ES2624485T3 - Método para reducir el potencial tromboembólico de una composición de inmunoglobulinas derivada de plasma - Google Patents

Abstract

Un método para reducir el contenido en factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composición de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto una composición de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio catiónico dispuesta en una columna de cromatografía en una primera condición de disolución que comprende un pH de no más de 6,0 y una conductividad de no más de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas IgG y al menos una fracción del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio catiónico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio catiónico poniendo en contacto la resina de intercambio catiónico con un tampón de elución que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato que comprende una porción delantera y una porción trasera; y (c) recoger la porción delantera del eluato por separado de la porción trasera del eluato, en el que la porción delantera del eluato comprende una composición de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolítica en comparación con la composición de partida y la porción trasera del eluato contiene una concentración mayor de actividad amidolítica en comparación con la porción delantera del eluato.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para reducir el potencial tromboembolico de una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/527.974, presentada el 26 de agosto de 2011.

Antecedentes de la invencion

Los hemoderivados derivados de plasma se usan para tratar no solo una diversidad de trastornos sangumeos, sino enfermedades de otro origen. Por ejemplo, en 1952 se usaron por primera vez productos de inmunoglobulinas (IgG) procedentes de plasma humano para tratar la inmunodeficiencia. Desde entonces, las preparaciones de IgG han encontrado un uso extendido en al menos tres categonas principales de estados medicos: (1) inmunodeficiencias tales como agammaglobulinemia ligada al cromosoma X, hipogammaglobulinemia (inmunodeficiencias primarias) y estados de inmunodepresion adquiridos (inmunodeficiencias secundarias), que se caracterizan por bajos niveles de anticuerpos; (2) enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias; y (3) infecciones agudas.

Deben tenerse en cuenta diversas precauciones de seguridad cuando se fabrican y formulan terapias biologicas derivadas de plasma. Estas precauciones incluyen metodos para retirar y/o inactivar patogenos de transmision hematica (por ejemplo, patogenos vmcos y bacterianos), actividad anticomplemento, y otros contaminantes no deseados que surgen del uso de plasma donado. Los estudios han sugerido que la administracion de altos niveles de actividad amidolttica pueden dar como resultado acontecimientos tromboembolicos no deseados (Wolberg AS et al., Coagulation factor XI is a contaminant in intravenous immunoglobulin preparations. Am J Hematol 2000; 65:3034; y Alving BM et al., Contact-activated factors: contaminants of immunoglobulin preparations with coagulant and vasoactive properties. J Lab Clin Med 1980; 96:334-346).

Esta preocupacion se puso de manifiesto con la retirada voluntaria de Octagam® (Octapharma) en EE.UU. y la suspension de la autorizacion de comercializacion de Octagam® y Octagam 10% por la Comision Europea tras el aumento de informes de acontecimientos tromboembolicos. Se ha sugerido que el aumento de acontecimientos tromboticos los provocaron altos niveles de actividad amidolftica en los productos biologicos, provocados por serina proteasa e impurezas de zimogeno de serina proteasa, tales como el factor XI, factor XIa, factor XII y factor XIIa (FDA Notice: Voluntary Market Withdrawal - 23 de septiembre de 2010 Octagam [Immune Globulin Intravenous (Human)] 5% Liquid Preparation; Octagam 50 mg/ml, solution pour perfusion- Octapharma France - Mise en quarantaine de tous les lots, publicado en lmea el 9 de septiembre de 2010 por la AFSSAPS; y Questions and aswers on the suspension of the marketing authorizations for Octagam (human normal immunoglobulin 5% and 10%), publicado en lmea el 23 de septiembre 2010 por la Agencia Europea del Medicamento).

La EDQM (Direccion Europea para la Calidad del Medicamento y el Cuidado de la Salud) publico una revision de la monograffa para inmunoglobulina humana normal para administracion intravenosa (0918) para una implementacion rapida el 1 de enero de 2012 para abordar la actividad procoagulante potencial en productos de inmunoglobulina. La revision declara que “el metodo de preparacion tambien incluye una etapa o etapas que han demostrado que retiran agentes que generan trombosis. Se hace enfasis en la identificacion de factores de coagulacion activados y sus zimogenos y etapas del procedimiento que pueden provocar su activacion. Tambien han de tenerse en cuenta otros agentes procoagulantes que podnan introducirse por el procedimiento de fabricacion.”

El 18 de marzo de 2011, Swissmedic notifico que la FDA habfa observado acontecimientos adversos tromboembolicos asociados con numerosos lotes del producto Vivaglobin. Vivaglobin (disolucion de inmunoglobulina humana normal 160 mg/ml para inyeccion subcutanea), fabricada por CSL se autorizo como tratamiento sustitutivo para adultos y ninos con smdromes de inmunodeficiencia primaria, mieloma o leucemia linfatica cronica. No se conocfa el riesgo de acontecimientos adversos tromboembolicos hasta ese momento para esta via de administracion. Las investigaciones revelaron actividad procoagulante en al menos algunos lotes. Como consecuencia, Vivaglobin se retiro del mercado y se remplazo por el nuevo producto Hizentra (disolucion de inmunoglobulina humana normal al 20% para inyeccion subcutanea). Debido a los acontecimientos adversos notificados para Vivaglobin, actualmente es un requisito que los productos de inmunoglobulinas para administracion subcutanea tengan bajos niveles de actividad procoagulante, similar a los requisitos para productos de inmunoglobulina por via intravenosa.

Las serina proteasas especializadas, conocidas genericamente como factores de coagulacion, son componentes integrales de tanto las rutas de activacion por contacto como del factor tisular de la cascada de coagulacion. Tras un estfmulo de las rutas de coagulacion, los zimogenos de serina proteasa, que son precursores enzimaticos inactivos, se vuelven proteasas activadas que catalizan la activacion del siguiente zimogeno de proteasa, dando como resultado una cascada de activacion. Esta cascada de coagulacion culmina en la activacion de trombina (factor IIa) y factor Xllla, que actua para convertir el fibrinogeno (factor I) en fibrina (factor la) y reticular la fibrina para formar un coagulo de fibrina, respectivamente.

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La ruta de activacion por contacto, tambien conocida como ruta de coagulacion intrmseca, empieza con la activacion de calicrema y factor XIIa (FXIIa) a partir de precalicrema y factor XII, respectivamente. La serina proteasa activada FXIIa escinde el factor XI (FXI), convirtiendo el zimogeno en el factor XIa (FXIa), una serina proteasa activa que participa en la posterior activacion del factor Xa (FXa).

Diversos documentos describen metodos para la purificacion de IgG que usan cromatograffa de intercambio cationico. La inmunoglobulina se eluye de la columna y se recoge toda la fraccion de elucion (documentos EP0659767; EP0440483; de Sounca Lucena, Brazilian Journal of pharmaceutical sciences, vol. 46, n.° 4, octubre de 2010, paginas 777-78).

La purificacion de gammaglobulina S-sulfonada se describe en una escala industrial usando cromatograffa de intercambio ionico. Las fracciones de elucion separadas se someten a prueba para determinar su actividad anticomplementaria (AAC). La reduccion de AAC se describe para algunas fracciones despues de la purificacion (documento GB 2039490).

Se notifica que la purificacion a gran escala de anticuerpos monoclonales describe la retirada de impurezas (por ejemplo, agregados de Ig, ADN, HCp y protema A) usando cromatograffa de intercambio cationico (ZHOU et al., JOURNAL OF CROMATOGRAPHY. vol 1175. n.° 1, 17 de octubre de 2007, paginas 69-80)

Las caractensticas de retencion de protemas de prueba (por ejemplo, protema de union a heparina; HBP) usando cromatograffa de intercambio cationico se analizan mediante estudios comparativos. Por tanto se determina el efecto de la resina de intercambio cationico fuerte y debil en el perfil de elucion (DE PHILLIPS P et al., JOURNAL OF CROMATOGRAPHY, vol. 933, 9 de noviembre de 2001, paginas 57-72).

La purificacion de FXI se describe usando un procedimiento de 2 etapas. En primer lugar, se enriquece el contenido en FXI del plasma mediante adsorcion inicial usando un filtro. En segundo lugar, se purifica adicionalmente la fraccion de FXI usando una etapa cromatograffa de intercambio cationico para la retirada de virus con envolturas lipfdicas (BURNOUF-RADOSEVICH M et al., TRANSFUSION, vol. 32, n.° 9, 1 de enero 1992, paginas 861-867).

Se analiza la influencia sobre la union de FXI a la resina de intercambio cationico a diferentes valores de pH. Se somete a prueba la fraccion no retenida de la columna y los resultados muestran que valores de pH de mas de 6 dieron como resultado una retirada de FXIa escasa de la disolucion de inmunoglobulina (documento WO201216963).

Debido a las preocupaciones en aumento sobre la presencia de serina proteasa y zimogenos de serina proteasa en composiciones de protemas derivadas de plasma, sigue habiendo la necesidad en la tecnica de metodos para reducir los niveles de estos contaminantes, y en particular de FXI y FXIa, en preparaciones de inmunoglobulina.

Breve sumario de la invencion

La presente invencion proporciona, entre otros aspectos, metodos para reducir el contenido amidofftico (por ejemplo, FXI y/o FXIa) de composiciones de inmunoglobulinas IgG y para composiciones de inmunoglobulinas IgG que tengan niveles menores de actividad amidofftica (por ejemplo, FXI y/o FXIa) que las composiciones comparables disponibles en el mercado.

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para reducir el contenido en factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) proporcionar una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa; (b) poner en contacto la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas IgG y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (c) eluir las inmunoglobulinas IgG de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato que comprende una porcion delantera y una porcion trasera; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidofftica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una concentracion mayor de actividad amidofftica en comparacion con la porcion delantera del eluato.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm.

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En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el metodo comprende ademas una etapa de lavado de la resina de intercambio cationico que tiene las inmunoglobulinas y FXI y/o FXIa unidos a la misma con un tampon de lavado que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de menos de 11 mS/cm antes de eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico en la etapa (c).

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica de los metodos proporcionados anteriormente, la resina de intercambio cationico debil es una resina de intercambio cationico de carboximetilo.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende un pH de entre 7,5 y 8,5. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende un pH de 8,0 + 0,2.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende cloruro de sodio entre 200 y 300 mM. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende cloruro de sodio entre 240 y 260 mM.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende glicina entre 100 mM y 300 mM. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de elucion comprende glicina entre 175 mM y 225 mM.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 7,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 7,0.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 6,5 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 6,5.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 6,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 6,0.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 5,5 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 5,5.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 5,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 5,0.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende monitorizar el pH del eluato.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato comprende las subetapas de: (i) monitorizar la densidad optica del eluato a 280 nm (DO280); (ii) empezar la recogida cuando la DO280 del eluato se eleva por encima de una primera DO280 umbral de al menos 50 mUA; y (iii) finalizar la recogida cuando la DO280 del eluato desciende por debajo de una segunda DO280 umbral de no menos de 1 UA. En otra realizacion espedfica, la segunda DO280 umbral es de no menos de 2 UA.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de lavado comprende un pH de entre 5,0 y 6,0. En otra realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, el tampon de lavado comprende un pH de 5,5 + 0,2.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, menos del 50% del FXI y/o FXIa unido a la resina de intercambio cationico en la etapa (b) esta presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d).

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, menos del 25% del FXI y/o FXIa unido a la resina de intercambio cationico en la etapa (b) esta presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d).

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, menos del 10% del FXI y/o FXIa unido a la resina de intercambio cationico en la etapa (b) esta presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d).

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la cantidad de FXI y/o FXIa se determina realizando un ensayo de la actividad amidolttica usando un sustrato espedfico para FXIA.

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En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a) es un precipitado de la fraccion plasmatica en suspension seleccionado del grupo que consiste en un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion I+N+NI, un precipitado de la fraccion II+NI, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler-Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann y un precipitado modificado de los mismos.

En una realizacion de los metodos proporcionados anteriormente, la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a) es un precipitado de la fraccion II en suspension.

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir la actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) proporcionar una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC; (b) poner en contacto la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas IgG y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (c) eluir las inmunoglobulinas IgG de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato que comprende una porcion delantera y una porcion trasera; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende no mas del 80% del eluato.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el metodo comprende ademas una etapa de lavado de la resina de intercambio cationico que tiene las inmunoglobulinas y AAC unidas a la misma con un tampon de lavado que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de menos de 11 mS/cm antes de eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico en la etapa (c).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica de los metodos descritos anteriormente, la resina de intercambio cationico debil es resina de intercambio cationico de carboximetilo.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende un pH de entre 7,5 y 8,5. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende un pH de 8,0 + 0,2.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende cloruro de sodio entre 200 y 300 mM. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende cloruro de sodio entre 240 y 260 mM.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende glicina entre 100 mM y 300 mM. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de elucion comprende glicina entre 175 mM y 225 mM.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la porcion delantera del eluato consiste en no mas del 70% del eluato.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 7,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 7,0.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 6,5 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 6,5.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 6,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 6,0.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 5,5 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 5,5.

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En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 5,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 5,0.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende monitorizar el pH del eluato.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la etapa de recoger la porcion delantera del eluato comprende las subetapas de: (i) monitorizar la densidad optica del eluato a 280 nm (DO280); (ii) empezar la recogida cuando la DO280 del eluato se eleva por encima de una primera DO280 umbral de al menos 50 mUA; y (iii) finalizar la recogida cuando la DO280 del eluato desciende por debajo de una segunda DO280 umbral de no menos de 500 mUA.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la segunda DO280 umbral es de no menos de 1 UA. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, la segunda DO280 umbral es de no menos de 2 UA.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de lavado comprende un pH de entre 5,0 y 6,0. En otra realizacion de los metodos descritos anteriormente, el tampon de lavado comprende un pH de 5,5 + 0,2.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d) es menor que la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d) es al menos un 25% menor que la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d) es al menos un 50% menor que la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d) es menor que la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en la porcion trasera del eluato recogido en la etapa (d).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d) es de menos del 50% de la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en la porcion trasera del eluato recogido en la etapa (d).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (d) es de menos del 25% de la concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en la porcion trasera del eluato recogido en la etapa (d).

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a) es un precipitado de la fraccion plasmatica en suspension seleccionado del grupo que consiste en un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion I+II+III, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler-Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann y un precipitado modificado de los mismos.

En una realizacion de los metodos descritos anteriormente, la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a) es un precipitado de la fraccion II en suspension.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra un cromatograma de la etapa de cromatograffa de flujo rapido (ff) en CM-Sefarosa descrita en el ejemplo 1. La lmea numero 1 muestra la absorbancia UV, la lmea numero 2 muestra el pH y la lmea numero 3 muestra la conductividad del efluente en la salida de la columna. La densidad optica a 280 nanometros indica una separacion parcial de dos fracciones durante la elucion de la protema de la columna de ff de CM-Sefarosa. El pH en la salida de la columna empieza a elevarse justo antes del comienzo de la nueva elevacion de la absorbancia UV durante la elucion. En este punto, las dos fracciones de eluato se separaron tal como se muestra en el cromatograma como F4 y F5 (fraccion 4 y fraccion 5), denominadas a continuacion E1 y E2.

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La figura 2 muestra un funcionamiento de cromatografo de la serie de ff en CM-Sefarosa descrita en el ejemplo 2. Ilustra el curso de pH y DO 280 durante la elucion de la fraccion de IgG de ff de CM-Sefarosa (material de partida: ruta II de pasta de fraccion II de Cohn; P24701IV; etapas de adsorcion: FIX; FVII; AT III).

La figura 3 muestra un cromatograma de la etapa de cromatograffa de flujo rapido (ff) en CM-Sefarosa descrita en el ejemplo 11. La lmea numero 1 muestra la absorbancia UV, la lmea numero 3 muestra el pH y la lmea numero 2 muestra la conductividad del efluente en la salida de la columna.

La figura 4 muestra un cromatograma de la etapa de cromatograffa de flujo rapido (ff) en CM-Sefarosa descrita en el ejemplo 12. La lmea numero 1 muestra la absorbancia UV, la lmea numero 3 muestra el pH y la lmea numero 2 muestra la conductividad del efluente en la salida de la columna.

La figura 5 muestra un cromatograma de la etapa de cromatograffa de flujo rapido (ff) en CM-Sefarosa descrita en el ejemplo 13. La lmea numero 1 muestra la absorbancia UV, la lmea numero 3 muestra el pH y la lmea numero 2 muestra la conductividad del efluente en la salida de la columna.

Descripcion detallada de invencion

I. Introduccion

Dado el amplio uso de composiciones de inmunoglobulinas por via intravenosa derivada de plasma terapeuticas, garantizar la seguridad de estas composiciones es de primordial importancia. Las preocupaciones sobre el contenido amidofftico de composiciones de inmunoglobulinas junto con la aparicion de acontecimientos tromboembolicos en pacientes a los que se les administraron inmunoglobulinas derivadas de plasma han puesto de manifiesto la necesidad de metodos para reducir eficazmente serina proteasas (por ejemplo, FXIa y FXIIa) y zimogenos de serina proteasa (por ejemplo, FXI y FXII) durante la fabricacion de inmunoglobulinas.

La presente invencion se basa, al menos en parte, en el sorprendente hallazgo de que pueden retirarse cantidades significativas de actividad amidofftica (por ejemplo, FXI y/o FXIa) y/o actividad anticomplemento (AAC) de una composicion de inmunoglobulinas recogiendo unicamente la porcion delantera de un eluato de intercambio cationico. De por sf, se proporcionan metodos en el presente documento para reducir la concentracion de serina proteasas y zimogenos de serina proteasa durante la fabricacion de composiciones de protemas derivadas de plasma.

En un aspecto, la invencion se basa en el descubrimiento de que durante una elucion de una sola etapa de una resina de intercambio cationico, se liberan inmunoglobulinas IgG de la resina antes de la elucion de una fraccion significativa de actividad amidofftica (por ejemplo, a la que contribuyen al menos FXI y/o FXIa) y/o AAC. Espedficamente, se encontro que tras poner en contacto una resina de intercambio cationico que tiene inmunoglobulinas IgG y protemas que contribuyen a la actividad amidofftica unidas a la misma con un tampon de elucion que tiene un pH de mas de al menos 7,0, el eluato inicial recuperado de la columna tiene un pH bajo (por ejemplo, un pH por debajo de 5,0). Tras un periodo de tiempo, el pH del eluato recuperado de la columna cambia a por encima de 7,0. De manera sorprendente, se encontro que el eluato inicial que tiene un pH bajo contiene niveles bajos de actividad amidofftica, contenido en FXI y/o FXIa, y/o contenido en AAC bajos, mientras que el eluato recuperado tras el cambio en el pH contiene un nivel significativamente mayor de actividad amidofftica, contenido en FXI y/o FXIa, y/o contenido en aAc.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion se basa en un metodo para separar una fraccion significativa de actividad amidofftica (por ejemplo, factor XI y/o factor XIa) de una composicion de inmunoglobulinas IgG uniendo las inmunoglobulinas IgG, la actividad amidofftica y/o AAC a una resina de intercambio cationico, eluyendo las inmunoglobulinas IgG, la actividad amidofftica y/o aAc en una elucion de una sola etapa, y recogiendo la porcion delantera del eluato, caracterizada por alto rendimiento de IgG, baja actividad amidofftica, por separado de la porcion trasera del eluato, caracterizada por bajo rendimiento de IgG y alta actividad amidofftica.

Entre otras ventajas, los metodos de la invencion proporcionan (1) metodos sencillos para retirar actividad amidofftica de composiciones de inmunoglobulinas IgG mediante cromatograffa de intercambio cationico con una elucion de una sola etapa; (2) metodos sencillos para identificar rapidamente fracciones de un eluato de intercambio cationico de inmunoglobulinas IgG que tiene altas actividades amidoffticas (es decir, alto contenido en FXI y/o FXIa), basandose en la monitorizacion del pH del eluato; (3) metodos para retirar actividad amidofftica de una composicion de inmunoglobulinas IgG que no se ven afectados por la concentracion de protema cargada en una resina de intercambio cationico, que permiten una ampliacion a escala sencilla para procedimientos de fabricacion a gran escala; (4) metodos que permiten la determinacion rapida de que fracciones de eluato de intercambio cationico de inmunoglobulinas IgG usar para el procesamiento adicional, basandose en la monitorizacion del pH; (5) metodos que permiten una reduccion significativa en la actividad amidofftica (por ejemplo, contenido en FXI y/o FXIa) con perdida minima de rendimiento de inmunoglobulina IgG; (6) metodos para fabricar composiciones de inmunoglobulinas IgG que tienen concentracion de agregado de IgG menor, actividad de PKA menor, actividad amidofftica menor tal como se mide con sustratos cromogenicos (incluyendo, pero sin limitarse al sustrato PL-1), una concentracion de

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monomero de IgG mayor y una distribucion de subclases de IgG mas deseable; (7) metodos que permiten la determinacion rapida de que fracciones de elucion de inmunoglobulinas IgG de intercambio cationico usar para el procesamiento adicional, basandose en el volumen de elucion de la etapa cromatografica; (8) metodos que permiten la determinacion rapida de que fracciones de elucion de intercambio cationico de inmunoglobulinas IgG usar para el procesamiento adicional, basandose en la absorbancia de protemas de la fraccion particular; (9) la capacidad para utilizar las caractensticas ventajosas de la invencion en procedimientos de fabricacion a gran escala; (10) enriquecimiento de la actividad amidolftica para identificacion y cuantificacion.

II. Definiciones

Tal como se usa en el presente documento, el termino tratamiento con “IgG por via intravenosa” o “IG i.v.” se refiere generalmente a la administracion por via intravenosa, por via subcutanea o por via intramuscular de una composicion de inmunoglobulinas IgG a un paciente para su uso en el tratamiento de varios estados tales como inmunodeficiencias, enfermedades inflamatorias y enfermedades autoinmunitarias. Las inmunoglobulinas IgG se combinan y se preparan normalmente a partir de plasma. Pueden usarse anticuerpos completos o fragmentos. Pueden formularse inmunoglobulinas IgG en concentraciones mas altas (por ejemplo, mayores del 10%) para administracion subcutanea, o formularse para administracion intramuscular. Esto es particularmente comun para preparaciones de IgG de especialidad que se preparan con tftulos mayores que en promedio para antfgenos espedficos (por ejemplo, factor p D, toxina pertusica, toxina tetanica, toxina botulmica, rabia, etc.). Para facilitar la descripcion, tambien se incluyen tales composiciones de IgG formuladas por via subcutanea o por via intramuscular en el termino “IG i.v.” en esta solicitud.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “actividad amidolftica” se refiere a la capacidad de un polipeptido para catalizar la hidrolisis de al menos un enlace peptfdico en otro polipeptido. El perfil de actividad amidolftica para una composicion de inmunoglobulinas IgG puede determinarse sometiendo a ensayo con diversos sustratos cromogenicos, con diferentes especialidades para proteasas encontradas en plasma humano, incluyendo sin limitacion: PL-1 (amplio espectro), S-2288 (amplio espectro), S-2266 (FXIa, calicremas glandulares), S-2222 (FXa, tripsina), S-2251 (plasmina) y S-2302 (calicrema, FXIa, y FXIIa). Se conocen bien en la tecnica metodos para determinar la actividad amidolftica de una composicion, por ejemplo, tal como se describe en M. Etscheid et al. (Identifications of kallikrein and FXIa as impurities in therapeutic immunoglobulins: implications for the safety and control of intravenous blood products, Vox Sang 2011.)

