한 피하 또는 근육내 제제화된 IgG 조성물은 또한 본원에서 용어 "IVIG" 내에 포함된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "아미도분해 활성"은 다른 폴리펩타이드에서 하나 이상의 펩타이드 결합의 가수분해를 촉진하는 폴리펩타이드의 능력을 의미한다. 제한 없이 PL-1(광대역 스펙트럼), S-2288(광대역 스펙트럼), S-2266(FXIa, 선형 칼리크레인, S-2222(FXa, 트립신), S-2251(플라스민) 및 S-2302(칼리크레인, FXIa 및 FXIIa)를 포함하는 인간 혈장에서 발견되는 프로테아제에 대한 상이한 특이성으로 다양한 색소 기질에 의해 평가하여 IgG 면역글로빈 조성물을 위한 아미도분해 활성 프로필을 결정할 수 있다. 조성물의 아미도분해 활성을 결정하는 방법이 예를 들면 문헌[M. Etscheid et al. (Identification of kallikrein and FXIa as impurities in therapeutic immunoglobulins: implications for the safety and control of intravenous blood products, Vox Sang 2011; 이의 개시내용이 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨]에 기재된 것처럼 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "항보체 활성", "항보체성 활성" 및 "ACA"는 상호교환적으로 사용되고, 보체 검정에서, 예를 들면 문헌["Public Health Monograph" No. 74; Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adaptation to Microtest, Washington, 1965, 및 E. A. Kabat and M. Mayer, Experimental Immunochemistry; 2nd Ed. Thomas Springfield 1961, 이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨]에 기재된 방법에 실질적으로 기초하는 방법에서 가능한 보체를 소모하는 단백질 조성물, 예를 들면 IgG 면역글로빈 조성물의 능력을 의미한다. 보체 활성의 통상적인 단위는 본 명세서에 기재된 보체 활성에서 최적으로 감작된 적혈구의 전체 5x108 중 2.5x108의 용리물을 생성하는 보체의 양이다.
일 실시양태에서, 보체의 공급원으로서 작용하는 기니아 피그 혈청의 여러 희석액과 항온처리된 항체 감작된 양의 적혈구의 표준화 현탁액을 사용하여 ACA를 측정한다. 용혈 정도를 분광광도법으로 측정한다. 예를 들면, 면역글로빈 생성물의 항보체 활성을 결정하기 위해, 다양한 양의 면역글로빈 생성물 및 1㎖당 기니아 피그 혈청의 2개의 C'H50 단위를 포함하는 시험 용액을 제조한다. 특정한 실시양태에서, 한정된 양의 시험 재료(예를 들면, 10㎎의 IgG 면역글로빈)를 한정된 양의 기니아 피그 보체(예를 들면, 20개의 C'H50)와 항온처리하여 항보체 활성을 측정하고, 남은 보체를 적정한다. 항보체 활성은 100%인 것으로 생각되는 보체 대조군에 대한 보체의 소모의 백분율로 표시된다. 일 실시양태에서, 유럽 약전: 정맥내 투여용 인간 정상 면역글로빈에 기재된 기준에 따라 ACA를 측정한다. 유럽 약전 6.3, 모노그래프 2.6.17, 4166-4168. Council of Europe, Strasbourg Cedex, France(이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함됨).
정맥내 투여에 의도되는 조성물의 항보체 활성을 감소시키는 방법이 문헌[Schultz, H. E. and Schwick, G., Dtsch. med. Wochenschrift 87 (1962), 1643; Barandun, S. et al., Vox Sang. 28 (1957), 157; Barandun, S. et al., Vox Sang. 7 (1962), 187; 및 Stephen, W., Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 7 (1969), 282(이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함됨)]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 "냉동 결핍성 혈장(cryo-poor plasma)"은 어는점에 가까운 온도에서, 예를 들면 약 10℃ 미만의 온도에서 혈장 또는 풀에 있는 혈장의 냉동 침전(냉동 침강) 후 형성된 상청액을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 혈장은 상호교환적으로 회수된 혈장(즉, 생체외 전체 혈액으로부터 분리된 혈장) 또는 공급원 혈장(즉, 혈장 혈장교환술을 통해 수집된 혈장)을 의미할 수 있다. 새로운 혈장을 사용할 수도 있지만, 예를 들면 안전성 및 품질 고려를 위해 이미 평가된 이전에 냉동된 풀에 있는 혈장을 해동하여 냉동침전을 흔히 수행한다. 6℃ 이하의 온도에서 해동을 통상적으로 수행한다. 낮은 온도에서 냉동된 혈장의 완전 해동 후, 액체 상청액으로부터 고체 저온침전물을 분리하기 위해 냉소(예를 들면, ≤6℃)에서 원심분리를 수행한다. 대안적으로, 원심분리보다는 정제에 의해 분리 단계를 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "콘 풀(Cohn pool)"은 혈장 샘플 또는 혈장 샘플의 풀의 분별화에 사용되는 출발 물질을 의미한다. 콘 풀은 예비 처리 단계로 처리되거나 처리되지 않을 수 있는 전체 혈장, 냉동 결핍성 혈장 샘플 및 냉동 결핍성 혈장 샘플의 풀을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 콘 풀은 예비 처리 단계, 예를 들면 고상(예를 들면, 수산화알루미늄, 미분 이산화규소 등)에의 흡착 또는 크로마토그래프 단계(예를 들면, 이온 교환 또는 헤파린 친화도 크로마토그래피)에서 1 이상의 혈액 인자가 제거되는 냉동 결핍성 혈장 샘플이다. 8 억제제 바이패스 활성(Factor Eight Inhibitor Bypass Activity: FEIBA) 인자, IX-복합체 인자, VII-농축물 인자 또는 안티트롬빈 III-복합체 인자(이들로 제한되지는 않음)를 비롯한 다양한 혈액 인자를 냉동 결핍성 혈장 샘플로부터 단리하여 콘 풀을 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "용리물의 전연부"는 양이온 교환 수지로부터 용리된 면역글로빈 조성물의 제1 분획을 의미하고, 그 분획은 용리 전에 수지에 결합된 전체 아미도분해 활성과 비교하여 높은 면역글로빈 수율 및 감소한 아미도분해 활성을 특징으로 한다. 용리물의 전연부는 면역글로빈 조성물의 제2 분획("용리물의 후연부"라 칭함)의 방출(즉, 용리) 전에 발생하는 양이온 교환 칼럼으로부터 방출된 용리물의 제1 분획이다. 용리물의 후연부는 오직 소량의 면역글로빈(칼럼에 결합된 면역글로빈 중 통상적으로 25% 이하, 바람직하게는 10% 이하)을 포함하고, 용리물의 전연부와 비교하여 아미도분해 활성의 더 높은 농도를 특징으로 한다. 다양한 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 제한함이 없이 용리물의 pH, 단백질 수율(예를 들면, 수지에 결합된 단백질의 백분율로 표현됨), 용리물의 단백질 농도(예를 들면, 광학 밀도에 의해 결정됨), 용리물의 용적 등을 비롯한 다양한 특징에 의해 정의될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "한외여과(ultrafiltration: UF)"는 정수압이 액체를 반투과성 막에 미는 다양한 막 정제 방법을 포함한다. 현탁된 고체 및 높은 분자량의 용질이 보유되고, 물 및 낮은 분자량의 용질이 막을 통과한다. 이 분리 과정은 대개 거대분자(103 내지 106Da) 용액, 특히 단백질 용액을 정제하고 농축하기 위해 사용된다. 이들이 보유하는 분자의 크기에 따라 여러 한외여과 막이 이용 가능하다. 한외여과는 통상적으로 1kDa 내지 1000kDa의 막 기공 크기를 특징으로 하고, 0.01bar 내지 10bar의 압력에서 작동하고, 특히 당 및 염과 같은 소분자로부터 단백질을 분리하기에 유용하다.
본 명세서에 사용되는 용어 "정용여과(diafiltration)"는 한외여과와 동일한 막으로 수행되고, 접선 유동 정제 또는 데드 엔드 정제 방식으로 실행될 수 있다. 정용여과 동안, 완충제를 순환 탱크로 도입하고, 여액을 유닛 조작으로부터 제거한다. 생성물이 잔류물(예를 들면, IgG 면역글로빈)인 공정에서, 정용여과는 생성물 풀로부터 성분을 여액으로 세척하여, 완충제를 교환시키고 바람직하지 않은 종의 농도를 감소시킨다.
본 명세서에 사용되는 용어 "세제"는 본원에서 용어 "계면활성제" 또는 "표면 활성 물질"과 상호교환적으로 사용된다. 계면활성제는 통상적으로 계면활성제가 유기 용매 및 물 둘 다 중에 가용성이 되도록 양친매성인, 즉 소수성 기("꼬리") 및 친수성 기("헤드") 둘 다를 포함하는 유기 화합물이다. 계면활성제는 이의 헤드 내에 공식적으로 하전된 기의 존재로 분류될 수 있다. 비이온성 계면활성제는 이의 헤드에서 하전 기가 없는 반면, 이온성 계면활성제는 이의 헤드 내에 순 전하를 보유한다. 양성이온 계면활성제는 2개의 반대로 하전된 기를 갖는 헤드를 포함한다. 몇몇 통상의 계면활성제의 예는 음이온성 계면활성제(설페이트, 설포네이트 또는 카복실레이트 음이온에 기초): 퍼플루오로옥타노에이트(PFOA 또는 PFO), 퍼플루오로옥탄설포네이트(PFOS), 황산 나트륨 도데실(SDS), 황산 암모늄 라우릴 및 다른 알킬 황산염, 황산 나트륨 라우레쓰(나트륨 라우릴 에터 설페이트 또는 SLES로도 공지됨), 알킬 벤젠 설포네이트; 양이온성 계면활성제(4급 암모늄 양이온에 기초): 헥사데실 트라이메틸 암모늄 브로마이드라고도 알려진 세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 및 다른 알킬트라이메틸암모늄 염, 세틸피리디늄 클로라이드(CPC), 폴리에톡실레이트화 탤로우 아민(POEA), 벤즈알코늄 클로라이드(BAC), 벤제토늄 클로라이드(BZT); 장쇄 지방산 및 이들의 염: 예컨대 카프릴레이트, 카프릴산, 헵타노에이트, 헥산산, 헵탄산, 나노산, 데칸산 등; 양성이온성(amphoteric) 계면활성제: 도데실 베타인; 코카미도프로필 베타인; 코코 암포 글라이시네이트; 비이온성: 알킬 폴리(에틸렌 옥사이드), 알킬페놀 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 옥사이드) 및 폴리(프로필렌 옥사이드)의 공중합체(상업적으로 폴록사머 또는 폴록사민으로 공지됨), 알킬 폴리글루코사이드, 예컨대 옥틸 글루코사이드, 데실 말토사이드, 지방 알코올(예를 들면, 세틸 알코올 및 올레일 알코올), 코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA, 폴리소르베이트(트윈 20, 트윈 80 등), 트라이톤 세제 및 도데실 다이메틸아민 옥사이드를 들 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "분사"는 예를 들면 알코올 침전 단계, 예컨대 변형 콘 I 또는 II+III 분획 침전 단계 동안 액체 물질을 액체 물질의 미세한 액적 또는 미스트 형태로 시스템에 전달하는 수단을 의미한다. 스프레이 헤드 또는 노즐을 갖고 액체로부터 미세한 미스트를 생성하기 위해 수동으로 또는 자동으로 작동하는 임의의 가압 장치, 예컨대 용기(예를 들면, 스프레이 병)에 의해 분사를 성취할 수 있다. 통상적으로, 액체 물질을 수용하는 시스템 내의 액체의 신속하고 동일한 분포를 보장하도록 시스템을 연속하여 교반하거나 그렇지 않으면 혼합하면서 분사를 수행한다.
"치료학적 유효량 또는 유효 용량" 또는 "충분한 유효량 또는 용량"으로 투여 목적의 효과를 생성하는 용량을 의미한다. 정확한 용량은 치료 목적에 따라 달라지고, 공지된 기법을 이용하여 당업자가 확인할 수 있다(예를 들면, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); 및 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins] 참조).
Ⅲ. 아미도분해 활성의 감소
일 양태에서, 본 개시내용은 (예를 들면, FXI/FXIa 및/또는 FXII/FXIIa의 함량을 감소시켜) 혈장 유래 IgG 면역글로빈 조성물의 아미도분해 활성을 감소시키기 위한 크로마토그래프 방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 제공된 방법에 따라 제조된 낮은 수준의 아미도분해 활성(예를 들면, 낮은 수준의 FXI/FXIa 및/또는 FXII/FXIIa)을 포함하는 혈장 유래 IgG 면역글로빈 조성물을 제공한다. 유리하게는, 본 명세서에 기재된 방법은 안전성 프로필이 개선된 혈장 유래 IgG 면역글로빈 조성물을 제공한다. 구체적으로, 이 방법에 의해 제공된 조성물은 현재 제조되는 IgG 면역글로빈 조성물과 비교하여 원치않는 혈전색전성 사건을 야기할 가능성을 감소한다.
A. 분별화 방법
본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에 존재하는 대부분의 아미도분해 활성이 단계 용리에 의해 생성된 용리물의 후연부로 양이온 교환 수지로부터 용리되는 반면, 이 분획의 대부분의 면역글로빈 함량이 상기 용리물의 전연부로 용리된다는 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집함으로써, 생성된 면역글로빈 제제의 아미도분해 활성이 유의적으로 감소한다. 구체적으로, XIa 인자 함량 및 이에 따른 XIa 인자 함량과 관련된 아미도분해 활성이 본 명세서에 제공된 방법에 따라 제조된 면역글로빈 조성물에서 유의적으로 감소한다는 것이 본 명세서에 나타난다.
따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 아미도분해 활성의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성(즉, 아미도분해 활성을 갖는 단백질 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부(높은 농도의 아미도분해 활성을 포함함)로부터 용리물의 전연부(시작 조성물과 비교하여 아미도분해 활성의 양이 감소한 IgG 면역글로빈 조성물을 포함함)를 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 아미도분해 활성은 상기 조성물 중에 존재하는 XIa 인자 활성이다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(FXI) 및/또는 XIa 인자(FXIa)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 아미도분해 활성의 양이 감소한 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 높은 농도의 아미도분해 활성을 포함하는 방법을 제공한다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 4.8 내지 5.6의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 아미도분해 활성의 양이 감소한 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 높은 농도의 아미도분해 활성을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa가 결합된 수지를 전도율이 충분히 낮은 완충제로 세척하여 면역글로빈이 수지로부터 용리되지 않고 pH는 5.1 내지 5.9인 단계; (c) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 아미도분해 활성의 양이 감소한 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 높은 농도의 아미도분해 활성을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.1이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5이다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 7.8±0.4의 pH 및 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 아미도분해 활성의 양이 감소한 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 높은 농도의 아미도분해 활성을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.1이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.0, 7.1, 7.2, 7.36, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 또는 8.5이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
일반적으로, 본 명세서에 제공된 방법에 사용되는 출발 물질은 IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성을 포함하는 임의의 혈장 분획 또는 조성물을 포함한다. 그러므로, 일 실시양태에서, 혈장은 당해 분야에 공지된 정제 반응식 중 어느 하나에 따라 부분 또는 완전 분별화된다. 특정한 실시양태에서, 혈장은 분별화되어 I 분획 침전물, II 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 또는 이의 변형된 침전물을 생성하고, 이들은 본 명세서에 제공된 방법에 대한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 혈장은 1개 이상의 에탄올 침전 단계에 의해 분별화된다. 상청액 중에 1종 이상의 비면역글로빈 단백질을 보유하면서 용액으로부터 원하는 면역글로빈을 침전시키거나, 상청액 중에 원하는 면역글로빈을 보유하면서 1종 이상의 비면역글로빈 단백질을 침전시키기 위해 에탄올 침전 단계를 이용할 수 있다. 이러한 방식으로 면역글로빈을 분별화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 에탄올 침전물은, 제한 없이, I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계, A 침전 단계, B 침전 단계 및 II 분획 침전 단계를 포함하는 4단계 에탄올 과정에 의해 냉동 결핍성 혈장에 존재하는 면역글로빈은 농후해진다.
일 실시양태에서, 풀에 있는 인간 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 에탄올 분별화에 의해 본 명세서에 제공되는 아미도분해 활성을 감소시키는 방법을 위한 출발 물질을 제조한다. 구체적인 일 실시양태에서, 에탄올 분별화는 하기 기재된 바와 같은 냉동 결핍성 혈장의 I+II+III 분획 침전, 현탁된 I+II+III 분획 침전물의 A 분획 침전, 현탁된 A 분획 침전물의 B 분획 침전 및 A 분획 상청액의 II 분획 침전을 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 에탄올 분별화는 냉동 결핍성 혈장의 I 분획 침전, I 분획 상청액의 II+III 분획 침전 및 현탁된 II+III 분획 침전물의 II 분획 침전을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바대로, 본 명세서에 제공된 방법의 유리한 특징은 대규모 제조 절차에 적용될 때 보유된다. IgG 면역글로빈 조성물의 제조와 관련하여, 대규모 제조는 적어도 100ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장) 출발 물질로부터 면역글로빈을 농후화하는 공정을 의미한다. 일반적으로, 대규모 면역글로빈 제조 공정은 배취마다 100ℓ 내지 20,000ℓ의 풀에 있는 혈장을 분별화한다. 특정한 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 100ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 500ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 1,000ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 5,000ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 10,000ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다.
일반적으로, 상기 기재된 로딩 조건, 세척 조건 및 용리 조건의 모든 조합을 포함하는 방법이 고려된다. 더욱이, 특이적 크로마토그래프 조건의 모든 조합을 포함하는 방법이 하기 기재된 바대로 용리물의 전연부를 한정하고 수집하기 위한 모든 가능한 반응식과 같이 고려된다.
1. 양이온 교환 용리물의 전연부 및 후연부
일 양태에서, 본 발명은 아미도분해 활성, 구체적으로 양이온 교환 용리물의 전연부를 수집하여 면역글로빈 제제 중에 존재하는 FXIa 불순물로부터 기인하는 아미도분해 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 유리하게는, 양이온 교환 크로마토그래프 단계의 단일 단계 용리에 의해 형성된 용리물의 전연부가 다량의 원하는 면역글로빈 함량을 포함하고, 용리물의 후연부가 다량의 원치않는 아미도분해 활성을 포함한다는 것이 본 명세서에 나타난다. 면역글로빈 및 아미도분해 활성의 용리가 완전히 분리될 수 없으므로, 용리물의 전연부와 후연부 사이의 분열을 결정해야 한다. 이 결정을 만들 때 2가지 중요한 사항을 고려할 수 있고, 즉 (ⅰ) 용리물의 전연부 및 후연부가 어떻게 한정되는지에 따라, 다소의 아미도분해 활성이 전연부에 회수되는 것 - 즉, 용리물의 전연부가 전체 용리물의 더 적은 부분으로 한정되고 그 반대일 때 아미도분해 활성의 더 많은 부분이 면역글로빈 함량으로부터 분리될 수 있다는 것; 및 (ⅱ) 용리물의 전연부 및 후연부가 어떻게 한정되는지에 따라, 더 많거나 더 적은 면역글로빈 회수 수율이 전연부에 존재한다는 것 - 즉, 용리물의 전연부가 전체 용리물의 더 적은 부분으로 한정되고 그 반대일 때 더 적은 면역글로빈 수율이 성취된다는 것이다.
