WO2007066017A2 - Procede de preparation d'un concentre de facteur h et utilisation de ce concentre de facteur h au titre de medicament - Google Patents

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Claudine Mazurier
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Bernadette Cauvin
Frédéric DHAINAULT
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Definitions

  • the invention relates to the use of Factor H for the manufacture of a medicament intended for the treatment of Hemolytic Uremic Syndrome (HUS), a method of purifying Factor H from fresh frozen plasma and the factor H obtained by this method.
  • HUS Hemolytic Uremic Syndrome
  • Hemolytic uremic syndrome is defined by the association of microangiopathic hemolytic anemia, thromb ⁇ penia and kidney damage. It is the main cause of acute renal failure in children under 3 years of age.
  • HUS There are two forms of HUS.
  • HUS occurs during the summer period after an episode of diarrhea, often bloody.
  • the typical HUS is secondary to an infection, in the majority of cases an infection with enteropathogenic Escherichia coli, in particular the serotype 0157: H7, producer of verotoxins.
  • HUS HUS-like fatty liver disease
  • Atypical HUS can occur at any age. It represents only 5% of cases of HUS in children.
  • the clinical signs of the syndrome are due to the development of rich micro-cells platelets in small vessels. This particularly affects the gloraerules of the kidney causing acute kidney damage.
  • Atypical HUS can be sporadic but it is often familial. In these two situations, the disease generally presents a recurrent development by pushing. His prognosis is poor.
  • HUS may be associated with hypocomplementemia.
  • the complement plays an essential role in the defense of the organism against infectious agents and in the inflammatory process.
  • Plasma complement proteins are approximately 20 and function either as enzymes, as binding proteins, or as regulators (inhibitors or activators).
  • the complement can be activated by two different routes: the conventional route and the alternative route.
  • Factor H is a 155 kDa protein found in plasma at a concentration of 110-615 ⁇ g / ml. It is synthesized in the liver, macrophages, fibroblasts, endothelial cells and platelets. The secreted form of the protein is made up of 20 repeating units of 60 amino acids.
  • the H factor is the central regulator of the alternative pathway of complement. It participates in the regulation of the level of immune complexes in the blood and therefore in the balance between the processes resulting in their generation or degradation ⁇ With factor I, factor H inactivates free or bound C3b molecules on the surface of cells. Thus, the immune complexes composed of an antigen-antibody complex complexed with the component of complement C3b can no longer activate the subsequent cascade of complement (components C5-C9).
  • the I Factor H behaves first of all as a co-factor of the factor I.
  • the Factor H and the Pactedr I proceed to the transformation of the protein C3b of the complement into C3bi (inactive molecule) by a cleavage of the • chain of the C3b protein.
  • the C3b protein thus inactivated can no longer fulfill its role in the functioning of the complement, and no longer participates in the formation of C3 convertase;
  • the 1 Factor H is involved in the endothelial and platelet mechanisms is finally involved in the dissociation of the preformed C3 convertase (C3bBb), in the alternative way of the activation of the complement.
  • the latter activity depends directly on the molecular integrity of Factor H, and is more particularly dependent on the presence of an intact asn323-asn324 link in Factor H.
  • Recurrence after transplantation in patients with an atypical form of HUS is observed in approximately 25% of cases.
  • the prognosis for recurrence is poor; graft loss related to recurrence is the rule,
  • the first-line treatment consisting of infusions of fresh frozen plasma with or without plasma exchange was started empirically in the 1970s long before the role of complement in HUS was known.
  • Today, fresh frozen plasma infusions with or without plasma exchange are the basis for HUS therapy, however, the amounts and frequency of fresh frozen plasma infusions are still empirically determined.