Tal como se usa en el presente documento, los terminos “actividad anticomplemento”, “actividad anticomplementaria” y “AAC” se usan de manera intercambiable y se refieren a la capacidad de una composicion de protemas, por ejemplo, una composicion de inmunoglobulinas IgG, para consumir potencial de complemento en un ensayo de complemento, por ejemplo, un metodo basado sustancialmente en el metodo descrito en “Public Health Monograph” n.° 74; Standardized Diagnostic Complement Fixation Method and Adaptation to Microtest, Washington, 1965, y E. A. Kabat y M. Mayer, Experimental Immunochemistry; 2a Ed. Thomas Springfield 1961. La unidad tfpica de actividad del complemento es la cantidad de complemento que producira la lisis de 2,5x108, de un total de 5x108 globulos rojos, optimamente sensibilizados en una actividad de complemento descrita en el presente documento.

En una realizacion, la AAC se mide usando una suspension normalizada de eritrocitos ovinos sensibilizados con anticuerpos, que se incuba con diferentes diluciones de suero de cobaya que actuan como fuente de complemento. El grado de hemolisis se mide de manera espectrofotometrica. Por ejemplo, para determinar la actividad anticomplementaria del producto de inmunoglobulina, se preparan disoluciones de prueba que contienen diversas cantidades del producto de inmunoglobulina y 2 unidades de C'Hso de suero de cobaya por ml. En una realizacion espedfica, se mide la actividad anticomplementaria incubando una cantidad definida de un material de prueba (por ejemplo, 10 mg de inmunoglobulina IgG) con una cantidad definida de complemento de cobaya (por ejemplo, 20 C'Hso) y se valora el complemento restante. La actividad anticomplementaria se expresa como el consumo en porcentaje de complemento en relacion con el control de complemento, que se considera que es el 100%. En una realizacion, la AAC se mide segun los criterios expuestos en la Farmacopea Europea: Human normal immunoglobulin for intravenous administration. Farmacopea Europea 6.3, monograffa 2.6.17, 4166-4168. Consejo de Europa, Estrasburgo Cedex, Francia.

En la bibliograffa se describen metodos para disminuir la actividad anticomplementaria de composiciones pretendidas para administracion intravenosa (Schultz, H. E. y Schwick, G., Dtsch. med. Wochenschrift 87 (1962), 1643; Barandun, S. et al., Vox Sang. 28 (1957), 157; Barandun, S. et al., Vox Sang. 7 (1962), 187; y Stefen, W., Z. Klin. Chem. Klin. Biochem. 7 (1969), 282.)

Tal como se usa en el presente documento, “plasma pobre en crioprecipitado” se refiere al sobrenadante formado tras la precipitacion en frio (crioprecipitacion) de plasma o plasma combinado a temperaturas proximas a la congelacion, por ejemplo, a temperaturas por debajo de aproximadamente 10°C. En el contexto de la presente invencion, plasma puede referirse de manera intercambiable a plasma recuperado (es dedr, plasma que se ha separado de sangre completa ex vivo) o plasma original (es decir, plasma recogido mediante plasmaferesis). Se realiza crioprecipitacion comunmente, por ejemplo, descongelando el plasma combinado previamente congelado, que ya se ha sometido a ensayo para determinar consideraciones de seguridad y calidad, aunque tambien puede

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usarse plasma nuevo. La descongelacion se lleva a cabo normalmente a una temperatura no mayor de 6°C. Tras la descongelacion completa del plasma congelado a baja temperatura, se realiza centrifugacion en fno (por ejemplo, < 6°C) para separar crioprecipitados solidos del sobrenadante Kquido. Alternativamente, puede realizarse la etapa de separacion mediante filtracion en vez de centrifugacion.

Tal como se usa en el presente documento, una “combinacion de Cohn” se refiere al material de partida usado para el fraccionamiento de una muestra de plasma o combinacion de muestras de plasma. Las combinaciones de Cohn incluyen plasma completo, muestras de plasma pobre en crioprecipitado, y combinaciones de muestras de plasma pobre en crioprecipitado que pueden haberse sometido o no a una etapa de procesamiento previo. En determinadas realizaciones, una combinacion de Cohn es una muestra de plasma pobre en crioprecipitado de la que se han retirado uno o mas factores sangumeos en una etapa de procesamiento previo, por ejemplo, adsorcion en una fase solida (por ejemplo, hidroxido de aluminio, dioxido de silicio finamente dividido, etc.), o etapa cromatografica (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico o de afinidad a heparina). Pueden aislarse diversos factores sangumeos, incluyendo pero sin limitarse a actividad de correccion del inhibidor de factor VIII (FEIBA), complejo de factor IX, concentrado de factor VII o complejo de antitrombina III, de la muestra de plasma pobre en crioprecipitado para formar una combinacion de Cohn.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “porcion delantera del eluato” se refiere a una primera fraccion de una composicion de inmunoglobulinas eluida de una resina de intercambio cationico, caracterizandose la fraccion por un alto rendimiento de inmunoglobulina y actividad amidolftica reducida en comparacion con la actividad amidolftica total unida a la resina antes de la elucion. La porcion delantera del eluato es la primera fraccion de un eluato liberado de una columna de intercambio cationico, que se produce antes de la liberacion (es decir, elucion) de una segunda fraccion de una composicion de inmunoglobulinas (denominada “porcion trasera del eluato”). La porcion trasera del eluato contiene unicamente una pequena cantidad de inmunoglobulinas (normalmente no mas del 25%, preferiblemente no mas del 10% de la inmunoglobulina unida a la columna) y se caracteriza por una concentracion mayor de actividad amidolftica en comparacion con la porcion delantera del eluato. En diversas realizaciones, las porciones delantera y trasera del eluato pueden definirse por diversas caractensticas, incluyendo sin limitacion, el pH del eluato, el rendimiento de protema (por ejemplo, expresado como porcentaje de la protema unida a la resina), la concentracion de protema (por ejemplo, tal como se determina mediante la densidad optica) del eluato, el volumen de eluato, y similares.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “ultrafiltracion (UF)” abarca una diversidad de metodos de filtracion por membrana en los que la presion hidrostatica fuerza un ftquido contra una membrana semipermeable. Se retienen solidos y solutos en suspension de alto peso molecular, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular pasan a traves de la membrana. Este procedimiento de separacion se usa a menudo para purificar y concentrar disoluciones macromoleculares (103 - 106 Da), especialmente disoluciones de protema. Hay disponibles varias membranas de ultrafiltracion segun el tamano de las moleculas que retienen. La ultrafiltracion se caracteriza normalmente por un tamano de poro de membrana de entre 1 y 1000 kDa y presiones de funcionamiento de entre 0,01 y 10 bar (1000 pascales a 1.000.000 pascales), y es particularmente util para separar protemas de pequenas moleculas como azucares y sales.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “diafiltracion” se realiza con las mismas membranas que la ultrafiltracion y puede ejecutarse o bien como modo de filtracion de extremo cerrado o bien como modo de filtracion de flujo tangencial. Durante la diafiltracion, se introduce el tampon en el tanque de recirculacion mientras que el filtrado se retira de la operacion unitaria. En procedimientos en los que el producto esta en el material retenido (por ejemplo, inmunoglobulinas IgG), la diafiltracion retira mediante lavado los componentes de la combinacion de producto en el filtrado, intercambiando asf tampones y reduciendo la concentracion de especies no deseables.

Tal como se usa en el presente documento, el termino “detergente” se usa en esta solicitud de manera intercambiable con el termino “tensioactivo” o “agente de accion superficial.” Los tensioactivos son normalmente compuestos organicos que son anfifflicos, es decir, que contienen tanto grupos hidrofobos (“colas”) como grupos hidrofilos (“cabezas”), que hacen que los tensioactivos sean solubles tanto en disolventes organicos como en agua. Un tensioactivo puede clasificarse por la presencia de grupos formalmente cargados en su cabeza. Un tensioactivo no ionico no tiene grupos cargados en su cabeza, mientras que un tensioactivo ionico porta una carga neta en su cabeza. Un tensioactivo zwitterionico contiene una cabeza con dos grupos cargados de manera opuesta. Algunos ejemplos de tensioactivos comunes incluyen: anionicos (basados en aniones sulfato, sulfonato o carboxilato): perfluorooctanoato (PFOA o PFO), perfluorooctanosulfonato (PFOS), dodecilsulfato de sodio (SDS), laurilsulfato de amonio, y otras sales de sulfato de alquilo, lauril eter sulfato de sodio (tambien conocido como SLES), sulfonato de alquilbenceno; cationicos (basados en cationes de amonio cuaternario): bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), tambien conocido como bromuro de hexadeciltrimetilamonio, y otras sales de alquiltrimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio (CPC), amina de sebo polietoxilado (POEA), cloruro de benzalconio (BAC), cloruro de bencetonio (BZT); acidos grasos de cadena larga y sus sales: incluyendo caprilato, acido capnlico, heptanoato, acido hexanoico, acido heptanoico, acido nanoico, acido decanoico, y similares; zwitterionicos (anfoteros): dodecilbetama; cocamidopropilbetama; cocoanfoglicinato; no ionicos: poli(oxido de etileno) de alquilo, poli(oxido de etileno) de alquilfenol, copoftmeros de poli(oxido de etileno) y poli(oxido de polipropileno) (comercialmente conocidos como poloxameros o poloxaminas), alquilpoliglucosidos, incluyendo octilglucosido, decilmaltosido, alcoholes grasos (por

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ejemplo, alcohol cetilico y alcohol oleflico), cocamida MEA, cocamida DEA, polisorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Triton y oxido de dodecildimetilamina.

Tal como se usa en esta solicitud, el termino “pulverizacion” se refiere a un medio de suministrar una sustancia ftquida en un sistema, por ejemplo, durante una etapa de precipitacion con alcohol, tal como una etapa de precipitacion de fraccionamiento I o M+IM de Cohn modificada, en forma de gotitas finas o niebla de la sustancia ftquida. La pulverizacion puede lograrse mediante cualquier dispositivo presurizado, tal como un recipiente (por ejemplo, una botella de pulverizador), que tiene una cabeza o una boquilla de pulverizador y que se hace funcionar de manera manual o automatica para generar una niebla fina a partir de un ftquido. Normalmente, se realiza pulverizacion mientras el sistema que recibe la sustancia ftquida se agita continuamente o se mezcla de otro modo para garantizar una distribucion rapida y equitativa del ftquido dentro del sistema.

Con “cantidad o dosis terapeuticamente eficaz” o “cantidad o dosis suficiente/eficaz,” quiere decirse una dosis que produce los efectos por los cuales se administra. La dosis exacta dependera del proposito del tratamiento, y se podra determinar por un experto en la tecnica usando tecnicas conocidas (vease, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vol. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edicion, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

II. Reduccion de la actividad amidolftica

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos cromatograficos para reducir la actividad amidolftica (por ejemplo, reduciendo el contenido de Fxi/FXIa y/o FXII/FXIIa) de una composicion de inmunoglobulinas IgG derivada de plasma. Asimismo, la divulgacion tambien proporciona composiciones de inmunoglobulinas IgG derivadas de plasma que contienen bajos niveles de actividad amidolftica (por ejemplo, bajos niveles de FXI/FXIa y/o FXII/FXIIa) preparadas segun los metodos proporcionados en el presente documento. Ventajosamente, los metodos descritos en el presente documento proporcionan composiciones de inmunoglobulinas IgG derivadas de plasma con perfiles de seguridad mejorados. Espedficamente, las composiciones proporcionadas por estos metodos tienen potencial reducido para provocar acontecimientos tromboembolicos no deseados, en comparacion con composiciones de inmunoglobulinas IgG fabricadas actualmente.

A. Metodos de fraccionamiento

La presente invencion se basa en parte en el descubrimiento de que una mayor parte de la actividad amidolftica presente en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma eluye de una resina de intercambio cationico en la porcion trasera de un eluato creado mediante una elucion en etapas, mientras que una mayor parte del contenido en inmunoglobulinas de la fraccion eluye en la porcion delantera de dicho eluato. Por consiguiente, al recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, la actividad amidolftica de la preparacion de inmunoglobulinas resultante se reduce significativamente. Espedficamente, se muestra en el presente documento que el contenido en factor XIa y, por tanto, la actividad amidolftica asociada con el contenido en factor XIa, se reduce significativamente en composiciones de inmunoglobulinas preparadas segun los metodos proporcionados en el presente documento.

Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad amidolftica en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad amidolitica (es decir, contaminantes proteicos que tienen actividad amidolftica) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y la actividad amidolftica; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolftica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de actividad amidolftica. En una realizacion espedfica, la actividad amidolftica es la actividad del factor XIa presente en la composicion. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por

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separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolftica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de actividad amidolftica. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de entre 4,8 y 5,6 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolftica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de actividad amidolftica. En una realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) lavar la resina con las inmunoglobulinas y FXI y/o FXIa unidos a la misma con un tampon que tiene una conductividad lo suficientemente baja de manera que las inmunoglobulinas no se eluyen de la resina y un pH de entre 5,1 y 5,9; (c) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolftica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de actividad amidolftica. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,1. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5. En aun otras realizaciones, el pH del tampon de lavado es 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de

elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de

elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de

elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio

cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de 7,8 + 0,4 y una conductividad de al menos 20 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolftica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de actividad amidolftica. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,1. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8. En aun otras realizaciones, el pH del

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tampon de elucion es 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 u 8,5. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

Generalmente, el material de partida usado para los metodos proporcionados en el presente documento incluye cualquier fraccion de plasma o composicion que comprende inmunoglobulina IgG y actividad amidolftica. Como tal, en una realizacion, se fracciona parcial o completamente plasma segun uno cualquiera de los esquemas de purificacion conocidos en la tecnica. En una realizacion espedfica, se fracciona el plasma para producir un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion II, un precipitado de la fraccion I+II+IN, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler-Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann, o un precipitado modificado de los mismos, que puede usarse como material de partida para los metodos proporcionados en el presente documento.

En una realizacion preferida, se fracciona el plasma mediante una o mas etapas de precipitacion con etanol. Pueden emplearse etapas de precipitacion con etanol para o bien precipitar las inmunoglobulinas deseadas de la disolucion, mientras se retiene al menos una protema distinta de inmunoglobulina en el sobrenadante, o bien precipitar al menos una protema distinta de inmunoglobulina de la disolucion, mientras se retiene la inmunoglobulina deseada en el sobrenadante. Los metodos para el fraccionamiento de inmunoglobulinas de esta manera se conocen bien en la tecnica. Los precipitados con etanol a modo de ejemplo incluyen, sin limitacion, un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion I+II+III, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler- Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann, y precipitados modificados de los mismos. En una realizacion particularmente preferida, las inmunoglobulinas presentes en el plasma pobre en crioprecipitado se enriquecen mediante un procedimiento con etanol de cuatro etapas, que comprende una etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III, una etapa de precipitacion de A, una etapa de precipitacion de By una etapa de precipitacion de la fraccion II.

En una realizacion, el material de partida para los metodos para reducir la actividad amidolftica proporcionados en el presente documento se prepara mediante fraccionamiento con etanol de plasma humano combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En una realizacion espedfica, el fraccionamiento con etanol incluye la precipitacion de la fraccion I+II+III de plasma pobre en crioprecipitado, precipitacion de la fraccion A de un precipitado de la fraccion I+II+III en suspension, precipitacion de la fraccion B de un precipitado de la fraccion A en suspension y precipitacion de la fraccion II de un sobrenadante de la fraccion A, tal como se describe a continuacion. En otra realizacion espedfica, el fraccionamiento con etanol incluye precipitacion de la fraccion I de plasma pobre en crioprecipitado, precipitacion de la fraccion II+III de un sobrenadante de la fraccion I y precipitacion de la fraccion II de un precipitado de la fraccion II+III en suspension.

Tal como se demuestra en el presente documento, las caractensticas ventajosas de los metodos proporcionados en el presente documento se mantienen cuando se aplican a procedimientos de fabricacion a gran escala. Con respecto a la preparacion de composiciones de inmunoglobulinas IgG, la fabricacion a gran escala se refiere a procedimientos que enriquecen inmunoglobulinas a partir de al menos 100 l de material de partida de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). Generalmente, los procedimientos de fabricacion de inmunoglobulinas a gran escala fraccionaran entre 100 l y 20.000 l de plasma combinado por lote. En determinadas realizaciones, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 100 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulinas IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 500 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 1.000 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 5000 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En aun otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 10.000 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado).

Generalmente, se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de las condiciones de carga, condiciones de lavado y condiciones de elucion descritas anteriormente. Ademas, se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de las condiciones cromatograficas espedficas con todos los posibles esquemas para definir y recoger la porcion delantera del eluato, tal como se describe a continuacion.

1. Porciones delantera y trasera del eluato de intercambio cationico

En un aspecto, la presente invencion proporciona metodos para reducir la actividad amidolftica, y espedficamente la actividad amidolftica aportada por impurezas del FXIa, presente en preparaciones de inmunoglobulina recogiendo la porcion delantera de un eluato de intercambio cationico. Ventajosamente, se muestra en el presente documento que la porcion delantera de un eluato formado por elucion de una sola etapa de una etapa cromatografica de intercambio

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cationico contiene la mayor parte del contenido en inmunoglobulina deseado, mientras que la porcion trasera del eluato contiene la mayor parte de la actividad amidolftica no deseada. Debido a que la elucion de las inmunoglobulinas y la actividad amidolftica no pueden separarse completamente, debe determinate una division entre las porciones delantera y trasera del eluato. Deben tenerse en cuenta dos consideraciones principales cuando se realiza esta determinacion, concretamente: (i) que segun como se definan las porciones delantera y trasera del eluato, se recuperara mas o menos actividad amidolftica en la porcion delantera -es decir, puede separarse una porcion de actividad amidolftica mayor del contenido en inmunoglobulinas cuando se define la porcion delantera del eluato como una porcion mas pequena del eluato total, y viceversa; y (ii) que segun como se definan las porciones delantera y trasera del eluato, estaran presentes rendimientos de recuperacion de inmunoglobulinas mayores o menores en la porcion delantera -es decir, se lograra un rendimiento de inmunoglobulina mas bajo cuando se define la porcion delantera del eluato como una porcion mas pequena del eluato total, y viceversa.

Por consiguiente, el experto en la tecnica decidira donde trazar el ftmite entre las porciones delantera y trasera del eluato de intercambio cationico basandose en sus necesidades individuales. Por ejemplo, cuando se prepara una purificacion a pequena escala para investigacion o un proposito terapeutico especializado, el experto en la tecnica podna maximizar la potencia de separacion del metodo recogiendo una porcion delantera del eluato mas pequena, mientras que se sacrifica el rendimiento de inmunoglobulina final. En cambio, cuando se realiza fabricacion a gran escala (por ejemplo, procesamiento de mas de 500 l de plasma pobre en crioprecipitado), el coste de oportunidad puede dictar que se recoja una porcion delantera del eluato mas grande para aumentar el rendimiento de recuperacion de inmunoglobulina a expensas de una reduccion mas moderada en la actividad amidolftica de la composicion.

En diversas realizaciones, las porciones delantera y trasera del eluato pueden definirse por diversas caractensticas incluyendo, sin limitacion, el pH del eluato, el rendimiento de protema (por ejemplo, expresado como porcentaje de la protema unida a la resina), la concentracion de protema (por ejemplo, tal como se determina mediante la densidad optica) del eluato, el volumen de eluato, y similares.

a. pH del eluato

Tal como se demuestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, el comienzo de la etapa de elucion de intercambio cationico esta marcado por una cafda en el pH de la disolucion que sale de la columna, hasta un pH por debajo de 5,0, a pesar de que el tampon de elucion tiene un pH mayor (generalmente > 7,5) que el de la carga de la columna y las etapas de lavado (generalmente 5,0-6,0). Esta cafda en el pH se corresponde con la elucion de una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene actividad amidolftica y contenido en factor XIa bajos (por ejemplo, veanse la tabla 4 y la tabla 11, respectivamente). En un momento posterior en la elucion, el pH de la disolucion que sale de la columna se eleva considerablemente, hasta mas de 6,0-8,0. Este cambio en el pH es concomitante con un aumento significativo en la actividad amidolftica y el contenido en factor XIa del eluato (por ejemplo, veanse la tabla 4 y la tabla 11, respectivamente). Por tanto, aunque se realiza una elucion en etapas mediante la aplicacion de un solo tampon de elucion de pH alto (mayor de 7,5), el perfil de elucion se parece a una elucion en dos etapas en la que las inmunoglobulinas IgG se eluyen en primer lugar de la columna, seguido por la actividad amidolftica acompanante (por ejemplo, factor XI y/o factor XIa). Por tanto, en determinadas realizaciones, las porciones delantera y trasera del eluato se definen basandose en el pH del eluato en la salida de la columna.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad amidolftica en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad amidolftica (es decir, contaminantes proteicos que tienen actividad amidolftica) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y la actividad amidolftica; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,0. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,0. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, o menos. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatografta en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de

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intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,0. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,0. En aun otras realizaciones, en otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, o menos. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al

menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al

menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al

menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio

cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

b. Absorbancia del eluato

En aun otra realizacion particularmente adecuada para la fabricacion a gran escala de composiciones de inmunoglobulinas, las porciones delantera y trasera del eluato se definen por la concentracion de inmunoglobulina que eluye de la columna de intercambio cationico. Por ejemplo, durante la fabricacion a gran escala, la composicion de inmunoglobulinas puede cargarse en la resina de intercambio cationico a cargas de protema lo suficientemente altas (por ejemplo, > 80 mg de protema por ml de resina) de manera que el eluato pico este altamente concentrado. En estos casos, la porcion delantera del eluato puede definirse como la fraccion del eluato que eluye antes del punto en el que la DO280 cae por debajo de un valor umbral. De esta manera, puede recuperarse de manera reproducible aproximadamente el mismo rendimiento de inmunoglobulinas de una preparacion a la siguiente, independientemente de pequenas variaciones entre las series de fabricacion. Tal como se demuestran en el ejemplo 9, la aplicacion de este esquema de recogida para un procedimiento de fabricacion a gran escala da como resultado una recuperacion de alto rendimiento de una composicion de inmunoglobulinas IgG con un contenido en actividad amidolftica y TGA significativamente reducido.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad amidolftica en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad amidolftica (es decir, contaminantes proteicos que tienen actividad amidolftica) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y la actividad amidolftica; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,0 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,5 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 2,0 UA. En aun otras realizaciones espedficas, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 deal menos 1,0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA, 1,6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 2,0 UA. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,5 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,0 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,0 UA. En aun otras realizaciones espedficas, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA, 1,6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra

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realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

c. Porcentaje del eluato total

En aun otra realizacion particularmente adecuada para la fabricacion a gran escala de composiciones de inmunoglobulinas, las porciones delantera y trasera del eluato se definen como un porcentaje del contenido en protema total del eluato (por ejemplo, en volumen o protema total). Al predeterminar el porcentaje del eluato que va a recogerse en la porcion delantera, el rendimiento de recuperacion de inmunoglobulina puede controlarse estrechamente. Este metodo para definir las porciones delantera y trasera del eluato es particularmente util para procedimientos de fabricacion que requieren un rendimiento de etapas mmimo y para procedimientos en los que se toma una decision basandose en sopesar el coste de rendimientos de inmunoglobulina reducidos con el beneficio de producir una composicion que tiene un contenido amidolftico y en factor XI y/o factor XIa reducido. De esta manera, puede recuperarse de manera reproducible aproximadamente el mismo rendimiento de inmunoglobulinas de una preparacion a la siguiente, independientemente de pequenas variaciones entre las series de fabricacion. Tal como se demuestra en el ejemplo 8, la aplicacion de este esquema de recogida puede dar como resultado una recuperacion de alto rendimiento de una composicion de inmunoglobulinas IgG con un contenido en actividad amidolftica y TGA significativamente reducido.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad amidolftica en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad amidolftica (es decir, contaminantes proteicos que tienen actividad amidolftica) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y la actividad amidolftica; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas del 80% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 75% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 75% y el 80% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79% o el 80% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 70% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y 65% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 65% y el 70% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 60%, el 61%, el 62%, el 63%, el 64%, el 65%, el 66%, el 67%, el 68%, el 69% o el 70% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 60% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 60% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 55% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 55% y el 60% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 50%, el 51%, el 52%, el 53%, el 54%, el 55%, el 56%, el 57%, el 58%, el 59% o el 60% del eluato total. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatografta en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas del 80% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 75% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 75% y el 80% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79% o el 80% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o

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combinada de interes) del eluato es de no mas del 70% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y 65% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 65% y el 70% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 60%, el 61%, el 62%, el 63%, el 64%, el 65%, el 66%, el 67%, el 68%, el 69% o el 70% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 60% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 60% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 55% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 55% y el 60% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 50%, el 51%, el 52%, el 53%, el 54%, el 55%, el 56%, el 57%, el 58%, el 59% o el 60% del eluato total. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

d. Volumen del eluato total

En otra realizacion particularmente adecuada para la fabricacion a gran escala de composiciones de inmunoglobulinas, las porciones delantera y trasera del eluato se definen como volumenes del pico del eluato en relacion con el tamano de la columna de intercambio cationico (por ejemplo, mediante un numero establecido de volumenes de columna). Al predeterminar un volumen de eluato que va a recogerse en la porcion delantera, el rendimiento de recuperacion de inmunoglobulinas puede controlarse estrechamente y reproducirse. Este metodo para definir las porciones delantera y trasera del eluato es particularmente util para procedimientos de fabricacion que requieren un rendimiento de etapas mmimo y para procedimientos en los que se toma una decision basandose en sopesar el coste de rendimientos de inmunoglobulinas reducidos con el beneficio de producir una composicion que tiene un contenido amidolftico y en factor XI y/o factor XIa reducido. De esta manera, puede recuperarse de manera reproducible aproximadamente el mismo rendimiento de inmunoglobulinas de una preparacion a la siguiente, independientemente de pequenas variaciones entre las series de fabricacion. Tal como se demuestra en los ejemplos 11 a 13, la aplicacion de este esquema de recogida puede dar como resultado una recuperacion de alto rendimiento de una composicion de inmunoglobulinas IgG con un contenido en actividad amidolftica y TGA significativamente reducido.