따라서, 당업자는 이의 각각의 필요에 기초하여 양이온 교환 용리물의 전연부와 후연부 사이의 경계를 그리는 것을 결정할 것이다. 예를 들면, 연구 또는 특수 치료 목적을 위한 소규모 정제를 준비할 때, 당업자는 최종 면역글로빈 수율을 희생하면서 용리물의 더 적은 전연부를 수집하여 그 방법의 분리 능력을 최소화할 것이다. 반대로, 대규모 제조(예를 들면, 500ℓ 초과의 냉동 결핍성 혈장의 처리)를 준비할 때, 기회 비용은, 그 조성물의 아미도분해 활성의 보다 정당한 감소를 훼손시키면서 면역글로빈 회수 수율을 증가시키기 위해, 용리물의 더 많은 전연부가 수집된다는 것을 설명할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는, 제한 없이, 용리물의 pH, 단백질 수율(예를 들면, 수지에 결합된 단백질의 백분율로 표시됨), 용리물의 단백질 농도(예를 들면, 광학 밀도로 결정됨), 용리물의 용적 등을 포함하는 다양한 특징에 의해 정의될 수 있다.
a. 용리물의 pH
본 명세서에 제공된 예에 기재된 바대로, 양이온 교환 용리 단계의 시작은, 칼럼 로드 및 세척 단계(일반적으로 5.0 내지 6.0)보다 더 높은 pH(일반적으로 > 7.0)를 갖는 용리 완충제에도 불구하고, 5.0 미만의 pH까지 칼럼으로부터 나오는 용액의 pH 하강에 의해 표시된다. 이 pH 하강은 낮은 아미도분해 활성 및 XIa 인자 함량을 갖는 IgG 면역글로빈 조성물의 용리에 상응한다(예를 들면, 각각 표 4 및 표 11 참조). 이후의 용리 시점에서, 칼럼으로부터 나오는 용액의 pH는 6.0 초과 내지 8.0으로 급격히 상승한다. 이러한 pH 이동은 용리물의 아미도분해 활성 및 XIa 인자 함량의 유의적인 증가에 수반된다(예를 들면, 각각 표 4 및 표 11 참조). 따라서, 단일 높은 pH 용리 완충제(일반적으로 7.0 초과)의 적용에 의해 단계 용리를 수행하지만, 용리 프로필은 IgG 면역글로빈이 처음에 칼럼으로부터 용리된 후, 동반된 아미도분해 활성(예를 들면, XI 인자 및/또는 XIa 인자)이 용리되는 2단계 용리와 유사하다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 칼럼 출구에서 용리물의 pH에 기초하여 한정된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 아미도분해 활성의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성(즉, 아미도분해 활성을 갖는 단백질 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 pH가 7.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(FXI) 및/또는 XIa 인자(FXIa)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 pH가 7.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
b. 용리물의 흡광도
면역글로빈 조성물의 대규모 제조에 특히 적합한 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 양이온 교환 칼럼으로부터 용리되는 면역글로빈 농도에 의해 한정된다. 예를 들면, 대규모 제조 동안, 면역글로빈 조성물은 충분히 높은 단백질 로드(예를 들면, 1㎖ 수지당 80㎎ 초과의 단백질)에서 양이온 교환 수지에 로딩되어 피크 용리물은 매우 농축된다. 이러한 경우, 용리물의 전연부는 OD280이 역치 값 아래로 떨어지는 시점 전의 용리물의 분획으로서 정의될 수 있다. 이러한 방식으로, 제조 실행 간의 작은 변화와 무관하게 1 제법으로부터 다른 제법으로 재현가능하게 거의 동일한 수율의 면역글로빈이 회수될 수 있다. 실시예 9에 기재된 바대로, 대규모 제조 공정에 대한 이 수집 반응식의 적용은 TGA 및 아미도분해 활성 함량이 유의적으로 감소한 IgG 면역글로빈 조성물의 수율 회수를 증가시킨다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 아미도분해 활성의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성(즉, 아미도분해 활성을 갖는 단백질 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.5AU인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.5AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 2.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 구체적인 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상인 용리물의 부분으로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(FXI) 및/또는 XIa 인자(FXIa)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 2.0AU인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.5AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.5AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 구체적인 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
c. 전체 용리물의 백분율
면역글로빈 조성물의 대규모 제조에 특히 적합한 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 용리물의 전체 단백질 함량(예를 들면, 용적 또는 전체 단백질)의 백분율로 정의된다. 전연부에서 수집하려는 용리물의 백분율을 선결정함으로써, 면역글로빈 회수 수율을 엄격히 제어할 수 있다. 용리물의 전연부 및 후연부를 정의하는 이 방법은 최소 단계 수율을 필요로 하는 제조 공정 및 면역글로빈 수율 감소 비용을 아미도분해 및 XI 인자 및/또는 XIa 인자 함량이 감소한 조성물을 제조하는 이익과 견주는 것에 기초하여 결정이 이루어지는 공정에 특히 유용하다. 이러한 방식으로, 제조 실행 간의 작은 변화와 무관하게 1 제법으로부터 다른 제법으로 재현가능하게 거의 동일한 수율의 면역글로빈이 회수될 수 있다. 실시예 8에 기재된 바대로, 이 수집 반응식의 적용은 TGA 및 아미도분해 활성 함량이 유의적으로 감소한 IgG 면역글로빈 조성물의 수율 회수를 증가시킬 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 아미도분해 활성의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성(즉, 아미도분해 활성을 갖는 단백질 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 80% 이하로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 75%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 75% 내지 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 70% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 65%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 65% 내지 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 60% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 60%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 55%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 55% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60%이다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(FXI) 및/또는 XIa 인자(FXIa)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 80% 이하로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 75%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 75% 내지 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 70% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 65%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 65% 내지 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 60% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 60%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 55%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 55% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
d. 전체 용리물의 용적
면역글로빈 조성물의 대규모 제조에 특히 적합한 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 양이온 교환 칼럼의 크기에 대한 용리물 피크의 용적(예를 들면, 칼럼 용적의 세트 수)으로 정의된다. 전연부에서 수집하려는 용리물의 용적을 선결정함으로써, 면역글로빈 회수 수율이 엄격하게 제어되고 재현 가능해질 수 있다. 용리물의 전연부 및 후연부를 정의하는 이 방법은 최소 단계 수율을 필요로 하는 제조 공정 및 면역글로빈 수율 감소 비용을 아미도분해 및 XI 인자 및/또는 XIa 인자 함량이 감소한 조성물을 제조하는 이익과 견주는 것에 기초하여 결정이 이루어지는 공정에 특히 유용하다. 이러한 방식으로, 제조 실행 간의 작은 변화와 무관하게 1 제법으로부터 다른 제법으로 재현가능하게 거의 동일한 수율의 면역글로빈이 회수될 수 있다. 실시예 11 내지 13에 기재된 바대로, 이 수집 반응식의 적용은 TGA 및 아미도분해 활성 함량이 유의적으로 감소한 IgG 면역글로빈 조성물의 수율 회수를 증가시킬 수 있다.
일 실시양태에서, 전연부의 시작은 기준 흡광도로 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 용리물 피크의 흡광도가 제1 역치를 횡단할 때 전연부의 수집이 시작한다. 일 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 2.0AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 1.5AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 1.0AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 0.5AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 구체적인 또 다른 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다.
몇몇 실시양태에서, 전연부의 수집이 개시되면, 용리물의 후연부의 수집(또는 처분)으로 전환하기 전에 선결정된 칼럼 용적 수를 수집한다. 일 실시양태에서, 5 이하의 칼럼 용적(column volume: CV)의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 4CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 3CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 2.7CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 2.5CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 2CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 1CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 0.5CV, 0.6CV, 0.7CV, 0.8CV, 0.9CV, 1.0CV, 1.1CV, 1.2CV, 1.3CV, 1.4CV, 1.5CV, 1.6CV, 1.7CV, 1.8CV, 1.9CV, 2.0CV, 2.1CV, 2.2CV, 2.3CV, 2.4CV, 2.5CV, 2.6CV, 2.7CV, 2.8CV, 2.9CV, 3.0CV, 3.1CV, 3.2CV, 3.3CV, 3.4CV, 3.5CV, 3.6CV, 3.7CV, 3.8CV, 3.9CV, 4.0CV, 4.1CV, 4.2CV, 4.3CV, 4.4CV, 4.5CV, 4.6CV, 4.7CV, 4.8CV, 4.9CV, 5.0CV, 5.1CV, 5.2CV, 5.3CV, 5.4CV, 5.5CV, 5.6CV, 5.7CV, 5.8CV, 5.9CV, 6.0CV 이하 또는 그 이상의 칼럼 용적의 용리물이 전연부에 수집된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 아미도분해 활성의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성(즉, 아미도분해 활성을 갖는 단백질 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 4 이하의 칼럼 용적(CV)으로 이루어지는 전체 용리물로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.5CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 4.0CV이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.5CV이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 0.5CV, 0.6CV, 0.7CV, 0.8CV, 0.9CV, 1.0CV, 1.1CV, 1.2CV, 1.3CV, 1.4CV, 1.5CV, 1.6CV, 1.7CV, 1.8CV, 1.9CV, 2.0CV, 2.1CV, 2.2CV, 2.3CV, 2.4CV, 2.5CV, 2.6CV, 2.7CV, 2.8CV, 2.9CV, 3.0CV, 3.1CV, 3.2CV, 3.3CV, 3.4CV, 3.5CV, 3.6CV, 3.7CV, 3.8CV, 3.9CV, 4.0CV, 4.1CV, 4.2CV, 4.3CV, 4.4CV, 4.5CV, 4.6CV, 4.7CV, 4.8CV, 4.9CV, 5.0CV, 5.1CV, 5.2CV, 5.3CV, 5.4CV, 5.5CV, 5.6CV, 5.7CV, 5.8CV, 5.9CV 또는 6.0CV이다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(FXI) 및/또는 XIa 인자(FXIa)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 4 이하의 칼럼 용적(CV)으로 이루어지는 전체 용리물로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.5CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 4.0CV이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.5CV이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 0.5CV, 0.6CV, 0.7CV, 0.8CV, 0.9CV, 1.0CV, 1.1CV, 1.2CV, 1.3CV, 1.4CV, 1.5CV, 1.6CV, 1.7CV, 1.8CV, 1.9CV, 2.0CV, 2.1CV, 2.2CV, 2.3CV, 2.4CV, 2.5CV, 2.6CV, 2.7CV, 2.8CV, 2.9CV, 3.0CV, 3.1CV, 3.2CV, 3.3CV, 3.4CV, 3.5CV, 3.6CV, 3.7CV, 3.8CV, 3.9CV, 4.0CV, 4.1CV, 4.2CV, 4.3CV, 4.4CV, 4.5CV, 4.6CV, 4.7CV, 4.8CV, 4.9CV, 5.0CV, 5.1CV, 5.2CV, 5.3CV, 5.4CV, 5.5CV, 5.6CV, 5.7CV, 5.8CV, 5.9CV 또는 6.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
Ⅳ. 항보체 활성(ACA)의 감소
일 양태에서, 본 개시내용은 혈장 유래 IgG 면역글로빈 조성물의 항보체 활성(ACA) 함량을 감소시키기 위한 크로마토그래프 방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 제공된 방법에 따라 제조된 낮은 수준의 항보체 활성(ACA)을 포함하는 혈장 유래 IgG 면역글로빈 조성물을 제공한다. 유리하게는, 본 명세서에 기재된 방법은 안전성 프로필이 개선된 혈장 유래 IgG 면역글로빈 조성물을 제공한다. 구체적으로, 이 방법에 의해 제공된 조성물은 현재 제조되는 IgG 면역글로빈 조성물과 비교하여 항보체 활성과 관련된 부작용을 야기할 가능성이 감소한다(예를 들면, 문헌[Buchacher A. et al., Vox Sang. 2010 Apr; 98(3 Pt 1):e209-18](이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함됨) 참조).
A. 분별화 방법
본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에 존재하는 대부분의 항보체 활성(ACA)이 단계 용리에 의해 생성된 용리물의 후연부에서 양이온 교환 수지로부터 용리하는 반면, 분획의 대부분의 면역글로빈 함량이 상기 용리물의 전연부에서 용리한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 따라서, 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계에 의해, 생성된 면역글로빈 제제의 항보체 활성이 유의적으로 감소한다. 구체적으로, ACA 함량이 본 명세서에 제공된 방법에 따라 제조된 면역글로빈 조성물에서 유의적으로 감소한다는 것이 본 명세서에 나타난다.
따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 항보체 활성(즉, 항보체 활성을 갖는 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 ACA의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 ACA의 양이 감소된 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 높은 농도의 ACA 활성을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 IgG 면역글로빈의 농도에 비해 ACA의 농도가 감소된 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 IgG 면역글로빈의 농도에 비해 높은 농도의 ACA 활성을 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 4.8 내지 5.6의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 IgG 면역글로빈의 양에 비해 ACA의 양이 감소된 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 IgG 면역글로빈의 양에 비해 높은 농도의 ACA 활성을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 면역글로빈 및 ACA가 결합된 수지를 전도율이 충분히 낮은 완충제로 세척하여 면역글로빈이 수지로부터 용리되지 않고 pH는 5.1 내지 5.9인 단계; (c) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 IgG 면역글로빈의 농도에 비해 ACA의 농도가 감소된 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 IgG 면역글로빈의 농도에 비해 높은 농도의 ACA 활성을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.1이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5이다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
구체적인 일 실시양태에서, 상기 방법은 (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 7.8±0.4의 pH 및 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 IgG 면역글로빈의 농도에 비해 ACA의 농도가 감소된 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고 용리물의 후연부는 IgG 면역글로빈의 농도에 비해 높은 농도의 ACA 활성을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.1이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.0, 7.1, 7.2, 7.36, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 또는 8.5이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
본 명세서에 제공된 방법에 사용되는 출발 물질은 IgG 면역글로빈 및 항보체 활성을 포함하는 임의의 혈장 분획 또는 조성물을 포함한다. 그러므로, 일 실시양태에서, 혈장은 당해 분야에 공지된 정제 반응식 중 어느 하나에 따라 부분 또는 완전 분별화된다. 특정한 실시양태에서, 혈장은 분별화되어 I 분획 침전물, II 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 또는 이의 변형된 침전물을 생성하고, 이들은 본 명세서에 제공된 방법에 대한 출발 물질로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 혈장은 1개 이상의 에탄올 침전 단계에 의해 분별화된다. 상청액 중에 1종 이상의 비면역글로빈 단백질을 보유하면서 용액으로부터 원하는 면역글로빈을 침전시키거나, 상청액 중에 원하는 면역글로빈을 보유하면서 1종 이상의 비면역글로빈 단백질을 침전시키기 위해 에탄올 침전 단계를 이용할 수 있다. 이러한 방식으로 면역글로빈을 분별화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 에탄올 침전물은, 제한 없이, I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계, A 침전 단계, B 침전 단계 및 II 분획 침전 단계를 포함하는 4단계 에탄올 과정에 의해 냉동 결핍성 혈장에 존재하는 면역글로빈은 농후해진다.
본 명세서에 기재된 바대로, 본 명세서에 제공된 방법의 유리한 특징은 대규모 제조 절차에 적용될 때 보유된다. IgG 면역글로빈 조성물의 제조와 관련하여, 대규모 제조는 적어도 100ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장) 출발 물질로부터 면역글로빈을 농후화하는 공정을 의미한다. 일반적으로, 대규모 면역글로빈 제조 공정은 배취마다 100ℓ 내지 20,000ℓ의 풀에 있는 혈장을 분별화한다. 특정한 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 100ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 500ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 1,000ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 5,000ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다. 또 다른 실시양태에서, 대규모 IgG 면역글로빈 제조 공정은 적어도 10,000ℓ의 풀에 있는 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 분별화를 의미한다.
일 실시양태에서, 풀에 있는 인간 혈장(예를 들면, 냉동 결핍성 혈장)의 에탄올 분별화에 의해 본 명세서에 제공되는 항보체 활성(ACA)을 감소시키는 방법을 위한 출발 물질을 제조한다. 구체적인 일 실시양태에서, 에탄올 분별화는 하기 기재된 바와 같은 냉동 결핍성 혈장의 I+II+III 분획 침전, 현탁된 I+II+III 분획 침전물의 A 분획 침전, 현탁된 A 분획 침전물의 B 분획 침전 및 A 분획 상청액의 II 분획 침전을 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 에탄올 분별화는 냉동 결핍성 혈장의 I 분획 침전, I 분획 상청액의 II+III 분획 침전 및 현탁된 II+III 분획 침전물의 II 분획 침전을 포함한다.
일반적으로, 상기 기재된 로딩 조건, 세척 조건 및 용리 조건의 모든 조합을 포함하는 방법이 고려된다. 더욱이, 특이적 크로마토그래프 조건의 모든 조합을 포함하는 방법이 하기 기재된 바대로 용리물의 전연부를 한정하고 수집하기 위한 모든 가능한 반응식과 같이 고려된다.
1. 양이온 교환 용리물의 전연부 및 후연부
일 양태에서, 본 발명은 양이온 교환 용리물의 전연부를 수집하여 면역글로빈 제제 중에 존재하는 항보체 활성(ACA)을 감소시키는 방법을 제공한다. 유리하게는, 양이온 교환 크로마토그래프 단계의 단일 단계 용리에 의해 형성된 용리물의 전연부가 다량의 원하는 면역글로빈 함량을 포함하고, 용리물의 후연부가 다량의 원치않는 ACA를 포함한다는 것이 본 명세서에 나타난다. 면역글로빈 및 ACA의 용리가 완전히 분리될 수 없으므로, 용리물의 전연부와 후연부 사이의 분열을 결정해야 한다. 이 결정을 만들 때 2가지 중요한 사항을 고려할 수 있고, 즉 (ⅰ) 용리물의 전연부 및 후연부가 어떻게 한정되는지에 따라, 다소의 ACA가 전연부에 회수되는 것 - 즉, 용리물의 전연부가 전체 용리물의 더 적은 부분으로 한정되고 그 반대일 때 ACA의 더 많은 부분이 면역글로빈 함량으로부터 분리될 수 있다는 것; 및 (ⅱ) 용리물의 전연부 및 후연부가 어떻게 한정되는지에 따라, 더 많거나 더 적은 면역글로빈 회수 수율이 전연부에 존재한다는 것 - 즉, 용리물의 전연부가 전체 용리물의 더 적은 부분으로 한정되고 그 반대일 때 더 적은 면역글로빈 수율이 성취된다는 것이다.