  • fresh frozen plasma contains anti-A or anti-B hemolysins and must be reserved for patients of the same ABO group, or at least for patients lacking A or B antigens corresponding to hemolysins (rule of reverse compatibility with that of red blood cells). Failure to comply with these rules exposes the recipient to post-transfusion hemolysis of red blood cells due to ABO incompatibility, In addition, in order to avoid any risk of immuno-immunization vis-à-vis the D antigen of the Rhesus system, it is necessary, especially in patients at risk (girls, women of childbearing age, multiririsfies ) to carry out infusions where the patient and the donor have the same characteristics with regard to this antigen,
  • PFC can cause hyperhosphatemia in HUS patients because the phosphate concentration in the PPC, in particular the viro-attenuated plasma (PVA), is very high (9 to 12 ntirool / lj) and the patient HUS suffers from kidney failure.
  • PVA viro-attenuated plasma
  • Another treatment is a kidney transplant.
  • the risk of recurrence after transplantation is very high,
  • Treatment of recurrence consists of infusions of fresh frozen plasma, plasma exchanges with or without plasma infusions with [very inconsistent results. These inconsistent results can be explained by the number and volume of PFC infusions, each infusion representing a pool of donations from multiple donors and
  • liver transplant As factor H is synthesized in the liver, it appears; logical to propose a liver transplant or even a combined liver-kidney transplant. !
  • Factor H for example in the form of a concentrate of factor H from fresh frozen plasma, makes it possible to restore factor H deficiency in patients with HUS while reducing the volumes injected and the injection times with an effective, stable and safe product.
  • factor H in the immediate post-liver transplant period makes it possible to compensate for the low production of factor H by the transplanted liver and thus for the immediate relapse and rejection of the graft.
  • the present invention also relates to a factor H purification process comprising the steps of;
  • the main object of the present invention is the use of Factor H for the manufacture of a medicament intended for the treatment of Hemolytic Uremic Syndrome (HUS), in particular of the typical form of HUS or of the atypical form of HUS.
  • HUS Hemolytic Uremic Syndrome
  • a preferred form of the invention is the use of Facteuir H for the manufacture of a medicament intended for the treatment of Hemolytic Uremic Syndrome, Factor H being purified from fresh human plasma! or plasma fractions from purification by conventional methods well known to those skilled in the art.
  • This purification is well known to those skilled in the art. It can be carried out by chromatography using a lysine-sepharose column, QAE-Sephadex, DEAE-Toyopearl, Sephacryl S-300 and hydroxyapatite.
  • Factor H resulting from purification from plasma; fresh frozen is for example in the form of a factor H concentrate.
  • Hemoly, ⁇ re ⁇ ique tick the Factor H being obtained by genetics, by the expression of its gene in a cellulje chosen in the group made up of bacteria, yeast
  • a particular embodiment of the invention consists in the use of Factor H for the manufacture of a medicament intended for the treatment of hememic hemorrhagic syndrome, the medicament thus obtained being BOUS lyophilized form.
  • An additional embodiment of the invention consists in the use of Factor H for the manufacture of a medicament intended for the treatment of the Uremic Hemolytic Syndrome, the medicament thus obtained having undergone at least one method of elimination or iinactivation of '' at least one infectious agent.
  • viruses and ATNCs unconventional transmissible agents
  • prion protein a virus that has a high degree of virus.
  • viruses and ATNCs conventional transmissible agents
  • the drug may be inactivated viral 'lying.
  • viral inactivated is understood to mean that the medicament has undergone at least one method of viral inactivation, known to a person skilled in the art by treatment with china products, for example by solvent / detergent / and / or heat, for example by dry heating or pasteurization, and / or by nanofiltration.
  • HIV human acquired immunodeficiency virus
  • HAV hepatitis A virus
  • HBV hepatitis B virus
  • CMV cytomegalovirus
  • BVDV bovine viral diarrhea virus
  • Another subject of the invention is a lyophilized and virally inactivated pharmaceutical composition, for example as described above, and comprising factor H and pharmaceutically acceptable excipients and / or vehicles.
  • Another object of the present invention relates to a method for purifying Factor H comprising the steps i consisting in:
  • step 3 adjudicate the pH of the fraction not retained after the chroma; tography of step 3 to allow the binding of the Fector H to a gel / resin of chromajtographic support comprising a grafted ligand of the Heparijne type,
  • the chromatographic support onto which a heparin ligand from step 3) is grafted is a heparin Sepharose gel / resin.