En una realizacion, el comienzo de la porcion delantera esta definido por una absorbancia de referencia. En algunas realizaciones, la recogida de la porcion delantera comienza una vez que la absorbancia del pico del eluato atraviesa un primer umbral. En una realizacion, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 2,0 UA. En una realizacion espedfica, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 1,5 UA. En otra realizacion espedfica, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 1,0 UA. En otra realizacion espedfica, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 0,5 UA. En aun otras realizaciones espedficas, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 0,1 UA, 0,2 UA, 0,3 UA, 0,4 UA, 0,5 UA, 0,6 UA, 0,7 UA, 0,8 UA, 0,9 UA, 1,0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA,

1.6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas.

En algunas realizaciones, una vez se inicia la recogida de la porcion delantera, se recoge un numero predeterminado de volumenes de columna antes de cambiar a la recogida (o eliminacion) de la porcion trasera del eluato. En una realizacion, no se recogen mas de 5 volumenes de columna (VC) de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 4 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 3 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 2,7 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 2,5 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 2 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recoge mas de 1 VC de eluato en la porcion delantera. En aun otras realizaciones, no se recogen mas de 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC,

0,8 VC, 0,9 VC, 1,0 VC, 1,1 VC, 1,2 VC, 1,3 VC, 1,4 VC, 1,5 VC, 1,6 VC, 1,7 VC, 1,8 VC, 1,9 VC, 2,0 VC, 2,1 VC,

2,2 VC, 2,3 VC, 2,4 VC, 2,5 VC, 2,6 VC, 2,7 VC, 2,8 VC, 2,9 VC, 3,0 VC, 3,1 VC, 3,2 VC, 3,3 VC, 3,4 VC, 3,5 VC,

3.6 VC, 3,7 VC, 3,8 VC, 3,9 VC, 4,0 VC, 4,1 VC, 4,2 VC, 4,3 VC, 4,4 VC, 4,5 VC, 4,6 VC, 4,7 VC, 4,8 VC, 4,9 VC,

5,0 VC, 5,1 VC, 5,2 VC, 5,3 VC, 5,4 VC, 5,5 VC, 5,6 VC, 5,7 VC, 5,8 VC, 5,9 VC, 6,0 VC, o mas volumenes de columna de eluato en la porcion delantera.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad amidolftica en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad amidolftica (es decir, contaminantes proteicos que tienen actividad amidolftica) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y la actividad amidolftica; y (d) recoger la porcion

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delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas de 4 volumenes de columna (VC) del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,0 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y 3,0 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre

2.0 VC y 3,5 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y

4.0 VC del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y

3.5 VC del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es de 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC,

0,8 VC, 0,9 VC, 1,0 VC, 1,1 VC, 1,2 VC, 1,3 VC, 1,4 VC, 1,5 VC, 1,6 VC, 1,7 VC, 1,8 VC, 1,9 VC, 2,0 VC, 2,1 VC,

2.2 VC, 2,3 VC, 2,4 VC, 2,5 VC, 2,6 VC, 2,7 VC, 2,8 VC, 2,9 VC, 3,0 VC, 3,1 VC, 3,2 VC, 3,3 VC, 3,4 VC, 3,5 VC,

3.6 VC, 3,7 VC, 3,8 VC, 3,9 VC, 4,0 VC, 4,1 VC, 4,2 VC, 4,3 VC, 4,4 VC, 4,5 VC, 4,6 VC, 4,7 VC, 4,8 VC, 4,9 VC,

5.0 VC, 5,1 VC, 5,2 VC, 5,3 VC, 5,4 VC, 5,5 VC, 5,6 VC, 5,7 VC, 5,8 VC, 5,9 VC o 6,0 VC del eluato total. En una

realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas de 4 volumenes de columna (VC) del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,0 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre

2.0 VC y 3,0 Vc del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y

3,5 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y 4,0 VC del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,5 VC del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es de 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC, 0,8 VC, 0,9 VC,

1.0 VC, 1,1 VC, 1,2 VC, 1,3 VC, 1,4 VC, 1,5 VC, 1,6 VC, 1,7 VC, 1,8 VC, 1,9 VC, 2,0 VC, 2,1 VC, 2,2 VC, 2,3 VC,

2,4 VC, 2,5 VC, 2,6 VC, 2,7 VC, 2,8 VC, 2,9 VC, 3,0 VC, 3,1 VC, 3,2 VC, 3,3 VC, 3,4 VC, 3,5 VC, 3,6 VC, 3,7 VC,

3,8 VC, 3,9 VC, 4,0 VC, 4,1 VC, 4,2 VC, 4,3 VC, 4,4 VC, 4,5 VC, 4,6 VC, 4,7 VC, 4,8 VC, 4,9 VC, 5,0 VC, 5,1 VC,

5.2 VC, 5,3 VC, 5,4 VC, 5,5 VC, 5,6 VC, 5,7 VC, 5,8 VC, 5,9 VC o 6,0 VC del eluato total. En otra realizacion

espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion

espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion

espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

IV. Reduccion de la actividad anticomplemento (AAC)

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos cromatograficos para reducir el contenido en actividad anticomplemento (AAC) de una composicion de inmunoglobulinas IgG derivada de plasma. Asimismo, la divulgacion tambien proporciona composiciones de inmunoglobulinas IgG derivadas de plasma que contienen bajos niveles de actividad anticomplemento (AAC) preparadas segun los metodos proporcionados en el presente documento. Ventajosamente, los metodos descritos en el presente documento proporcionan composiciones de inmunoglobulinas IgG derivadas de plasma con perfiles de seguridad mejorados. Espedficamente, las composiciones proporcionadas por estos metodos tienen potencial reducido para provocar reacciones adversas asociadas con la actividad anticomplementaria, en comparacion con las composiciones de inmunoglobulinas IgG fabricadas actualmente (vease, por ejemplo, Buchacher A. et al., Vox Sang. Abril de 2010; 98(3 Pt 1):e209-18), cuyo contenido se incorpora expresamente en el presente documento en su totalidad como referencia para todos los propositos.

A. Metodos de fraccionamiento

La presente divulgacion se basa en parte en el descubrimiento de que una mayor parte de la actividad anticomplemento (AAC) presente en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma eluye de una resina de intercambio cationico en la porcion trasera de un eluato creado mediante una elucion en etapas, mientras que una mayor parte del contenido en inmunoglobulinas de la fraccion eluye en la porcion delantera de dicho eluato. Por consiguiente, al recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, la actividad anticomplemento de la preparacion de inmunoglobulina resultante se reduce significativamente. Espedficamente, se muestra en el presente documento que el contenido en AAC se reduce significativamente en composiciones de inmunoglobulinas preparadas segun los metodos proporcionados en el presente documento.

Por consiguiente, en una realizacion, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el

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metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad anticomplemento (es decir, contaminantes que tienen actividad anticomplemento) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y AAC; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de AAC en comparacion con la composicion de partida, y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de actividad AAC. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una concentracion reducida de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una

realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM). En otra

realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra

realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra

realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm.

En una realizacion espedfica, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de entre 4,8 y 5,6 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de AAC, en relacion con la cantidad de inmunoglobulina IgG, en comparacion con la composicion de partida, y la porcion trasera del eluato contiene una cantidad elevada de AAC, en relacion con la cantidad de inmunoglobulina IgG. En una realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b) lavar la resina con las inmunoglobulinas y AAC unidas a la misma con un tampon que tiene una conductividad lo suficientemente baja de manera que las inmunoglobulinas no se eluyen de la resina y un pH de entre 5,1 y 5,9; (c) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una concentracion reducida de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulinas IgG, en comparacion con la composicion de partida, y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulinas IgG. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,3. En

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otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,1. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5. En aun otras realizaciones, el pH del tampon de lavado es 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el

tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el

tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, el metodo comprende las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b)

eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio

cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de 7,8 + 0,4 y una conductividad de al menos 20 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una concentracion reducida de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG, en comparacion con la composicion de partida, y la porcion trasera del eluato contiene una alta concentracion de AAC, en relacion con la concentracion de inmunoglobulina IgG. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,1. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8. En aun otras realizaciones, el pH del tampon de elucion es 7,0, 7,1, 7,2, 7,36, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 u 8,5. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

Generalmente, el material de partida usado para los metodos proporcionados en el presente documento incluye cualquier fraccion de plasma o composicion que comprende inmunoglobulina IgG y actividad anticomplementaria. Como tal, en una realizacion, se fracciona parcial o completamente plasma segun uno cualquiera de los esquemas de purificacion conocidos en la tecnica. En una realizacion espedfica, se fracciona el plasma para producir un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion II, un precipitado de la fraccion I+II+IN, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler-Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann, o un precipitado modificado de los mismos, que puede usarse como material de partida para los metodos proporcionados en el presente documento.

En una realizacion preferida, se fracciona el plasma mediante una o mas etapas de precipitacion con etanol. Pueden emplearse etapas de precipitacion con etanol para o bien precipitar las inmunoglobulinas deseadas de la disolucion, mientras se retiene al menos una protema distinta de inmunoglobulina en el sobrenadante, o bien precipitar al menos una protema distinta de inmunoglobulina de la disolucion, mientras se retiene la inmunoglobulina deseada en el sobrenadante. Los metodos para el fraccionamiento de inmunoglobulinas de esta manera se conocen bien en la tecnica. Los precipitados con etanol a modo de ejemplo incluyen, sin limitacion, un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion I+II+III, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler- Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann, y precipitados modificados de los mismos. En una realizacion particularmente preferida, las inmunoglobulinas presentes en el plasma pobre en crioprecipitado se enriquecen mediante un procedimiento con etanol de cuatro etapas, que comprende una etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III, una etapa de precipitacion de A, una etapa de precipitacion de By una etapa de precipitacion de la fraccion II.

Tal como se demuestra en el presente documento, las caractensticas ventajosas de los metodos proporcionados en el presente documento se mantienen cuando se aplican a procedimientos de fabricacion a gran escala. Con respecto a la preparacion de composiciones de inmunoglobulinas IgG, la fabricacion a gran escala se refiere a procedimientos que enriquecen inmunoglobulinas a partir de al menos 100 l de material de partida de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). Generalmente, los procedimientos de fabricacion de inmunoglobulinas a gran escala fraccionaran entre 100 l y 20.000 l de plasma combinado por lote. En determinadas realizaciones, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 100 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 500 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 1.000 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 5000 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En aun otra realizacion, un procedimiento de fabricacion de

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inmunoglobulina IgG a gran escala se refiere al fraccionamiento de al menos 10.000 l de plasma combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado).

En una realizacion, el material de partida para los metodos para reducir la actividad anticomplemento (AAC) proporcionados en el presente documento se prepara mediante fraccionamiento con etanol de plasma humano combinado (por ejemplo, plasma pobre en crioprecipitado). En una realizacion espedfica, el fraccionamiento con etanol incluye la precipitacion de la fraccion I+N+NI de plasma pobre en crioprecipitado, precipitacion de la fraccion A de un precipitado de la fraccion I+N+NI en suspension, precipitacion de la fraccion B de un precipitado de la fraccion A en suspension y precipitacion de la fraccion II de un sobrenadante de la fraccion A, tal como se describe a continuacion. En otra realizacion espedfica, el fraccionamiento con etanol incluye precipitacion de la fraccion I de plasma pobre en crioprecipitado, precipitacion de la fraccion II+III de un sobrenadante de la fraccion I y precipitacion de la fraccion II de un precipitado de la fraccion II+III en suspension.

Generalmente, se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de las condiciones de carga, condiciones de lavado y condiciones de elucion descritas anteriormente. Ademas, se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de las condiciones cromatograficas espedficas con todos los posibles esquemas para definir y recoger la porcion delantera del eluato, tal como se describe a continuacion.

1. Porciones delantera y trasera del eluato de intercambio cationico

En un aspecto, la presente divulgacion proporciona metodos para reducir la actividad anticomplemento (AAC), presente en preparaciones de inmunoglobulina recogiendo la porcion delantera de un eluato de intercambio cationico. Ventajosamente, se muestra en el presente documento que la porcion delantera de un eluato formado por elucion de una sola etapa de una etapa cromatografica de intercambio cationico contiene la mayor parte del contenido en inmunoglobulina deseado, mientras que la porcion trasera del eluato contiene la mayor parte de la AAC no deseada. Debido a que la elucion de inmunoglobulinas y AAC no puede separarse completamente, debe determinarse una division entre las porciones delantera y trasera del eluato. Deben tenerse en cuenta dos consideraciones principales cuando se realiza esta determinacion, concretamente: (i) que segun como se definan las porciones delantera y trasera del eluato, se recuperara mas o menos AAC en la porcion delantera -es decir, puede separarse una porcion mas grande de AAC del contenido en inmunoglobulina cuando se define la porcion delantera del eluato como una porcion mas pequena del eluato total, y viceversa; y (ii) que segun como se definan las porciones delantera y trasera del eluato, estaran presentes rendimientos de recuperacion de inmunoglobulina mayores o menores en la porcion delantera -es decir, se lograra un rendimiento de inmunoglobulina mas bajo cuando se define la porcion delantera del eluato como una porcion mas pequena del eluato total, y viceversa.

Por consiguiente, el experto en la tecnica decidira donde trazar el Nmite entre las porciones delantera y trasera del eluato de intercambio cationico basandose en sus necesidades individuales. Por ejemplo, cuando se prepara una purificacion a pequena escala para investigacion o un fin terapeutico especializado, el experto en la tecnica podna maximizar la potencia de separacion del metodo recogiendo una porcion delantera del eluato mas pequena, mientras que se sacrifica el rendimiento de inmunoglobulina final. En cambio, cuando se realiza fabricacion a gran escala (por ejemplo, procesamiento de mas de 500 l de plasma pobre en crioprecipitado), el coste de oportunidad puede dictar que se recoja una porcion delantera del eluato mas grande para aumentar el rendimiento de recuperacion de inmunoglobulina a expensas de una reduccion mas moderada en la AAC de la composicion.

En diversas realizaciones, las porciones delantera y trasera del eluato pueden definirse por diversas caractensticas, incluyendo sin limitacion, el pH del eluato, el rendimiento de protema (por ejemplo, expresado como porcentaje de la protema unida a la resina), la concentracion de protema (por ejemplo, tal como se determina mediante la densidad optica) del eluato, el volumen de eluato, y similares.

a. pH del eluato

Tal como se demuestra en los ejemplos proporcionados en el presente documento, el comienzo de la etapa de elucion de intercambio cationico esta marcado por una cafda en el pH de la disolucion que sale de la columna, hasta un pH por debajo de 5,0, a pesar de que el tampon de elucion tiene un pH mayor (generalmente > 7,0) que el de la carga de la columna y las etapas de lavado (generalmente 5,0-6,0). Esta cafda en el pH se corresponde con la elucion de una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una AAC baja (por ejemplo, veanse la tabla 3, la tabla 11 y la tabla 15). En un momento posterior en la elucion, el pH de la disolucion que sale de la columna se eleva considerablemente, hasta mas de 6,0-8,0. Este cambio en el pH es concomitante con un aumento significativo en el contenido en AAC del eluato (por ejemplo, veanse la tabla 3, la tabla 11 y la tabla 15). Por tanto, aunque se realiza una elucion en etapas mediante la aplicacion de un solo tampon de elucion de pH alto (generalmente mayor de 7,0), el perfil de elucion se parece a una elucion en dos etapas en la que las inmunoglobulinas IgG se eluyen en primer lugar de la columna, seguido por la actividad anticomplemento acompanante. Por tanto, en determinadas realizaciones, las porciones delantera y trasera del eluato se definen basandose en el pH del eluato en la salida de la columna.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de

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actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad anticomplemento (es decir, contaminantes que tienen actividad anticomplemento) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene inmunoglobulina IgG y AAC unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y AAC; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,0. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,0. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, o menos. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la AAC a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 6,0. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,5. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 5,0. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene un pH de no mas de 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, o menos. En una realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de

disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2,

5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una

conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una

conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

b. Absorbancia del eluato

En aun otra realizacion particularmente adecuada para la fabricacion a gran escala de composiciones de inmunoglobulinas, las porciones delantera y trasera del eluato se definen por la concentracion de inmunoglobulina que eluye de la columna de intercambio cationico. Por ejemplo, durante la fabricacion a gran escala, la composicion de inmunoglobulinas puede cargarse en la resina de intercambio cationico a cargas de protema lo suficientemente altas (por ejemplo, > 80 mg de protema por ml de resina) de manera que el eluato pico este altamente concentrado. En estos casos, la porcion delantera del eluato puede definirse como la fraccion del eluato que eluye antes del punto en el que la DO280 cae por debajo de un valor umbral. De esta manera, puede recuperarse de manera reproducible aproximadamente el mismo rendimiento de inmunoglobulinas de una preparacion a la siguiente, independientemente de pequenas variaciones entre las series de fabricacion. Tal como se demuestra en el ejemplo 9, la aplicacion de este esquema de recogida para un procedimiento de fabricacion a gran escala da como resultado una recuperacion de alto rendimiento de una composicion de inmunoglobulinas IgG con un contenido en actividad anticomplemento (AAC) significativamente reducido.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad anticomplemento (es decir, contaminantes que tienen actividad anticomplemento) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y AAC; y (d) recoger

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la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 0,5 UA. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,0 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,5 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 2,0 UA. En aun otras realizaciones espedficas, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 0,1 UA, 0,2 UA, 0,3 UA, 0,4 UA, 0,5 UA, 0,6 UA, 0,7 UA, 0,8 UA, 0,9 UA,

1.0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA, 1,6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 0,5 UA. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,0 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 1,5 UA. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 2,0 UA. En aun otras realizaciones espedficas, la porcion delantera del eluato consiste en la porcion del eluato que tiene una DO280 de al menos 0,1 UA, 0,2 UA, 0,3 UA, 0,4 UA, 0,5 UA, 0,6 UA, 0,7 UA, 0,8 UA, 0,9 UA,

1.0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA, 1,6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas. En una realizacion

espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7,

5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos

20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos

22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos

25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

c. Porcentaje del eluato total

En aun otra realizacion particularmente adecuada para la fabricacion a gran escala de composiciones de inmunoglobulinas, las porciones delantera y trasera del eluato se definen como un porcentaje del contenido en protema total del eluato (por ejemplo, en volumen o protema total). Al predeterminar el porcentaje del eluato que va a recogerse en la porcion delantera, el rendimiento de recuperacion de inmunoglobulina puede controlarse estrechamente. Este metodo para definir las porciones delantera y trasera del eluato es particularmente util para procedimientos de fabricacion que requieren un rendimiento de etapas mmimo y para procedimientos en los que se toma una decision basandose en sopesar el coste de rendimientos de inmunoglobulina reducidos con el beneficio de producir una composicion que tiene un contenido en actividad anticomplemento (AAC) reducido. De esta manera, puede recuperarse de manera reproducible aproximadamente el mismo rendimiento de inmunoglobulinas de una preparacion a la siguiente, independientemente de pequenas variaciones entre las series de fabricacion. Tal como se demuestra en el ejemplo 8, la aplicacion de este esquema de recogida puede dar como resultado una recuperacion de alto rendimiento de una composicion de inmunoglobulinas IgG con un contenido en actividad anticomplemento significativamente reducido.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad anticomplemento (es dedr, contaminantes que tienen actividad anticomplemento) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y AAC; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas del 80% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 75% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 75% y el 80% del eluato

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total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79% o el 80% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es dedr, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 70% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y 65% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 65% y el 70% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 60%, el 61%, el 62%, el 63%, el 64%, el 65%, el 66%, el 67%, el 68%, el 69% o el 70% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 60% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 60% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 55% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 55% y el 60% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 50%, el 51%, el 52%, el 53%, el 54%, el 55%, el 56%, el 57%, el 58%, el 59% o el 60% del eluato total. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de la actividad anticomplemento (AAC) con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas del 80% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 75% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 75% y el 80% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79% o el 80% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 70% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y 65% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 65% y el 70% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 60%, el 61%, el 62%, el 63%, el 64%, el 65%, el 66%, el 67%, el 68%, el 69% o el 70% del eluato total. En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 60% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 60% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 55% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 55% y el 60% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 50%, el 51%, el 52%, el 53%, el 54%, el 55%, el 56%, el 57%, el 58%, el 59% o el 60% del eluato total. En una realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

d. Volumen del eluato total

En otra realizacion particularmente adecuada para la fabricacion a gran escala de composiciones de inmunoglobulinas, las porciones delantera y trasera del eluato se definen como volumenes del pico del eluato en relacion con el tamano de la columna de intercambio cationico (por ejemplo, mediante un numero establecido de volumenes de columna). Al predeterminar un volumen de eluato que va a recogerse en la porcion delantera, el rendimiento de recuperacion de inmunoglobulina puede controlarse estrechamente y reproducirse. Este metodo para definir las porciones delantera y trasera del eluato es particularmente util para procedimientos de fabricacion que requieren un rendimiento de etapas mmimo y para procedimientos en los que se toma una decision basandose en sopesar el coste de rendimientos de inmunoglobulina reducidos con el beneficio de producir una composicion que

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tiene un contenido en actividad anticomplemento (AAC) reducido. De esta manera, puede recuperarse de manera reproducible aproximadamente el mismo rendimiento de inmunoglobulinas de una preparacion a la siguiente, independientemente de pequenas variaciones entre las series de fabricacion. Tal como se demuestra en los ejemplos 11 a 13, la aplicacion de este esquema de recogida puede dar como resultado una recuperacion de alto rendimiento de una composicion de inmunoglobulinas IgG con contenido en actividad anticomplemento reducido.