따라서, 당업자는 이의 각각의 필요에 기초하여 양이온 교환 용리물의 전연부와 후연부 사이의 경계를 그리는 것을 결정할 것이다. 예를 들면, 연구 또는 특수 치료 목적을 위한 소규모 정제를 준비할 때, 당업자는 최종 면역글로빈 수율을 희생하면서 용리물의 더 적은 전연부를 수집하여 그 방법의 분리 능력을 최소화할 것이다. 반대로, 대규모 제조(예를 들면, 500ℓ 초과의 냉동 결핍성 혈장의 처리)를 준비할 때, 기회 비용은, 그 조성물의 ACA의 보다 정당한 감소를 훼손시키면서 면역글로빈 회수 수율을 증가시키기 위해, 용리물의 더 많은 전연부가 수집된다는 것을 설명할 수 있다.
다양한 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는, 제한 없이, 용리물의 pH, 단백질 수율(예를 들면, 수지에 결합된 단백질의 백분율로 표시됨), 용리물의 단백질 농도(예를 들면, 광학 밀도로 결정됨), 용리물의 용적 등을 포함하는 다양한 특징에 의해 정의될 수 있다.
a. 용리물의 pH
본 명세서에 제공된 예에 기재된 바대로, 칼럼 로드 및 세척 단계의 pH(일반적으로 5.0 내지 6.0)보다 pH가 더 높은(일반적으로 > 7.0) 용리 완충제에도 불구하고 칼럼으로부터 나오는 용액의 pH의 5.0 미만의 pH로의 하강으로 양이온 교환 용리 단계의 시작은 표시된다. 이 pH 하강은 ACA가 낮은 IgG 면역글로빈 조성물의 용리에 상응한다(예를 들면, 표 3, 표 11 및 표 15 참조). 나중 용리의 시점에서, 칼럼으로부터 나오는 용액의 pH는 6.0 초과 내지 8.0으로 가파르게 상승한다. 이러한 pH 이동은 용리물의 ACA 함량의 유의적인 증가에 수반된다(예를 들면, 표 3, 표 11 및 표 15 참조). 따라서, 단일 고 pH 용리 완충제(일반적으로 7.0 초과)의 적용에 의해 단계 용리를 수행하더라도, 용리 프로필은 IgG 면역글로빈이 칼럼으로부터 처음에 용리된 후, 항보체 활성을 동반하는 2단계 용리와 유사하다. 따라서, 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 칼럼 출구에서 용리물의 pH에 기초하여 한정된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 항보체 활성(즉, 항보체 활성을 갖는 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 IgG 면역글로빈 및 ACA가 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 ACA의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 pH가 7.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 pH가 7.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 6.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.5 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 pH가 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0 이하인 용리물의 부분으로 이루어진다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
b. 용리물의 흡광도
면역글로빈 조성물의 대규모 제조에 특히 적합한 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 양이온 교환 칼럼으로부터 용리하는 면역글로빈 농도에 의해 한정된다. 예를 들면, 대규모 제조 동안, 면역글로빈 조성물은 충분히 높은 단백질 로드(예를 들면, 1㎖ 수지당 80㎎ 초과의 단백질)에서 양이온 교환 수지에 로딩되어 피크 용리물은 매우 농축된다. 이러한 경우, 용리물의 전연부는 OD280이 역치 값 아래로 떨어지는 시점 전의 용리물의 분획으로서 정의될 수 있다. 이러한 방식으로, 제조 실행 간의 작은 변화와 무관하게 1 제법으로부터 다른 제법으로 재현가능하게 거의 동일한 수율의 면역글로빈이 회수될 수 있다. 실시예 9에 기재된 바대로, 대규모 제조 공정에 대한 이 수집 반응식의 적용은 항보체 활성(ACA) 함량이 유의적으로 감소한 IgG 면역글로빈 조성물의 수율 회수를 증가시킨다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 항보체 활성(즉, 항보체 활성을 갖는 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 ACA의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.5AU인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.5AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 2.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 구체적인 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상인 용리물의 부분으로 이루어진다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.5AU인 용리물의 부분으로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 1.5AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 2.0AU인 용리물의 부분으로 이루어진다. 구체적인 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 OD280이 적어도 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상인 용리물의 부분으로 이루어진다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
c. 전체 용리물의 백분율
면역글로빈 조성물의 대규모 제조에 특히 적합한 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 용리물의 전체 단백질 함량(예를 들면, 용적 또는 전체 단백질)의 백분율로 정의된다. 전연부에서 수집하려는 용리물의 백분율을 선결정함으로써, 면역글로빈 회수 수율을 엄격히 제어할 수 있다. 용리물의 전연부 및 후연부를 정의하는 이 방법은 최소 단계 수율을 필요로 하는 제조 공정 및 면역글로빈 수율 감소 비용을 항보체 활성(ACA) 함량이 감소한 조성물을 제조하는 이익과 견주는 것에 기초하여 결정이 이루어지는 공정에 특히 유용하다. 이러한 방식으로, 제조 실행 간의 작은 변화와 무관하게 1 제법으로부터 다른 제법으로 재현가능하게 거의 동일한 수율의 면역글로빈이 회수될 수 있다. 실시예 8에 기재된 바대로, 이 수집 반응식의 적용은 항보체 활성 함량이 유의적으로 감소한 IgG 면역글로빈 조성물의 수율 회수를 증가시킬 수 있다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 항보체 활성(즉, 항보체 활성을 갖는 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 ACA의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 80% 이하로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 75%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 75% 내지 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 70% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 65%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 65% 내지 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 60% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 60%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 55%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 55% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60%이다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 제1 양의 항보체 활성(ACA)을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 80% 이하로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 75%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 75% 내지 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 70% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 65%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 65% 내지 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 60% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 60%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 55%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 55% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60%이다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
d. 전체 용리물의 용적
면역글로빈 조성물의 대규모 제조에 특히 적합한 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 양이온 교환 칼럼의 크기에 대한 용리물 피크의 용적(예를 들면, 칼럼 용적의 세트 수)으로 정의된다. 전연부에서 수집하려는 용리물의 용적을 선결정함으로써, 면역글로빈 회수 수율이 엄격하게 제어되고 재현 가능해질 수 있다. 용리물의 전연부 및 후연부를 정의하는 이 방법은 최소 단계 수율을 필요로 하는 제조 공정 및 면역글로빈 수율 감소 비용을 항보체 활성(ACA) 함량이 감소한 조성물을 제조하는 이익과 견주는 것에 기초하여 결정이 이루어지는 공정에 특히 유용하다. 이러한 방식으로, 제조 실행 간의 작은 변화와 무관하게 1 제법으로부터 다른 제법으로 재현가능하게 거의 동일한 수율의 면역글로빈이 회수될 수 있다. 실시예 11 내지 13에 기재된 바대로, 이 수집 반응식의 적용은 항보체 활성 함량이 유의적으로 감소한 IgG 면역글로빈 조성물의 수율 회수를 증가시킬 수 있다.
일 실시양태에서, 전연부의 시작은 기준 흡광도로 정의된다. 몇몇 실시양태에서, 용리물 피크의 흡광도가 제1 역치를 횡단할 때 전연부의 수집이 시작한다. 일 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 0.5AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 1.0AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 1.5AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 2.0AU에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다. 구체적인 또 다른 실시양태에서, 용리물의 OD280이 적어도 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상에 도달할 때 전연부의 수집이 시작한다.
몇몇 실시양태에서, 전연부의 수집이 개시되면, 용리물의 후연부의 수집(또는 처분)으로 전환하기 전에 선결정된 칼럼 용적 수를 수집한다. 일 실시양태에서, 5 이하의 칼럼 용적(CV)의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 4CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 3CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 2.7CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 2.5CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 2CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 1CV 이하의 용리물이 전연부에 수집된다. 또 다른 실시양태에서, 0.5CV, 0.6CV, 0.7CV, 0.8CV, 0.9CV, 1.0CV, 1.1CV, 1.2CV, 1.3CV, 1.4CV, 1.5CV, 1.6CV, 1.7CV, 1.8CV, 1.9CV, 2.0CV, 2.1CV, 2.2CV, 2.3CV, 2.4CV, 2.5CV, 2.6CV, 2.7CV, 2.8CV, 2.9CV, 3.0CV, 3.1CV, 3.2CV, 3.3CV, 3.4CV, 3.5CV, 3.6CV, 3.7CV, 3.8CV, 3.9CV, 4.0CV, 4.1CV, 4.2CV, 4.3CV, 4.4CV, 4.5CV, 4.6CV, 4.7CV, 4.8CV, 4.9CV, 5.0CV, 5.1CV, 5.2CV, 5.3CV, 5.4CV, 5.5CV, 5.6CV, 5.7CV, 5.8CV, 5.9CV, 6.0CV 이하 또는 그 이상의 칼럼 용적의 용리물이 전연부에 수집된다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 아미도분해 활성의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 항보체 활성(즉, 항보체 활성을 갖는 오염물질)을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 임의로 단백질이 결합된 양이온 교환 수지를 세척 완충제로 세척하여 느슨하게 회합된 오염물질을 제거하는 단계; (c) IgG 면역글로빈 및 ACA의 단일 단계 용리를 수행하는 단계; 및 (d) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 4 이하의 칼럼 용적(CV)으로 이루어지는 전체 용리물로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.5CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 4.0CV이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.5CV이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 0.5CV, 0.6CV, 0.7CV, 0.8CV, 0.9CV, 1.0CV, 1.1CV, 1.2CV, 1.3CV, 1.4CV, 1.5CV, 1.6CV, 1.7CV, 1.8CV, 1.9CV, 2.0CV, 2.1CV, 2.2CV, 2.3CV, 2.4CV, 2.5CV, 2.6CV, 2.7CV, 2.8CV, 2.9CV, 3.0CV, 3.1CV, 3.2CV, 3.3CV, 3.4CV, 3.5CV, 3.6CV, 3.7CV, 3.8CV, 3.9CV, 4.0CV, 4.1CV, 4.2CV, 4.3CV, 4.4CV, 4.5CV, 4.6CV, 4.7CV, 4.8CV, 4.9CV, 5.0CV, 5.1CV, 5.2CV, 5.3CV, 5.4CV, 5.5CV, 5.6CV, 5.7CV, 5.8CV, 5.9CV 또는 6.0CV이다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
특정한 실시양태에서, 본 발명은 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 항보체 활성(ACA)의 양을 감소시키는 방법으로서, (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (b) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 면역글로빈을 용리시켜 용리물을 형성하는 단계; 및 (c) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하고, 용리물의 전연부는 4 이하의 칼럼 용적(CV)으로 이루어지는 전체 용리물로 이루어지는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.0CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 3.5CV이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.0CV 내지 4.0CV이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 2.5CV 내지 3.5CV이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부가 전체 용리물 중 0.5CV, 0.6CV, 0.7CV, 0.8CV, 0.9CV, 1.0CV, 1.1CV, 1.2CV, 1.3CV, 1.4CV, 1.5CV, 1.6CV, 1.7CV, 1.8CV, 1.9CV, 2.0CV, 2.1CV, 2.2CV, 2.3CV, 2.4CV, 2.5CV, 2.6CV, 2.7CV, 2.8CV, 2.9CV, 3.0CV, 3.1CV, 3.2CV, 3.3CV, 3.4CV, 3.5CV, 3.6CV, 3.7CV, 3.8CV, 3.9CV, 4.0CV, 4.1CV, 4.2CV, 4.3CV, 4.4CV, 4.5CV, 4.6CV, 4.7CV, 4.8CV, 4.9CV, 5.0CV, 5.1CV, 5.2CV, 5.3CV, 5.4CV, 5.5CV, 5.6CV, 5.7CV, 5.8CV, 5.9CV 또는 6.0CV이다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
Ⅴ. 냉동 결핍성 혈장의 제조
농축된 IgG 조성물의 제조를 위해 사용되는 출발 물질은 일반적으로 회수된 혈장(즉, 생체외 전체 혈액로부터 분리된 혈장) 또는 공급원 혈장(즉, 혈장교환술을 통해 수집된 혈장)으로 이루어진다. 정제 공정은 통상적으로 이전에 냉동된 풀에 있는 혈장을 해동하면서 시작하고, 이 혈장은 안전성 및 품질 고려를 위해 이미 평가되었다. 6℃ 이하, 바람직하게는 -1℃ 내지 6℃의 온도에서 해동을 통상적으로 수행한다. 낮은 온도에서 냉동된 혈장을 완전히 해동한 후, 냉소(예를 들면, ≤6℃, 바람직하게는 2.5±3.5℃)에서 원심분리를 수행하여 액체 상청액으로부터 고체 저온침전물을 분리시킨다. 대안적으로, 원심분리보다는 정제에 의해 분리 단계를 수행할 수 있다. 이후, 액체 상청액(또한 새로 해동된 혈장으로부터 원심분리에 의해 제거된 차가운 불용성 단백질 후 "냉동 결핍성 혈장"이라고도 칭함)을 다음 단계에서 처리한다. 인자 8 억제제 바이패스 활성(FEIBA), IX 인자-복합체, VII 인자-농축물 또는 안티트롬빈 III-복합체의 단리를 위해 이 시점에서 다양한 추가의 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 면역글로빈 함유 용액을 추가로 농후화하기 전에 냉동 결핍성 혈장으로부터 1종 이상의 혈액 인자가 흡착될 수 있다.
Ⅵ. 냉동 결핍성 혈장의 분별화
IgG 면역글로빈 조성물을 제조하기 위해, 냉동 결핍성 혈장을 보통 분별화하여 존재하는 다른 단백질 및 불순물로부터 원하는 면역글로빈을 분리한다. 알코올(예를 들면, 에탄올) 분별화, 중합체(예를 들면, PEG) 침전, 지방산 및 에스터(예를 들면, 카프릴레이트) 침전, 크로마토그래피 등을 비롯한 혈장을 분별화하는 많은 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 분별화 과정의 예는, 제한 없이, 콘 분별화(J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475; J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950)), 온클레이(Oncley) 분별화(J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550), Deutsch purifications (J. Biol. Chem. 164:109-118), 호퍼(Hoppe) 정제(Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), 팔크스베덴(Falksveden) 정제(스웨덴 특허 제348942), 팔크스베덴 및 룬드발드(Lundblad) 정제(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980), 레빙(Lebing) 정제(Vox Sang 2003 (84):193-201), 타나카(Tanaka) 정제(Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30)), 테츄너(Teschner) 정제(Vox Sang, 2007 (92):42-55), 니츄만(Nitschmann) 분별화(Helv. Chim. Acta 37:866-873), 키스틀러/니츄만 분별화(Vox Sang. 7:414-424 (1962)), 바룬덴(Barundern) 정제(Vox Sang. 7:157-74 (1962)), 코블렛(Koblet) 정제(Vox Sang. 13:93-102 (1967)), 미국 특허 제5,122,373호 또는 제5,177,194호에 개시된 정제 절차, 이의 변형된 절차 및 당해 분야에 공지된 유사한 또는 동등한 정제 절차를 들 수 있고, 이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 명확히 포함된다.
일반적으로, 본 명세서에 제공된 방법은 상기 기재된 임의의 정제 반응식과 호환된다. 그러므로, 일 실시양태에서, 냉동 결핍성 혈장을 정제 반응식 중 어느 하나에 따라 부분 또는 완전 분별화한다. 특정한 실시양태에서, 냉동 결핍성 혈장을 상기 기재된 교시내용에 개시된 1개 이상의 분별화 단계에 따라 분별화하여 분별화 중간체 조성물을 제조한다. 더 구체적인 실시양태에서, 냉동 결핍성 혈장을 분별화하여 I 분획 침전물, II 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 또는 이의 변형된 침전물을 제조한다.
바람직한 실시양태에서, 냉동 결핍성 혈장은 1개 이상의 에탄올 침전 단계에 의해 분별화된다. 상청액 중에 1종 이상의 비면역글로빈 단백질을 보유하면서 용액으로부터 원하는 면역글로빈을 침전시키거나, 상청액 중에 원하는 면역글로빈을 보유하면서 1종 이상의 비면역글로빈 단백질을 침전시키기 위해 에탄올 침전 단계를 이용할 수 있다. 이러한 방식으로 면역글로빈을 분별화하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 에탄올 침전물은, 제한 없이, I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 하기 기재된 바와 같은 I+II+III 분획 침전 단계, A 침전 단계, B 침전 단계 및 II 분획 침전 단계를 포함하는 4단계 에탄올 과정에 의해 냉동 결핍성 혈장에 존재하는 면역글로빈은 농후해진다.
Ⅶ. 예시적인 분별화 반응식
아미도분해 활성(예를 들면, XI 인자 및/또는 XIa 인자 함량) 및/또는 항보체 활성(ACA)을 감소시키기 위해 본 명세서에 제공된 방법을 수행하기 위해 많은 상이한 출발 물질(예를 들면, 상이한 혈장 분획)을 사용할 수 있다는 것을 당업자가 인식할지라도, 예시적인 분별화 반응식이 하기 제공된다. 예시적인 분별화 반응식은 재현탁되고 이후 본 명세서에 제공된 방법에 대한 출발 물질로서 사용될 수 있는 II 분획 침전을 제조하기 위해 4개의 에탄올 침전 반응을 이용한다. 당해 분야에 널리 공지된 예컨대 음이온 교환 크로마토그래피, 한외여과/정용여과, 바이러스 불활화 및/또는 제거 단계 및 다른 농후화 단계와 같은 기법을 이용하는 하류 공정처리에 의해 생성된 농후화 IgG 면역글로빈 조성물은 추가로 농후화될 수 있다.