  • the chromatographic support onto which a heparin ligand from step 4) is grafted is a heparin Sepharose gel / resin.
  • the gel / resin chromatography of the cation exchanger type of the strong acid type of step 6) is a ch.romatograpb.ie of the SP Sepharose type.
  • the chromatography on a gel / resin of anion exchanger type of strong acid type of step 8) is a Q Sepharose FF type chromatography or equivalent.
  • the pH of the fraction not retained in step 4) is adjusted to be within the range from pH 5.5 to pH 6.5 and preferably to be equal to pH 6.0.
  • the pH of the fraction diluted in step 8) is adjusted to be within the range from pH 6.5 to pH 7.5.
  • the purification process of the invention is the only one known process for the purification of a factor H from plasma which proves to be realize ⁇ sable, and which makes it possible to obtain a concentrated factor H purified in the absence of inhibitors of chemical or synthetic proteases, thus leaving no trace of cesj inhibitors in the final product.
  • protease inhibitors inhibit the action of trypsin-like proteins, present in serum and plasma, which are responsible for the cleavage of the protein link joining the amino acids asn323 and asn 324 of the H factor molecule.
  • addition of protease inhibitors contributes to the decrease in the proteolysis of this factor and therefore improves its stability.
  • pjotease inhibitors are often highly toxic compounds, making them unsuitable for an industrial process of production of factor H intended for therapeutic use.
  • the method of the invention has a significant advantage in that it makes it possible to obtain a factor H concentrate of which the 3 main types of activities are conserved, which none of the H factors described in the state of technique does have.
  • the Facteujr H obtained by the process of the invention can therefore fill its activity as central regulator of the alternative pathway to complement, an activity which is revealed! deficient in HUS patients, especially atypical HUS.
  • the Factor H produced by the process of the invention advises its dissociation activity of the preformed C3 convertase in the alternative route of the complement and appears capable of being used in the treatment of HUS thanks to its activity
  • AS O.8 to 0.9
  • Mistletoe although therapeutically effective, has many disadvantages, as was written in the introduction to the present application.
  • the administration of plasma introduces into the body additional proteins which are useless for the treatment of HUS (albumin, fibrinogen, etc.) which, on the other hand, can trigger undesirable reactions linked to protein overload or cause reactions allergic, known as "serial illness".
  • the inactivation of transmissible viruses present in the plasma is generally more difficult and less efficient than that implemented to inactivate the viruses present in blood derivatives.
  • the Factor H concentrate obtained by the process of the invention can therefore benefit from recognized and proven treatments providing documented viral safety.
  • the procedure used to purify the Factor H is shown in schematic form in Figure 1.
  • the fresh frozen human plasma is thawed at a temperature of between 1 ° C and 6 ° C, then the plastic supernatant of the cryoprecipitate is separated from the insoluble traction of the cryoprecipitate by centriifugation.
  • the plasma supernatant of the cryoprecipitate obtained is subjected to chromatography on resin / gel of anion exchanger type (for example , a gel / resin of the DEAE Sepha & ex type), in order to separate the Factors dependent on vitamin K from the plasma supernatant by retention of these Factors on the resin / gel.
  • resin / gel of anion exchanger type for example , a gel / resin of the DEAE Sepha & ex type
  • fraction A The fraction of plasma supernatant not retained (fraction A), the concentration of Factor H is in a range from about 400 to about 500 i ⁇ g of Factor H / liter, is then subjected to a! affinity chromatography on a gel / resin of ty & e Heparin Sepharose FF, in order to separate
  • PH 1id the fraction A not retained (fraction B), the concentration of Factor H of which is included in a ga ⁇ time
  • Fraction C The eluted fraction containing Factor H (Fraction C) is diluted, then subjected to a chromatography on gel / resin of the cation exchanger type of strong acid type! for example an SP type gel / resin
  • the Factor H retained on the gel / resin is then eluted using a buffer having a higher ionic strength than that of the buffer used for i
  • Fraction D The eluted fraction containing Factor H (Fraction D) is then subjected to a viral inactivation step by treatment with a solvent of detergent type, for example Polysorbate 80 and TnBP.