En una realizacion, el comienzo de la porcion delantera esta definido por una absorbancia de referencia. En algunas realizaciones, la recogida de la porcion delantera comienza una vez que la absorbancia del pico del eluato atraviesa un primer umbral. En una realizacion, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 0,5 UA. En una realizacion espedfica, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 1,0 UA. En otra realizacion espedfica, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 1,5 UA. En otra realizacion espedfica, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 2,0 UA. En aun otras realizaciones espedficas, la recogida de la porcion delantera comienza cuando la DO280 del eluato alcanza al menos 0,1 UA, 0,2 UA, 0,3 UA, 0,4 UA, 0,5 UA, 0,6 UA, 0,7 UA, 0,8 UA, 0,9 UA, 1,0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA,

1.6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas.

En algunas realizaciones, una vez se inicia la recogida de la porcion delantera, se recoge un numero predeterminado de volumenes de columna antes de cambiar a la recogida (o eliminacion) de la porcion trasera del eluato. En una realizacion, no se recogen mas de 5 volumenes de columna (VC) de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 4 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 3 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 2,7 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 2,5 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recogen mas de 2 VC de eluato en la porcion delantera. En otra realizacion, no se recoge mas de 1 VC de eluato en la porcion delantera. En aun otras realizaciones, no se recogen mas de 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC,

0,8 VC, 0,9 VC, 1,0 VC, 1,1 VC, 1,2 VC, 1,3 VC, 1,4 VC, 1,5 VC, 1,6 VC, 1,7 VC, 1,8 VC, 1,9 VC, 2,0 VC, 2,1 VC,

2.2 VC, 2,3 VC, 2,4 VC, 2,5 VC, 2,6 VC, 2,7 VC, 2,8 VC, 2,9 VC, 3,0 VC, 3,1 VC, 3,2 VC, 3,3 VC, 3,4 VC, 3,5 VC,

3.6 VC, 3,7 VC, 3,8 VC, 3,9 VC, 4,0 VC, 4,1 VC, 4,2 VC, 4,3 VC, 4,4 VC, 4,5 VC, 4,6 VC, 4,7 VC, 4,8 VC, 4,9 VC,

5.0 VC, 5,1 VC, 5,2 VC, 5,3 VC, 5,4 VC, 5,5 VC, 5,6 VC, 5,7 VC, 5,8 VC, 5,9 VC, 6,0 VC, o mas volumenes de columna de eluato en la porcion delantera.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad amidolftica en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) unir inmunoglobulinas IgG y actividad anticomplemento (es decir, contaminantes que tienen actividad anticomplemento) en una resina de intercambio cationico; (b) lavar opcionalmente la resina de intercambio cationico que tiene protemas unidas a la misma con un tampon de lavado para retirar contaminantes ligeramente asociados; (c) realizar una elucion de una sola etapa de las inmunoglobulinas IgG y AAC; y (d) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas de 4 volumenes de columna (VC) del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,0 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre

2.0 VC y 3,0 Vc del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y

3,5 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y 4,0 VC del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,5 VC del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es de 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC, 0,8 VC, 0,9 VC,

1.0 VC, 1,1 VC, 1,2 VC, 1,3 VC, 1,4 VC, 1,5 VC, 1,6 VC, 1,7 VC, 1,8 VC, 1,9 VC, 2,0 VC, 2,1 VC, 2,2 VC, 2,3 VC,

2.4 VC, 2,5 VC, 2,6 VC, 2,7 VC, 2,8 VC, 2,9 VC, 3,0 VC, 3,1 VC, 3,2 VC, 3,3 VC, 3,4 VC, 3,5 VC, 3,6 VC, 3,7 VC,

3,8 VC, 3,9 VC, 4,0 VC, 4,1 VC, 4,2 VC, 4,3 VC, 4,4 VC, 4,5 VC, 4,6 VC, 4,7 VC, 4,8 VC, 4,9 VC, 5,0 VC, 5,1 VC,

5.2 VC, 5,3 VC, 5,4 VC, 5,5 VC, 5,6 VC, 5,7 VC, 5,8 VC, 5,9 VC o 6,0 VC del eluato total. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

En una realizacion espedfica, la divulgacion proporciona un metodo para reducir la cantidad de actividad anticomplemento (AAC) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y una primera cantidad de AAC con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas y al menos una fraccion de la primera cantidad de AAC a la resina de intercambio cationico; (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato; y (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas de 4 volumenes de columna (VC) del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,0 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre

2.0 VC y 3,0 Vc del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y

3.5 VC del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,0 VC y 4,0 VC del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre 2,5 VC y 3,5 VC del eluato

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total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es de 0,5 VC, 0,6 VC, 0,7 VC, 0,8 VC, 0,9 VC,

1,0 VC, 1,1 VC, 1,2 VC, 1,3 VC, 1,4 VC, 1,5 VC, 1,6 VC, 1,7 VC, 1,8 VC, 1,9 VC, 2,0 VC, 2,1 VC, 2,2 VC, 2,3 VC,

2,4 VC, 2,5 VC, 2,6 VC, 2,7 VC, 2,8 VC, 2,9 VC, 3,0 VC, 3,1 VC, 3,2 VC, 3,3 VC, 3,4 VC, 3,5 VC, 3,6 VC, 3,7 VC,

3,8 VC, 3,9 VC, 4,0 VC, 4,1 VC, 4,2 VC, 4,3 VC, 4,4 VC, 4,5 VC, 4,6 VC, 4,7 VC, 4,8 VC, 4,9 VC, 5,0 VC, 5,1 VC,

5,2 VC, 5,3 VC, 5,4 VC, 5,5 VC, 5,6 VC, 5,7 VC, 5,8 VC, 5,9 VC o 6,0 VC del eluato total. En una realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7,

5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos

20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos

22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos

25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

V. Preparacion de plasma pobre en crioprecipitado

El material de partida usado para la preparacion de composiciones de IgG concentradas generalmente consiste en o bien plasma recuperado (es decir, plasma que se ha separado de sangre completa ex vivo) o plasma original (es decir, plasma recogido mediante plasmaferesis). El procedimiento de purificacion normalmente empieza con la descongelacion de plasma combinado previamente congelado, que ya se ha sometido a ensayo para determinar consideraciones de seguridad y calidad. La descongelacion normalmente se lleva a cabo a una temperatura no mayor de 6°C, preferiblemente entre -1°C y 6°C. Tras la descongelacion completa del plasma congelado a baja temperatura, se realiza centrifugacion en fno (por ejemplo, < 6°C, preferiblemente 2,5 + 3,5°C) para separar crioprecipitados solidos del sobrenadante lfquido. Alternativamente, puede realizarse la etapa de separacion mediante filtracion en vez de centrifugacion. Entonces el sobrenadante lfquido (tambien denominado “plasma pobre en crioprecipitado”, tras la retirada de protemas insolubles en fno mediante centrifugacion de plasma recien descongelado) se procesa en la siguiente etapa. Pueden adoptarse diversas etapas adicionales en este momento para el aislamiento de la actividad de correccion del inhibidor de factor VIII (FElBA), el complejo del factor IX, el concentrado del factor VII o el complejo de antitrombina III. Por ejemplo, pueden adsorberse uno o mas factores sangumeos del plasma pobre en crioprecipitado antes de enriquecer adicionalmente la disolucion que contiene inmunoglobulina.

VI. Fraccionamiento de plasma pobre en crioprecipitado

Con el fin de preparar una composicion de inmunoglobulinas IgG, se fracciona comunmente plasma pobre en crioprecipitado para separar las inmunoglobulinas deseadas de otras protemas e impurezas presentes. Se conocen muchos metodos para el fraccionamiento de plasma en la tecnica, incluyendo fraccionamiento con alcohol (por ejemplo, etanol), precipitacion con polfmero (por ejemplo, PEG), precipitacion con acido graso y ester (por ejemplo, caprilato), cromatograffa, y similares. Los ejemplos de estos procedimientos de fraccionamiento incluyen, sin limitacion, fraccionamientos de Cohn (J. Am. Chem. Soc., 1946, 68(3): 459-475; J. Am. Chem. Soc. 72:465-474 (1950)), fraccionamientos de Oncley (J. Am. Chem. Soc., 1949, 71(2): 541-550), purificaciones de Deutsch (J. BioI. Chem. 164:109-118), purificaciones de Hoppe (Munch Med Wochenschr 1967 (34): 1749-1752), purificaciones de Falksveden (patente sueca n.° 348942), purificaciones de Falksveden y Lundblad (Methods of Plasma Protein Fractionation 1980), purificaciones de Lebing (Vox Sang 2003 (84):193-201), purificaciones de Tanaka (Braz J Med Biol Res 2000 (33)37-30)), purificaciones de Teschner (Vox Sang, 2007 (92):42-55), fraccionamientos de Nitschmann (Helv. Chim. Acta 37:866-873), fraccionamientos de Kistler/Nitschmann (Vox Sang. 7:414-424 (1962)), purificaciones de Barundern (Vox Sang. 7:157-74 (1962)), purificaciones de Koblet (Vox Sang. 13:93-102 (1967)) un procedimiento de purificacion divulgado en las patentes estadounidenses n.os 5.122.373 o 5.177.194, procedimientos modificados de los mismos, y procedimientos de purificacion similares o equivalentes conocidos en la tecnica.

Generalmente, los metodos proporcionados en el presente documento son compatibles con cualquiera de los esquemas de purificacion senalados anteriormente. Como tal, en una realizacion, se fracciona parcial o completamente plasma pobre en crioprecipitado segun uno cualquiera de los esquemas de purificacion mencionados anteriormente. En una realizacion espedfica, se fracciona parcialmente plasma pobre en crioprecipitado segun una o mas etapas de fraccionamiento divulgadas en las ensenanzas descritas anteriormente, para producir una composicion intermedia de fraccionamiento. En una realizacion mas espedfica, se fracciona plasma pobre en crioprecipitado para producir un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion II, un precipitado de la fraccion I+II+III, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler- Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann, o un precipitado modificado de los mismos.

En una realizacion preferida, se fracciona plasma pobre en crioprecipitado mediante una o mas etapas de precipitacion con etanol. Pueden emplearse etapas de precipitacion con etanol para o bien precipitar las inmunoglobulinas deseadas de la disolucion, mientras se retiene al menos una protema distinta de inmunoglobulina en el sobrenadante, o bien precipitar al menos una protema distinta de inmunoglobulina de la disolucion, mientras se retiene la inmunoglobulina deseada en el sobrenadante. Los metodos para el fraccionamiento de inmunoglobulinas

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de esta manera se conocen bien en la tecnica. Los precipitados con etanol a modo de ejemplo incluyen, sin limitacion, un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion I+N+NI, un precipitado de la fraccion II+IN, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler-Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann y precipitados modificados de los mismos. En una realizacion particularmente preferida, las inmunoglobulinas presentes en el plasma pobre en crioprecipitado se enriquecen mediante un procedimiento con etanol de cuatro etapas, que comprende una etapa de precipitacion de la fraccion I+N+NI, una etapa de precipitacion de A, una etapa de precipitacion de B, y una etapa de precipitacion de la fraccion II, tal como se describe a continuacion.

VII. Esquemas de fraccionamiento a modo de ejemplo

Aunque el experto en la tecnica apreciara que pueden usarse muchos materiales de partida diferentes (por ejemplo, diferentes fracciones de plasma) para realizar los metodos proporcionados en el presente documento para reducir la actividad amidolftica (por ejemplo, contenido en factor XI y/o factor XIa) y/o actividad anticomplemento (AAC), se proporciona un esquema de fraccionamiento a modo de ejemplo a continuacion. El esquema de fraccionamiento a modo de ejemplo emplea cuatro reacciones de precipitacion con etanol para preparar una precipitacion de la fraccion II que puede resuspenderse y posteriormente usarse como material de partida para los metodos proporcionados en el presente documento. La composicion de inmunoglobulinas IgG enriquecida resultante puede enriquecerse adicionalmente mediante procesamiento posterior usando tecnicas tales como cromatograffa de intercambio anionico, ultra/diafiltracion, etapas de inactivacion y/o retirada de virus, y otras etapas de enriquecimiento bien conocidas en la tecnica.

Por consiguiente, en una realizacion, la presente invencion proporciona un metodo para fabricar una composicion de inmunoglobulinas IgG, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) proporcionar una fraccion de plasma pobre en crioprecipitado; (b) precipitar inmunoglobulinas de la fraccion de plasma pobre en crioprecipitado en una primera reaccion de precipitacion mezclando etanol con la fraccion de plasma pobre en crioprecipitado a una concentracion final de entre el 17% y el 23% (v/v) a un pH de entre 6,5 y 7,3 y una temperatura de entre -8°C y -2°C, formando asf un primer precipitado y un primer sobrenadante; (c) resuspender inmunoglobulinas presentes en el primer precipitado, formando asf una primera suspension; (d) precipitar inmunoglobulinas de la primera suspension en una segunda reaccion de precipitacion mezclando etanol con la fraccion de plasma pobre en crioprecipitado a una concentracion final de entre el 17% y el 23% (v/v) a un pH de entre 6,8 y 7,6 y una temperatura de entre -8°C y -2°C, formando asf un segundo precipitado y un segundo sobrenadante; (e) resuspender inmunoglobulinas presentes en el segundo precipitado, formando asf una segunda suspension; (f) precipitar inmunoglobulinas de la segunda suspension en una tercera reaccion de precipitacion mezclando etanol con la fraccion de plasma pobre en crioprecipitado a una concentracion final de entre el 14% y el 20% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 5,8 y una temperatura de entre -8°C y -2°C, formando asf un tercer precipitado y un tercer sobrenadante; (g) precipitar inmunoglobulinas del tercer sobrenadante en una cuarta reaccion de precipitacion mezclando etanol con la fraccion de plasma pobre en crioprecipitado a una concentracion final de entre el 22% y el 28% (v/v) a un pH de entre 6,7 y 7,5 y una temperatura de entre -8°C y -2°C, formando asf un cuarto precipitado y un cuarto sobrenadante; (h) resuspender el cuarto precipitado para formar una tercera suspension; (i) poner en contacto la tercera suspension con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas IgG y al menos uno de: (i) una fraccion del FXI y/o FXIa, y (ii) una primera cantidad de la actividad anticomplemento (AAC), a la resina de intercambio cationico; (j) eluir las inmunoglobulinas IgG de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato que comprende una porcion delantera y una porcion trasera; y (k) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato. En una realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de disolucion es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH de la primera condicion de

disolucion es 5,2. En aun otras realizaciones, el pH de la primera condicion de disolucion es 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2,

5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0. En otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una

conductividad de al menos 22 mS/cm. En aun otra realizacion espedfica, el tampon de elucion comprende una

conductividad de al menos 25 mS/cm. En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. En una realizacion espedfica, la resina de intercambio cationico debil es una resina de carboximetilo (CM).

A. Esquema de fraccionamiento anterior I

En un primer esquema de purificacion anterior a modo de ejemplo, se somete plasma que contiene inmunoglobulina IgG a fraccionamiento con alcohol (por ejemplo, fraccionamiento con etanol) tal como se describe a continuacion. En una realizacion, este primer esquema de fraccionamiento anterior incluye una etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III, una etapa de precipitacion de la fraccion A y una etapa de precipitacion de la fraccion B antes de la etapa de precipitacion de la fraccion II que finalmente proporciona el material de partida para los metodos cromatograficos de intercambio cationico proporcionados en el presente documento para la reduccion de la actividad amidolftica (por ejemplo, factor XI/XIa) y/o actividad anticomplemento (AAC).

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Se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de condiciones de precipitacion (por ejemplo, concentracion de etanol, pH, temperatura, tecnica de separacion) para cada una de las etapas de precipitacion de la fraccion I+M+IM, fraccion A, fraccion B y fraccion II tal como se describe a continuacion. Ademas, se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de las condiciones de precipitacion espedficas con todos los posibles esquemas para definir y recoger la porcion delantera del eluato, tal como se describe a continuacion.

1. Precipitacion de la fraccion I+II+III

En una realizacion, se forma una precipitacion de la fraccion I+II+III anadiendo etanol a plasma pobre en crioprecipitado a una concentracion final de entre el 17% y el 23% (v/v) a un pH de entre 6,5 y 7,3. La mezcla se incuba entonces mientras se agita a entre -8°C y -2°C. El precipitado de la fraccion I+II+III resultante puede separarse del sobrenadante de la fraccion I+II+III mediante centrifugacion o filtracion de la mezcla, que se realiza generalmente en fno. La mayor parte del contenido en inmunoglobulina esta presente en el precipitado de la fraccion I+II+III, que puede resuspenderse y enriquecerse adicionalmente.

En una realizacion espedfica, la concentracion final de etanol en la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es del 20 + 3% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 20 + 2% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 20 + 1% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 20% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22% o el 23% (v/v).

En una realizacion espedfica, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de 6,9 + 0,4. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de 6,9 + 0,3. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de 6,9 + 0,2. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de 6,9 + 0,1. En aun otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es

6,9. En aun otras realizaciones, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2 o 7,3.

En una realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de -5 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de -5 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de -5 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de - 5°C. En aun otras realizaciones, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I+II+III es de - 8°C, -7°C, -6°C, -5°C, -4°C, -3°C o -2°C.

En una realizacion espedfica, el plasma pobre en crioprecipitado se ajusta a un pH de 6,9 + 0,2 y se calcula que la concentracion de alcohol es del 20% (v/v) mediante la adicion de un tampon de resuspension que contiene acetato de sodio trihidratado, acido acetico glacial, y agua para inyeccion (pH 4,0) y alcohol etflico desnaturalizado (formula SDA-3A). El tampon se anade con la cantidad requerida de alcohol con mezclado minucioso. El alcohol se enfna hasta una temperatura de -15°C o mas fna antes de la adicion a plasma pobre en crioprecipitado. El tampon y el alcohol se anaden al plasma mientras que el tanque de suspension se enfna hasta una temperatura de -5 + 2°C. Tras completarse la adicion, se comprueba el pH de la disolucion y se ajusta a 6,9 +0,2 si se requiere con disolucion de bicarbonato de sodio o tampon de pH 4,0. Entonces se centrifuga la suspension de la fraccion I+II+III para separar el precipitado del sobrenadante.

2. Precipitacion de la fraccion A

Para enriquecer adicionalmente el contenido y la pureza de IgG, en una realizacion, se resuspende un precipitado de la fraccion I+II+III y se realiza una segunda etapa de precipitacion (precipitacion de la fraccion A). Se realiza precipitacion de la fraccion A anadiendo etanol a la suspension de la fraccion I+II+III hasta una concentracion final de entre el 17% y el 23% (v/v) a un pH de entre 6,8 y 7,6. La mezcla se incuba entonces mientras se agita a de entre -8°C y -2°C. El precipitado de la fraccion A resultante puede separarse del sobrenadante de la fraccion A mediante centrifugacion o filtracion de la mezcla, que se realiza generalmente en fno. La mayor parte del contenido en inmunoglobulina esta presente en el precipitado de la fraccion A, que puede resuspenderse y enriquecerse adicionalmente.

En una realizacion espedfica, la concentracion final de etanol en la etapa de precipitacion de la fraccion A es del 20 + 3% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 20 + 2% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 20 + 1% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 20% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22% o el 23% (v/v).

En una realizacion espedfica, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion A es 7,2 + 0,4. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion A es 7,2 + 0,3. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion A es 7,2 + 0,2. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion A es 7,2 + 0,1. En

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aun otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion A es 7,2. En aun otras realizaciones, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion A es 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5 o 7,6.

En una realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5°C. En aun otras realizaciones, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -8°C, -7°C, -6°C, -5°C, - 4°C, -3°C o -2°C.

En una realizacion espedfica, el precipitado de la fraccion I+II+IN se suspende en tampon de resuspension fno que contiene acetato de sodio trihidratado, acido acetico glacial y agua para inyeccion (pH 4,0) y se mezcla. La suspension se diluye con WFI para lograr una concentracion de protema calculada del 1,0 + 0,3% (p/v). Se continua la agitacion hasta que la suspension es homogenea. La disolucion se ajusta a un pH de 7,2 + 0,2 con tampon (pH 4,0) o con fosfato de disodio 0,25 M y se lleva hasta una concentracion de alcohol calculada del 20% (v/v). El alcohol se enfna hasta una temperatura de -15°C o mas fna antes de la adicion a la disolucion. El alcohol fno se anade mientras que se enfna el tanque hasta -5 + 2°C. Tras completarse la adicion, se comprueba el pH de la suspension y se ajusta a 7,2 + 0,2 si se requiere. Entonces se filtra el precipitado formado (denominado precipitado de la fraccion A) para separar el precipitado del sobrenadante.

3. Precipitacion de la fraccion B

Para enriquecer adicionalmente el contenido y la pureza de IgG, en una realizacion, se resuspende un precipitado de la fraccion A y se realiza una tercera etapa de precipitacion (precipitacion de la fraccion B). Se realiza la precipitacion de la fraccion B anadiendo etanol a la suspension de la fraccion A hasta una concentracion final de entre el 14% y el 20% (v/v) a un pH de entre 5,0 y 5,8. La mezcla se incuba entonces mientras se agita a de entre -8°C y -2°C. El precipitado de la fraccion B resultante puede separarse del sobrenadante de la fraccion B mediante centrifugacion o filtracion de la mezcla, que se realiza generalmente en fno. La mayor parte del contenido en inmunoglobulina esta presente en el sobrenadante de la fraccion B, que puede recuperarse y enriquecerse adicionalmente.

En una realizacion espedfica, la concentracion final de etanol en la etapa de precipitacion de la fraccion B es del 17 + 3% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 17 + 2% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 17 + 1% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 17% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19% o el 20% (v/v).

En una realizacion espedfica, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion B es de 5,4 + 0,4. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion B es de 5,4 + 0,3. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion B es de 5,4 + 0,2. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion B es de 5,4 + 0,1. En aun otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion B es 5,4. En aun otras realizaciones, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion B es 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7 o 5,8.

En una realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -5°C. En aun otras realizaciones, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion A es de -8°C, -7°C, -6°C, -5°C, -4°C, -3°C o -2°C.

En una realizacion espedfica, se suspende un precipitado de la fraccion A en agua fna para inyeccion (WFI) y se agita durante al menos una hora. Cuando el precipitado se suspende minuciosamente, se anade un tampon que contiene acetato de sodio. La agitacion continua hasta que la suspension es homogenea. El pH se ajusta a 5,4 + 0,2 con tampon pH 4,0 (acetato de sodio trihidratado 109 g/l, acido acetico glacial 240 g/l y WFI) o fosfato de disodio 0,25 M. La suspension se diluye con WFI fna calculada para lograr una concentracion de protema del 1,2 + 0,3% (p/v). La agitacion continua hasta que la suspension es homogenea. El contenido en alcohol se lleva hasta una concentracion calculada para que sea del 17% (v/v) anadiendo alcohol enfriado bruscamente de manera previa hasta -15°C o menos. El alcohol fno se anade mientras que se enfna el tanque hasta -5 + 2°C. Si es necesario, se reajusta el pH hasta 5,4 + 0,2 con tampon de pH 4,0 o fosfato de disodio 0,25 M. El precipitado formado, el precipitado de la fraccion B, se separa mediante filtracion usando un filtro de profundidad. El filtrado de la fraccion B (es decir, sobrenadante) se recupera para enriquecimiento adicional.