따라서, 일 실시양태에서, 본 발명은 IgG 면역글로빈 조성물을 제조하는 방법으로서, (a) 냉동 결핍성 혈장 분획을 제공하는 단계; (b) 6.5 내지 7.3의 pH 및 -8℃ 내지 -2℃의 온도에서 17% 내지 23%(v/v)의 최종 농도에서 에탄올을 냉동 결핍성 혈장 분획과 혼합하여 제1 침전 반응에서 냉동 결핍성 혈장 분획으로부터 면역글로빈을 침전시켜, 제1 침전물 및 제1 상청액을 형성하는 단계; (c) 제1 침전물에 존재하는 면역글로빈을 재현탁시켜 제1 현탁액을 형성하는 단계; (d) 6.8 내지 7.6의 pH 및 -8℃ 내지 -2℃의 온도에서 17% 내지 23%(v/v)의 최종 농도에서 에탄올을 냉동 결핍성 혈장 분획과 혼합하는 제2 침전 반응에서 제1 현탁액으로부터 면역글로빈을 침전시켜, 제2 침전물 및 제2 상청액을 형성하는 단계; (e) 제2 침전물에 존재하는 면역글로빈을 재혀탁시켜, 제2 현탁액을 형성하는 단계; (f) 5.0 내지 5.8의 pH 및 -8℃ 내지 -2℃의 온도에서 14% 내지 20%(v/v)의 최종 농도에서 에탄올을 냉동 결핍성 혈장 분획과 혼합하여 제3 침전 반응에서 제2 현탁액으로부터 면역글로빈을 침전시켜, 제3 침전물 및 제3 상청액을 형성하는 단계; (g) 6.7 내지 7.5의 pH 및 -8℃ 내지 -2℃의 온도에서 22% 내지 28%(v/v)의 최종 농도에서 에탄올을 냉동 결핍성 혈장 분획과 혼합하여 제4 침전 반응에서 제3 상청액으로부터 면역글로빈을 침전시켜, 제4 침전물 및 제4 상청액을 형성하는 단계; (h) 제4 침전물을 재현탁시켜 제3 현탁액을 형성하는 단계; (i) 제3 현탁액을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 IgG 면역글로빈 및 (ⅰ) FXI 및/또는 FXIa의 분획 및 (ⅱ) 제1 양의 항보체 활성(ACA) 중 하나 이상을 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계; (j) 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 양이온 교환 수지로부터 IgG 면역글로빈을 용리시켜 전연부 및 후연부를 포함하는 용리물을 형성하는 단계; 및 (k) 용리물의 후연부로부터 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 제1 용액 조건의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 22mS/㎝의 전도율을 갖는다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 특정한 실시양태에서, 약양이온 교환 수지는 카복시메틸(CM) 수지이다.
A. 상류 분별화 반응식 I
제1 예시적인 상류 정제 반응식에서, IgG 면역글로빈을 포함하는 혈장을 하기 기재된 바대로 알코올 분별화(예를 들면, 에탄올 분별화)로 처리한다. 일 실시양태에서, 이 제1 상류 분별화 반응식은 궁극적으로 아미도분해 활성(예를 들면, XI 인자/XIa) 및/또는 항보체 활성(ACA)의 감소를 위한 본 명세서에 제공된 양이온 교환 크로마토그래프 방법에 대한 출발 물질을 제공하는 II 분획 침전 단계 전에 I+II+III 분획 침전 단계, A 분획 침전 단계 및 B 분획 침전 단계를 포함한다.
하기 기재된 각각의 I+II+III 분획, A 분획, B 분획 및 II 분획 침전 단계에 대한 침전 조건(예를 들면, 에탄올 농도, pH, 온도, 분리 기법)의 모든 조합을 포함하는 방법이 고려된다. 더욱이, 특정 침전 조건의 모든 조합을 포함하는 방법이 하기 기재된 바대로 용리물의 전연부를 한정하고 수집하는 모든 가능한 반응식과 함께 고려된다.
1. I+II+III 분획 침전
일 실시양태에서, 6.5 내지 7.3의 pH에서 17% 내지 23%(v/v)의 최종 농도에서 에탄올을 냉동 결핍성 혈장에 첨가하여 I+II+III 분획 침전을 형성한다. 이후, 혼합물을 -8℃ 내지 -2℃에서 교반하면서 항온처리한다. 일반적으로 냉소에서 수행되는 혼합물의 원심분리 또는 정제에 의해 I+II+III 분획 상청액으로부터 생성된 I+II+III 분획 침전물을 분리할 수 있다. 다량의 면역글로빈 함량이 I+II+III 분획 침전물에 존재하고, 이 침전물을 재현탁시키고 추가로 농후화할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 20±3%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 20±2%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 20±1%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 20%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% 또는 23%(v/v)이다.
구체적인 일 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.9±0.4이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.9±0.3이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.9±0.2이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.9±0.1이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.9이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2 또는 7.3이다.
구체적인 일 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 온도는 -5±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 온도는 -5±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 온도는 -5±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 온도는 -5℃이다. 또 다른 실시양태에서, I+II+III 분획 침전 단계의 온도는 -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃ 또는 -2℃이다.
특정한 실시양태에서, 냉동 결핍성 혈장을 6.9±0.2의 pH로 조정하고, 알코올 농도는 아세트산나트륨 3수화물, 빙초산 및 주사용수(pH 4.0) 및 변성 에틸 알코올(화학식 SDA-3A)을 포함하는 재현탁액 완충제의 첨가에 의해 20%(v/v)인 것으로 계산된다. 완전 혼합으로 알코올의 필요한 양으로 완충제를 첨가한다. 알코올을 냉동 결핍성 혈장에 첨가하기 전에 -15℃ 이하의 온도로 냉각시킨다. 완충제 및 알코올을 혈장에 첨가하고, 현탁액 탱크를 -5±2℃의 온도로 냉각시킨다. 첨가를 완료한 후, 용액의 pH를 확인하고 pH 4.0 완충제 또는 중탄산나트륨 용액으로 필요한 대로 6.9±0.2로 조정한다. 이후, 생성된 I+II+III 분획 현탁액을 원심분리하여 상청액으로부터 침전물을 분리시킨다.
2. A 분획 침전
IgG 함량 및 순도를 추가로 농후화하기 위해, 일 실시양태에서, I+II+III 분획 침전물을 재현탁시키고 제2 침전 단계(A 분획 침전)를 수행한다. 6.8 내지 7.6의 pH에서 17% 내지 23%(v/v)의 최종 농도로 에탄올을 I+II+III 분획 현탁액에 첨가하여 A 분획 침전을 수행한다. 이후, 혼합물을 -8℃ 내지 -2℃에서 교반하면서 항온처리한다. 일반적으로 냉소에서 수행되는 혼합물의 원심분리 또는 정제에 의해 A 분획 상청액으로부터 생성된 A 분획 침전물을 분리할 수 있다. 다량의 면역글로빈 함량이 A 분획 침전물에 존재하고, 이 침전물을 재현탁시키고 추가로 농후화할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, A 분획 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 20±3%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 20±2%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 20±1%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 20%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% 또는 23%(v/v)이다.
구체적인 일 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 pH는 7.2±0.4이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 pH는 7.2±0.3이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 pH는 7.2±0.2이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 pH는 7.2±0.1이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 pH는 7.2이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 pH는 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 또는 7.6이다.
구체적인 일 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃ 또는 -2℃이다.
구체적인 일 실시양태에서, I+II+III 분획 침전물을 아세트산나트륨 3수화물, 빙초산 및 주사용수(pH 4.0)를 포함하는 차가운 재현탁액 완충제 중에 현탁시키고 혼합한다. 현탁액을 WFI로 희석하여 1.0±0.3%(w/v)의 계산된 단백질 농도를 성취한다. 현탁액이 균일할 때까지 계속해서 교반한다. 용액을 완충제(pH 4.0) 또는 0.25M 인산나트륨으로 7.2±0.2의 pH로 조정하고 20%(v/v)의 계산된 알코올 농도가 되게 한다. 알코올을 용액에 첨가하기 전에 -15℃ 이하의 온도로 냉각시킨다. 차가운 알코올을 첨가하고, 탱크를 -5±2℃의 온도로 냉각시킨다. 첨가를 완료한 후, 현탁액의 pH를 확인하고 필요한 대로 7.2±0.2로 조정한다. 이후, 형성된 침전물(A 분획 침전물이라 칭함)을 여과시켜 상청액으로부터 침전물을 분리시킨다.
3. B 분획 침전
IgG 함량 및 순도를 추가로 농후화하기 위해, 일 실시양태에서, A 분획 침전물을 재현탁시키고 제3 침전 단계(B 분획 침전)를 수행한다. 5.0 내지 5.8의 pH에서 14% 내지 20%(v/v)의 최종 농도로 에탄올을 A 분획 현탁액에 첨가하여 B 분획 침전을 수행한다. 이후, 혼합물을 -8℃ 내지 -2℃에서 교반하면서 항온처리한다. 일반적으로 냉소에서 수행되는 혼합물의 원심분리 또는 정제에 의해 B 분획 상청액으로부터 생성된 B 분획 침전물을 분리할 수 있다. 다량의 면역글로빈 함량이 B 분획 침전물에 존재하고, 이 침전물을 재현탁시키고 추가로 농후화할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, B 분획 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 17±3%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 17±2%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 17±1%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 17%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% 또는 20%(v/v)이다.
구체적인 일 실시양태에서, B 분획 침전 단계의 pH는 5.4±0.4이다. 또 다른 실시양태에서, B 분획 침전 단계의 pH는 5.4±0.3이다. 또 다른 실시양태에서, B 분획 침전 단계의 pH는 5.4±0.2이다. 또 다른 실시양태에서, B 분획 침전 단계의 pH는 5.4±0.1이다. 또 다른 실시양태에서, B 분획 침전 단계의 pH는 5.4이다. 또 다른 실시양태에서, B 분획 침전 단계의 pH는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7 또는 5.8이다.
구체적인 일 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -5℃이다. 또 다른 실시양태에서, A 분획 침전 단계의 온도는 -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃ 또는 -2℃이다.
특정한 실시양태에서, A 분획 침전물을 차가운 주사용수(WFI) 중에 현탁시키고 1 시간 이상 동안 교반한다. 침전물을 완전히 현탁시킬 때, 아세트산나트륨을 포함하는 완충제를 첨가한다. 현탁액이 균질해질 때까지 계속해서 교반한다. pH를 pH 4.0 완충제(109g/ℓ 아세트산나트륨 3수화물, 240g/ℓ 빙초산 및 WFI) 또는 0.25M 인산나트륨으로 5.4±0.2로 조정한다. 현탁액을 1.2±0.3%(w/v)의 단백질 농도를 성취하도록 계산된 차가운 WFI 중에 희석한다. 현탁액이 균질해질 때까지 계속해서 교반한다. 알코올 함량은 -15℃ 이하로 예비 냉각된 알코올을 첨가하여 17%(v/v)인 것으로 계산된 농도가 된다. 차가운 알코올을 첨가하고, 탱크를 -5±2℃로 냉각시킨다. 필요한 경우, pH를 4.0 pH 완충제 또는 0.25M 인산나트륨으로 5.4±0.2로 재조정한다. 형성된 침전물인 B 분획 침전물을 뎁스 필터(depth filter)를 사용하여 정제로 분리한다. B 분획 여액(즉, 상청액)을 추가의 농후화를 위해 회수한다.
B. 상류 분별화 반응식 II
제2 예시적인 상류 정제 반응식에서, IgG 면역글로빈을 포함하는 혈장을 하기 기재된 바대로 알코올 분별화(예를 들면, 에탄올 분별화)로 처리한다. 일 실시양태에서, 이 제1 상류 분별화 반응식은 궁극적으로 아미도분해 활성(예를 들면, XI 인자/XIa) 및/또는 항보체 활성(ACA)의 감소를 위한 본 명세서에 제공된 양이온 교환 크로마토그래프 방법에 대한 출발 물질을 제공하는 II 분획 침전 단계 전에 I 분획 침전 단계 및 II+III 분획 침전 단계를 포함한다.
하기 기재된 각각의 I 분획, II+III 분획 및 II 분획 침전 단계에 대한 침전 조건(예를 들면, 에탄올 농도, pH, 온도, 분리 기법)의 모든 조합을 포함하는 방법이 고려된다. 더욱이, 특정 침전 조건의 모든 조합을 포함하는 방법이 하기 기재된 바대로 용리물의 전연부를 한정하고 수집하는 모든 가능한 반응식과 함께 고려된다.
1. I 분획 침전
일 실시양태에서, 6.7 내지 7.3의 pH에서 6% 내지 10%(v/v)의 최종 농도에서 에탄올을 냉동 결핍성 혈장에 첨가하여 I 분획 침전을 형성한다. 이후, 혼합물을 -4℃ 내지 2℃에서 교반하면서 항온처리한다. 일반적으로 냉소에서 수행되는 혼합물의 원심분리 또는 정제에 의해 I 분획 상청액으로부터 생성된 I 분획 침전물을 분리할 수 있다. 다량의 면역글로빈 함량이 I 분획 상청액에 존재하고, 이 상청액을 재현탁시키고 추가로 농후화할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, I 분획 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 8±2%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 8±1%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 8%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%(v/v)이다.
구체적인 일 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.4이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.3이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.2이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.1이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 pH는 7.0이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 pH는 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2 또는 7.3이다.
구체적인 일 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 온도는 -1±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 온도는 -1±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 온도는 -1±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 온도는 -1℃이다. 또 다른 실시양태에서, I 분획 침전 단계의 온도는 -4℃, -3℃, -2℃, -1℃, 0℃, 1℃ 또는 2℃이다.
특정한 실시양태에서, 냉동 결핍성 혈장을 7.0±0.1의 pH로 조정하고, 알코올 농도는 8%(v/v)인 것으로 계산된다. pH 및 알코올 농도를 조정하기 위해 사용되는 용액을 완전 혼합으로 첨가한다. 침전 반응의 온도를 낮추고, -1±1℃에서 유지시킨다. 이후, 생성된 I 분획 현탁액을 원심분리하거나 여과시켜 상청액으로부터 침전물을 분리시킨다.
2. II+III 분획 침전
IgG 함량 및 순도를 추가로 농후화하기 위해, 일 실시양태에서, I 분획 상청액을 제2 침전 단계(II+III 분획 침전)를 위한 재료로서 사용한다. 6.7 내지 7.3의 pH에서 22% 내지 28%(v/v)의 최종 농도로 에탄올을 I 분획 상청액에 첨가하여 II+III 분획 침전을 수행한다. 이후, 혼합물을 -10℃ 내지 -4℃에서 교반하면서 항온처리한다. 일반적으로 냉소에서 수행되는 혼합물의 원심분리 또는 정제에 의해 II+III 분획 상청액으로부터 생성된 II+III 분획 침전물을 분리할 수 있다. 다량의 면역글로빈 함량이 II+III 분획 침전물에 존재하고, 이 침전물을 재현탁시키고 추가로 농후화할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 25±3%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 25±2%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 25±1%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 25%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27% 또는 28%(v/v)이다.
구체적인 일 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.4이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.3이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.2이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 pH는 7.0±0.1이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 pH는 7.0이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 pH는 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3 또는 7.4이다.
구체적인 일 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 온도는 -7±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 온도는 -7±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 온도는 -7±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 온도는 -7℃이다. 또 다른 실시양태에서, II+III 분획 침전 단계의 온도는 -10℃, -9℃, -8℃, -7℃, -6℃, -5℃ 또는 -4℃이다.
특정한 실시양태에서, I 분획 상청액을 7.0±0.1의 pH로 조정하고, 알코올 농도는 25%(v/v)인 것으로 계산된다. pH 및 알코올 농도를 조정하기 위해 사용되는 용액을 완전 혼합으로 첨가한다. 침전 반응의 온도를 낮추고, -6±2℃에서 유지시킨다. 이후, 생성된 II+III 분획 현탁액을 원심분리하거나 여과시켜 상청액으로부터 침전물을 분리시킨다.
C. II 분획 침전
IgG 함량 및 순도를 추가로 농후화하기 위해, 일 실시양태에서, 제4(하기 상류 분별화 반응식 I) 또는 제3(하기 상류 분별화 반응식 II) 알코올 침전 단계(II 분획 침전)를 수행한다. B 분획 여액 또는 II+III 분획 침전물 현탁액의 pH를 6.7 내지 7.5로 조정하고 에탄올을 22% 내지 28%(v/v)의 최종 농도로 첨가하여 II 분획 침전을 수행한다. 이후, 혼합물을 -13℃ 내지 -2℃에서 교반하면서 항온처리한다. 일반적으로 냉소에서 수행되는 혼합물의 원심분리 또는 정제에 의해 B 분획 상청액으로부터 생성된 II 분획 침전물을 분리할 수 있다. 다량의 면역글로빈 함량이 II 분획 침전물에 존재하고, 이 침전물을 재현탁시키고 추가로 농후화할 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, II 분획 침전 단계에서의 에탄올의 최종 농도는 25±3%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 25±2%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 25±1%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 25%(v/v)이다. 또 다른 실시양태에서, 에탄올의 최종 농도는 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27% 또는 28%(v/v)이다.
구체적인 일 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 pH는 7.1±0.4이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 pH는 7.1±0.3이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 pH는 7.1±0.2이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 pH는 7.1±0.1이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 pH는 7.1이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 pH는 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 또는 7.5이다.
구체적인 일 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -5±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -5±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -5±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -5℃이다. 다른 특정한 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -10±3℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -10±2℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -10±1℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -10℃이다. 또 다른 실시양태에서, II 분획 침전 단계의 온도는 -13, -12, -11, -10, -9, -8℃, -7℃, -6℃, -5℃, -4℃, -3℃ 또는 -2℃이다.
특정한 실시양태에서, 1.0M 중탄산나트륨 용액을 사용하여 B 분획 여액의 pH를 7.1±0.2로 조정한다. 추가의 알코올을 혼합하면서 첨가하여 계산된 농도가 25%(v/v)가 되게 한다. pH를 확인하고, 1M 중탄산나트륨 또는 4.0 pH 완충제를 사용하여 필요한 경우 7.3±0.2로 재조정한다. 알코올 첨가를 완료한 후 현탁액을 -5±2℃의 온도에서 적어도 2시간 동안 교반한다. 교반을 완료한 후, pH를 필요한 경우 7.3±0.2로 재조정한다. 현탁액을 원심분리하고, 침전물인 II 분획 침전물을 분리한다.