  • a solvent of detergent type for example Polysorbate 80 and TnBP.
  • Fraction D is then diluted, and the pH of this fraction is adjusted to be within a range from pH 6.5 to pH 7.5.
  • the fraction D is then diluted, and the pH of this fraction is adjusted to be within a range from pH 6.5 to pH 7.5.
  • the fraction D is then diluted, and the pH of this fraction is adjusted to be within a range from pH 6.5 to pH 7.5.
  • the fraction D is then diluted, and the pH of this fraction is adjusted to be within a range from pH 6.5 to pH 7.5.
  • a gel / resin of the anion exchanger type of strong acid type for example a gel / resin of the Q type Sepharose FF or an equivalent.
  • the Factor H retained on the gel / resin is eluted using a buffer having an ionic strength greater than that of the tamipon used to balance the gel / resin.
  • the agents previously introduced to carry out viral inadivation by treatment with a solvent of detergent type are eliminated during this tographic chroma 1 step, and the degree of purity of Factor H is increased.
  • Fraction E The eluted fraction containing Factor H (Fraction E) is then subjected to a viral elimination step by nanofiltration on a filter having a porosity of approximately 15 nm. This viral elimination treatment effectively eliminates viruses, and
  • the resulting solution (fraction F) is finally concentrated and adjusted by ultrafiltration then filtered on a 0.22 ⁇ m filter.
  • Example 2 Method for Assaying the Factor H Activity
  • the wells of an ELISA plate (of the 96 well type) are covered with a solution of purified C3b protein, having a concentration of 2.5 g / ml (Calbiochem: ref . 341274) in 0.2 M sodium carbonate buffer. To do this, 100 ⁇ l of solution are introduced into the wells 'and the plates are incubated for 1 hour ' at 37 ° C and 1 night at 4 ° C.
  • washes of 300 ⁇ l / well are carried out with a 10 mM sodium phosphate buffer solution, 25 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.2.
  • the aspecific sites are then saturated by an incubation of one hour at 37 ° C with 300 ⁇ l / well of a 10 mM sodium phosphate buffer solution, 25 mM NaCl, pH 7.2, Tween 20 0.05%, and containing 1% BSA.
  • washing the wells is carried out with the layering solution described above.
  • 10 ⁇ gi / ml, 1 ⁇ g / ml, 0.25 ⁇ g / ml, 0.0625 ⁇ g / ml, 0.015625 ⁇ g / mli 0.00390625 ⁇ g / ml and 0.001 ⁇ g / ml is prepared. 100 ⁇ il of each solution are placed in a different well and an incubation of 30 min at 37 ° C is carried out. Three successive washes of 300 ⁇ l / well are then carried out with a 10 mM sodium phosphate buffer solution, 25 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.2.
  • a solution of human anti-factor E goat antibody (Calbio ⁇ hem ref: 341272) is diluted to 1/2000 in a PBS buffer (Sigma P-3813), pH 7.4, containing
  • the substrate of OPD peroxidase (Sigma), at a concentration of 5 mg / 10 ml in a solution of sodium citrate, is added to the wells, as well as 10 ⁇ l of H 3 O 3 , at a rate of 100 ⁇ l / well in the end.
  • the reaction mixture is left in contact with the wells for approximately 10 minutes before stopping the reaction by adding 50 ⁇ l of 4N H-SO 4 per well.
  • the absorbance of the solution contained in the wells is then measured at a wavelength of 492 nm.
  • the corresponding results are presented in FIG. 2.
  • the graphical representations appearing in FIG. 2 give the value of the absorbance measured as a function of the concentration of Factor H or as a function of the concentration of protein (SAH).

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation de Facteur H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrome Hémolytique Urémique (SHU), un procédé de purification du Facteur H à partir de plasma frais congelé et le concentré de facteur H obtenu par ce procédé.