B. Esquema de fraccionamiento anterior II

En un segundo esquema de purificacion anterior a modo de ejemplo, se somete plasma que contiene inmunoglobulina IgG a fraccionamiento con alcohol (por ejemplo, fraccionamiento con etanol) tal como se describe a

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continuacion. En una realizacion, este primer esquema de fraccionamiento anterior incluye una etapa de precipitacion de la fraccion I y una etapa de precipitacion de la fraccion M+MI antes de la etapa de precipitacion de la fraccion II que finalmente proporciona el material de partida para los metodos cromatograficos de intercambio cationico proporcionados en el presente documento para la reduccion de la actividad amidolftica (por ejemplo, factor XI/XIa) y/o actividad anticomplemento (AAC).

Se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de condiciones de precipitacion (por ejemplo, concentracion de etanol, pH, temperatura, tecnica de separacion) para cada una de las etapas de precipitacion de la fraccion I, fraccion II+III y fraccion II tal como se describe a continuacion. Ademas, se contemplan metodos que contienen todas las combinaciones de las condiciones de precipitacion espedficas con todos los posibles esquemas para definir y recoger la porcion delantera del eluato, tal como se describe a continuacion.

1. Precipitacion de la fraccion I

En una realizacion, se forma una precipitacion de la fraccion I anadiendo etanol a plasma pobre en crioprecipitado a una concentracion final de desde el 6% hasta el 10% (v/v) a un pH desde 6,7 hasta 7,3. La mezcla se incuba entonces mientras se agita a de desde -4°C hasta 2°C. El precipitado de la fraccion I resultante puede separarse del sobrenadante de la fraccion I mediante centrifugacion o filtracion de la mezcla, que se realiza generalmente en fno. La mayor parte del contenido en inmunoglobulina esta presente en el sobrenadante de la fraccion I, que puede recuperarse y enriquecerse adicionalmente.

En una realizacion espedfica, la concentracion final de etanol en la etapa de precipitacion de la fraccion I es del 8 + 2% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 8 + 1% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 8% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 6%, el 7%, el 8%, el 9% o el 10% (v/v).

En una realizacion espedfica, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de 7,0 + 0,4. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de 7,0 + 0,3. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I es 7,0 + 0,2. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de

7,0 + 0,1. En aun otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I es 7,0. En aun otras realizaciones, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion I es 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2 o 7,3.

En una realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de -1 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de -1 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de -1 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de -1°C. En aun otras realizaciones, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion I es de -4°C, -3°C, -2°C, -1°C, 0°C, 1°C o 2°C.

En una realizacion espedfica, el plasma pobre en crioprecipitado se ajusta a un pH de 7,0 + 0,1 y una concentracion de alcohol que se calcula que es del 8% (v/v). Las disoluciones usadas para ajustar el pH y las concentraciones de alcohol se anaden con mezclado minucioso. La temperatura de la reaccion de precipitacion se reduce y se mantiene a -1 + 1°C. Entonces la suspension de la fraccion I resultante se centrifuga o filtra para separar el precipitado del sobrenadante.

2. Precipitacion de la fraccion II+III

Para enriquecer adicionalmente el contenido y la pureza de IgG, en una realizacion, se usa un sobrenadante de la fraccion I como material para una segunda etapa de precipitacion (precipitacion de la fraccion II+III). Se realiza precipitacion de la fraccion II+III anadiendo etanol al sobrenadante de la fraccion I hasta una concentracion final de desde el 22% hasta el 28% (v/v) a un pH de entre 6,7 y 7,3. La mezcla se incuba entonces mientras se agita a entre -10°C y -4°C. El precipitado de la fraccion II+III resultante puede separarse del sobrenadante de la fraccion II+III mediante centrifugacion o filtracion de la mezcla, que se realiza generalmente en fno. La mayor parte del contenido en inmunoglobulina esta presente en el precipitado de la fraccion II+III, que puede resuspenderse y enriquecerse adicionalmente.

En una realizacion espedfica, la concentracion final de etanol en la etapa de precipitacion de la fraccion II+III es del 25 + 3% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 25 + 2% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 25 + 1% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 25% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 22%, el 23%, el 24%, el 25%, el 26%, el 27% o el 28% (v/v).

En una realizacion espedfica, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II+III es de 7,0 + 0,4. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II+III es de 7,0 + 0,3. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II+III es de 7,0 + 0,2. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II+III es de 7,0 + 0,1. En aun otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II+III es 7,0.

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En aun otras realizaciones, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion M+IM es 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3 o 7,4.

En una realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion 11+111 es de -7 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion 11+111 es de -7 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II+NI es de -7 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion 11+111 es de -7°C. En aun otras realizaciones, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II+NI es de -10°C, -9°C, -8°C, -7°C, -6°C, -5°C o -4°C.

En una realizacion espedfica, el sobrenadante de la fraccion I se ajusta a un pH de 7,0 + 0,1 y se calcula que la concentracion de alcohol es del 25% (v/v). Las disoluciones usadas para ajustar el pH y las concentraciones de alcohol se anaden con mezclado minucioso. La temperatura de la reaccion de precipitacion se reduce y se mantiene a -6 + 2°C. Entonces se centrifuga o se filtra la suspension de la fraccion II+III resultante para separar el precipitado del sobrenadante.

C. Precipitacion de la fraccion II

Para enriquecer adicionalmente el contenido y la pureza de IgG, en una realizacion, se realiza una cuarta (tras el esquema de fraccionamiento anterior I) o tercera (tras el esquema de fraccionamiento anterior II) etapa de precipitacion con alcohol (precipitacion de la fraccion II). Se realiza la precipitacion de la fraccion II ajustando el pH de una suspension del filtrado de la fraccion B o precipitado de la fraccion II+III hasta entre 6,7 y 7,5 y anadiendo etanol hasta una concentracion final de entre el 22% y el 28% (v/v). La mezcla se incuba entonces mientras se agita a entre -13°C hasta -2°C. El precipitado de la fraccion II resultante puede separarse del sobrenadante de la fraccion B mediante centrifugacion o filtracion de la mezcla, que se realiza generalmente en frio. La mayor parte del contenido en inmunoglobulina esta presente en el precipitado de la fraccion II, que puede resuspenderse y enriquecerse adicionalmente.

En una realizacion espedfica, la concentracion final de etanol en la etapa de precipitacion de la fraccion II es de 25 + 3% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 25 + 2% (v/v). En otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 25 + 1% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 25% (v/v). En aun otra realizacion, la concentracion final de etanol es del 22%, el 23%, el 24%, el 25%, el 26%, el 27% o el 28% (v/v).

En una realizacion espedfica, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II es 7,1 + 0,4. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II es 7,1 + 0,3. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II es 7,1 + 0,2. En otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II es 7,1 + 0,1. En aun otra realizacion, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II es 7,1. En aun otras realizaciones, el pH de la etapa de precipitacion de la fraccion II es 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4 o 7,5.

En una realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -5 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -5 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -5 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -5°C. En otra realizacion espedfica, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -10 + 3°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -10 + 2°C. En otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -10 + 1°C. En aun otra realizacion, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -10°C. En aun otras realizaciones, la temperatura de la etapa de precipitacion de la fraccion II es de -13, -12, -11, -10, -9, -8°C, - 7°C, -6°C, -5°C, -4°C, -3°C o -2°C.

En una realizacion espedfica, se ajusta el pH del filtrado de la fraccion B hasta 7,1 + 0,2 usando disolucion de bicarbonato de sodio 1,0 M. Se anade alcohol adicional con mezclado hasta llevar la concentracion calculada hasta el 25% (v/v). Se comprueba el pH y se reajusta, si es necesario, hasta 7,3 + 0,2 usando bicarbonato de sodio 1 M o tampon pH 4,0. Se agita la suspension durante al menos dos horas a una temperatura de -5 + 2°C tras finalizar la adicion de alcohol. Tras finalizar la agitacion, se reajusta el pH hasta 7,3 + 0,2, si se requiere. Se centrifuga la suspension y se separa el precipitado, el precipitado de la fraccion II.

D. Cromatografia de intercambio cationico

Para enriquecer adicionalmente la composicion de inmunoglobulinas, en una realizacion, puede resuspenderse un precipitado de la fraccion II en agua o un tampon de baja fuerza ionica y someterse a cromatograffa de intercambio cationico. En una realizacion, el precipitado de la fraccion II se resuspende en agua o tampon de baja fuerza ionica a un pH por debajo de 6,0. Normalmente, el pH del precipitado de la fraccion II resuspendido es 5,2 + 0,2 y la conductividad de la suspension es baja, normalmente no mas de 1 mS/cm. Entonces se filtra la suspension de la fraccion II para retirar material no solubilizado antes de cargarlo en una resina de intercambio cationico, equilibrada a

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un pH por debajo de 6,0. Tras cargar las inmunoglobulinas en la resina de intercambio cationico (por ejemplo, una columna de intercambio cationico), puede lavarse la resina con un tampon de lavado que tiene un pH por debajo de 6,0. Para eluir las inmunoglobulinas, la resina de intercambio cationico se pone entonces en contacto con un tampon de elucion que tiene una conductividad de al menos 15 mS/cm (por ejemplo, con una concentracion de sal de al menos NaCl 15 mM o una sal equivalente de la misma) y pH superior a 7,0. En una realizacion espedfica, el precipitado de la fraccion II suspendido se somete a tratamiento con disolvente y detergente (D/D) antes de realizar cromatograffa de intercambio cationico. Aunque se usa un precipitado de la fraccion II resuspendido del esquema de fraccionamiento a modo de ejemplo presentado en el presente documento como el material de partida para los metodos de intercambio cationico proporcionados en el presente documento, se apreciara que cualquier composicion (es decir, fraccion) de inmunoglobulinas derivada de plasma que contenga inmunoglobulinas IgG y actividad amidolftica (por ejemplo, FXI y/o FXIa) y/o actividad anticomplemento (AAC) puede usarse en los metodos proporcionados en el presente documento.

Se ha encontrado que altos niveles de actividad amidolftica (por ejemplo, FXI y/o FXIa) y/o actividad anticomplemento (AAC) se coeluyen con IgG de la resina de intercambio cationico. La incapacidad para separar cantidades significativas de estas impurezas de las inmunoglobulinas deseadas da como resultado una composicion de IgG final con alta actividad amidolftica y/o alta actividad anticomplemento. Dado el riesgo aumentado de acontecimientos tromboembolicos que se ha atribuido a alta actividad amidolftica en preparaciones farmaceuticas de inmunoglobulina, y reacciones adversas que se han asociado con actividad anticomplemento, sigue habiendo una necesidad en el campo para la retirada de impurezas que contribuyen a la actividad amidolftica (por ejemplo, FXI/FXIa) y/o actividad anticomplemento (AAC) presente en muchos productos de IgG. Ventajosamente, se ha encontrado que cuando se usa un tampon que tiene un pH por encima de 7,0 para eluir inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico, la actividad amidolftica y la actividad anticomplemento (AAC) eluyen solo en la porcion trasera del eluato. En particular, la elucion de la actividad amidolftica y AAC en la porcion trasera del eluato se corresponde con un cambio en el pH del eluato, desde por debajo de 6,0 hasta por encima de 7,0. Como tal, la porcion delantera del eluato contiene una alta concentracion de inmunoglobulinas y baja concentracion de actividad amidolftica y AAC, mientras que la porcion trasera del eluato tiene una concentracion de inmunoglobulina menor y actividad amidolftica y AAC mayor. Por consiguiente, en realizaciones preferidas de los metodos proporcionados en el presente documento, la porcion delantera del eluato de intercambio cationico se recoge por separado de la porcion trasera del eluato.

En determinadas realizaciones, la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil. Las resinas de intercambio cationico debiles a modo de ejemplo incluyen aquellas con un ligando de acido carboxflico, por ejemplo, resinas de carboximetilo (CM). En una realizacion preferida, la resina de intercambio cationico usada en los metodos proporcionados en el presente documento es una resina de carboximetilo, por ejemplo, CM-Sefarosa.

En una realizacion, se resuspende el precipitado de la fraccion II con agua fna o un tampon de baja fuerza ionica a un pH de entre 4,8 y 5,6. En una realizacion espedfica, el pH del agua o tampon usados para la resuspension es de 5,2 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH del agua o tampon usados para la resuspension es de 5,2 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del agua o tampon usados para la resuspension es de 5,2 + 0,1. En aun otra realizacion espedfica, el pH del agua o tampon usado para la resuspension es de 5,2. En aun otras realizaciones, el pH del agua o tampon usado para la resuspension es de 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0.

En una realizacion, la resina de intercambio cationico se equilibra previamente hasta un pH de entre 4,6 y 5,6. En una realizacion espedfica, la resina se equilibra previamente hasta un pH de entre 4,6 y 5,5. En otra realizacion espedfica, la resina se equilibra previamente hasta pH 5,0 + 0,4. En otra realizacion espedfica, la resina se equilibra previamente hasta pH 5,0 + 0,3. En otra realizacion espedfica, la resina se equilibra previamente hasta pH 5,0 + 0,2. En otra realizacion espedfica, la resina se equilibra previamente hasta pH 5,0 + 0,1. En otra realizacion espedfica, la resina se equilibra previamente hasta pH 5,0. En aun otras realizaciones, la resina se equilibra previamente hasta pH 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0.

En una realizacion, tras cargar una suspension de la fraccion II clarificada en la resina de intercambio cationico, la resina se lava con un tampon que tiene una conductividad lo suficientemente baja de manera que las inmunoglobulinas no se eluyen de la resina y un pH de entre 5,1 y 5,9. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5 + 0,1. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de lavado es 5,5. En aun otras realizaciones, el pH del tampon de lavado es 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9 o 6,0.

En una realizacion, el pH del tampon de elucion es mayor de 7,5. En otra realizacion, el pH del tampon de elucion es de entre 7,4 y 8,2. En una realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,3. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,2. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8 + 0,1. En otra realizacion espedfica, el pH del tampon de elucion es 7,8. En aun otras realizaciones, el pH del tampon de elucion es 7,0, 7,1, 7,2, 7,36, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4 u 8,5.

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En una realizacion espedfica, la conductividad del tampon de elucion es de al menos 10 mS/cm. En una realizacion preferida, la conductividad del tampon de elucion es de al menos 15 mS/cm. En otra realizacion preferida, la conductividad del tampon de elucion es de al menos 20 mS/cm. En una realizacion espedfica, la conductividad del tampon de elucion es de entre 10 mS/cm y 40 mS/cm. En otra realizacion, la conductividad del tampon de elucion es de entre 15 mS/cm y 30 mS/cm. En otra realizacion, la conductividad del tampon de elucion es de entre 20 mS/cm y

30 mS/cm. En otra realizacion, la conductividad del tampon de elucion es de entre 25 mS/cm y 30 mS/cm. En aun

otras realizaciones, la conductividad del tampon de elucion es de aproximadamente 5 mS/cm, o aproximadamente 6 mS/cm, 7 mS/cm, 8 mS/cm, 9 mS/cm, 10 mS/cm, 11 mS/cm, 12 mS/cm, 13 mS/cm, 14 mS/cm, 15 mS/cm, 16 mS/cm, 17 mS/cm, 18 mS/cm, 19 mS/cm, 20 mS/cm, 21 mS/cm, 22 mS/cm, 23 mS/cm, 24 mS/cm, 25 mS/cm,

26 mS/cm, 27 mS/cm, 28 mS/cm, 29 mS/cm, 30 mS/cm, 31 mS/cm, 32 mS/cm, 33 mS/cm, 34 mS/cm, 35 mS/cm,

36 mS/cm, 37 mS/cm, 38 mS/cm, 39 mS/cm, 40 mS/cm, o mayor.

En una realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 80% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 80% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 70% y el 75% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 75% y el 80% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 70%, el 71%, el 72%, el 73%, el 74%, el 75%, el 76%, el 77%, el 78%, el 79% o el 80% del eluato total.

En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 70% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 70% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 60% y 65% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 65% y el 70% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es del 60%, el 61%, el 62%, el 63%, el 64%, el 65%, el 66%, el 67%, el 68%, el 69% o el 70% del eluato total.

En otra realizacion, la porcion delantera (es decir, la fraccion recogida o combinada de interes) del eluato es de no mas del 60% del eluato total. En una realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 60% del eluato total. En otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 50% y el 55% del eluato total. En aun otra realizacion espedfica, la porcion delantera del eluato es de entre el 55% y el 60% del eluato total. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato es de 50%, el 51%, el 52%, el 53%, el 54%, el 55%, el 56%, el 57%, el 58%, el 59% o el 60% del eluato total.

En otra realizacion, las porciones delantera y trasera del eluato estan definidas por el pH de la disolucion. En una realizacion, la porcion delantera es el eluato que tiene un pH de no mas de 7,0. En otra realizacion, la porcion delantera es el eluato que tiene un pH de no mas de 6,5. En otra realizacion, la porcion delantera es el eluato que tiene un pH de no mas de 6,0. En otra realizacion, la porcion delantera es el eluato que tiene un pH de no mas de 5,5. En otra realizacion, la porcion delantera es el eluato que tiene un pH de no mas de 5,0. En aun otras realizaciones, la porcion delantera es el eluato que tiene un pH de no mas de 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6, 6,5, 6,4, 6,3, 6,2, 6,1, 6,0, 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, o menos.

En una realizacion, la porcion delantera del eluato se define como la fraccion del eluato que eluye de la resina de intercambio cationico antes del momento en el que la DO280 del eluato cae por debajo de 2,0 UA. En otra realizacion, la porcion delantera del eluato se define como la fraccion del eluato que eluye de la resina de intercambio cationico antes del momento en el que la DO280 del eluato cae por debajo de 1,5 UA. En otra realizacion, la porcion delantera del eluato se define como la fraccion del eluato que eluye de la resina de intercambio cationico antes del momento en el que la DO280 del eluato cae por debajo de 1,0 UA. En otra realizacion, la porcion delantera del eluato se define como la fraccion del eluato que eluye de la resina de intercambio cationico antes del momento en el que la DO280 del eluato cae por debajo de 0,5 UA. En aun otras realizaciones, la porcion delantera del eluato se define como la fraccion del eluato que eluye de la resina de intercambio cationico antes del momento en el que la DO280 del eluato cae por debajo de 2,0 UA, 1,9 UA, 1,8 UA, 1,7 UA, 1,6 UA, 1,5 UA, 1,4 UA, 1,3 UA, 1,2 UA, 1,1 UA, 1,0 UA, 0,9 UA, 0,8 Ua, 0,7 UA, 0,6 UA, 0,5 UA, 0,4 UA, 0,3 UA, 0,2 UA, 0,1 UA, o menos. En determinadas realizaciones, la porcion delantera del eluato se define ademas como la porcion del eluato que eluye de la resina de intercambio cationico despues de que la DO280 del eluato se eleva por encima de un umbral, por ejemplo, 0,1 UA, 0,2 UA, 0,3 UA, 0,4 UA, 0,5 UA, 0,6 UA, 0,7 UA, 0,8 UA, 0,9 UA, 1,0 UA, 1,1 UA, 1,2 UA, 1,3 UA, 1,4 UA, 1,5 UA, 1,6 UA, 1,7 UA, 1,8 UA, 1,9 UA, 2,0 UA, o mas.

E. Ultrafiltracion/Diafiltracion (UF/DF)

Las composiciones de IgG pueden concentrarse adicionalmente mediante ultrafiltracion/diafiltracion. En una realizacion, la composicion de IgG puede concentrarse mediante ultrafiltracion hasta una concentracion de protema de entre el 2% y el 10% (p/v). En determinadas realizaciones, la ultrafiltracion se lleva a cabo en un casete con una pantalla de canal abierto y la membrana de ultrafiltracion tiene un punto de corte de peso molecular nominal

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(NMWCO) de no mas de 100 kDa o no mas de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, o menos kDa. En una realizacion preferida, la membrana de ultrafiltracion tiene un NMWCO de no mas de 50 kDa.

Tal como se describe en la publicacion de solicitud de patente estadounidense n.° 2010/0330071, puede usarse una membrana de canal abierto con una formulacion y lavado posterior espedficamente disenados cerca del fin del procedimiento de produccion para hacer que las composiciones de IgG resultantes tengan el doble de concentracion de protema (200 mg/ml) en comparacion con IG i.v. del estado de la tecnica (por ejemplo, GAMMAGARD® LIQUID) sin afectar al rendimiento ni a la estabilidad de almacenamiento. Con la mayona de las membranas de ultrafiltracion disponibles comercialmente no puede lograrse una concentracion de IgG 200 mg/ml sin importantes perdidas de protema. Estas membranas se bloquearan pronto y, por tanto, es diffcil lograr un lavado posterior adecuado. Por tanto, han de usarse configuraciones de membrana de canal abierto. Incluso con membranas de canal abierto, ha de usarse un procedimiento de lavado posterior espedficamente disenado para obtener la concentracion requerida sin perdida de protema significativa (perdida de menos del 2%). Incluso mas sorprendente es el hecho de que la concentracion de protema mayor de 200 mg/ml no afecta a la capacidad de inactivacion de virus de la etapa de almacenamiento de pH bajo.

Tras la finalizacion de la etapa de ultrafiltracion, el concentrado puede concentrarse adicionalmente mediante diafiltracion frente a una disolucion adecuada para administracion intravenosa o intramuscular. En determinadas realizaciones, la disolucion de diafiltracion puede comprender un agente estabilizante y/o tamponante. En una realizacion preferida, el agente estabilizante y tamponante es glicina a una concentracion adecuada, por ejemplo desde 0,20 M hasta 0,30 M, o desde 0,22 M hasta 0,28 M, o desde 0,24 M hasta 0,26 mM, o a una concentracion de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9 o 3,0. En una realizacion preferida, el tampon de diafiltracion contiene glicina 0,25 M.

Normalmente, el volumen de intercambio irnnimo es al menos aproximadamente 3 veces el volumen del concentrado original o al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, o mas veces el volumen del concentrado original. La disolucion de IgG puede concentrase hasta obtener una concentracion de protema final de entre el 3% y el 25% (p/v), o entre el 3% y el 7%, o entre el 6% y el 18% (p/v), o entre el 7% y el 16% (p/v), o entre el 8% y el 14% (p/v), o entre el 9% y el 12%, o hasta una concentracion final del 5%, o el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24%, el 25% o mayor. En una realizacion, se logra una concentracion de protema final de al menos el 23% sin anadir la fraccion de lavado posterior a la disolucion concentrada. En otra realizacion, se logra una concentracion de protema final de al menos el 24% sin anadir la fraccion de lavado posterior a la disolucion concentrada. En aun otra realizacion, se logra una concentracion de protema final de al menos el 25% sin anadir la fraccion de lavado posterior a la disolucion concentrada. Normalmente, al final del procedimiento de concentracion, el pH de la disolucion sera desde aproximadamente 4,6 hasta 5,1.

En una realizacion a modo de ejemplo, se ajusta el pH de la composicion de IgG hasta 5,2 + 0,2 usando acido clorddrico 1 M y se concentra hasta el 5 + el 1% en g de protema mediante ultrafiltracion (100 kDa o lfmite de corte de peso molecular nominal menor). Entonces el concentrado se filtra mediante diafiltracion con disolucion de diafiltracion (NaCl 0,02 M, PEG al 0,05% (p/v)). El filtrado obtenido mediante diafiltracion se enfna hasta 5 + 2°C. Se ajusta la concentracion del tampon Tris de la disolucion hasta 0,025 M usando Tris 2,0 M y se reajusta el pH hasta 7,8 + 0,2.