D. 양이온 교환 크로마토그래피
면역글로빈 조성물을 추가로 농후화하기 위해, 일 실시양태에서, II 분획 침전물을 물 또는 저 이온 농도의 완충제 중에 재현탁시키고 양이온 교환 크로마토그래피로 처리할 수 있다. 일 실시양태에서, II 분획 침전물을 6.0 미만의 pH에서 물 또는 저 이온 농도의 완충제 중에 재현탁시킨다. 통상적으로, 재현탁된 II 분획 침전물의 pH는 5.2±0.2이고, 현탁액의 전도율은 통상적으로 1mS/㎝ 이하로 낮다. 이후, II 분획 현탁액을 여과시켜 6.0 미만의 pH에서 평형화된 양이온 교환 수지에 로딩하기 전에 비가용화 재료를 제거한다. 면역글로빈을 양이온 교환 수지(예를 들면, 양이온 교환 칼럼)에 로딩한 후, 수지를 pH가 6.0 미만인 세척 완충제로 세척할 수 있다. 이후, 면역글로빈을 용리시키기 위해, 양이온 교환 수지를 전도율이 적어도 15mS/㎝(예를 들면, 적어도 150mM NaCl의 염 농도 또는 이의 등가 염으로)이고 pH가 7.0 초과인 용리 완충제와 접촉시킨다. 특정한 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 전에 현탁된 II 분획 침전물을 용매 및 세제(S/D)로 처리한다. 본 명세서에 제시된 예시적인 분별화 반응식의 재현탁된 II 분획 침전물을 본 명세서에 제공된 양이온 교환 방법에 대한 출발 물질로서 사용하더라도, IgG 면역글로빈 및 아미도분해 활성(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa) 및/또는 항보체 활성(ACA)을 포함하는 임의의 혈장 유래 면역글로빈 조성물(즉, 분획)이 본 명세서에 제공된 방법에서 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
높은 수준의 아미도분해 활성(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa) 및/또는 항보체 활성(ACA)이 양이온 교환 수지로부터의 IgG와 동시용리되는 것으로 밝혀졌다. 원하는 면역글로빈으로부터 유의적인 양의 이 불순물을 분리할 수 없다는 것은 높은 아미도분해 활성 및/또는 높은 항보체 활성을 갖는 최종 IgG 조성물을 생성시킨다. 약제학적 면역글로빈 제제 내의 높은 아미도분해 활성 및 항보체 활성과 관련되는 부작용에 기여하는 혈전색전성 사건의 위험 증가를 고려하면, 많은 IgG 생성물에 존재하는 아미도분해 활성(예를 들면, FXI/FXIa) 및/또는 항보체 활성(ACA)에 기여하는 불순물의 제거에 대한 분야의 수요가 존재한다. 유리하게는, 양이온 교환 수지로부터 pH가 7.0 초과인 완충제를 사용하여 면역글로빈을 용리할 때, 아미도분해 활성 및 항보체 활성(ACA)이 오직 용리물의 후연부로 용리된다는 것을 발견하였다. 특히, 용리물의 후연부에서의 아미도분해 활성 및 ACA의 용리는 6.0 미만 내지 7.0 초과의 용리물의 pH 이동에 상응한다. 그러므로, 용리물의 전연부는 높은 농도의 면역글로빈 및 낮은 농도의 아미도분해 활성 및 ACA를 포함하고, 용리물의 후연부는 더 낮은 면역글로빈 농도 및 더 높은 아미도분해 활성 및 ACA를 갖는다. 따라서, 본 명세서에 제공된 방법의 바람직한 실시양태에서, 양이온 교환 용리물의 전연부가 용리물의 후연부와 별도로 수집된다.
특정한 실시양태에서, 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지이다. 예시적인 약양이온 교환 수지는 카복실산 리간드를 갖는 것, 예를 들면 카복시메틸(CM) 수지를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 명세서에 제공된 방법에 사용되는 양이온 교환 수지는 카복시메틸 수지, 예를 들면 CM-세파로스이다.
일 실시양태에서, II 분획 침전물을 4.8 내지 5.6의 pH에서 차가운 물 또는 저 이온 농도의 완충제로 재현탁시킨다. 특정한 실시양태에서, 재현탁액에 사용되는 물 또는 완충제의 pH는 5.2±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 재현탁액에 사용되는 물 또는 완충제의 pH는 5.2±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 재현탁액에 사용되는 물 또는 완충제의 pH는 5.2±0.1이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 재현탁액에 사용되는 물 또는 완충제의 pH는 5.2이다. 또 다른 실시양태에서, 재현탁액에 사용되는 물 또는 완충제의 pH는 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다.
일 실시양태에서, 양이온 교환 수지를 4.6 내지 5.6의 pH로 예비 평형화한다. 특정한 실시양태에서, 수지를 4.6 내지 5.5의 pH로 예비 평형화한다. 다른 특정한 실시양태에서, 수지를 5.0±0.4의 pH로 예비 평형화한다. 다른 특정한 실시양태에서, 수지를 5.0±0.3의 pH로 예비 평형화한다. 다른 특정한 실시양태에서, 수지를 5.0±0.2의 pH로 예비 평형화한다. 다른 특정한 실시양태에서, 수지를 5.0±0.1의 pH로 예비 평형화한다. 다른 특정한 실시양태에서, 수지를 5.0의 pH로 예비 평형화한다. 또 다른 실시양태에서, 수지를 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0의 pH로 예비 평형화한다.
일 실시양태에서, 청명한 II 분획 현탁액을 양이온 교환 수지에 로딩한 후, 수지를 전도율이 충분히 낮은 완충제로 세척하여 면역글로빈이 수지로부터 용리되지 않고, pH는 5.1 내지 5.9이다. 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5±0.1이다. 다른 특정한 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.5이다. 또 다른 실시양태에서, 세척 완충제의 pH는 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9 또는 6.0이다.
일 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.5 초과이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.4 내지 8.2이다. 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.3이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.2이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8±0.1이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.8이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 pH는 7.0, 7.1, 7.2, 7.36, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4 또는 8.5이다.
구체적인 일 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 적어도 10mS/㎝이다. 바람직한 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 적어도 15mS/㎝이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 적어도 20mS/㎝이다. 특정한 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 10mS/㎝ 내지 40mS/㎝이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 15mS/㎝ 내지 30mS/㎝이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 20mS/㎝ 내지 30mS/㎝이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 25mS/㎝ 내지 30mS/㎝이다. 또 다른 실시양태에서, 용리 완충제의 전도율은 약 5mS/㎝ 또는 약 6mS/㎝, 7mS/㎝, 8mS/㎝, 9mS/㎝, 10mS/㎝, 11mS/㎝, 12mS/㎝, 13mS/㎝, 14mS/㎝, 15mS/㎝, 16mS/㎝, 17mS/㎝, 18mS/㎝, 19mS/㎝, 20mS/㎝, 21mS/㎝, 22mS/㎝, 23mS/㎝, 24mS/㎝, 25mS/㎝, 26mS/㎝, 27mS/㎝, 28mS/㎝, 29mS/㎝, 30mS/㎝, 31mS/㎝, 32mS/㎝, 33mS/㎝, 34mS/㎝, 35mS/㎝, 36mS/㎝, 37mS/㎝, 38mS/㎝, 39mS/㎝, 40mS/㎝ 이상이다.
일 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 80% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 80%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70% 내지 75%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 75% 내지 80%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%이다.
또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 70% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 70%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60% 내지 65%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 65% 내지 70%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 또는 70%이다.
또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부(즉, 관심 대상의 수집된 풀에 있는 분획)는 전체 용리물 중 60% 이하이다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 60%이다. 다른 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50% 내지 55%이다. 또 다른 구체적인 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 55% 내지 60%이다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 전체 용리물 중 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% 또는 60%이다.
또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부 및 후연부는 용액의 pH에 의해 정의된다. 일 실시양태에서, 전연부는 pH가 7.0 이하인 용리물이다. 또 다른 실시양태에서, 전연부는 pH가 6.5 이하인 용리물이다. 또 다른 실시양태에서, 전연부는 pH가 6.0 이하인 용리물이다. 또 다른 실시양태에서, 전연부는 pH가 5.5 이하인 용리물이다. 또 다른 실시양태에서, 전연부는 pH가 5.0 이하인 용리물이다. 또 다른 실시양태에서, 전연부는 pH가 7.0, 6.9, 6.8, 6.7, 6.6, 6.5, 6.4, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0 이하인 용리물이다.
일 실시양태에서, 용리물의 전연부는 용리물의 OD280이 2.0AU 미만으로 하강하는 시점 전에 양이온 교환 수지로부터 용리되는 용리물의 분획으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 용리물의 OD280이 1.5AU 미만으로 하강하는 시점 전에 양이온 교환 수지로부터 용리되는 용리물의 분획으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 용리물의 OD280이 1.0AU 미만으로 하강하는 시점 전에 양이온 교환 수지로부터 용리되는 용리물의 분획으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 용리물의 OD280이 0.5AU 미만으로 하강하는 시점 전에 양이온 교환 수지로부터 용리되는 용리물의 분획으로 정의된다. 또 다른 실시양태에서, 용리물의 전연부는 용리물의 OD280이 2.0AU, 1.9AU, 1.8AU, 1.7AU, 1.6AU, 1.5AU, 1.4AU, 1.3AU, 1.2AU, 1.1AU, 1.0AU, 0.9AU, 0.8AU, 0.7AU, 0.6AU, 0.5AU, 0.4AU, 0.3AU, 0.2AU, 0.1AU 이하로 하강하는 시점 전에 양이온 교환 수지로부터 용리되는 용리물의 분획으로 정의된다. 특정한 실시양태에서, 용리물의 전연부는 용리물의 OD280이 역치, 예를 들면 0.1AU, 0.2AU, 0.3AU, 0.4AU, 0.5AU, 0.6AU, 0.7AU, 0.8AU, 0.9AU, 1.0AU, 1.1AU, 1.2AU, 1.3AU, 1.4AU, 1.5AU, 1.6AU, 1.7AU, 1.8AU, 1.9AU, 2.0AU 이상으로 상승한 후 양이온 교환 수지로부터 용리되는 용리물의 분획으로 추가로 정의된다.
E. 한외여과/정용여과(UF/DF)
IgG 조성물은 한외여과/정용여과에 의해 추가로 농축될 수 있다. 일 실시양태에서, IgG 조성물은 2% 내지 10%(w/v)의 단백질 농도로 한외여과에 의해 농축될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 개방 채널 스크린을 갖는 카세트에서 한외여과를 수행하고, 한외여과 막은 명칭 분자량 컷오프(NMWCO)가 100kDa 이하 또는 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30kDa 이하 또는 더 낮다. 바람직한 실시양태에서, 한외여과 막은 NMWCO가 50kDa 이하이다.
미국 특허 출원 공보 제2010/0330071호(이의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)에 기재된 것처럼, 개방 채널 막은 생성 과정 종료 근처의 제조 및 특별히 설계된 후세척에 사용되어 생성된 IgG 조성물이 수율 및 저장 안정성에 영향을 미치는 일 없이 최신 IVIG(예를 들면, 감마가드(GAMMAGARD)(등록상표) 액체)와 비교하여 단백질 농도(200㎎/㎖)에서 약 2배되게 할 수 있다. 대부분의 상업적으로 구입 가능한 한외여과 막으로, 200㎎/㎖의 IgG의 농도가 주요한 단백질 손실 없이 도달될 수 없다. 이 막은 일찍 차단되고 따라서 적절한 후세척을 성취하기 어렵다. 따라서 개방 채널 막 구성을 사용해야 한다. 심지어 개방 채널 막으로도, 유의적인 단백질 손실(2% 미만의 손실) 없이 필요한 농도를 얻기 위해 특별히 설계된 후세척 절차를 사용해야 한다. 200㎎/㎖의 더 높은 단백질 농도가 낮은 pH 저장 단계의 바이러스 불활화 용량에 영향을 미치지 않는다는 것이 심지어 더 놀랍다.
한외여과 단계 완료 시, 정맥내 또는 근육내 투여에 적합한 용액에 대해 정용여과를 통해 농축물을 추가로 농축할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 정용여과 용액은 안정화제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 안정화제 및 완충제는 0.20M 내지 0.30M 또는 0.22M 내지 0.28M 또는 0.24M 내지 0.26mM과 같은 적절한 농도 또는 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9 또는 3.0의 농도의 글라이신이다. 바람직한 실시양태에서, 정용여과 완충제는 0.25M 글라이신을 포함한다.
통상적으로, 최소 교환 용적은 원래의 농축물 용적의 적어도 약 3배 또는 원래의 농축물 용적의 적어도 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 이상이다. IgG 용액은 3% 내지 25%(w/v) 또는 3% 내지 7% 또는 6% 내지 18%(w/v) 또는 7% 내지 16%(w/v) 또는 8% 내지 14%(w/v) 또는 9% 내지 12%의 최종 단백질 농도 또는 5% 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 이상의 최종 농도로 농축될 수 있다. 일 실시양태에서, 후세척 분획을 농축된 용액에 첨가하지 않고 적어도 23%의 최종 단백질 농도가 성취된다. 또 다른 실시양태에서, 후세척 분획을 농축된 용액에 첨가하지 않고 적어도 24%의 최종 단백질 농도가 성취된다. 또 다른 실시양태에서, 후세척 분획을 농축된 용액에 첨가하지 않고 적어도 25%의 최종 단백질 농도가 성취된다. 통상적으로, 농축 과정의 종료 시, 용액의 pH는 약 4.6 내지 5.1이다.
예시적인 실시양태에서, IgG 조성물의 pH를 1M 염산을 사용하여 5.2±0.2로 조정하고, 한외여과(100kDa 이하의 명칭 분자량 컷오프 한계)에 의해 5±1g % 단백질로 농축시킨다. 이후, 농축물을 정용여과 용액(0.02M NaCl, 0.05%(w/v) PEG)으로 정용여과시킨다. 정용여과을 5±2℃로 냉각시킨다. 용액의 트리스 완충제 농도를 2.0M 트리스를 사용하여 0.025M으로 조정하고, pH를 내지 7.8±0.2로 재조정한다.
F. 음이온 교환 크로마토그래피
일 실시양태에서, 이후 단백질을 평형화 ANX 세파로스(등록상표) 4 고속 유동 칼럼에 로딩하여 혈장 유래 오염물질을 제거한다. 로딩을 완료한 후, 칼럼을 평형 완충제(25mM 트리스, 20mM NaCl, pH 7.8±0.2)로 세척한다. 로딩 및 세척 단계로부터의 칼럼 통과물(IgG 용액)을 풀에 넣는다.
G. 바이러스 불활화 및/또는 제거
특정한 실시양태에서, 농후화된 면역글로빈 조성물의 제조를 위한 본 명세서에 제공된 방법은 1개 이상, 바람직하게는 적어도 2개, 가장 바람직하게는 적어도 3개의 바이러스 불활화 또는 제거 단계를 추가로 포함한다. 본 명세서에 제공된 방법과 사용될 수 있는 바이러스 불활화 또는 제거 단계의 비제한적인 예는 용매 세제 처리(Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Suppl 3):S21-S28 및 Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028, 이들 둘 다 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨), 나노정제(Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 및 Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024, 이들 둘 다 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨) 및 고온에서의 낮은 pH 항온처리(Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 및 Louie et al., Biologicals 1994 (22):13-19)를 들 수 있다.
제조 공정 동안 생성된 임의의 중간체 면역글로빈 분획에서 바이러스 불활화 또는 제거 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 일 실시양태에서, I+II+III 분획 현탁액, A 분획 현탁액, B 분획 여액, II 분획 현탁액, 양이온 교환 용리물, 음이온 교환 용리물 등에서 바이러스 불활화 또는 제거 단계를 수행할 수 있다.
일 실시양태에서, II 분획 현탁액에서 바이러스 불활화 또는 제거 단계를 수행한다. 바람직한 실시양태에서, II 분획 현탁액을 용매 및 세제(S/D) 처리한다.
1. 용매 세제(S/D) 처리
혈장 유래 생성물에 존재할 수 있는 다양한 바이러스 오염물질을 불활화하기 위해, 1종 이상의 면역글로빈 제제 중간체를 용매 세제(S/D) 처리할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, II 분획 침전물을 재현탁시키고 S/D 처리한다. 혈장 유래 분획의 세제 처리 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(검토를 위해, 문헌[Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006;19(1):205-42]을 참조한다). 일반적으로, 본 명세서에 제공된 방법과 함께 임의의 표준 S/D 처리를 이용할 수 있다. 예를 들면, S/D 처리를 위한 예시적인 프로토콜이 하기 제공된다.
간단히 말하면, 트라이톤 X-100, 트윈-20 및 트라이(n-뷰틸)포스페이트(TNBP)를 각각 약 1.0%, 0.3% 및 0.3%의 최종 농도에서 청명한 PptG 여액에 첨가한다. 이후, 혼합물을 약 18℃ 내지 약 25℃의 온도에서 적어도 약 1시간 동안 교반한다.
일 실시양태에서, S/D 시약(예를 들면, 트라이톤 X-100, 트윈-20 및 TNBP)을 능수능란한 첨가보다는 분사로 첨가한다. 다른 실시양태에서, 세제 시약을 면역글로빈 중간체 용액에 고체로서 첨가할 수 있고, 이 중간체 용액을 혼합하여 S/D 성분의 신속한 분포를 보장한다. 특정한 실시양태에서, 여액의 비편재화 표면적에 걸쳐 고체를 뿌려 고체 시약을 첨가하는 것이 바람직하고, 능수능란한 첨가에서처럼 국소 과농도가 발생하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로빈 함유 용액을 농축 또는 희석 형태로 SD-시약이 이미 존재하는 탱크에 펌프질하여 과정 개선을 실현한다.
2. 나노정제
본 명세서에 제공된 면역글로빈 조성물의 바이러스 로드를 추가로 감소시키기 위해, 적합한 나노정제 장치를 사용하여 면역글로빈 중간체 분획을 나노여과시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 나노정제 장치는 약 15㎚ 및 200㎚ 또는 이들 사이의 평균 기공 크기를 갖는다. 이러한 사용에 적합한 나노필터의 예는, 제한 없이, DVD, DV 50, DV 20(Pall), 비레솔브(Viresolve) NFP, 비레솔브 NFR(밀리포어(Millipore)), 플라노바(Planova) 15N, 20N, 35N 및 75N(플라노바)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 나노필터는 약 15㎚ 및 72㎚ 또는 이들 사이 또는 약 19㎚ 및 35㎚ 또는 이들 사이 또는 약 15㎚, 19㎚, 35㎚ 또는 72㎚의 평균 기공 크기를 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 나노필터는 약 35㎚의 평균 기공 크기를 갖고, 예컨대 아사히(Asahi) 플라노바 35N 필터 또는 이의 균등물이다.
임의로, 나노여액을 추가로 농축시키기 위해 한외여과/정용여과를 수행할 수 있다. 일 실시양태에서, 개방 채널 막은 생성 과정 종료 근처의 제조 및 특별히 설계된 후세척에 사용되어 높은 농도의 면역글로빈 조성물을 생성시킨다.