Description

Procédé de préparation d'un concentré de Facteur H et utilisation de ce concentré de Facteur H au titre de médicament
L'invention concerne l'utilisation de Facteur H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrome Hémolytique Urémique (SHU) , un procédé de purification du Facteur H à partir de plasma frais congeljé et le facteur H obtenu par ce procédé.
Domaine de l'invention Le syndrome hémolytique et urémique (SHU) est défini par l'association d'une anémie hémolytique microangiopathique, d'une thrombσpénie et d'une atteinte rénale. 11 est la cause principale des insuffisances rénales aiguës chez l'enfant de moins de 3 ans.
II existe deux formes de SHU.
Dans sa forme typique, le SHU survient pendant la période estivale après un épisode de diarrhée, souvent sanglante. Le SHU typique est secondaire à une infection, dans la majorité des cas une infection à Escherichia coli entéropathogène, en particulier le sérotype 0157 :H7, producteur de vérotoxines.
A côte de la forme typique, certains patients ont une présentation différente. Les formes atypiques de SHU se présentent sans prodromes et ont une évolution plus chronique aboutissant fréquemment à l'insuffisance rénale chronique. Le SHU atypique peut survenir à n'importe quel âge. II ne représente que 5% des cas de SHU chez l'enfant. Les signes cliniques du syndrome sont dus au développement de raicro-caiIlots riche plaquettes dans les petits vaisseaux. Ceci affecte particulièrement les gloraérules du rein causant une atteinte rénale aigue. Le SHU atypique peut être sporadique mais il est souvent familial. Dans ces deux situations, la maladie présente généralement un développement récurrent par poussée. Son pronostic est faible. De plus, il existe un risque élevé de récidive de la maladie après une transplantation rénale, menant au rejet du greffon dans la plupart des cas.
Le SHU peut être associé à une hypocomplémentémie.
Le complément joue un rôle essentiel dans la défense de l'organisme contre des agents infectieux et dans le processus inflammatoire.
II comprend à la fois des protéines plasmatique, de nombreux récepteurs cellulaires de surface différents, certains présents sur les cellules inflammatoires et d'autres sur les cellules du système immunitaire, ainsi ique des protéines membranaires de régulation qui protègent les cellules hôte d'une auto-attaque.
Les protéines plasmatiques du complément sont environ au noimbre de 20 et fonctionnent soit comme des enzymes, soit comme des protéines de liaison, soit comme Ides régulateurs (inhibiteurs ou activateurs) .
Le complément peut être activé par deux voies différentes : la voie classique et la voie alternative.
Figure imgf000004_0001
La voie classique est activée par la liaison des antiedrps à la particule étrangère. Elle est donc dépendante des anticorps.
La volie alternative est activée par l'invasion de micro-organismes , donc elle est indépendante des antiedrps et extrêmement importante dans la défense de l'hôtel contre les infections bactériennes.
Le facteur H est une protéine de 155 kDa rencontrée dans le plasma à une concentration de 110-615 μg/ml. Il est synthétisé dans le foie, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les plaquettes. La forme sécrétée de la protéine est composée de 20 unités répétitives de 60 acides aminés. Le facteur H est le régulateur central de la voie alternative du complément. II participe à la régulaition du taux de complexes immuns dans le sang et par conséquent à l'équilibre entre les processus résu±uant en leur génération ou en leur dégradation< Avec le facteur I, le facteur H inactive les molécules de C3b libres ou liées à la surface des cellules. Ainsi,j les complexes immuns composés d'un, complexe antigène-anticorps complexé avec le composant du complément C3b ne peuvent plus activer la cascade subséquente du complément (composants C5-C9) .