F. Cromatografia de intercambio anionico

En una realizacion, se carga entonces la protema en una columna de flujo rapido de ANX Sepharose® 4 equilibrada para retirar contaminantes derivados de plasma. Tras finalizar la carga, se lava la columna con tampon de equilibrado (Tris 25 mM, NaCl 20 mM, pH 7,8 + 0,2). Se combina lo que pasa a traves de la columna (disolucion de IgG) de las etapas de carga y lavado.

G. Inactivacion y/o retirada de virus

En determinadas realizaciones, los metodos proporcionados en el presente documento para la preparacion de una composicion de inmunoglobulinas enriquecida incluiran ademas al menos una, preferiblemente al menos dos, lo mas preferiblemente al menos tres, etapas de inactivacion o retirada de virus. Los ejemplos no limitativos de etapas de inactivacion o retirada de virus que pueden emplearse con los metodos proporcionados en el presente documento incluyen, tratamiento con disolvente y detergente (Horowitz et al., Blood Coagul Fibrinolysis 1994 (5 Supl 3): S21- S28 y Kreil et al., Transfusion 2003 (43):1023-1028), nanofiltracion (Hamamoto et al., Vox Sang 1989 (56)230-236 y Yuasa et al., J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)):2021-2024), e incubacion a pH bajo a altas temperaturas (Kempf et al., Transfusion 1991 (31)423-427 y Louie et al., Biologicals 1994 (22): 13-19).

Pueden realizarse etapas de inactivacion o retirada de virus en cualquier fraccion de inmunoglobulina intermedia generada durante el procedimiento de fabricacion. Por ejemplo, en una realizacion, puede realizarse una etapa de inactivacion o retirada de virus en una suspension de la fraccion I+II+III, suspension de la fraccion A, filtrado de la

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fraccion B, suspension de la fraccion II, eluato de intercambio cationico, eluato de intercambio anionico, y similares.

En una realizacion, se realiza una etapa de inactivacion o retirada de virus en una suspension de la fraccion II. En una realizacion preferida, la suspension de la fraccion II se somete a tratamiento con disolvente y detergente (D/D).

1. Tratamiento con disolvente y detergente (D/D)

Con el fin de inactivar diversos contaminantes vmcos que pueden estar presentes en productos derivados de plasma, uno o mas productos intermedios de la fabricacion de inmunoglobulinas pueden someterse a un tratamiento con disolvente y detergente (D/D). En una realizacion preferida, un precipitado de la fraccion II se resuspende y se trata con D/D. Se conocen bien en la tecnica metodos para el tratamiento con detergente de fracciones derivadas de plasma (para revision vease, Pelletier JP et al., Best Pract Res Clin Haematol. 2006; 19(1):205-42). Generalmente, puede usarse cualquier tratamiento con D/D convencional junto con los metodos proporcionados en el presente documento. Por ejemplo, a continuacion se proporciona un protocolo a modo de ejemplo para un tratamiento con D/D.

Brevemente, se anaden Triton X-100, Tween-20 y tri(n-butil)fosfato (TNBP) al filtrado de PptG clarificado a concentraciones finales de aproximadamente el 1,0%, el 0,3% y el 0,3%, respectivamente. Entonces se agita la mezcla a una temperatura de entre aproximadamente 18°C y aproximadamente 25°C durante al menos aproximadamente una hora.

En una realizacion, se anaden los reactivos de D/D (por ejemplo, Triton X-100, Tween-20 y TNBP) mediante pulverizacion en vez de adicion de fluido. En otras realizaciones, los reactivos de detergente pueden anadirse como solidos a la disolucion intermedia de inmunoglobulina, que se mezcla para garantizar una rapida distribucion de los componentes de D/D. En determinadas realizaciones, es preferible anadir reactivos solidos rociando los solidos sobre una superficie deslocalizada del filtrado de manera que no se produzca sobreconcentracion local, tal como en la adicion de fluido. En otra realizacion, se realiza una mejora del procedimiento bombeando una disolucion que contiene inmunoglobulina a un tanque en el que los reactivos de DD ya estan presentes o bien en forma concentrada o bien diluida.

2. Nanofiltracion

Con el fin de reducir adicionalmente la carga vmca de la composicion de inmunoglobulinas proporcionada en el presente documento, puede someterse a nanofiltracion una fraccion intermedia de inmunoglobulina usando un dispositivo de nanofiltracion adecuado. En determinadas realizaciones, el dispositivo de nanofiltracion tendra un tamano de poro medio de o aproximadamente entre 15 nm y 200 nm. Los ejemplos de nanofiltros adecuados para este uso incluyen, sin limitacion, DVD, DV 50, DV 20 (Pall), Viresolve NFP, Viresolve NFR (Millipore), Planova 15N, 20N, 35N y 75n (Planova). En una realizacion espedfica, el nanofiltro puede tener un tamano de poro medio de o aproximadamente entre 15 nm y 72 nm, o de o aproximadamente entre 19 nm y 35 nm, o de o aproximadamente 15 nm, 19 nm, 35 nm o 72 nm. En una realizacion preferida, el nanofiltro tendra un tamano de poro medio de o aproximadamente 35 nm, tal como un filtro PLANOVA 35N de Asahi o equivalente del mismo.

Opcionalmente, puede realizarse ultrafiltracion/diafiltracion para concentrar adicionalmente el nanofiltrado. En una realizacion, se usa una membrana de canal abierto con una formulacion y lavado posterior espedficamente disenados cerca del final del procedimiento de produccion dando como resultado una composicion de inmunoglobulinas de alta concentracion.

Posteriormente a la nanofiltracion, el filtrado puede concentrarse adicionalmente mediante ultrafiltracion y/o ajustarse la composicion de tampon mediante diafiltracion. En una realizacion, el nanofiltrado puede concentrarse mediante ultrafiltracion hasta obtener una concentracion de protemas de o aproximadamente entre el 0,5% y el 10% (p/v). En determinadas realizaciones, la ultrafiltracion se lleva a cabo en un casete con una pantalla de canal abierto y la membrana de ultrafiltracion tiene un punto de corte de peso molecular nominal (NMWCO) de menos de o aproximadamente 150 kDa o menos de o aproximadamente 140, 130, 120, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, o menos kDa. En una realizacion, la membrana de ultrafiltracion tiene un NMWCO de no mas de 50 kDa.

3. Incubacion a pH bajo

En determinadas realizaciones, puede tratarse una disolucion que contiene inmunoglobulina para reducir o inactivar la carga vmca de la composicion. En una realizacion, esto se logra ajustando el pH de la composicion a un pH bajo, por ejemplo, menos de o aproximadamente 6,0, e incubando durante al menos aproximadamente una semana antes de liberar la composicion. En una realizacion preferida, el pH de la disolucion en volumen se ajusta a menos de o aproximadamente 5,5 antes de la incubacion. En una mas realizacion preferida, el pH de la disolucion se reduce hasta menos de o aproximadamente 5,0 antes de la incubacion. En determinadas realizaciones, el pH de la disolucion se reduce hasta menos de o aproximadamente 6,0 o menos de o aproximadamente 5,9, 5,8, 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, o menor antes de la incubacion.

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En determinadas realizaciones, se incuba entonces la disolucion durante al menos una semana, o al menos 2, 3, 4, o mas semanas, o durante al menos 1, 2, 3, o mas meses. En realizaciones preferidas, la composicion se incuba a una temperatura por encima de 20°C, o por encima de 25°C o por encima de 30°C. En realizaciones particulares, la composicion se incuba a una temperatura de 20°C, o 21°C, 22°C, 23°C, 24°C, 25°C, 26°C, 27°C, 28°C, 29°C, 30°C, 31°C, 32°C, 33°C, 34°C, 35°C, 36°C, 37°C, 38°C, 39°C, 40°C, o mayor.

4. Liofilizacion ytratamiento termico

En aun otras realizaciones, la presente invencion proporciona composiciones de inmunoglobulinas liofilizadas, sometidas a liofilizacion segun metodos conocidos en la tecnica. La actividad vftica de estas composiciones liofilizadas, que puede haberse sometido previamente a otras etapas de inactivacion o retirada de virus tales como tratamiento con D/D o nanofiltracion, puede reducirse adicionalmente mediante tratamiento termico de la composicion liofilizada. Se conocen bien en la tecnica tratamientos termicos para la inactivacion de cargas vfticas en factores sangumeos (por ejemplo, vease, Piszkiewicz et al., Thromb Res. 1987 Jul 15; 47(2):235-41; Piszkiewicz et al., Curr Stud Hematol Blood Transfus. 1989;(56):44-54; Epstein y Fricke, Arch Pathol Lab Med. 1990 Mar; 114(3):335-40).

H. Formulacion

Tras la finalizacion de la etapa de diafiltracion, la concentracion de protema de la disolucion se ajusta con el tampon de diafiltracion hasta una concentracion final de entre aproximadamente el 3% y aproximadamente el 20% (p/v), o entre el 3% y el 7%, o entre aproximadamente el 6% y aproximadamente el 18% (p/v), o entre aproximadamente el 7% y aproximadamente el 16% (p/v), o entre aproximadamente el 8% y aproximadamente el 14% (p/v), o entre aproximadamente el 9% y aproximadamente el 12%, o hasta una concentracion final de aproximadamente el 5%, o el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24%, el 25%, o mayor. En una realizacion preferida, la concentracion de protema final de la disolucion es de entre aproximadamente el 9% y aproximadamente el 11%, mas preferiblemente de aproximadamente el 10%.

La disolucion a granel formulada se esteriliza adicionalmente mediante filtracion a traves de un filtro de membrana con un tamano de poro absoluto de no mas de aproximadamente 0,22 micrometros, por ejemplo, aproximadamente 0,2 micrometros. Entonces, la disolucion se dispensa de manera aseptica en recipientes finales para un sellado adecuado, con muestras tomadas para pruebas.

En una realizacion, la composicion de IgG se ajusta adicionalmente hasta una concentracion de aproximadamente el 10,2 + 0,2% (p/v) con tampon de diafiltracion. El pH se ajusta a de aproximadamente 4,4 a aproximadamente 4,9 si es necesario. Finalmente, la disolucion se filtra en condiciones esteriles y se incuba durante tres semanas a o aproximadamente 30°C.

En una realizacion a modo de ejemplo, la disolucion de IgG resultante se estabiliza con NaCl (maximo 0,15 M), glicina (maximo 0,3 M), glucosa (maximo 0,11 M) y albumina humana (maximo 3 mg/ml). El pH se ajusta a 7,0 + 0,2 usando acido clortudrico 1 M. Entonces se concentra la disolucion mediante ultrafiltracion hasta la concentracion deseada y se reajusta el pH hasta 7,15 + 0,1 usando acido clorhfdrico 1 M o hidroxido de sodio 1 M. La disolucion en volumen se filtra en condiciones esteriles usando un filtro de tamano de poro de 0,2 micrometros o equivalente.

La disolucion de IgG esteril puede dispensarse de manera aseptica en un recipiente, colocarse un tapon para liofilizacion, congelarse, liofilizarse, sellarse en condiciones asepticas y taparse.

VIII. Ejemplos

Entre otras ventajas, los ejemplos 1 a 7 demuestran que: (1) la etapa elucion de inmunoglobulinas de una resina de intercambio cationico (por ejemplo, CM-Sefarosa) da como resultado una distribucion bimodal de protemas, donde la actividad amidolftica (PL-1) se eluye mas tarde que IgG, haciendo posible retirar la actividad amidolftica con una perdida minima de rendimiento de IgG; (2) la elucion de la actividad amidolftica (PL-1) de la resina de intercambio cationico (por ejemplo, CM-Sefarosa) se correlaciona con, y esta producida probablemente por, un cambio de pH en la columna de CM durante la elucion segun los metodos proporcionados en el presente documento; (3) la cantidad de protema cargada en una resina de intercambio cationico (por ejemplo, CM-Sefarosa) no influye en la retirada de la actividad amidolftica (PL-1) a lo largo de al menos un intervalo de 60 a 120 mg de protema por ml de resina; (4) la monitorizacion del pH en la salida de la columna y la detencion de la elucion cuando se manifiesta el aumento conduce a una retirada parcial de la actividad amidolftica (PL-1), debido probablemente a que ya se ha alterado el equilibrio de pH en la parte superior de la columna; (5) la actividad amidolftica puede reducirse significativamente con una perdida minima en el rendimiento de IgG (< 10%) recogiendo una combinacion de elucion inicial de menos de 3 VC, como tal, la monitorizacion del volumen de una etapa de elucion de CM-Sefarosa es un metodo sencillo para reducir significativamente la actividad amidolftica de una composicion de inmunoglobulinas preparada segun los metodos proporcionados en el presente documento; y (6) recogiendo el “primer pico” de una etapa de elucion de CM-Sefarosa, puede lograrse una composicion que tiene una concentracion de agregado de IgG menor; actividad de

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PKA menor, actividad de PL-1 menor, una concentracion de monomero de IgG mayor y una distribucion de subclase de IgG mas deseable.

Ademas, los ejemplos 8 y 9 demuestran al menos que (1) las protemas que producen TGA elevado y FXIa pueden separarse en cromatograffa en CM dividiendo la ultima parte de 25% del eluato; (2) las ventajas descritas anteriormente pueden repetirse en procedimientos de fabricacion a gran escala; y (3) los eluatos del intercambio cationico (es decir, CM-Sefarosa) producidos en procedimientos de fabricacion a gran escala pueden combinarse monitorizando la DO, por ejemplo, el eluato puede recogerse en una primera combinacion hasta que la DO del eluato desciende por debajo de 2,0, proporcionando separacion significativa de protemas no deseadas que producen valores elevados de FXIa y TGA.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe la distribucion de protemas no deseadas que producen valores elevados de TGA, FXIa y disminuidos de NAPTT de una composicion de inmunoglobulinas de la fraccion II preparada segun un fraccionamiento con alcohol de Kistler-Nitschmann modificado. Estas impurezas pueden separarse durante la elucion de una etapa de cromatograffa de intercambio cationico (por ejemplo, cromatograffa de flujo rapido en CM- Sefarosa).

Este ejemplo demuestra una reduccion significativa en el contenido amidofftico (por ejemplo, FXI y/o FXIa) durante la elucion de la cromatograffa de intercambio cationico. El metodo da como resultado un producto de inmunoglobulina final que contiene significativamente menos actividad de TGA y FXIa. Esta reduccion se logra mediante un fraccionamiento espedfico de la etapa de eluato de CM, que separa eficazmente la actividad amidofftica (presente en la porcion trasera del eluato) de la fraccion de IgG principal (encontrada en la porcion delantera del eluato). Este ejemplo muestra que dividiendo el eluato de intercambio cationico en las porciones delanteras y traseras, se separan protemas traza no deseadas del volumen del contenido en IgG. Ademas, este ejemplo demuestra que este procedimiento es eficaz y economicamente factible para la fabricacion a gran escala.

Brevemente, se preparo el precipitado de la fraccion II tal como sigue. Tras la crioprecipitacion de plasma humano combinado, se formo un precipitado de la fraccion I+II+III mediante precipitacion con alcohol al 20% a pH 6,9. Tras la resuspension del precipitado I+II+III, se anadio alcohol hasta una concentracion final del 20% a pH de 7,2, para formar el precipitado A. La separacion del precipitado A se realizo mediante centrifugacion. La fraccion I+III (tambien denominada precipitado de suspension B) se forma mediante la precipitacion de un precipitado A suspendido con alcohol al 17%. El precipitado se recupera mediante filtracion o centrifugacion. Entonces se procesa el filtrado de suspension B para formar la fraccion II, que contiene la fraccion de protema plasmatica de gammaglobulina parcialmente purificada (por ejemplo, IgG).

Entonces se trato una suspension de la fraccion II clarificada con una mezcla de detergente disolvente (DD) y se cargo sobre una columna de ff de CM-Sefarosa. Tras el lavado de los reactivos con DD residual, se eluye la fraccion de IgG unida a la resina. Posteriormente, se somete la disolucion de inmunoglobulina a ultra/diafiltracion y entonces se carga en un intercambiador anionico para retirar las impurezas trazas. Tras otra etapa de concentracion, la formulacion final puede seguirse por liofilizacion.

Entonces se disolvio el precipitado de la fraccion II en agua ffffa a 4°C y pH 5,2 ± 0,2. Tras la clarificacion mediante filtracion en CWSS, se ajusto la disolucion para el tratamiento con DD. Se ajusto la concentracion de protema al 2% y se mantuvo la temperatura durante la incubacion con DD en el intervalo de 20°C a 25°C. Entonces se cargo la disolucion de protema en una columna de flujo rapido de CM-Sefarosa equilibrada (tampon de equilibrado: acetato de sodio 0,025 M, pH 5,0 + 0,2). Tras la carga, se lavo la columna con 30 volumenes de columna de tampon acetato (acetato de sodio 0,01 M, pH 5,5 + 0,2), para lavar los reactivos de DD, antes de que la protema adsorbida se eluyera con tampon de elucion (NaCl 0,25 M, glicina 0,2 M, PEG 3350 al 0,1%, Tris 25 mM, pH 8,00). La recogida de la primera parte del eluato (E1) comenzo a DO de 400 mUA y se detuvo tras exactamente 2,7 volumenes de columna (figura 1). Se recogio la segunda fraccion (E2) del pico de elucion hasta que la DO cayo hasta 400 mUA de nuevo. Entonces se procesaron las fracciones eluidas por separado durante el resto del procedimiento.

Entonces se ajustaron las composiciones de E1 y E2 a pH 5,2 y se sometieron a ultra/diafiltracion frente a tampon de diafiltracion (NaCl 0,02 M, PEG 3350 al 0,05%) para concentrar hasta protemas al 5% (p/v). Se anadio Tris 0,025 M a las composiciones y se ajusto el pH a 7,7. Entonces se cargaron las fracciones de IgG en una columna de flujo rapido de ANX-Sefarosa equilibrada con tampon (Tris 0,025 M, NaCl 0,02 M, pH 7,7). Se recogio la fraccion no retenida de ANX resultante y se complemento con NaCl 8,5 g/l, glicina 16,5 g/l, antffdrido de glucosa 21,7 g/l y albumina 1 g/l (20%). Entonces se ajusto el pH y se concentraron las composiciones de E1 y E2 hasta protema al 10% (p/v) mediante ultrafiltracion. Tras la concentracion, se complementaron de nuevo las disoluciones concentradas con NaCl y glicina (pero no con albumina) y se ajusto el pH a 7,1, si fue necesario, antes de la filtracion en condiciones esteriles.

En la figura 1 se proporciona un resultado de cromatografo que muestra la absorbancia (mUA), la conductividad y el pH de la etapa de cromatograffa. Tal como puede observarse, una elucion de una sola etapa con el tampon de

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elucion descrito anteriormente da como resultado una elucion de dos picos. De manera notable, tras la adicion del tampon de elucion, el pH del eluato cae significativamente a medida que el primer pico sale de la columna, y luego se eleva considerablemente con la elucion del segundo pico. Tal como se describe, los picos de elucion se separaron recogiendo 2,7 volumenes de columna en una primera fraccion E1 (a la izquierda de la lmea vertical mostrada en la figura 1) y una segunda fraccion (a la derecha de la lmea vertical mostrada en la figura 1).

Las fracciones eluidas (E1 y E2) se procesaron por separado para producir una preparacion de inmunoglobulina final, tal como se describe a continuacion. Para hacer esto, se ajusto el pH de las fracciones E1 y E2 a 5,2 y se sometieron las muestras a diafiltracion frente a tampon de diafiltracion (NaCl 0,02 M, PEG 3350 al 0,05%) para concentrar la composicion hasta una concentracion de protema final del 5%. Tras la diafiltracion, se anadio Tris 0,025 M a cada disolucion de protema y se ajusto el pH a 7,7. Entonces se cargaron las fracciones de IgG en una columna de flujo rapido de ANX-Sefarosa equilibrada (tampon de equilibrado Tris 0,025 M, NaCl 0,02 M pH 7,7) y se recogio la fraccion no retenida. Entonces se complemento la fraccion no retenida de ANX con NaCl 8,5 g/l, glicina 16,5 g/l, anhndrido de glucosa 21,7 g/l y albumina 1 g/l (20%). Entonces se ajusto el pH de la disolucion a 7,00 y se concentro la muestra de inmunoglobulina hasta protema al 10% mediante ultrafiltracion. Tras la concentracion, se anadieron de nuevo NaCl, glicina y antndrido de glucosa y se ajusto el pH a 7,1, si fue necesario, antes de la filtracion en condiciones esteriles.

Para caracterizar la etapa cromatografica, se determino un balance de masas, cuyos resultados se muestran en la tabla 1. Aproximadamente el 10% de la protema total se encontro en la segunda parte del pico de elucion. Esta es la perdida de rendimiento que se produce cuando se detiene la composicion combinada tras 2,7 volumenes de columna de eluato.

Tabla 1. Balance de masas de la etapa de enriquecimiento cromatografico en CM.

TPUV Protema Rendimiento Rendimiento

(%) (g) (%) (g/l de plasma)

Dis. de la fraccion II

6,99 150,07 100,00 3,93

CWSS

6,33 149,74 99,78 3,92

E1 de CM

2,97 136,27 90,80 3,57

E2 de CM

1,04 16,40 10,93 0,43

E1 ANX D/N

2,56 92,96 61,94 2,43

E1 ANX2M

0,87 11,25 7,50 0,29

FC de E1

4,76 76,31 60,85 2,00

E2 ANX D/N

2,71 12,56 8,37 0,33

E2ANX 2M

0,78 1,02 0,68 0,03

FC de E2

4,77 8,21 5,47 0,21

Entonces se analizaron los recipientes finales preparados a partir de las dos fracciones de elucion de CM para determinar la distribucion de tamano molecular, la actividad anti-complementaria, la actividad amidolttica usando tanto PL-1 y TGA como sustratos, la actividad de FXIa y la actividad de NAPTT. Los resultados se muestran en la tabla 2 y la tabla 3. La caracterizacion bioqmmica de los recipientes finales derivados de las partes primera y segunda de la fraccion de IgG eluida revelo que la primera parte de la elucion esta esencialmente libre de FXIa y otras protemas no deseables que producen niveles elevados de TGA y disminuidos de NAPTT. En cambio, las actividades de FXIa y amidolftica estan enriquecidas en la segunda parte, donde el contenido en agregados y oligodfmeros tambien es mayor. Resulta interesante que el valor de AAC en la primera parte del eluato es muy bajo, mientras que la segunda parte del eluato muestra un valor mucho mayor.

Tabla 2. Comparacion de la distribucion de tamano molecular de los dos E1 y E2 de recipientes finales.

HPLC

Polfmeros Oligo/Dfmeros Monomeros Fragmentos

FC de E1

0,20% 4,66% 93,13% 2,01%

FC de E2

2,82% 9,09% 85,95% 2,15%

Tabla 3. Comparacion de la caracterizacion bioqmmica de los dos E1 y E2 de recipientes finales.

PKKA TGA FXIa AAC PL-1 NAPTT

PKKA/ml

% de plasma normal ml/ml de FXIa % de CM50 consumido nmol/mil.min (Plasma con FXI)

FC de E1

< 4 96,87 < 0,04 18,9/36,6% < 10 >5 mg

FC de E2

6,9 258,41 2,14 48,2/58,7% < 10 >5 mg

En conclusion, la division de la elucion de la columna de ff de CM-Sefarosa da como resultado dos fracciones y permite la fabricacion de composiciones de IgG sustancialmente libres de FXIa.

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Ejemplo 2

Con el fin de reducir la cantidad de actividad amidolftica presente en las preparaciones de inmunoglobulina a escala de fabricacion, se investigaron las condiciones usadas para eluir y fraccionar la cromatograffa de intercambio cationico. A continuacion se proporcionan los detalles de estas investigaciones.