나노정제에 후속하여, 여액을 한외여과로 추가로 농축시키고/시키거나 완충제 조성물을 정용여과로 조정할 수 있다. 일 실시양태에서, 나노여액을 약 0.5% 및 10%(w/v) 또는 이들 사이의 단백질 농도로 한외여과로 농축시킬 수 있다. 특정한 실시양태에서, 개방 채널 스크린을 갖는 카세트에서 한외여과를 수행하고, 한외여과 막은 명칭 분자량 컷오프(NMWCO)가 약 150kDa 이하 또는 약 140, 130, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30kDa 이하 또는 더 낮다. 일 실시양태에서, 한외여과 막은 NMWCO가 50kDa 이하이다.
3. 낮은 pH에서의 항온처리
특정한 실시양태에서, 상기 조성물의 바이러스 로드를 감소시키거나 불활화시키기기 위해 면역글로빈 함유 용액을 처리할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 조성물의 pH를 예를 들면 약 6.0 이하의 낮은 pH로 조정하고 상기 조성물을 방출하기 전에 적어도 약 1주 동안 항온처리하여 이를 성취한다. 바람직한 실시양태에서, 항온처리 전에 벌크 용액의 pH를 약 5.5 이하로 조정한다. 더 바람직한 실시양태에서, 항온처리 전에 용액의 pH를 약 5.0 이하로 낮춘다. 특정한 실시양태에서, 항온처리 전에 용액의 pH를 약 6.0 이하 또는 약 5.9, 5.8, 5.7, 5.6, 5.5, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 5.0, 4.9, 4.8, 4.7, 4.6, 4.5, 4.4, 4.3, 4.2, 4.1, 4.0 이하로 낮춘다.
특정한 실시양태에서, 이후 용액을 1주 이상 또는 적어도 2주, 3주, 4주 이상 또는 적어도 1달, 2달, 3달 이상 동안 항온처리한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물을 20℃ 초과 또는 25℃ 초과 또는 30℃ 초과의 온도에서 항온처리한다. 특정한 실시양태에서, 상기 조성물을 20℃ 또는 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 40℃ 이상의 온도에서 항온처리한다.
4. 동결건조 및 열 처리
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 동결건조된 동결건조 면역글로빈 조성물을 제공한다. 다른 바이러스 불활화 또는 제거 단계, 예컨대 S/D 처리 또는 나노정제로 이전에 처리될 수 있는 이 동결건조된 조성물의 바이러스 활성을 동결건조된 조성물의 열 처리에 의해 추가로 감소시킬 수 있다. 혈액 인자에서 바이러스 로드의 불활화를 위한 열 처리가 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15;47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein and Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar; 114(3):335-40] 참조).
H. 제조
정용여과 단계의 완료 시, 용액의 단백질 농도를 정용여과 완충제로 약 3% 내지 약 20%(w/v) 또는 3% 내지 7% 또는 약 6% 내지 약 18%(w/v) 또는 약 7% 내지 약 16%(w/v) 또는 약 8% 내지 약 14%(w/v) 또는 약 9% 내지 약 12%의 최종 농도 또는 약 5% 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% 이상의 최종 농도로 조정한다. 바람직한 실시양태에서, 용액의 최종 단백질 농도는 약 9% 내지 약 11%, 더 바람직하게는 약 10%이다.
제제화된 벌크 용액을 약 0.22마이크론 이하, 예를 들면 약 0.2마이크론의 절대 기공 크기를 갖는 막 필터를 통해 여과시켜 추가로 무균화시킨다. 이후, 용액을 적절한 밀봉을 위한 최종 용기로 무균으로 분배하고, 샘플을 시험에 취한다.
일 실시양태에서, IgG 조성물을 정용여과 완충제로 약 10.2±0.2%(w/v)의 농도로 추가로 조정한다. pH를 필요한 경우 약 4.4 내지 약 4.9로 조정한다. 마지막으로, 용액을 무균 여과시키고 약 30℃에서 3주 동안 항온처리한다.
예시적인 실시양태에서, 생성된 IgG 용액을 NaCl(0.15M 최소), 글라이신(0.3M 최소), 글루코스(0.11M 최소) 및 인간 알부민(3㎎/㎖ 최소)으로 안정화시킨다. 1M 염산을 사용하여 pH를 7.0±0.2로 조정한다. 이후, 용액을 한외여과로 원하는 농도로 농축하고, 1M 염산 또는 1M 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.15±0.1로 재조정한다. 0.2마이크론 기공 크기 필터 또는 등가물을 사용하여 벌크 용액을 무균 여과시킨다.
무균 IgG 용액을 용기에 무균으로 분배하고, 동결건조를 위해 마개를 단고, 냉동시키고, 동결건조시키고, 무균 조건 하에 밀봉하고 캡핑할 수 있다.
Ⅷ. 실시예
다른 이점 중에서, 실시예 1 내지 7은 (1) 양이온 교환 수지(예를 들면, CM-세파로스)로부터의 면역글로빈의 단계 용리가 단백질의 이봉 분포를 발생시키고, 여기서 아미도분해 활성(PL-1)이 IgG보다 늦게 용리되어, IgG 수율의 최소 손실로 아미도분해 활성을 제거하는 것이 가능하게 하고; (2) 양이온 교환 수지(예를 들면, CM-세파로스)로부터의 아미도분해 활성(PL-1)의 용리가 본 명세서에 제공된 방법에 따라 용리 동안 CM 칼럼에서 pH 이동과 상관되고 이에 의해 야기될 것이고; (3) 양이온 교환 수지(예를 들면, CM-세파로스)에 로딩된 단백질의 양이 적어도 1㎖ 수지당 60 내지 120㎎ 단백질의 범위에 걸쳐 아미도분해 활성(PL-1)의 제거에 영향을 미치지 않고; (4) 칼럼의 상부에서의 pH 평형이 이미 방해될 것 같으므로, 칼럼 출구에서의 pH를 모니터링하고 증가가 명확할 때 용리를 중지시키는 것은 아미도분해 활성(PL-1) 활성을 부분 제거하고; (5) 아미도분해 활성이 3CV 미만의 초기 용리 풀을 수집하여 IgG 수율(≤10%)의 최소 손실로 유의적으로 감소할 수 있어서, CM-세파로스 용리 단계의 용적을 모니터링하는 것이 본 명세서에 제공된 방법에 따라 제조된 면역글로빈 조성물의 아미도분해 활성을 유의적으로 감소시키기 위한 단순한 방법이고; (6) CM-세파로스 용리 단계의 "제1 피크"를 수집하여, 더 낮은 IgG 응집물 농도, 더 낮은 PKA 활성, 더 낮은 PL-1 활성, 더 높은 IgG 단량체 농도 및 더 바람직한 IgG 하위종류 분포를 갖는 조성물을 성취할 수 있다는 것을 나타낸다.
더욱이, 실시예 8 및 9는 적어도 (1) 용리물의 마지막 25% 부분을 분할하여 FXIa 및 TGA 상승 야기 단백질이 CM-크로마토그래피에서 분리될 수 있고; (2) 상기 기재된 이점은 대규모 제조 공정에서 재현될 수 있고; (3) OD를 모니터링하여 대규모 제조 공정에서 양이온 교환(즉, CM-세파로스) 용리물을 풀에 넣을 수 있고, 예를 들면 용리물의 OD가 2.0 미만으로 하강할 때까지 용리물이 제1 풀에 수집되어, FXIa 및 TGA 값 상승을 야기하는 원치않는 단백질의 유의적인 분리를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 1
이 실시예는 변형된 키스틀러-니츠만 알코올 분별화에 따라 제조된 II 분획 면역글로빈 조성물로부터 TGA, FXIa 상승 및 NAPTT 값 감소를 야기하는 원치않는 단백질의 분포를 기술한다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계(예를 들면, CM 세파로스 고속 유동 크로마토그래피)의 용리 동안 이 불순물을 분리할 수 있다.
이 실시예는 양이온 교환 크로마토그래피의 용리 동안 유의적인 아미도분해 함량(예를 들면, FXI 및/또는 FXIa) 감소를 나타낸다. 상기 방법은 유의적으로 더 적은 TGA 및 FXIa 활성을 포함하는 최종 면역글로빈 생성물을 발생시킨다. (용리물의 전연부에서 발견되는) 주요 IgG 분획으로부터 (용리물의 후연부에 존재하는) 아미도분해 활성을 효과적으로 분리시키는 CM 용리물 단계의 특정한 분별화에 의해 이 감소를 성취한다. 이 실시예는 양이온 교환 용리물을 전연부 및 후연부로 분할하여, IgG 함량의 벌크로부터 원치않는 미량의 단백질이 분리된다는 것을 나타낸다. 더구나, 이 실시예는 이 과정이 대규모 제조에 효과적이고 경제적으로 실행 가능하다는 것을 나타낸다.
간단히 말하면, 하기한 바대로 II 분획 침전물을 준비하였다. 풀에 있는 인간 혈장의 냉동침전 후, pH 6.9에서 20% 알코올에 의한 침전에 의해 I+II+III 분획 침전물을 형성하였다. 침전물 I+II+III의 재현탁 후, 알코올을 7.2의 pH에서 20%의 최종 농도로 첨가하여 A 침전물을 형성하였다. 원심분리에 의해 A 침전물의 분리를 수행하였다. 17% 알코올에 의해 현탁된 A 침전물을 침전시켜 I+III 분획(B 현탁액 침전물이라고도 칭함)을 형성하였다. 정제 또는 원심분리에 의해 침전물을 회수하였다. 이후, B 현탁액 여액을 공정처리하여 II 분획을 형성하고, 이 분획은 부분 정제된 감마 글로빈(예를 들면, IgG) 혈장 단백질 분획을 포함하였다.
이후, II 분획의 청명한 현탁액을 용매 세제(SD)의 혼합물로 처리하고 CM 세파로스 ff 칼럼에 로딩하였다. 잔류 SD 시약으로 세척한 후, 수지에 결합된 IgG 분획을 용리시켰다. 이후, 면역글로빈 용액을 한외여과/정용여과시킨 후, 음이온 교환기에 로딩하여 미량의 불순물을 제거하였다. 다른 농축 단계 후, 최종 제제를 동결건조로 처리할 수 있다.
이후, II 분획 침전물을 4℃ 및 pH 5.2±0.2에서 차가운 물 중에 용해시킬 수 있다. CWSS 정제로 청명하게 한 후, SD 처리를 위해 용액을 조정하였다. 단백질 농도를 2%로 조정하고, SD 항온처리 동안 온도를 20℃ 내지 25℃ 범위에서 유지시켰다. 이후, 단백질 용액을 평형화 CM-세파로스 고속 유동 칼럼(평형 완충제: 0.025M 아세트산나트륨, pH 5.0±0.2)에 로딩하였다. 로딩 후, 흡착된 단백질이 용리 완충제(0.25M NaCl, 0.2M 글라이신, 0.1% PEG 3350, 25mM 트리스, pH 8.00)로 용리되기 전에 칼럼을 30의 칼럼 용적의 아세테이트 완충제(0.01M 아세트산나트륨. pH 5.5±0.2)로 세척하여 SD 시약을 세척하였다. 용리물의 제1 부분(E1)의 수집을 OD 400mAU에서 시작하고, 정확히 2.7의 칼럼 용적에서 중지시켰다(도 1). OD가 다시 400mAU로 하강할 때까지 용리 피크의 제2 분획(E2)을 수집하였다. 이후, 과정의 나머지에 대해 용리된 분획을 별도로 공정처리하였다.
이후, E1 및 E2 조성물을 pH 5.2로 조정하고 정용여과 완충제(0.02M NaCl, 0.05% PEG 3350)에 대해 한외여과/정용여과시켜 5% 단백질(w/v)로 농축시켰다. 0.025M 트리스를 상기 조성물에 첨가하고, pH를 7.7로 조정하였다. 이후, IgG 분획을 완충제(0.025M 트리스, 0.02M NaCl, pH 7.7)로 평형화된 평형화 ANX-세파로스 고속 유동 칼럼에 로딩하였다. 생성된 ANX 통과물을 수집하고, 8.5g/ℓ NaCl, 16.5g/ℓ 글라이신, 21.7g/ℓ 글루코스 무수화물 및 1g/ℓ 알부민(20%)으로 보충하였다. 이후, pH를 조정하고 E1 및 E2 조성물을 한외여과에 의해 10%(w/v) 단백질로 농축시켰다. 농축 후, 농축된 용액을 다시 (알부민이 아니라) NaCl 및 글라이신으로 보충하고, 무균 정제 전에 pH를 필요한 경우 7.1로 조정하였다.
크로마토그래피 단계의 흡광도(mAU), 전도율 및 pH를 보여주는 크로마토그래프가 도 1에 제공되어 있다. 볼 수 있는 것처럼, 상기 기재된 용리 완충제에 의한 단일 단계 용리로 2개의 피크 용리가 생겼다. 특히, 용리 완충제의 첨가 시, 제1 피크가 칼럼으로부터 나오고 이후 제2 피크의 용리로 가파르게 상승하면서, 용리물의 pH가 유의적으로 하강하였다. 기재된 바대로, 제1 분획 E1(도 1에 도시된 수직선의 왼쪽) 및 제2 분획(도 1에 도시된 수직선의 오른쪽)에서 2.7의 칼럼 용적을 수집하여 용리 피크를 분리하였다.
용리된 분획(E1 및 E2)을 별도로 공정처리하여 하기 기재된 바와 같은 최종 면역글로빈 제제를 생성하엿다. 이렇게 하여, 분획 E1 및 E2의 pH를 5.2로 조정하고, 샘플을 정용여과 완충제(0.02M NaCl, 0.05% PEG 3350)에 대해 정용여과시켜 조성물을 5%의 최종 단백질 농도로 농축시켰다. 정용여과 후, 0.025M 트리스를 각각의 단백질 용액에 첨가하고, pH를 7.7로 조정하였다. 이후, IgG 분획을 평형화 ANX-세파로스 고속 유동 칼럼(평형 완충제 0.025M 트리스, 0.02M NaCl pH 7.7)에 로딩하고, 통과물 분획을 수집하였다. 이후, ANX 통과물을 8.5g/ℓ NaCl, 16.5g/ℓ 글라이신, 21.7g/ℓ 글루코스 무수화물 및 1g/l 알부민(20%)으로 보충하였다. 이후, 용액의 pH를 7.00로 조정하고, 면역글로빈 샘플을 한외여과에 의해 10% 단백질로 농축시켰다. 농축 후, NaCl, 글라이신 및 글루코스 무수화물을 다시 첨가하고, 무균 정제 전에 pH를 필요한 경우 7.1로 조정하였다.
크로마토그래프 단계를 규명하기 위해, 물질 균형을 결정하고, 이의 결과가 표 1에 기재되어 있다. 용리 피크의 제2 부분에서 거의 10%의 전체 단백질이 발견되었다. 이는 용리물의 2.7의 칼럼 용적 후 풀에 있는 조성물이 중단될 때 나타나는 수율 손실이다.
Figure 112014028930540-pct00001
이후, 분자 크기 분포, 항보체 활성, 아미도분해 활성(기질로서의 PL-1 및 TGA 둘 다 사용), FXIa 활성 및 NAPTT 활성에 대해 2개의 CM 용리 분획으로부터 제조된 최종 용기를 분석하였다. 결과가 표 2 및 표 3에 기재되어 있다. 용리된 IgG 분획의 제1 부분 및 제2 부분으로부터 유래한 최종 용기의 생화학적 규명은 용리의 제1 부분이 TGA 상승 및 NAPTT 값 감소를 야기하는 FXIa 및 다른 원치않는 단백질이 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, FXIa 및 아미도분해 활성은 제2 부분에서 농후해지고, 여기서 응집물 및 올리고머-이합체 함량이 또한 더 높았다. 흥미롭게도, 용리물의 제1 부분에서의 ACA 값은 매우 낮았고, 용리물의 제2 부분은 훨씬 더 높은 값을 나타낸다.
Figure 112014028930540-pct00002
Figure 112014028930540-pct00003
결론적으로, CM 세파로스 ff 칼럼으로부터 용리의 분할은 2개의 분획을 발생시키고 실질적으로 FXIa가 없는 IgG 조성물이 제조되게 하였다.
실시예 2
제조 규모 면역글로빈 제제에 존재하는 아미도분해 활성의 양을 감소시키기 위해, 양이온 교환 크로마토그래피를 용리시키고 분별화하는 조건을 조사하였다. 이 조사의 상세내용이 하기 제공되어 있다.
본 명세서에서 기재된 감마가드 SID 제조 방법에 따라 하류 과정 동안 아미도분해 활성을 감소/제거하기 위한 적합한 용액을 발견하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 간단히 말하면, 콘 분획 페이스트를 4℃ 및 pH 5.2±0.2에서 차가운 물 중에 용해시켰다. CWSS 정제로 청명하게 한 후, 샘플을 무균 여과시키고 4℃에서 저장하거나, 즉시 공정처리를 위해 2%의 단백질 농도로 물로 희석하였다. 이후, 용액이 20-25℃가 되게 하고, 단백질 용액을 평형화 CM-세파로스 고속 유동 칼럼(평형 완충제: 25mM Na-아세테이트, pH 5.0±0.2)에 로딩하기 전에 용매/세제 혼합물(1% 트라이톤 X-100, 0.3% 트윈 80; 0.3% TNBP)로 1시간 동안 항온처리하였다. 로딩한 후, 칼럼을 아세테이트-완충제(0.01M Na-아세테이트, pH 5.5±0.2)로 세척하고 흡착된 IgG를 용리 완충제(0.25M NaCl, 0.2M 글라이신, 0.1% PEG 3350, 25mM 트리스, pH 7.8)로 용리시켰다. CM 세파로스 ff 실행 동안, (한정된 시점에서) CM 용리물을 분별화하기 위해 OD 280; pH; 및 칼럼 용적(CV)에서의 용리 용적과 같은 매개변수를 모니터링하였다. 이후, 용리물을 정용여과 완충제(0.02M NaCl, 0.05% PEG 3350)로 한외여과/정용여과시키거나 분석에 즉시 사용하였다. 또한 10% 최종 용기 조성물에 상응하는 단백질 값에서 아미도분해 활성을 측정하기 위해 이 농축 단계를 수행하였다.
용리 동안, 용리물은 CM 용리 완충제의 전도율 값을 빨리 얻었다. 그러나, 도 2에 도시된 것처럼, 칼럼 출구에서 측정된 용리물의 pH는 초기에 세척 완충제에서처럼 5.5로부터 5.0(4.3 내지 4.8) 미만으로 하강하고 용리 완충제가 7.8의 pH를 갖는다는 사실에도 불구하고 제1 4CV에 대해 변하지 않았다. 용리물 수집 종료 시 약 7.8로의 pH 증가가 관찰되었다. 칼럼 출구에서의 OD 280의 모니터링은 이 pH 이동이 제2 피크의 방출에 상응하고, 이때 (PL-1 검정을 통해 측정된) 다량의 아미도분해 활성이 검출된다는 것을 나타낸다.