La fonction du Facteur H peut se décomposer en trois
I
activités principales Ï
1) Le I Facteur H se comporte tout d'abord comme un co- facteujr du facteur I. Ainsi, le Facteur H et le Pactedr I procèdent à la transformation de la protéine C3b du complément en C3bi (molécule inactive) par un clivagre de la chaîne • de la protéine C3b. La protéine C3b ainsi inactivée ne peut alors plus remplir son rôle idans le fonctionnement du complément, et ne participe plus à la formation de la C3 convertase ; 2) Le1 Facteur H est impliqué dans les mécanismes de endothéliales et aux plaquettes
Figure imgf000005_0001
est enfin impliqué dans la dissociation de la C3 convertase préformée (C3bBb) , dans j la voie alternative de l'aσtivation du complément. Cette dernière activité dépend directement de l' |ntégrité moléculaire du Facteur H, et s'avère plus particulièrement dépendante de la présence d'une liaisαjn asn323-asn324 intacte dans le Facteur H.
!
Le déficit ou l'absence du Facteur H, responsables de nombrejux cas de SHϋ atypique, entraînent par conséquent une hyperactivation du complément, Ce qui se traduit, chez certains patients, par l'observation de dépjβts de protéines C3 lors de biopsies rénales, et
I
d'une idiminution du taux de protéine C3 présent dans la circulation.
Chez certains patients atteints du SHU atypique, le taux Joas de C3 n'est observé çpie pendant la phase aiguë j de la maladie. Des arguments forts plaident en faveur: du rôle d'un déficit qualitatif et quantitatif en facteur H souvent associé à une baisse du taux de C3, dans la pathogénie de certains SHU atypiques (Rougier N, Kazatchkine MD, et al., Human complément factoij H deficiency associated with hemolytiσ urémie syndrcjme, J. Am. Soc. Nephrol. 1998 ; 9:2318-2326). Le dφficit en facteur H est responsable d'une
I
activaition permanente de la voie alterne du complément respoφable d'un taux bas de C3.
Une liaison entre le SHU atypique et une région codant pour lies protéines régulatrices du complément, en particulier le facteur H, située sur le chromosome 1, a été; démontrée (Noris et al., Hypocomplementemia disclcjses genetic prédisposition to haemolytic uraemic syndrcjme and thrombotic thrombocytopenic purpura : rôle φf factor H abnormalities, J". Am. Soc Nephrol. 1999, '10:281-293) ; (Warwicker et al., Genetic studies
I
into •' haemolytic uraemic syndrome, Kîdney Int, 1998 ;|53: 836-844) ; (Warwicker et al., Familial relapaing haemolytic uraemic syndrome and complément factor] H deficienσy, Nephrol JDial Transplaixt 1999;l|4:1229-1233) .
Des mutations du gène du facteur H ont ensuite été identijfiées dans des formes familiales de SHU avec une transmission autosomiφie récessive ou dominante (Buddljes et al., Complément factor H gène mutation associjated with autosomal récessive atypical haemolytic uraemic syndrome, Am J ffυm Genêt, 2000;β!6:1721-1722) ; (Caprioli et al,, The molecular foasis i of familial haemolytic uraemic syndrome: mutatiion analysis of factor H gène reveals a hot spot in shqrt consensus repeat 20, J Am Soc Nephrol 2001 ; 12 : 297-307) ; {Ohali et al., Hypocomplementemic autosohal récessive haemolytic uraemic syndrome with de crëased factor H, Pediatr Nephrol 1998; 12: 619-624) ; (Ying et al., Complément factor H gene mutation associated with autosomal récessive atypical haemolytic uremic syndrome, Am j Hum Genet 1999;65:1538-1546) .
La récidive après transplantation chez les patients ayant une forme atypique de SHU est observée dans environ 25% des cas. Le pronostic en cas de récidive est mauvais ; la perte du greffon en rapport avec la récidive est la règle,
Art antérieur
Le traitement de première intention consistant en des perfusions de plasma frais congelé avec ou sans échanges plasmatiques a été entrepris empiriquement dans les années 70 bien avant que l'on connaisse le rôle jdu complément dans le SHU. Aujourd'hui, les perfusions de plasma frais congelé avec ou sans échanges plasmatiques servent de base à la thérapie du SHU, jcependant, les quantités et la fréquence des perfusions de plasma frais congelé sont encore déteririnées de façon empirique.