Se realizaron una serie de experimentos para encontrar las disoluciones adecuadas para reducir/retirar la actividad amidolftica durante el procedimiento posterior segun el metodo de produccion de S/D de Gammagard descrito en el presente documento. Brevemente, se disolvio pasta de fraccion de Cohn en agua fffa a 4°C y pH 5,2+0,2. Tras la clarificacion mediante filtracion en CWSS las muestras o bien se filtraron en condiciones esteriles y se almacenaron a 4°C o bien se diluyeron con agua hasta obtener una concentracion de protemas del 2% para su procesamiento inmediato. Entonces se llevo la disolucion hasta 20-25°C y se incubo durante 1 hora con una mezcla de disolvente/detergente (Triton X-100 al 1%, Tween 80 al 0,3%; TNBP al 0,3%) antes de cargar la disolucion de protema en una columna de flujo rapido de CM-Sefarosa equilibrada (tampon de equilibrado: acetato de Na 25 mM, pH 5,0+0,2). Tras la carga, se lavo la columna con tampon acetato (acetato de Na 0,01 M, pH 5,5+0,2) y se eluyo la IgG adsorbida con tampon de elucion (NaCl 0,25 M, glicina 0,2 M, Peg 3350 al 0,1%, Tris 25 mM, pH 7,8). Durante las series de ff en CM-Sefarosa, se monitorizaron los siguientes parametros para fraccionar el eluato de CM (en un punto definido): DO 280; pH; y volumen de elucion en volumenes de columna (VC). Los eluatos o bien se sometieron entonces a ultra/diafiltracion con tampon de diafiltracion (NaCl 0,02 M, PEG 3350 al 0,05%) o bien se usaron inmediatamente para el analisis. Esta etapa de concentracion se realizo con el fin de medir la actividad amidolftica a valores de protema que tambien correspondfan a una composicion de recipiente final del 10%.

Durante la elucion, el eluato logro rapidamente el valor de conductividad del tampon de elucion de CM. Sin embargo, tal como se muestra en la figura 2, el pH del eluato medido en la salida de la columna cayo inicialmente desde 5,5, cuando estaba en el tampon de lavado, hasta por debajo de 5,0 (4,3 - 4,8) y permanecio sin cambios durante los primeros 4 VC, a pesar del hecho de que el tampon de elucion tema un pH de 7,8. Se observo un aumento en el pH hasta aproximadamente 7,8 al final de la recogida del eluato. La monitorizacion de la DO 280 en la salida de la columna muestra que este cambio de pH corresponde a la liberacion de un segundo pico, donde se detecta la mayor parte de la actividad amidolftica (tal como se mide a traves del ensayo de PL-1).

Ejemplo 3

Para investigar adicionalmente el fenomeno de elucion bimodal en CM-Sefarosa y el cambio de pH observado en el ejemplo 1 y el ejemplo 2, se recogieron fracciones de elucion individuales durante otro experimento de cromatograffa de flujo rapido en CM-Sefarosa. Brevemente, se realizo cromatograffa de flujo rapido en CM-Sefarosa tal como se describio anteriormente, recogiendose y analizandose las fracciones por separado antes de combinar las fracciones A - N y concentrarlas mediante ultrafiltracion. El material de partida para la etapa cromatografica fue pasta de fraccion II de Cohn (P25001ivLE; adsorbida con AT-III y FIX). Se equilibro la columna de CM-Sefarosa con tampon que tema un pH de 5,2 y el lavado se realizo a un pH de 5,7. La velocidad de flujo de la etapa cromatografica se mantuvo a 0,64 cm/min.

Tras el cambio de pH, se encontro una cantidad creciente de actividad amidolftica (PL-1) en las fracciones. Incluso en la combinacion concentrada se observa una reduccion de la actividad amidolftica. El hecho de que la actividad de PL1 fuera detectable tras ultra-/diafiltracion o bien se debe a dilucion en el eluato de CM o bien a la generacion del mismo durante la concentracion.

Tal como se muestra en la tabla 4, las fracciones que eluyeron con un pH por debajo de 5,5 (fraccion A-N) conteman concentraciones mucho menores de actividad amidolftica en comparacion con las que eluyeron con valores de pH mayores (fracciones O y P). La cuantificacion de la actividad amidolftica muestra que se eluyo mas actividad en las fracciones O y P que en todas las fracciones A-N combinadas. Tras el cambio de pH, se encontro una cantidad creciente de actividad amidolftica (PL-1) en las fracciones. Incluso en la combinacion concentrada se observa una reduccion de la actividad amidolftica. El hecho de que la actividad de PL1 fuera detectable tras ultra-/diafiltracion o bien se debe a dilucion en el eluato de CM o bien a la generacion del mismo durante la concentracion.

Tabla 4: Analisis de fracciones de elucion de ff de CM-Sefarosa

Muestra

Eluato en pH Volumen Conc. de Protema Recuperacion Actividad Actividad

volumen de columna (corregido) protema (corregida) de etapa proteica amidolftica (PL-1) amidolftica (PL-1)

nmol/min

VC g % g % nmol/mil.min por g de protema

Resusp. de pasta

1349 5,4 73,00 100,0 14,5 268

5

10

15

20

25

Filtrado en CWSS

1480 4,7 66,97 94,5 14,4 309

Fraccion A

0,26 5,6 245 0,04 0,10 0,1 < 10

Fraccion B

0,26 4,8 247 2,17 5,36 7,3 < 10

Fraccion C

0,27 4,6 255 6,59 17,09 23,4 < 10

Fraccion D

0,27 4,8 256 5,55 14,22 19,5 < 10

Fraccion E

0,27 4,5 256 4,21 10,78 14,8 < 10

Fraccion F

0,28 4,7 270 2,99 8,08 11,1 < 10

Fraccion G

0,28 4,8 252 2,15 5,41 7,4 < 10

Fraccion H

0,26 4,7 245 1,49 3,65 5,0 < 10

Fraccion I

0,29 4,7 278 0,99 2,75 3,8 < 10

Fraccion J

0,30 4,7 287 0,67 1,92 2,5 < 10

Fraccion K

0,27 4,7 256 0,51 1,32 1,8 < 10

Fraccion L

0,26 4,7 251 0,43 1,08 1,5 < 10

Fraccion M

0,27 4,7 257 0,37 0,95 1,3 < 10

Fraccion N

0,28 4,9 267 0,39 1,04 1,4 < 10

Fraccion O

0,34 5,5 324 0,52 1,69 2,3 28,2 5423

Fraccion P

0,29 7,5 276 0,34 0,94 1,3 29,6 3705

Fraccion Q

0,28 7,8 270 0,01 0,03 0,0 < 10

Eluato de CM A-N

3616 1,91 69,08 94,6 < 10

A-N tras UF/DF

996 7,00 69,70 95,5 12,7 181

Ejemplo 4

Para definir adicionalmente los Ifmites de elucion de la actividad amidolftica de la resina de ff de CM-Sefarosa, se realizo otro experimento, tal como se describio anteriormente, excepto en que los eluatos de CM se recogieron en fracciones definidas por un lfmite de pH. Espedficamente, se recogieron eluatos de CM hasta un pH predefinido (4,3, 4,8, 6,0, 7,5), tal como se monitoriza en la salida de la columna. En este experimento, el material de partida para la etapa cromatografica fue pasta de fraccion II de Cohn (P25001ivLE; adsorbida con AT-III y FIX), como en el ejemplo 3. Se equilibro la columna de CM-Sefarosa a un pH de 4,8 y se lavo a un pH de 5,3. Se sometieron las fracciones de eluato a ultra/diafiltracion y se ajusto el pH con Tris antes del analisis. En este experimento, el pH del eluato cayo hasta 4,1 al inicio de la etapa de elucion. El analisis de las fracciones de eluato recogidas se muestra en la tabla 5.

Tabla 5. Analisis de fracciones de elucion de ff de CM-Sefarosa

Muestra

Eluato en volumen de columna VC Conc. de protema % Actividad amidolftica (PL-1) nmol/mol.min Actividad amidolftica (PL-1) nmol/min por g de protema

Resusp. de pasta

5,7 14,4 251

Filtrado en CWSS

4,9 14,1 287

Eluato de CM (pH 4,3)

4,88 (4,38) 2,29 < 10

Tras UF/DF

7,42 12,0 162

Eluato de CM (pH 4,8)

4,49 2,66 < 10

Tras UF/DF

6,57 12,7 193

Eluato de CM (pH 5,0)

5,21 2,11 < 10

Tras UF/DF

7,20 14,1 195

Eluato de CM (pH 7,5)

6,43 1,71 < 10

Tras UF/DF

6,71 15,8 235

Ejemplo 5

A continuacion, se determino si una reduccion en la cantidad de protema por resina de CM-Sefarosa unitaria potenciana adicionalmente la separacion de picos mostrada en la figura 2. Con el fin someter esto a prueba, se realizaron una serie de series de cromatograffas de ff en CM-Sefarosa con cargas de protema decrecientes, que oscilaban entre 118 mg de protema por ml de resina hasta 57 mg/protema por ml de resina. Como en el ejemplo 2, el material de partida para el experimento fue ruta II de pasta de fraccion II de Cohn; P24701IV; que incluye la retirada de FIX, FVII y ATIII del plasma pobre en crioprecipitado mediante adsorcion (Tabla 6). Se equilibro la resina a pH 5,2 y se realizo la etapa de lavado a pH 5,7. Se combinaron los eluatos de CM-Sefarosa como en el ejemplo 2, para dar una primera parte (el primer pico) y una segunda parte (el segundo pico). La figura 2 proporciona un resultado de cromatografo a modo de ejemplo, en el que la primera combinacion termina y la segunda combinacion

5

10

15

20

25

comienza cuando la absorbancia UV del eluato toca fondo a aproximadamente DO280 = 1,6±0,2 entre los dos picos. Tabla 6. Analisis del material de partida (ruta II de pasta de fraccion II de Cohn; P24701IV)

volumen protema recuperacion act. amidolttica act. amidolttica

(corregido) (corregida) (PL-1) (PL-1) nmol/ming de

muestra

g g % nmol/mil.min protema

Resusp. COHN II

1001 75 100 24,3 325

Filtrado en CWSS

1083 74 98 22,5 331

Filtrado en condiciones esteriles

1067 72 96 22,5 335

Tal como se muestra en la tabla 7, la reduccion de la carga de protema de la resina no mostro ningun efecto sobre la separacion de picos, pero tuvo un impacto sobre la recuperacion. Concordando con los resultados presentados en los ejemplos anteriores, estan presentes niveles muy bajos de actividad amidolttica en las primeras combinaciones de eluato de cada serie cromatografica.

Tabla 7: Analisis de purificaciones cromatograficas en CM-Sefarosa realizadas con cargas de protema variables.

mg de protema/ ml de medio

Muestra Eluato en volumen de columna* Concentracion de protema % Recuperacion % Actividad amidolftica (PL-1) nmol/mol.min

116

Primera parte de eluato de CM 2,7 3,5 81,5 < 10

Segunda parte de eluato de CM 4,8 0,3 13,5

Tras UF/DF 8,49 < 10

110

Primera parte de eluato de CM 2,3 4,0 78,1 < 10

Segunda parte de eluato de CM 5,1 0,5 19,6

Tras UF/DF 7,16 < 10

80

Primera parte de eluato de CM 2,8 2,25 72,4 < 10

Segunda parte de eluato de CM 3,5 0,6 24,7

Tras UF/DF 7,06 < 10

72

Primera parte de eluato de CM 2,7 2,05 76,7 < 10

Segunda parte de eluato de CM 4,4 0,4 23,1

Tras UF/DF 5,62 < 10

57

Primera parte de eluato de CM 2,3 1,71 67,0 < 10

Segunda parte de eluato de CM 4,6 0,4 27,9

Tras UF/DF 3,88 < 10

Ejemplo 6

Para validar adicionalmente los hallazgos experimentales descritos anteriormente, se realizaron purificaciones cromatograficas en CM-Sefarosa con velocidades de flujo y esquemas de combinacion de elucion variables. Brevemente, se proceso una pasta de fraccion II de Cohn que contema un alto contenido en actividad amidolttica (100 nmol/ml.min al 6% de protema) tal como se describe en el presente documento hasta la fraccion precedente a la cromatograffa en ANX. Para todas las series en CM-Sefarosa, se recogio el eluato cuando la UV comenzo a aumentar y se detuvo o bien tras 3 VC o bien tras 4 VC.

Se realizaron tres purificaciones cromatograficas en CM-Sefarosa tal como sigue. Se concentraron las fracciones de eluato recogidas tal como se describe en el presente documento y luego se concentraron adicionalmente para evitar valores de PL-1 por debajo del lfmite de deteccion para el ensayo de PL-1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Primera serie: se aclaro la resina de CM-Sefarosa y se equilibro a una velocidad de flujo de 1 cm/min. La velocidad de flujo de las etapas de carga de protema, lavado y elucion se mantuvo constante a 0,64 cm/min. Se recogieron 3 volumenes de columna (3 VC) de eluato en la combinacion principal.

Segunda serie: se aclaro la resina de CM-Sefarosa y se equilibro a una velocidad de flujo de 1,2 cm/min. La velocidad de flujo de la etapa de carga de protema fue de 0,64 cm/min. La velocidad de flujo de la etapa de lavado fue de 0,64 cm/min para los primeros 1,2 volumenes de columna (VC) y de 1,8 cm/min para los siguientes 28,8 VC. La etapa de elucion se realizo a 0,64 cm/min. Se recogieron 3 volumenes de columna (3 VC) de eluato en la combinacion principal.

Tercera serie: se aclaro la resina de CM-Sefarosa y se equilibro a una velocidad de flujo de 1,2 cm/min. La velocidad de flujo de la etapa de carga de protema fue de 0,64 cm/min. La velocidad de flujo de la etapa de lavado fue de 0,64 cm/min para los primeros 1,2 volumenes de columna (VC) y de 1,8 cm/min para los siguientes 28,8 VC. La etapa de elucion se realizo a 0,64 cm/min. Se recogieron 4 volumenes de columna de eluato en la combinacion principal.

Se concentro la combinacion principal de cada serie cromatografica en CM-Sefarosa y se analizo para determinar la actividad amidolftica (PL-1), la concentracion de protema total y el perfil de HPLC. Tal como se muestra en la tabla 8, aumentar la velocidad de flujo de la etapa de lavado dio como resultado cantidades inferiores de actividad amidolftica en la combinacion principal (comparense la serie 1 y la serie 2). La recogida de 4 VC, en lugar de 3 VC, proporciono un rendimiento de protema total nominal (2,55 g/l plasma frente a 2,5 g/l plasma; comparense la serie 3 y la serie 2), sin embargo, se produjo mas del doble de la cantidad total de actividad amidolftica presente en la composicion final (384,7 nmol de pL-1/min g de protema frente a 188,5 nmol de PL-1 /ming protema). La combinacion de 4 VC tambien aumento el contenido en agregados de la composicion de inmunoglobulinas final (el 0,52% frente al 0,12%; comparense la serie 3 y la serie 2). De manera notable, el contenido final en actividad amidolftica y agregados de la composicion preparada mediante la serie 2 concuerda con el observado anteriormente (veanse la tabla 2, la tabla 4 y la tabla 5).

Tabla 8. Analisis de purificaciones cromatograficas en CM-Sefarosa realizadas con velocidades de flujo de lavado y volumenes de recogida de eluato variables.

Serie 1 Serie 2 Serie 3

Rendimiento de protema, g/l de plasma

2,36 2,5 2,55

Valor de protema, %

8,12 7,48 3,28

nmol de PL-1/mol.min

27,5 14,1 35,7

nmol de PL-1 /ming protema

338,7 188,5 384,7

HPLC

Agregados 0,18 0,12 0,62

Oligo/Dfmeros

5,84 5,74 8,38

Monomeros

93,88 94,10 92,88

Fragmentos

0,08 0,04 0,12

Ejemplo 7

Para demostrar que los resultados proporcionados anteriormente podfan aumentarse a escala hasta escala de fabricacion industrial, se procesaron 360 g de material de partida de fraccion II de Cohn como en los experimentos anteriores. Se recogieron 2,9 VC de CM-Sefarosa en una primera combinacion y el resto del eluato se recogio en una segunda combinacion. Entonces se procesaron las combinaciones de eluato resultantes hasta una composicion de recipiente final, tal como se describe en el presente documento, adecuada para su administracion a un individuo. Este procesamiento adicional incluyo cromatograffa en ANX, ultra-/diafiltracion y liofilizacion a partir de la formulacion final. Entonces se analizaron las caractensticas bioqmmicas de cada preparacion final y los resultados se presentan en la tabla 9.

Tabla 9. Comparacion de la caracterizacion bioqmmica de los dos E1 (primera parte de la elucion; 2,9 VC) y E2 (segunda parte de la elucion; > 2,9 VC) de recipientes finales.

Eluato de CM tras procesamiento posterior

primera parte de elucion

segunda parte de elucion

Valor de protema, %

4,90 3,95

IgG, g/l

48,3 36,3

IgA, g/l

0,006 0,0002

Subclases de IgG

IgG 1 71,9 71,4

IgG 2

21,0 16,4

IgG 3

4,6 10,8

IgG 4

2,5 1,4

HPLC

Agregados 0,07 0,08

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Oligo-/Dfmeros 4,59 10,76

Monomeros

94,81 87,86

Fragmentos

0,52 1,32

Electroforesis CA

Albumina a/p globulina y globulina 1,2 2,3

0,2

98,8

97,5

ACA (C'H 50)

25,4 26,5

PKA, UI/ML

< 0,6 41,2

nmol de PL-1/mil.min

19,7 728,6

nmol de PL-1/ming de protema

402,0 18446,6

Tal como se muestra en la tabla 9, la composicion final derivada de la primera parte de la elucion de CM-Sefarosa contema una actividad amidolttica 50 veces menor que la composicion final derivada de la segunda parte de la elucion de CM-Sefarosa (402 nmol de PL-1/ming de protema frente a 18.446,6 nmol de PL-1/ming de protema). La composicion final derivada de la primera parte de la elucion de CM-Sefarosa tambien contema menos albumina (el 1,2% frente al 2,3%), a/p globulina (no detectada frente al 0,2%), actividad de PKA (< 0,6 Ul/ml frente a 41,2 Ul/ml) e IgG 3 (el 4,6% frente al 10,8%) en comparacion con la composicion final derivada de la segunda parte de la elucion de CM-Sefarosa. Ademas, la composicion derivada de la primera parte de la elucion de CM-Sefarosa contema un contenido mucho mayor en IgG (el 94,81% frente al 87,86%) que la composicion final derivada de la segunda parte de la elucion de CM-Sefarosa.

Ejemplo 8

Para validar adicionalmente los resultados proporcionados anteriormente, se preparo una porcion de pasta de fraccion II (RI10XD142; precipitado A centrifugado) segun los metodos proporcionados en el presente documento. Entonces se resuspendio la pasta y se cargo en una columna de intercambio cationico de CM-Sefarosa tal como se describe en el presente documento y se eluyo tal como se describio anteriormente. Se dividio el eluato (volumen total: 4743 ml) en una primera fraccion que contema el 75% del eluato total (3530 ml) y una segunda fraccion que contema el 25% del eluato total (1213 ml). Entonces se procesaron ambas fracciones de eluato de CM-Sefarosa primera y segunda hasta el recipiente final tal como se describe en el presente documento y se analizaron para determinar la actividad de FXIa, TGA, NAPTT y amidolttica (PL-1), agregado de IgG, y el contenido en AAC. Los resultados se proporcionan en la tabla 10. Concordando con los resultados proporcionados anteriormente, la separacion del eluato de CM-Sefarosa en una combinacion primera y segunda da como resultado la reduccion de la actividad de FXIa y TGA en la preparacion de inmunoglobulina final.

Tabla 10. Caracterizacion bioqmmica de las fracciones de elucion de CM-Sefarosa primera y segunda.

Prueba

Unidad Primera parte del eluato de CM Segunda parte del eluato de CM

TGA

% de plasma normal 96,87 256,41

F-XIa espedfico

mU/ml < 0,04 2,14

NAPTT

mg < 5 < 5

Actividad amidolttica (PL-1)

nmol/ml min < 10 < 10

PKA

UI/ml < 4 5,9

MDD

% de agregados 0,20 2,82

AAC

% 16,6 58,7

Ejemplo 9

Para evaluar adicionalmente la viabilidad de ampliar a escala los metodos proporcionados en el presente documento, se monitorizo un eluato de CM-Sefarosa de un procedimiento de fabricacion a gran escala para determinar el contenido en protema, el pH y la actividad de FXIa. Brevemente, se procesaron aproximadamente 19.000 l de plasma pobre en crioprecipitado, tal como se describe en el presente documento, para formar aproximadamente 220 kg de pasta de fraccion II, que contema aproximadamente 70 kg de protema. Se resuspendio la pasta de la fraccion II y se cargo en una columna de CM-Sefarosa a escala de fabricacion, se lavo y se eluyo, tal como se describio anteriormente. Se recogio una muestra del eluato y se analizo tras cada VC (aproximadamente 350 l) de elucion. Tal como se muestra en la tabla 11, solo se encuentran niveles elevados de FXIa al final de la elucion de CM-Sefarosa, una vez que cambia el pH del eluato. Se monitorizo la concentracion de protema del eluato a DO280 y se recogio la primera parte de la elucion y se combino hasta que la DO280 disminuyo por debajo de 2,0. Entonces se recogio la segunda parte de la elucion y se combino por separado hasta que la DO280 disminuyo por debajo de 0,2. Entonces se analizaron y se compararon las combinaciones de eluato primera y segunda, tal como se muestra en la tabla 12. De manera notable, se encontro el 98% del rendimiento de IgG en la primera parte del eluato de CM y se encontro el 2% del rendimiento de IgG en la segunda parte del eluato de CM. Por tanto, terminando la recogida de una combinacion de elucion de CM-Sefarosa una vez que la DO280 del eluato desciende por debajo de

5

10

15

20

25

30

2,0, puede retirarse una cantidad significativa de actividad de TGA y de FXIa de la preparacion, mientras que se minimiza la perdida de rendimiento de IgG.

Tabla 11. Caracterizacion bioqmmica de muestras del eluato de CM-Sefarosa tomadas tras la elucion de cada volumen de columna.

Muestra (columna 1 de CM- Sefarosa)

Volumen de eluato (l) DO pH en la salida de la columna* TPUV (g/dl) FXIa (mU/g)

LE08L008 1 VC

355 > 2 4,37 6,57 0,61

LE08L008 2 VC

706 > 2 4,28 1,67 2,40

LE08L008 3 VC

1069 > 2 4,27 0,90 4,44

LE08L008 4 VC

1408 > 2 7,48 0,65 86,55

LE08L008 5 VC

1753 > 2 8,18 0,19 101,07

LE08L008 6 VC

2106 0,85 8,28 0,06 86,24

LE08L008 7 VC

2451 0,26 8,34 0,00 n.d.

Tabla 12. Caracterizacion bioqmmica de las combinaciones de elucion de CM-Sefarosa primera y segunda.

Prueba

Unidad Primera parte del eluato de CM Segunda parte del eluato de CM (tras DO de 2)

TGA

% de plasma de referencia a 2,4 mg/ml 144,64 366,65

F-XIa

mU/g de IgG 12,53 Actividad similar a factor XIa muy alta; no puede evaluarse cuantitativamente ya que el producto tambien contiene actividades de FXa y/o FIXa

Ejemplo 10

Para evaluar adicionalmente los metodos divulgados para reducir el contenido amidolftico de una composicion de inmunoglobulinas, se realizo un segundo experimento a gran escala, usando un precipitado de la fraccion II como material de partida. Brevemente, se preparo el precipitado de la fraccion II tal como se describe en el ejemplo 1, excepto en que la separacion de precipitado A se realizo mediante filtracion, en lugar de mediante centrifugacion.