실시예 3
실시예 1 및 실시예 2에서 관찰된 이봉 CM-세파로스 용리 현상 및 pH 이동을 추가로 조사하기 위해, 다른 CM-세파로스 고속 유동 크로마토그래피 실험 동안 개별 용리 분획을 수집하였다. 간단히 말하면, 상기 기재된 바대로 CM-세파로스 고속 유동 크로마토그래피를 수행하고, A-N 분획을 풀에 넣고 한외여과로 농축하기 전에 분획을 수집하고 별도로 분석하였다. 크로마토그래프 단계를 위한 출발 물질은 콘 II 분획 페이스트(P25001ivLE; 흡착된 FIX 및 AT-III)였다. CM-세파로스 칼럼을 pH가 5.2인 완충제로 평형화시키고, 5.7의 pH에서 세척을 수행하였다. 0.64㎝/분에서 크로마토그래프 단계의 유속을 유지시켰다.
pH 이동 후, 분획에서 증가한 양의 아미도분해 활성(PL-1)이 발견되었다. 농축된 풀에서도, 아미도분해 활성 감소가 관찰되었다. 한외여과/정용여과 후 PL1 활성이 검출된다는 사실은 농축 동안 CM 용리물 중의 희석 또는 동일물의 생성으로 인한다.
표 4에서처럼, 5.5 미만의 pH로 용리하는 분획(A-N 분획)은 더 높은 pH 값으로 용리하는 분획(O 및 P 분획)과 비교하여 훨씬 더 낮은 농도의 아미도분해 활성을 포함하였다. 아미도분해 활성의 정량화는 합한 A-N 분획 모두에서보다 O 및 P 분획에서 더 높은 활성이 용리된다는 것을 나타낸다. pH 이동 후, 분획에서 증가한 양의 아미도분해 활성(PL-1)이 발견되었다. 농축된 풀에서도, 아미도분해 활성 감소가 관찰되었다. 한외여과/정용여과 후 PL1 활성이 검출된다는 사실은 농축 동안 CM 용리물 중의 희석 또는 동일물의 생성으로 인한다.
Figure 112014028930540-pct00004
실시예 4
CM-세파로스 ff 수지로부터 아미도분해 활성 용리의 경계를 추가로 한정하기 위해, pH 경계에 의해 한정된 분획에서 CM-용리물이 수집된다는 것을 제외하고, 상기 기재된 바대로 다른 실험을 수행하였다. 구체적으로, CM-용리물을 칼럼 출구에서 모니터링되는 것처럼 미리 한정된 pH(4.3, 4.8, 6.0, 7.5)로 수집하였다. 이 실험에서, 크로마토그래프 단계를 위한 출발 물질은 실시예 3에서처럼 콘 II 분획 페이스트(P25001ivLE; 흡착된 FIX 및 AT-III)였다. CM-세파로스 칼럼을 4.8의 pH에서 평형화시키고, 5.3의 pH에서 세척하였다. 용리물 분획을 분석 전에 한외여과/정용여과시키고 트리스로 pH 조정하였다. 이 실험에서, 용리물의 pH는 용리 단계 시작 시 4.1로 하강하였다. 수집된 용리물 분획의 분석이 표 5에 도시되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00005
실시예 5
다음에, 단위 CM-세파로스 수지당 단백질의 양의 감소가 도 2에 도시된 피크 분리를 추가로 증대시키는지를 결정하였다. 이를 시험하기 위해, 1㎖ 수지당 118㎎ 단백질로부터 1㎖ 수지당 57㎎/단백질 범위로 단백질 로드를 감소시키면서 일련의 CM-세파로스 ff 크로마토그래프 실행을 수행하였다. 실시예 2에서처럼, 실험을 위한 출발 물질은 콘 II 분획 페이스트 경로 II; P24701IV였고; 이것은 흡착에 의해 냉동 결핍성 혈장으로부터 FIX, FVII 및 ATIII의 제거를 포함하였다(표 6). 수지를 pH 5.2에서 평형화시키고, pH 5.7에서 세척 단계를 수행하였다. CM-세파로스 용리물을 실시예 2에서처럼 제1 부분(제1 피크) 및 제2 부분(제2 피크)으로 풀에 넣었다. 도 2는 예시적인 크로마토그래프를 제공하고, 여기서 제1 풀이 종료하고 2개의 피크 사이의 대략 OD280 = 1.6±0.2에서 용리물 저부의 UV 흡광도가 있을 때 제2 풀이 시작하였다.
Figure 112014028930540-pct00006
표 7에서처럼, 수지의 단백질 로드의 감소는 피크 분리에 영향을 미치지 않았지만, 회수에는 영향을 미쳤다. 이전 실시예에 제시된 결과와 일치하게, 매우 낮은 수준의 아미도분해 활성이 각각의 크로마토그래프 실행의 제1 용리물 풀에 존재하였다.
Figure 112014028930540-pct00007
실시예 6
상기 기재된 실험 발견을 추가로 검정하기 위해, 다양한 유속 및 용리 풀링 반응식으로 CM-세파로스 크로마토그래프 정제를 수행하였다. 간단히 말하면, 높은 아미도분해 활성 함량(6% 단백질에서 100nmol/㎖.분)을 포함하는 콘 II 분획 페이스트를 본 명세서에 기재된 바대로 ANX 크로마토그래피에 선행하는 분획으로 공정처리하였다. 모든 CM-세파로스 실행을 위해, UV가 상승하기 시작할 때 용리물을 수집하고 3CV 또는 4CV 후 중지하였다.
3회의 CM 세파로스 크로마토그래프 정제를 하기한 대로 수행하였다. 수집된 용리물 분획을 본 명세서에 기재된 바대로 농축시킨 후, 추가로 농축하여 PL-1 검정을 위한 검출 한계 미만의 PL-1 값을 피했다.
제1 실행: CM-세파로스 수지를 세정하고 1㎝/분의 유속에서 평형화시켰다. 단백질 로딩, 세척 및 용리 단계의 유속을 0.64㎝/분에서 일정하게 유지시켰다. 주요 풀에서 용리물의 3의 칼럼 용적(3CV)을 수집하였다.
제2 실행: CM-세파로스 수지를 세정하고 1.2㎝/분의 유속에서 평형화시켰다. 단백질 로딩 단계의 유속은 0.64㎝/분이었다. 세척 단계의 유속은 제1 1.2의 칼럼 용적(CV)의 경우 0.64㎝/분였고, 이후 28.8CV의 경우 1.8㎝/분이었다. 0.64㎝/분에서 용리 단계를 수행하였다. 주요 풀에서 용리물의 3의 칼럼 용적(3CV)을 수집하였다.
제3 실행: CM-세파로스 수지를 세정하고 1.2㎝/분의 유속에서 평형화시켰다. 단백질 로딩 단계의 유속은 0.64㎝/분이었다. 세척 단계의 유속은 제1 1.2의 칼럼 용적(CV)의 경우 0.64㎝/분였고, 이후 28.8CV의 경우 1.8㎝/분이었다. 0.64㎝/분에서 용리 단계를 수행하였다. 주요 풀에서 용리물의 4의 칼럼 용적을 수집하였다.
각각의 CM-세파로스 크로마토그래프 실행의 주요 풀을 농축하고 아미도분해 활성(PL-1), 전체 단백질 농도 및 HPLC 프로필에 대해 분석하였다. 표 8에서처럼, 세척 단계의 유속을 증가시키는 것은 주요 풀에서 아미도분해 활성의 양을 감소시켰다(1 실행 및 2 실행과 비교한다). 3CV보다는 4CV의 수집이 명목상 전체 단백질 수율을 제공하지만(2.55g/ℓ 혈장 대 2.5g/ℓ 혈장; 3 실행 및 2 실행과 비교한다), 이는 최종 조성물에 존재하는 아미도분해 활성의 총량의 2배 이상이었다(384.7 PL-1nmol/분ㆍg 단백질 대 188.5 PL-1nmol/분ㆍg 단백질). 4CV의 풀링은 또한 최종 면역글로빈 조성물의 응집물 함량을 증가시켰다(0.52% 대 0.12%; 3 실행 및 2 실행과 비교한다). 특히, 2 실행에 의해 제조된 조성물의 최종 아미도분해 및 응집물 함량은 상기 관찰된 것과 일치하였다(표 2, 표 4 및 표 5 참조).
Figure 112014028930540-pct00008
실시예 7
상기 제공된 결과가 산업용 제조 규모로 규모 확대된다는 것을 입증하기 위해, 상기 실험에서 360g의 콘 II 분획 출발 물질을 공정처리하였다. 2.9CV의 CM-세파로스를 제1 풀에 수집하고, 용리물의 균형을 제2 풀에 수집하였다. 이후, 생성된 용리물 풀을 개인에게 투여하기에 적합한 본 명세서에 기재된 최종 용기 조성물로 공정처리하였다. 이 추가의 공정처리는 최종 제제로부터의 ANX 크로마토그래피, 한외여과/정용여과 및 동결건조를 포함한다. 이후, 각각의 최종 제제의 생화학 특징을 분석하고, 결과가 표 9에 제시되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00009
표 9에서처럼, CM-세파로스 용리의 제1 부분으로부터 유도된 최종 조성물은 CM-세파로스 용리(402nmol PL-1/분ㆍg 단백질 대 18,446.6nmol PL-1/분ㆍg 단백질)의 제2 부분으로부터 유도된 최종 조성물보다 50배 더 적은 아미도분해 활성을 포함하였다. CM-세파로스 용리의 제1 부분으로부터 유도된 최종 조성물은 또한 CM-세파로스 용리의 제2 부분으로부터 유도된 최종 조성물과 비교하여 더 적은 알부민(1.2% 대 2.3%), α/β 글로빈(비검출 대 0.2%), PKA 활성(<0.6 IE/㎖ 대 41.2 IE/㎖) 및 IgG 3(4.6% 대 10.8%)을 포함하였다. 더욱이, CM-세파로스 용리의 제1 부분으로부터 유도된 조성물은 CM-세파로스 용리의 제2 부분으로부터 유도된 최종 조성물보다 훨씬 더 높은 IgG 단량체 함량(94.81% 대 87.86%)을 포함하였다.
실시예 8
상기 제공된 결과를 추가로 검정하기 위해, 본 명세서에 제공된 방법에 따라 II 분획 페이스트의 부분(RI10XD142; 원심분리된 A 침전물)을 제조하였다. 이후, 페이스트를 재현탁시키고 본 명세서에 기재된 바대로 CM-세파로스 양이온 교환 칼럼에 로딩하고 상기 기재된 바대로 용리시켰다. 용리물(전체 용적: 4743㎖)을 전체 용리물의 75%를 포함하는 제1 분획(3530㎖) 및 전체 용리물의 25%를 포함하는 제2 분획(1213㎖)으로 나눴다. 이후, 제1 및 제2 CM-세파로스 용리물 분획 둘 다 본 명세서에 기재된 바대로 최종 용기로 공정처리하고, FXIa, TGA, NAPTT 및 아미도분해(PL-1) 활성, IgG 응집물 및 ACA 함량에 대해 분석하였다. 결과가 표 10에 제공되어 있다. 상기 제공된 결과와 일치하게, 제1 및 제2 풀로의 CM-세파로스 용리물의 분리는 최종 면역글로빈 제제에서 FXIa 및 TGA 활성을 감소시켰다.
Figure 112014028930540-pct00010
실시예 9
본 명세서에 제공된 방법의 규모 확대의 실행성을 추가로 평가하기 위해, 단백질 함량, pH 및 FXIa 활성을 위해 대규모 제조 공정으로부터의 CM-세파로스 용리물을 모니터링하였다. 간단히 말하면, 대략 19,000ℓ의 냉동 결핍성 혈장을 본 명세서에 기재된 바대로 공정처리하여 약 70㎏의 단백질을 포함하는 약 220㎏의 II 분획 페이스트를 형성하였다. II 분획 페이스트를 재현탁시키고 제조 규모 CM-세파로스 칼럼에 로딩하고, 세척하고 상기 기재된 바대로 용리시켰다. 용리물의 샘플을 수집하고 용리의 각각의 CV(대략 350ℓ) 후 분석하였다. 표 11에 기재된 바대로, 용리물의 pH 이동 후 CM-세파로스 용리의 종료 시에만 FXIa 값 상승이 발견되었다. 용리물의 단백질 농도를 OD280에서 모니터링하고, OD280이 2.0 미만으로 하강할 때까지 용리의 제1 부분을 수집하고 풀에 넣었다. 이후, OD280이 0.2 미만으로 하강할 때까지 용리의 제2 부분을 수집하고 풀에 넣었다. 이후, 제1 용리물 풀 및 제2 용리물 풀을 표 12에 기재된 바대로 분석하고 비교하였다. 특히, 98%의 IgG 수율이 CM 용리물의 제1 부분에서 발견되었고, 2%의 IgG 수율이 CM 용리물의 제2 부분에서 발견되었다. 따라서, 용리물의 OD280이 2.0 미만으로 하강한 후 CM-세파로스 용리 풀의 수집을 종료하여, IgG 수율 손실을 최소화하면서 유의적인 양의 TGA 및 FXIa 활성을 제제로부터 제거할 수 있다.
Figure 112014028930540-pct00011
Figure 112014028930540-pct00012
실시예 10
면역글로빈 조성물의 아미도분해 함량을 감소시키기 위해 개시된 방법을 추가로 평가하기 위해, 출발 물질로서 II 분획 침전물을 사용하여 제2 대규모 실험을 수행하였다. 간단히 말하면, A 침전물의 분리를 원심분리보다는 정제로 수행한다는 것을 제외하고는 II 분획 침전물을 실시예 1에 기재된 바대로 제조하였다.
II 분획 침전물을 실시예 1에 기재된 바대로 CM-양이온 크로마토그래피로 처리하였다. 실시예 1에서처럼, CM 용리물을 IgG 함량의 벌크를 포함하는 전연부(E1) 및 다량의 아미도분해 활성을 포함하는 후연부(E2)의 2개의 풀에 수집하였다. 용리물의 제1 부분(E1)의 수집을 OD 400mAU에서 시작하고 정확히 2.7의 칼럼 용적 후 중지하였다. OD가 다시 400mAU로 하강할 때까지 용리 피크의 제2 분획(E2)을 수집하였다. 이후, 과정의 나머지에 대해 용리된 분획을 별도로 공정처리하였다. 정제 과정에 대한 물질 균형이 표 13에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00013
실시예 1에서처럼, 전체 단백질 중 거의 10%가 용리 피크의 제2 부분에서 발견되었다. 이는 용리가 2.7의 칼럼 용적 후 중지된 경우 확인된 수율 손실이다.
2개의 CM 용리 분획(E1 및 E2)으로부터 제조된 최종 용기를 기질 SN13a 및 TGA, FXIa 및 NAPTT 검정과 함께 분자 크기 분포, 항보체 활성, 아미도분해 활성에 대해 분석하였다. 결과가 표 14 및 표 15에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00014
Figure 112014028930540-pct00015
용리된 IgG 분획의 제1 부분 및 제2 부분으로부터 유래한 최종 용기의 생화학적 규명은 용리의 제1 부분이 TGA 상승 및 NAPTT 값 감소를 발생시키는 FXIa 및 다른 원치않는 단백질을 실질적으로 포함하지 않는다는 것을 밝혀냈다. 반대로, FXIa 및 아미도분해 활성이 제2 부분에서 농후화되고, 여기서 A 현탁액의 분리를 정제에 의해 수행하더라도 응집물 및 올리고머/이합체 함량이 또한 더 높았다. 흥미롭게도, 용리물의 제1 부분에서의 ACA 값은 훨씬 더 낮은 반면, 용리물의 제2 부분에서의 ACA 값은 훨씬 더 높았다.
하류 과정에서 A 현탁액의 분리에 정제가 이용되는 이 실험에서, 용리의 제2 부분에서의 잔류 FXIa는 훨씬 더 적고, 이 용리 부분의 최종 용기의 TGA 값은 정상 범위 내였다.
실시예 1과 함께, 2개의 분획(E1 및 E2)에서의 CM 세파로스 ff 칼럼으로부터의 용리의 분할은 FXIa를 실질적으로 포함하지 않는 IgG 조성물의 제조가 가능하게 한다. A 침전물 분리를 정제로 수행하는 경우 FXIa가 유의적으로 더 낮더라도, 이는 A 분획에 대한 분리 옵션(즉, 원심분리 및 정제) 둘 다에 사실이다.
실시예 11
이 실시예는 피하 투여를 위한 면역글로빈 조성물의 제조를 위해 설계된 대규모 제조 공정에서 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 응고촉진 활성의 분리를 위한 현재 방법의 적합성을 입증한다. 이 실험을 위한 출발 물질은 유럽에서 수집된 풀에 있는 인간 공급원 혈장으로부터 형성된 II 분획 침전물이고, 이 혈장을 저온침전시키고 흡착을 통해 항-트롬빈 III(ATIII)을 회수하기 위해 사용하였다.
간단히 말하면, ATIII의 냉동침전 및 흡착 후, 차가운 알코올 분별화는 8% 알코올 및 pH 7.0에서 I 분획 침전물의 침전으로 피브리노겐 및 잔류 응고 인자(예를 들면, XIII 인자)의 분리로 시작하였다. II+III 분획을 침전시키고 알부민을 분리하기 위해 상청액에서의 알코올 농도를 25%로 조정하였다. II+III 침전물의 재현탁액 후, 알코올을 약 5.2의 pH에서 12%로 첨가하여 III 침전물을 형성하였다. III 침전물을 분리한 후, 0.04g의 DEAE 세파덱스(Sephadex)/g 단백질을 첨가하고, 용액을 쿠노(Cuno) 90 뎁스 필터로 여과시키고, 정제된 감마 글로빈 분획을 포함하는 콘 II 분획을 중성 pH에서 25% 알코올만큼 침전시켰다.
II 분획 침전물을 4℃ 및 pH 5.2±0.2에서 차가운 물 중에 용해시켰다. CWSS 정제로 청명하게 한 후, 용액을 SD 처리를 위해 2%의 단백질 농도로 조정하였다. SD 항온처리 동안 온도를 20 내지 25℃ 범위에서 유지시켰다. 단백질 용액을 평형화 CM-세파로스 고속 유동 칼럼(평형 완충제: 0.025M 아세트산나트륨, pH 5.0±0.2)에 로딩하였다. 로딩 후, 흡착된 단백질이 용리 완충제(0.25M NaCl, 0.2M 글라이신, 0.1% PEG 3350, 25mM 트리스, pH 8.00)로 용리되기 전에 칼럼을 30의 칼럼 용적의 아세테이트 완충제(0.01M 아세트산나트륨. pH 5.5±0.2)로 세척하여 SD 시약을 세척하였다. 용리물의 제1 부분(E1) 수집을 OD 400mAU에서 시작하고, 정확히 2.7의 칼럼 용적 후 중지하였다. OD가 다시 400mAU로 하강할 때까지 용리 피크의 제2 분획(E2)을 수집하였다. 용리된 분획을 하기 단계에 따라 최종 벌크로 별도로 공정처리하였다.