Ces perfusions doivent être répétées à intervalles régulijers de deux fois par semaine à deux fois par mois, chaque perfusion prenant de 2 à 3 heures,
Ce traitement est donc long et répétitif pour le patient .
Les quantités de plasma frais congelé transfusé sont importantes, ce qui augmente les risques classiques d'une [perfusion de plasma frais congelé.
En premier lieu, le plasma frais congelé (PFC) contient des hémolysines anti-A ou anti-B et doit être réservlé aux malades du même groupe ABO, ou tout au moins aux malades dépourvus d'antigènes A ou B corresipondant aux hémolysines (règle de compatibilité inverse de celle des globules rouges) . Le non-respect de ces règles expose le receveur à une hémolyse post- transfusionnelle des globules rouges par incompatibilité ABO, Par ailleurs, dans le but d'éviter tout risque d'allo- irtimunisation vis-à-vis de l'antigène D du système Rhésus, il est nécessaire, surtout ches les malades à risqua (filles, femmes en âge de procréer, multitiraïisfuses) de réaliser des perfusions où malade et donneur ont les mimes caractéristiques au niveau de cet antigène,
En de Iuxième lieu, le PFC peut entraîner une hyperfjhosphatémie chez les patients SHU car la concentration en phosphate dans le PPC, en particulier le plasma viro-atténué (PVA) , est très élevée (9 à 12 ntirool/lj) et le patient SHU souffre d'une insuffisance rénale. La concentration élevée en phosphate du PVA est (susceptible d'entraîner chez les patients transfusés avec du PVA une hyperphosphatémie, d'autant plus i portante que :
- l'es volumes de PVA transfusés sont importants,
- qu'ils sont répétés de façon journalière,
" que pré-existe chez le patient une insuffisance riénale,
- que pré-existe chez le patient une hyperphosphatémie.
I Ensuitje, les quantités de PFC perfusées peuvent entraîner une surcharge protéique et/ou une surcharge en cijtrate qui réduit la concentration en calcium i
circulant . Enfin,I le PFC entraîne un risque d'allergies, ainsi que dé transmission d'agents infectieux. En effet, les méthoφs de détection et d'inactivation actuelles ne ne présentent pas toujours une sensibilité et une capacité d'inactivation suffisantes- pour permettre la détection et l'élimination des agents infectieux potentiellement présents dans le plasma frais congelé.
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L'association des échanges plasmatiques aux perfusions de pljasma frais congelé s'impose quand les volumes perfus|és sont trop importants pour être éliminés par la dijirèse et pour maintenir une tension artérielle
!
normale. Cette association présente des risques
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supplémentaires significatifs, pour la plupart dus à l'accès vasculaire (nécessité d'une voie centrale), à la surcharge volurrdque, à la réaction anaphylactique, aux problèmes de coagulation et à la transmission de maladies virales »
De plτjis, les échanges plasmatiques sont difficiles à mettre; en oeuvre chez les jeunes enfants.
Un autre traitement consiste en une transplantation rénalej. Cependant, le risque de récidive après transplantation est très élevé,
De plus, le diagnostic après transplantation rénale chez jles patients SHUa (SHU atypique) peut être difficile. Il peut être difficile de faire la différence entre une récidive et un rejet vasculaire aigu 'ou un rejet chronique sur une biopsie du transpilant.
Le traitement de la récidive consiste en des perfusions de plasma frais congelé, des échanges plasmaitiques avec ou sans perfusions de plasma avec des [résultats très inconstants. Ces résultats inconstants peuvent être expliqués par le nombre et le volumel des perfusions de PFC, chaque perfusion repré entant un pool de dons de plusieurs donneurs et
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pas un lot homogène,
Comme île facteur H est synthétisé dans le foie, il paraît; logique de proposer une transplantation hépatijque voire une transplantation combinée foie- rein. !