Se sometio el precipitado de la fraccion II a cromatograffa cationica en CM, tal como se describe en el ejemplo 1. Como en el ejemplo 1, se recogio el eluato de CM en dos combinaciones, una porcion delantera (E1) que contema el volumen del contenido en IgG y una porcion trasera (E2) que contema la mayor parte de la actividad amidolftica. La recogida de la primera parte del eluato (E1) comenzo a DO de 400 mUA y se detuvo tras exactamente 2,7 volumenes de columna. Se recogio la segunda fraccion (E2) del pico de elucion hasta que la DO cayo hasta 400 mUA de nuevo. Entonces se procesaron las fracciones eluidas por separado durante el resto del procedimiento. El balance de masas para el procedimiento de purificacion se muestra en la tabla 13.

Tabla 13. Balance de masas para la segunda purificacion a gran escala a partir del precipitado de la fraccion II.

TPUV(%) Protema (g) Rendimiento (%) Rendimiento (g/l plasma)

Disolucion de la fraccion II

6,14 126,72 100,00 3,02

CWSS

5,50 124,50 98,24 2,96

E1 de CM

2,96 108,73 85,80 2,59

E2 de CM

0,90 16,02 12,64 0,38

E1 ANX D/N

2,74 94,82 74,82 2,26

E1 ANX2M

0,94 10,20 8,05 0,24

E1 EB

4,99 96,20 75,92 2,29

E2 ANX D/N

2,70 13,26 10,46 0,32

E2 ANX 2M

0,95 1,20 0,94 0,03

E2 EB

5,42 11,81 9,32 0,28

Como en el ejemplo 1, aproximadamente el 10% de la protema total se encuentra en la segunda parte del pico de elucion. Esta es la perdida de rendimiento confirmada si la elucion se detiene tras 2,7 volumenes de columna.

Se analizaron los recipientes finales preparados a partir de las dos fracciones de elucion de CM (E1 y E2) para determinar la distribucion de tamano molecular, la actividad anti-complementaria, la actividad amidolftica con el sustrato SN13a y con los ensayos de TGA, FXIa y NAPTT. Los resultados se muestran en la tabla 14 y la tabla 15.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Tabla 14. Comparacion de la distribucion de tamano molecular de los dos recipientes finales

HPLC

Polfmeros Oligo/Dfmeros Monomeros Fragmentos

FC de E1

0,24% 5,18% 93,21% 1,36%

FC de E2

4,42% 9,60% 84,55% 1,44%

Tabla 15. Comparacion de caractensticas adicionales de los dos recipientes finales

PKKA TGA FXIa AAC SN13a NAPTT

PKKA, IU/ml

% de plasma normal mU/ml de FXIa Unidades de C'H50 consumidas/% mU/ml de FXIa (Plasma con FXI)

FC de E1

< 4 102,76 < 0,04 7,9/9,7% < 0,375 > 5 mg

FC de E2

< 4 119,75 0,09 52,4/63,7% 3,23 > 5 mg

La caracterizacion bioqmmica de los recipientes finales derivados de las partes primera y segunda de la fraccion de IgG eluida revelo que la primera parte de la elucion esta esencialmente libre de FXIa y otras protemas no deseables que producen niveles elevados de TGA y disminuidos de NAPTT. En cambio, las actividades de FXIa y amidolttica estan enriquecidas en la segunda parte, donde el contenido en agregados y oligo/dfmeros tambien es mayor, aunque la separacion de suspension A se realiza mediante filtracion. Resulta interesante que el valor de AAC en la primera parte del eluato es incluso menor, mientras que el valor de AAC en la segunda parte del eluato es mayor.

En este experimento, cuando se usa filtracion para la separacion de la suspension A en el procedimiento anterior, el FXIa residual en la segunda parte de la elucion es mucho menor y el valor de TGA del recipiente final de esta parte de elucion esta en el intervalo normal.

Tomado junto con el ejemplo 1, la division de la elucion de la columna de ff de CM-Sefarosa en dos fracciones (E1 y E2) permite la fabricacion de una composicion de IgG que esta sustancialmente libre de FXIa. Esto es cierto para ambas opciones de separacion para la fraccion A (es decir, centrifugacion y filtracion), aunque FXIa es significativamente menor si la separacion del precipitado A se realiza mediante filtracion.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra la idoneidad de los presentes metodos para la separacion de actividades procoagulantes mediante cromatograffa de intercambio cationico en procedimientos de fabricacion a gran escala disenados para la produccion de composiciones de inmunoglobulinas para administracion subcutanea. El material de partida para este experimento fue un precipitado de la fraccion II formado a partir de plasma de origen humano combinado recogido en Europa, que se sometio a crioprecipitacion y se uso para recuperar antitrombina III (ATIII) a traves de adsorcion.

Brevemente, tras la crioprecipitacion y adsorcion de ATIII, comienza el fraccionamiento con alcohol en frio con la separacion de fibrinogeno y factores de coagulacion residuales (por ejemplo, factor XIII) mediante la precipitacion de un precipitado de la fraccion I en alcohol al 8% y pH 7,0. Se ajusta la concentracion de alcohol en el sobrenadante al 25% con el fin de precipitar la fraccion II+III y separar la albumina. Tras la resuspension del precipitado II+III, se anade alcohol hasta el 12% a un pH de ~5,2 para formar el precipitado III. Tras la separacion del precipitado III, se anaden 0,04 g de DEAE Sephadex/g de protema, se filtra la disolucion a traves de filtros de profundidad Cuno 90, y se precipita la fraccion II de Cohn que contema la fraccion de gammaglobulina purificada mediante alcohol al 25% a pH neutro.

Se disuelve el precipitado de la fraccion II en agua fria a 4°C y pH 5,2 + 0,2. Tras la clarificacion mediante filtracion en CWSS, se ajusta la disolucion para el tratamiento con DD hasta obtener una concentracion de protema del 2%. La temperatura durante la incubacion con DD se mantiene en el intervalo de 20 a 25°C. La disolucion de protema se carga en una columna de flujo rapido de CM-Sefarosa equilibrada (tampon de equilibrado: acetato de sodio 0,025 M, pH 5,0 + 0,2). Tras la carga, se lava la columna con 30 volumenes de columna de tampon acetato (acetato de sodio 0,01 M, pH 5,5 + 0,2) para lavar los reactivos de DD antes de eluir la protema adsorbida con tampon de elucion (NaCl 0,25 M, glicina 0,2 M, PEG 3350 al 0,1%, Tris 25 mM, pH 8,00). La recogida de la primera parte del eluato (E1) comienza a DO de 400 mUA y se detiene tras exactamente 2,7 volumenes de columna. La segunda fraccion (E2) del pico de elucion se recoge hasta que la DO cae hasta 400 mUA de nuevo. Las fracciones eluidas se procesan por separado hasta el volumen final segun las etapas siguientes.

Se ajusta el pH de la fraccion de eluato a 5,2 y luego la concentracion al 5%, tiene lugar la diafiltracion frente a tampon de diafiltracion (NaCl 0,02 M, PEG 3350 al 0,05%) y la posterior concentracion hasta protema al 10%. Se anaden 0,055 g de glicina/g de protema a la disolucion y se ajusta el pH a 7,0 antes de la filtracion en condiciones esteriles.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El cromatograma de las etapas de lavado y elucion de intercambio cationico se muestra en la figura 3. La lmea 1 muestra la absorbancia UV, la lmea 2 la conductividad y la lmea 3 el pH en la salida de la columna. La densidad optica a 280 nm indica una separacion parcial de dos fracciones durante la elucion de la protema de la columna de ff de CM-Sefarosa. El pH en la salida de la columna comienza a aumentar justo tras el inicio de la nueva elevacion de la absorbancia UV durante la elucion. En este punto se separaron las dos fracciones de eluato (F4 y F5, denominadas en el presente documento E1 y E2). El balance de masas para la serie de purificacion posterior se muestra en la tabla 16.

Tabla 16. Balance de masas para la purificacion a gran escala de IgG a partir del precipitado de la fraccion II.

TPUV Protema Rendimiento Rendimiento

(%) (g) (%) (g/l de plasma)

Dis. de la frac. II

4,94 179,45 100,00 3,58

CWSS

2,70 169,46 94,43 3,38

E1 de CM

2,78 148,05 82,50 2,95

E2 de CM

0,85 21,04 11,72 0,42

Volumen de E1

13,25 127,60 71,11 2,54

Volumen de E2

13,15 20,32 11,32 0,41

Se encuentra aproximadamente el 15% de la protema total en la segunda parte del pico de elucion (E2). Esta es la perdida de rendimiento debida a la detencion de la recogida de E1 tras 2,7 volumenes de columna. Se analizaron los recipientes finales preparados a partir de las dos fracciones de elucion de CM (E1 y E2) para determinar la distribucion de tamano molecular, la actividad anti-complementaria, la actividad amidolftica con el sustrato SN13a y con los ensayos de TGA, FXIa y NAPTT. Los resultados se muestran en la tabla 17 y la tabla 18.

Tabla 17. Comparacion de la distribucion de tamano molecular de los dos recipientes finales.

HPLC

Poftmeros Oligo/Dfmeros Monomeros Fragmentos

Volumen de E1

0,47% 5,92% 93,61% -

Volumen de E2

6,33% 8,50% 83,97% 1,20%

Tabla 18. Comparacion de caractensticas adicionales de los dos recipientes finales.

PKKA TGA FXIa AAC SN13a NAPTT

PKKA UI/ml

% de plasma normal ng/ml de FXIa % mU/ml de FXIa (Plasma con FXI)

Volumen de E1

< 4 118,34 0,095 44 < 0,39 > 10 mg

Volumen de E2

16,5 109,11 0,23 57 167 > 10 mg

La primera parte del eluato de CM (E1) dio como resultado un volumen final con menor contenido en agregados, dfmeros y fragmentos, con un bajo contenido en FXIa, con un resultado de TGA proximo al del plasma normal, con actividad de PKA y amidolftica tal como se mide con SN-13 por debajo del ftmite de deteccion y sin NAPTT disminuido. Las actividades de FXIa, PKKA y similar a FXIa estan enriquecidas en la segunda parte, donde el contenido en oligo/dfmeros, fragmentos y poftmeros de IgG tambien es mayor. Resulta interesante que el valor de AAC en la porcion delantera del eluato (E1) es menor que en la porcion trasera del eluato (E2).

Ejemplo 12

Para evaluar adicionalmente los metodos divulgados para reducir el contenido amidolftico de una composicion de inmunoglobulinas, se realizo otro experimento a gran escala, usando un precipitado de la fraccion II como material de partida. Brevemente, se preparo el precipitado de la fraccion II tal como se describe en el ejemplo 11, excepto en que el material de partida para este experimento fue un precipitado de la fraccion II formado a partir de plasma de origen humano combinado recogido en Europa, que se sometio a crioprecipitacion y se uso para recuperar FEIBA y antitrombina III (ATIII) a traves de adsorcion. Por lo demas, se uso cromatograffa de intercambio cationico en CM- Sefarosa y procesamiento posterior tal como se describe en el ejemplo 11.

El cromatograma de las etapas de lavado y elucion de intercambio cationico se muestra en la figura 4. La lmea 1 muestra la absorbancia UV, la lmea 2 la conductividad y la lmea 3 el pH en la salida de la columna. La densidad optica a 280 nm indica una separacion parcial de dos fracciones durante la elucion de la protema de la columna de ff de CM-Sefarosa. El pH en la salida de la columna comienza a aumentar justo tras el inicio de la nueva elevacion de la absorbancia UV durante la elucion. En este punto, se separaron las dos fracciones de eluato (F4 y F5, denominadas en el presente documento E1 y E2). El balance de masas para la serie de purificacion posterior se muestra en la tabla 19.

Tabla 19. Balance de masas para la purificacion a gran escala de IgG a partir del precipitado de la fraccion II.

5

10

15

20

25

30

35

40

TPUV Protema Rendimiento Rendimiento

(%) (g) (%) (g/l de plasma)

Dis. de la frac. II

5,09 174,15 100,00 4,03

CWSS

2,98 168,81 96,93 3,91

E1 de CM

2,69 143,69 82,51 3,33

E2 de CM

0,94 21,28 12,22 0,49

Volumen de E1

9,28 127,68 73,32 2,96

Volumen de E2

9,63 19,95 11,46 0,46

Como en el ejemplo 11, se encuentra aproximadamente el 15% de la protema total en la segunda parte del pico de elucion. Esta es la perdida de rendimiento debida a la detencion de la recogida de E1 tras 2,7 volumenes de columna. Se analizaron los recipientes finales preparados a partir de las dos fracciones de elucion de CM (E1 y E2) para determinar la distribucion de tamano molecular, la actividad anti-complementaria, la actividad amidolttica con el sustrato SN13a y con los ensayos de TGA, FXIa y NAPTT. Los resultados se muestran en la tabla 20 y la tabla 21.

Tabla 20. Comparacion de la distribucion de tamano molecular de los dos recipientes finales.

HPLC

Polfmeros Oligo/Dfmeros Monomeros Fragmentos

Volumen de E1

0,54% 4,95% 94,49% 0,02%

Volumen de E2

6,49% 6,71% 85,18% 1,62%

Tabla 21. Comparacion de caractensticas adicionales de los dos recipientes finales.

PKKA TGA FXIa AAC SN13a NAPTT

PKKA UI/ml

% de plasma normal ng/ml de FXIa % mU/ml de FXIa (Plasma con FXI)

Volumen de E1

< 4 114,34 0,081 57 1,15 > 10 mg

Volumen de E2

34,2 157,18 3,208 59 276 > 10 mg

La caracterizacion bioqmmica de los volumenes estabilizados derivados de las partes primera y segunda de la fraccion de IgG eluida revelo que la primera parte de la elucion esta esencialmente libre de FXIa y otras protemas no deseables que producen niveles elevados de TGA y disminuidos de NAPTT, mientras que las actividades de PKKA, FXIa y similar a FXIa estan enriquecidas en la segunda parte, donde el contenido en oligo/dfmeros, polfmeros y fragmentos de IgG tambien es mayor. Los valores de AAC no difieren significativamente en los volumenes de la primera parte y la segunda parte del eluato. Los resultados confirman en general los hallazgos en el ejemplo 11.

Ejemplo 13

Para evaluar adicionalmente los metodos divulgados para reducir el contenido amidolftico de una composicion de inmunoglobulinas, se realizo otro experimento a gran escala, usando un precipitado de la fraccion II como material de partida. Brevemente, se preparo el precipitado de la fraccion II tal como se describe en el ejemplo 11, excepto en que el material de partida para este experimento fue un precipitado de la fraccion II formado a partir de plasma de origen humano combinado recogido en los Estados Unidos, que se sometio a crioprecipitacion y se uso para recuperar FEIBA y antitrombina III (ATIII) a traves de adsorcion. Por lo demas, se uso cromatograffa de intercambio cationico en CM-Sefarosa y procesamiento posterior tal como se describe en el ejemplo 11.

El cromatograma de las etapas de lavado y elucion de intercambio cationico se muestra en la figura 5. La lmea 1 muestra la absorbancia UV, la lmea 2 la conductividad y la lmea 3 el pH en la salida de la columna. La densidad optica a 280 nm indica una separacion parcial de dos fracciones durante la elucion de la protema de la columna de ff de CM-Sefarosa. El pH en la salida de la columna comienza a aumentar justo tras el inicio de la nueva elevacion de la absorbancia UV durante la elucion. En este punto, se separaron las dos fracciones de eluato (F4 y F5, denominadas en el presente documento E1 y E2). El balance de masas para la serie de purificacion posterior se muestra en la tabla 22.

Tabla 22. Balance de masas para la purificacion a gran escala de IgG a partir del precipitado de la fraccion II.

TPUV Protema Rendimiento Rendimiento

(%) (g) (%) (g/l de plasma)

Dis. de la frac. II

4,02 125,70 100,00 3,09

CWSS

2,31 120,19 95,62 2,95

E1 de CM

2,73 104,01 82,74 2,55

E2 de CM

0,85 18,20 14,48 0,45

Volumen de E1

9,33 91,11 72,49 2,24

Volumen de E2

9,01 16,35 13,00 0,40

5

10

15

20

25

30

35

40

Como en el ejemplo 11, se encuentra aproximadamente el 15% de la protema total en la segunda parte del pico de elucion. Esta es la perdida de rendimiento debida a la detencion de la recogida de E1 tras 2,7 volumenes de columna. Se analizaron de nuevo los recipientes finales preparados a partir de las dos fracciones de elucion de CM (E1 y E2) para determinar la distribucion de tamano molecular, la actividad anti-complementaria, actividad de PKKA y similar a FXIa con el sustrato SN13a y con los ensayos de TGA, FXIa y NAPTT. Los resultados se muestran en la tabla 23 y la tabla 24.

Tabla 23. Comparacion de la distribucion de tamano molecular de los dos recipientes finales.

HPLC

Polfmeros Oligo/Dfmeros Monomeros Fragmentos

Volumen de E1

0,67% 5,29% 94,03% -

Volumen de E2

6,48% 8,92% 83,74% 0,86%

Tabla 24. Comparacion de caractensticas adicionales de los dos recipientes finales.

PKKA TGA FXIa AAC SN13a NAPTT

PKKA Ul/ml

% de plasma normal ng/ml de FXIa % mU/ml de FXIa (Plasma con FXI)

Volumen de E1

< 4 109,53 0,080 44 1,23 > 10 mg

Volumen de E2

54,6 148,17 1,652 60 203 > 10 mg

La caracterizacion bioqmmica de los volumenes finales confirmo los resultados de los ejemplos 11 y 12. La primera parte de la elucion (E1) esta esencialmente libre de FXIa y otras protemas no deseables que producen niveles elevados de TGA y disminuidos de NAPTT, mientras que las actividades de FXIa y amidolttica estan enriquecidas en la segunda parte (E2), donde el contenido en fragmentos, polfmeros y oligoMmeros tambien es mayor aunque la separacion de suspension A se realiza mediante filtracion. Resulta interesante que el valor de AAC en el volumen estabilizado de la primera parte del eluato sea de nuevo menor que en el volumen de la segunda parte del eluato.

Tomados juntos, los resultados proporcionados en los ejemplos anteriores demuestran que la division del eluato de una columna de ff de CM-Sefarosa en dos fracciones permite la fabricacion de una composicion de inmunoglobulinas sustancialmente libre de actividades procoagulantes. Esto es cierto para fuentes de plasma variables (UE y EE.UU.) y esquemas de procesamiento anteriores.

Las perdidas de producto determinadas para las preparaciones de inmunoglobulina descritas en los ejemplos 11 a 13 son mayores que las observadas en los ejemplos 1 a 10. En los ejemplos 11 a 13, la division del pico de eluato tras 2,7 volumenes de columna da como resultado una perdida de aproximadamente el 15% de la protema total. Puesto que el cambio de pH del eluato se produjo posteriormente en los ejemplos 11-15, un corte de elucion posterior debena mejorar el rendimiento global, sin poner en peligro significativamente la separacion de actividades procoagulantes.

Los datos mostrados anteriormente demuestran que la division de un eluato de cromatograffa de intercambio cationico es un metodo solido para la produccion de composiciones de inmunoglobulinas que tienen actividades procoagulantes sustancialmente reducidas.

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritos en el presente documento son unicamente para fines ilustrativos y que los expertos en la tecnica sugeriran diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos.

Claims (17)

1. 5

   10

   15

   20
2. 2.

   25
3. 3.

   30
4. 4.
5. 5. 35
6. 6.

   40 7.
7. 8.

   45
8. 9.
9. 10.

   50
10. 11.

    55
11. 12.

    60

    REIVINDICACIONES

    Un metodo para reducir el contenido en factor XI (FXI) y/o factor XIa (FXIa) en una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma, comprendiendo el metodo las etapas de:

    (a) poner en contacto una composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma que comprende inmunoglobulinas IgG y FXI y/o FXIa con una resina de intercambio cationico dispuesta en una columna de cromatograffa en una primera condicion de disolucion que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de no mas de 11 mS/cm para unir las inmunoglobulinas IgG y al menos una fraccion del FXI y/o FXIa a la resina de intercambio cationico;

    (b) eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico poniendo en contacto la resina de intercambio cationico con un tampon de elucion que comprende un pH de al menos 7,5 y una conductividad de al menos 15 mS/cm para formar un eluato que comprende una porcion delantera y una porcion trasera; y

    (c) recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato,

    en el que la porcion delantera del eluato comprende una composicion de inmunoglobulinas IgG que tiene una cantidad reducida de actividad amidolttica en comparacion con la composicion de partida y la porcion trasera del eluato contiene una concentracion mayor de actividad amidolftica en comparacion con la porcion delantera del eluato.

    El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tampon de elucion comprende una conductividad de al menos 20 mS/cm.

    El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, que comprende ademas una etapa de lavado de la resina de intercambio cationico que tiene las inmunoglobulinas y FXI y/o FXIa unidos a la misma con un tampon de lavado que comprende un pH de no mas de 6,0 y una conductividad de menos de 11 mS/cm antes de eluir las inmunoglobulinas de la resina de intercambio cationico en la etapa (b).

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la resina de intercambio cationico es una resina de intercambio cationico debil.

    El metodo segun la reivindicacion 4, en el que la resina de intercambio cationico debil es una resina de intercambio cationico de carboximetilo.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 un pH de entre 7,5 y 8,5.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 cloruro de sodio entre 200 y 300 mM.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 glicina entre 100 mM y 300 mM.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la porcion delantera del eluato consiste en no mas del 70% del eluato.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende recoger un eluato que tiene un pH de no mas de 7,0 por separado de un eluato que tiene un pH de mas de 7,0.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa de recoger la porcion delantera del eluato por separado de la porcion trasera del eluato comprende monitorizar el pH del eluato.

    El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa de recoger la porcion delantera del eluato comprende las subetapas de:

    (i) monitorizar la densidad optica del eluato a 280 nm (DO280);

    (ii) empezar la recogida cuando la DO280 del eluato se eleva por encima de una primera DO280 umbral de al menos 50 mUA; y

    (iii) finalizar la recogida cuando la DO280 del eluato desciende por debajo de una segunda DO280 umbral de no menos de 1 o 2 UA.

    a 5, en el que el tampon de elucion comprende

    a 6, en el que el tampon de elucion comprende

    a 7, en el que el tampon de elucion comprende

    5

    10

    15

    20
12. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en el que el tampon de lavado comprende un pH de entre 5,0 y 6,0.
13. 14. El metodo segun la reivindicacion 13, en el que el tampon de lavado comprende un pH de 5,5 + 0,2.
14. 15. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que menos del 50% del FXI y/o FXIa unido a la resina de intercambio cationico en la etapa (a) esta presente en la porcion delantera del eluato recogido en la etapa (c).
15. 16. El metodo segun la reivindicacion 15, en el que la cantidad de FXI y/o FXIa se determina realizando un ensayo de la actividad amidolttica usando un sustrato espedfico para FXIA.
16. 17. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a) es un precipitado de la fraccion plasmatica en suspension seleccionado del grupo que consiste en un precipitado de la fraccion I, un precipitado de la fraccion I+II+NI, un precipitado de la fraccion II+III, la fraccion IV-1, un precipitado A de Kistler-Nitschmann, un precipitado B de Kistler-Nitschmann y un precipitado modificado de los mismos.
17. 18. El metodo segun la reivindicacion 17, en el que la composicion de inmunoglobulinas derivada de plasma proporcionada en la etapa (a) es un precipitado de la fraccion II en suspension.