용리물 분획의 pH를 5.2로 조정한 후 5%로 농축하고, 정용여과 완충제(0.02M NaCl, 0.05% PEG 3350)에 대한 정용여과 및 10% 단백질에 대한 후속 농축을 수행하였다. 1g 단백질당 0.055g의 글라이신을 용액에 첨가하여 무균 정제 전에 pH를 7.0으로 조정하였다.
양이온 교환 세척 및 용리 단계의 크로마토그램이 도 3에 도시되어 있다. 1 라인은 UV 흡광도를 보여주고, 2 라인은 전도율을 보여주며, 3 라인은 칼럼 출구에서의 pH를 보여준다. 280㎚에서의 광학 밀도는 CM 세파로스 ff 칼럼으로부터 단백질의 용리 동안 2개의 분획의 부분 분리를 나타낸다. 칼럼 출구에서의 pH는 용리 동안 UV 흡광도의 재상승 시작 직전 상승하기 시작한다. 이때, 2개의 용리물 분획(F4 및 F5, 본 명세서에 E1 및 E2라 칭함)을 분리하였다. 하류 정제 실행에 대한 물질 균형이 표 16에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00016
전체 단백질 중 거의 15%가 용리 피크의 제2 부분(E2)에서 발견되었다. 이는 2.7의 칼럼 용적 후 E1의 수집 중지로 인한 수율 손실이다. 기질 SN13a 및 TGA, FXIa 및 NAPTT 검정과 함께 분자 크기 분포, 항보체 활성, 아미도분해 활성에 대해 2개의 CM 용리 분획(E1 및 E2)으로부터 제조된 최종 용기를 분석하였다. 결과가 표 17 및 표 18에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00017
Figure 112014028930540-pct00018
CM-용리물의 제1 부분(E1)은 더 적은 응집물, 이합체 및 단편 함량을 갖고, 낮은 FXIa 함량을 가지며, 정상 혈장과 유사한 TGA 결과를 갖고, 검출 한계 미만의 SN-13으로 측정된 PKA 및 아미도분해 활성을 가지며, NAPTT 감소가 없는 최종 벌크를 생성시켰다. FXIa, PKKA 및 FXIa 유사 활성은 제2 부분에서 농후화되고, 여기서 IgG 중합체, 단편 및 올리고머/이합체 함량이 또한 더 높았다. 흥미롭게도, 용리물의 전연부(E1)에서의 ACA 값은 용리물의 후연부(E2)에서보다 낮았다.
실시예 12
면역글로빈 조성물의 아미도분해 함량을 감소시키기 위해 개시된 방법을 추가로 평가하기 위해, 출발 물질로서 II 분획 침전물을 사용하여 다른 대규모 실험을 수행하였다. 간단히 말하면, 이 실험을 위한 출발 물질은 유럽에서 수집된 풀에 있는 인간 공급원 혈장으로부터 형성된 II 분획 침전물이라는 것을 제외하고는 II 분획 침전물을 실시예 11에 기재된 바대로 제조하였고, 이 혈장을 저온침전시키고 흡착을 통해 FEIBA 및 항-트롬빈 III(ATIII)을 회수하기 위해 사용하였다. 실시예 11에 기재된 바대로 CM-세파로스 양이온 교환 크로마토그래피 및 하류 공정처리를 달리 수행하였다.
양이온 교환 세척 및 용리 단계의 크로마토그램가 도 4에 도시되어 있다. 1 라인은 UV 흡광도를 나타내고, 2 라인은 전도율을 나타내고, 3 라인은 칼럼 출구에서의 pH를 나타낸다. 280㎚에서의 광학 밀도는 CM 세파로스 ff 칼럼으로부터 단백질의 용리 동안 2개의 분획의 부분 분리를 나타낸다. 칼럼 출구에서의 pH는 용리 동안 UV 흡광도의 재상승 시작 직전 상승하기 시작한다. 이때, 2개의 용리물 분획(F4 및 F5, 본 명세서에 E1 및 E2라 칭함)을 분리하였다. 하류 정제 실행에 대한 물질 균형이 표 19에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00019
실시예 11에서처럼, 전체 단백질 중 거의 15%가 용리 피크의 제2 부분에서 발견되었다. 이는 2.7의 칼럼 용적 후 E1의 수집 중지로 인한 수율 손실이다. 기질 SN13a 및 TGA, FXIa 및 NAPTT 검정과 함께 분자 크기 분포, 항보체 활성, 아미도분해 활성에 대해 2개의 CM 용리 분획(E1 및 E2)으로부터 제조된 최종 용기를 분석하였다. 결과가 표 20 및 표 21에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00020
Figure 112014028930540-pct00021
용리된 IgG 분획의 제1 부분 및 제2 부분으로부터 유래한 안정화된 벌크의 생화학적 규명은 용리의 제1 부분이 TGA 상승 및 NAPTT 값 감소를 발생시키는 FXIa 및 다른 원치않는 단백질을 실질적으로 포함하지 않고, PKKA, FXIa 및 FXIa 유사 활성이 제2 부분에서 농후화되고, 여기서 IgG 단편, 중합체 및 올리고머/이합체 함량이 또한 더 높다는 것을 밝혀냈다. ACA 값은 용리물의 제1 부분 및 제2 부분의 벌크에서 유의적으로 다르지 않았다. 결과는 전체적으로 실시예 11에서의 발견을 확인시켜준다.
실시예 13
면역글로빈 조성물의 아미도분해 함량을 감소시키기 위해 개시된 방법을 추가로 평가하기 위해, 출발 물질로서 II 분획 침전물을 사용하여 다른 대규모 실험을 수행하였다. 간단히 말하면, 이 실험을 위한 출발 물질은 유럽에서 수집된 풀에 있는 인간 공급원 혈장으로부터 형성된 II 분획 침전물이라는 것을 제외하고는 II 분획 침전물을 실시예 11에 기재된 바대로 제조하였고, 이 혈장을 저온침전시키고 흡착을 통해 FEIBA 및 항-트롬빈 III(ATIII)을 회수하기 위해 사용하였다. 실시예 11에 기재된 바대로 CM-세파로스 양이온 교환 크로마토그래피 및 하류 공정처리를 달리 수행하였다.
양이온 교환 세척 및 용리 단계의 크로마토그램가 도 5에 도시되어 있다. 1 라인은 UV 흡광도를 나타내고, 2 라인은 전도율을 나타내고, 3 라인은 칼럼 출구에서의 pH를 나타낸다. 280㎚에서의 광학 밀도는 CM 세파로스 ff 칼럼으로부터 단백질의 용리 동안 2개의 분획의 부분 분리를 나타낸다. 칼럼 출구에서의 pH는 용리 동안 UV 흡광도의 재상승 시작 직전 상승하기 시작한다. 이때, 2개의 용리물 분획(F4 및 F5, 본 명세서에 E1 및 E2라 칭함)을 분리하였다. 하류 정제 실행에 대한 물질 균형이 표 22에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00022
실시예 11에서처럼, 전체 단백질 중 거의 15%가 용리 피크의 제2 부분에서 발견되었다. 이는 2.7의 칼럼 용적 후 E1의 수집 중지로 인한 수율 손실이다. 기질 SN13a 및 TGA, FXIa 및 NAPTT 검정과 함께 분자 크기 분포, 항보체 활성, PKKA, FXIa 유사 활성에 대해 2개의 CM 용리 분획(E1 및 E2)으로부터 제조된 최종 용기를 분석하였다. 결과가 표 23 및 표 24에 기재되어 있다.
Figure 112014028930540-pct00023
Figure 112014028930540-pct00024
최종 벌크의 생화학적 규명은 실시예 11 및 12로부터의 결과를 확인시켜준다. 용리의 제1 부분(E1)은 TGA 상승 및 NAPTT 값 감소를 발생시키는 FXIa 및 다른 원치않는 단백질을 실질적으로 포함하지 않고, FXIa 및 아미도분해 활성은 제2 부분(E2)에서 농후화되고, 여기서 A 현탁액의 분리를 정제에 의해 수행하더라도 단편, 중합체 및 올리고머/이합체 함량이 또한 더 높았다. 흥미롭게도, 용리물의 제1 부분의 안정화된 벌크에서의 ACA 값은 다시 용리물의 제2 부분의 벌크에서보다 낮았다.
종합하면, 상기 실시예에 제공된 결과는 2개의 분획에서 CM 세파로스 ff 칼럼으로부터의 용리물의 분할이 응고촉진 활성을 실질적으로 포함하지 않는 면역글로빈 조성물의 제조를 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 이는 다양한 혈장 공급원(EU 및 US) 및 업스트림 공정 반응식의 경우 사실이다.
실시예 11 내지 실시예 13에 기재된 면역글로빈 제제에 대해 결정된 생성물 손실은 실시예 1 내지 10에 보이는 것보다 높다. 실시예 11 내지 13에서, 2.7의 칼럼 용적 후 용리물 피크의 분열은 전체 단백질의 약 15%의 손실을 발생시켰다. 용리물의 pH 이동이 실시예 11 내지 15에 이후 발생하면서, 이후 용리 유분(cut)은 응고촉진 활성의 분리를 유의적으로 손상시키지 않으면서 전체 수율을 개선해야 한다.
상기 기재된 데이터는 양이온 교환 크로마토그래피 용리물의 분열이 응고촉진 활성이 실질적으로 감소한 면역글로빈 조성물의 제조를 위한 탄탄한 방법이라는 것을 나타낸다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시양태는 오직 예시 목적이며, 이와 관련된 다양한 변형 또는 변경은 당업자에게 제시되어 있고 본원 및 특허청구범위의 정신 및 시야 내에 포함되는 것으로 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다.

Claims (62)

  1. 혈장 유래 면역글로빈 조성물에서 XI 인자(Factor XI: FXI) 및/또는 XIa 인자(Factor XIa: FXIa) 함량을 감소시키는 방법으로서,
    (a) IgG 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa를 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율(conductivity)을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 IgG 면역글로빈 및 적어도 FXI 및/또는 FXIa의 분획을 상기 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계;
    (c) 상기 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 상기 양이온 교환 수지로부터 상기 IgG 면역글로빈을 용리시켜 전연부(leading portion) 및 후연부(lagging portion)를 포함하는 용리물을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하되,
    상기 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 감소된 양의 아미도분해 활성(amidolytic activity)을 갖는 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고, 상기 용리물의 후연부는 상기 용리물의 전연부와 비교하여 높은 농도의 아미도분해 활성을 함유하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 양이온 교환 수지로부터 상기 면역글로빈을 용리시키기 전에 상기 면역글로빈 및 FXI 및/또는 FXIa가 결합된 양이온 교환 수지를 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 미만의 전도율을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지(weak cation exchange resin)인 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약양이온 교환 수지는 카복시메틸 양이온 교환 수지인 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 용리 완충제는 7.5 내지 8.5의 pH를 포함하는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 용리 완충제는 8.0±0.2의 pH를 포함하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 용리 완충제는 200mM 내지 300mM 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 용리 완충제는 240mM 내지 260mM 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 용리 완충제는 100mM 내지 300mM 글라이신을 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 용리 완충제는 175mM 내지 225mM 글라이신을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 전연부는 상기 용리물 중 70% 이하로 이루어진 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 7.0 초과인 용리물로부터 pH가 7.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.5 초과인 용리물로부터 pH가 6.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.0 초과인 용리물로부터 pH가 6.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.5 초과인 용리물로부터 pH가 5.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.0 초과인 용리물로부터 pH가 5.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 상기 용리물의 pH를 모니터링하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 용리물의 전연부를 수집하는 단계는,
    (ⅰ) 280㎚에서의 상기 용리물의 광학 밀도(OD280)를 모니터링하는 하위단계;
    (ⅱ) 상기 용리물의 OD280이 적어도 50mAU의 제1 역치(threshold) OD280 초과로 상승할 때 수집을 시작하는 하위단계; 및
    (ⅲ) 상기 용리물의 OD280이 1AU 이상의 제2 역치 OD280 미만으로 하강할 때 수집을 종료하는 하위단계를 포함하는 것인 방법.
  21. 삭제
  22. 제20항에 있어서, 상기 제2 역치 OD280은 2AU 이상인 것인 방법.
  23. 제4항에 있어서, 상기 세척 완충제는 5.0 내지 6.0의 pH를 포함하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 세척 완충제는 5.5±0.2의 pH를 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 양이온 교환 수지에 결합된 FXI 및/또는 FXIa 중 50% 미만은 단계 (d)에서 수집된 용리물의 전연부에 존재하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 양이온 교환 수지에 결합된 FXI 및/또는 FXIa 중 25% 미만은 단계 (d)에서 수집된 용리물의 전연부에 존재하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 단계 (b)에서 상기 양이온 교환 수지에 결합된 FXI 및/또는 FXIa 중 10% 미만은 단계 (d)에서 수집된 용리물의 전연부에 존재하는 것인 방법.
  28. 제25항 또는 제27항에 있어서, FXI 및/또는 FXIa의 양을 FXIa 특이적 기질을 사용하는 아미도분해 활성 검정(amidolytic activity assay)을 수행하여 결정하는 것인 방법.
  29. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만(Kistler-Nitschmann) A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물로 이루어진 군으로부터 선택되는 현탁된 혈장 분획 침전물인 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 현탁된 II 분획 침전물인 것인 방법.
  31. 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내에 항보체 활성(anti-complement activity: ACA)을 감소시키는 방법으로서,
    (a) IgG 면역글로빈 및 ACA의 제1 양을 포함하는 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 제공하는 단계;
    (b) 상기 혈장 유래 면역글로빈 조성물을 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 이하의 전도율을 포함하는 제1 용액 조건 하에 크로마토그래피 칼럼에 위치한 양이온 교환 수지와 접촉시켜 IgG 면역글로빈 및 적어도 ACA의 제1 양의 분획을 상기 양이온 교환 수지에 결합시키는 단계;
    (c) 상기 양이온 교환 수지를 적어도 7.5의 pH 및 적어도 15mS/㎝의 전도율을 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 상기 양이온 교환 수지로부터 상기 IgG 면역글로빈을 용리시켜 전연부 및 후연부를 포함하는 용리물을 형성하는 단계; 및
    (d) 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계를 포함하되,
    상기 용리물의 전연부는 시작 조성물과 비교하여 감소된 양의 아미도분해 활성(amidolytic activity)을 갖는 IgG 면역글로빈 조성물을 포함하고, 상기 용리물의 후연부는 상기 용리물의 전연부와 비교하여 높은 농도의 아미도분해 활성을 함유하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 용리 완충제는 적어도 20mS/㎝의 전도율을 포함하는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 용리 완충제는 적어도 25mS/㎝의 전도율을 포함하는 것인 방법.
  34. 제31항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 양이온 교환 수지로부터 상기 면역글로빈을 용리시키기 전에 상기 면역글로빈 및 ACA가 결합된 양이온 교환 수지를 6.0 이하의 pH 및 11mS/㎝ 미만의 전도율을 포함하는 세척 완충제로 세척하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 약양이온 교환 수지인 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 약양이온 교환 수지는 카복시메틸 양이온 교환 수지인 것인 방법.
  37. 제31항에 있어서, 상기 용리 완충제는 7.5 내지 8.5의 pH를 포함하는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 용리 완충제는 8.0±0.2의 pH를 포함하는 것인 방법.
  39. 제31항에 있어서, 상기 용리 완충제는 200mM 내지 300mM 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 용리 완충제는 240mM 내지 260mM 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  41. 제31항에 있어서, 상기 용리 완충제는 100mM 내지 300mM 글라이신을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 용리 완충제는 175mM 내지 225mM 글라이신을 포함하는 것인 방법.
  43. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 전연부는 상기 용리물 중 70% 이하로 이루어진 것인 방법.
  44. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 7.0 초과인 용리물로부터 pH가 7.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  45. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.5 초과인 용리물로부터 pH가 6.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  46. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 6.0 초과인 용리물로부터 pH가 6.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  47. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.5 초과인 용리물로부터 pH가 5.5 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  48. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 pH가 5.0 초과인 용리물로부터 pH가 5.0 이하인 용리물을 분리하여 수집하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  49. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 후연부로부터 상기 용리물의 전연부를 분리하여 수집하는 단계는 상기 용리물의 pH를 모니터링하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  50. 제31항에 있어서, 상기 용리물의 전연부를 수집하는 단계는,
    (ⅰ) 280㎚에서의 상기 용리물의 광학 밀도(OD280)를 모니터링하는 하위단계;
    (ⅱ) 상기 용리물의 OD280이 적어도 50mAU의 제1 역치 OD280 초과로 상승할 때 수집을 시작하는 하위단계; 및
    (ⅲ) 상기 용리물의 OD280이 1AU 이상의 제2 역치 OD280 미만으로 하강할 때 수집을 종료하는 하위단계를 포함하는 것인 방법.
  51. 삭제
  52. 제50항에 있어서, 상기 제2 역치 OD280은 2AU 이상인 것인 방법.
  53. 제34항에 있어서, 상기 세척 완충제는 5.0 내지 6.0의 pH를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 세척 완충제는 5.5±0.2의 pH를 포함하는 것인 방법.
  55. 제31항에 있어서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내의 ACA의 농도보다 낮은 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내의 ACA의 농도보다 적어도 25% 낮은 것인 방법.
  57. 제55항에 있어서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물 내의 ACA의 농도보다 적어도 50% 낮은 것인 방법.
  58. 제31항에 있어서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 후연부 내의 ACA의 농도보다 낮은 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 후연부 내의 ACA의 농도보다 50% 낮은 것인 방법.
  60. 제58항에 있어서, IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 전연부에 존재하는 ACA의 농도는 IgG 면역글로빈의 농도에 대한 단계 (d)에서 수집한 용리물의 후연부 내의 ACA의 농도보다 25% 낮은 것인 방법.
  61. 제31항에 있어서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 I 분획 침전물, I+II+III 분획 침전물, II+III 분획 침전물, IV-1 분획, 키스틀러-니츠만 A 침전물, 키스틀러-니츠만 B 침전물 및 이의 변형된 침전물로 이루어진 군으로부터 선택되는 현탁된 혈장 분획 침전물인 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 단계 (a)에서 제공된 혈장 유래 면역글로빈 조성물은 현탁된 II 분획 침전물인 것인 방법.
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