Cette .transplantation est toujours un. choix difficile pour les médecins et les parents et présente les risquejs opératoires et de rejet de toute
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transplantation hépatique. Résume de l' invention
Pour pallier à ces inconvénients de l'art antérieur, le Deψandeur a observé de façon surprenante qu'il est possible d'utiliser du facteur H pour la fabrication d'un Médicament destiné au traitement du SHU,
Le facteur H, par exemple sous la forme d'un concentré de faέteur H à partir de plasma frais congelé, permet de rejstaurer la déficience en facteur H chez les patients atteints du SHU tout en diminuant les volumes injectjés et les temps d'injection avec un produit efficace, stable et sûr.
En particulier, l'administration de facteur H dans la période immédiate post-transplantation hépatique permet de pallier à la faible production de facteur H par le foie transplanté et ainsi à la rechute immédiate et au rejet du greffon.
! La présente invention concerne également un procédé de purification du Facteur H comprenant les étapes consistant à ;
1)préparer le surnageant d'un cryoprécipité du plasma, 2) souπjettre ce surnageant à une chromatographie sur gel/réjsine de type échangeur d'anions,
3) soumettre la fraction non retenue à une chromatographie sur un(e) gel/résine comportant un ligandj greffé de type Héparine,
4)Ajuster le pH de la fraction non retenue après la chromajtog-raphie de l'étape 3 pour permettre la liaison du Facteur H à un(e) gel/résine de support chroαiatographique comportant un ligand greffé de type Héparijne,
5)Eluejr le facteur H par un tampon de force ionique supérijeure à celle du tampon d'équilibrage du gel/de la résline,
6}Dilu|er la fraction éluée, puis la soumettre à une chromatographie sur gel/résine de type échangeur de cations de type acide fort,
7)Eluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage du gel/de la résine,
8)Diluer la fraction éluée, puis la soumettre à une chromaitographie sur gel/résine de type échangeur d'anions de type acide fort,
9) Laver le gel/la résine et éluer le facteur H,
10) Préparer un concentré de facteur H.
Description détaillée de l'invention Figures :
Figure 1 : Schéma du procédé de purification du facteur H
Figure 2 : Dissociation de la C3 convertase par le
Facteur H
L'objet principal de la présente invention est l'utilisation du Facteur H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrome Hémolytique Urémique (SHU) , en particulier de la forme typiquje du SHU ou de la forme atypique du SHU.
Une forme préférée de l'invention est l'utilisation du Facteuir H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrome Hémolytique Urémique, le Facteur H étant purifié à partir de plasma frais humain! ou de fractions plasmatiques provenant d'une purification par des procédés classiques bien connus de l'homme du métier.
Cette , purification est bien connue de l'homme du métier. Elle peut se dérouler par chromatographie en utilisant une colonne de lysine-sépharose, QAE- Séphadex, DEAE-Toyopearl, Sephacryl S-300 et hydroxyapatite. Elle jest détaillée dans les documents suivants : Fearon, J Immwiol, 119, 1248-1252 (1977) ; Crossley et al., biûchem J, 191, 173-182, (1980) ; Nagasawa et al., -7 Iimimol, 125, 578-582, (1980) ; Weiler et al., P.N.AJS., 73, 3268-3272, (1976) et Wïialey et al., J Exp Mèά, 144, 1147-1163 (1976) .
Le facteur H résultant d'une purification à partir de plasma; frais congelé se trouve par exemple sous la forme jd'un concentré de facteur H.
;
Un aijtre mode de réalisation de l'invention est l'utilisation du Facteur H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrome
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Hémoly,tique ϋréïαique, le Facteur H étant obtenu par génie jgénétique, par l'expression de son gène dans une cellulje choisie dans le groupe composé des bactéries, levure|s, champignons ou des cellules de mammifères. i
Un mαdè de réalisation particulier de l'invention consiste en l'utilisation du Facteur H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrdme Hémolytique ϋrémique, le médicament ainsi obtenu étant BOUS forme lyophilisée.
Un mode supplémentaire de réalisation de l'invention consiste en l'utilisation du Facteur H pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du Syndrcjme Hémolytique Urémique, le médicament ainsi obtenu ayant subi au moins une méthode d'élimination ou d'ijnactivation d'au moins un agent infectieux.
Parmi 'les agents infectieux, on peut citer les virus et les, ATNC (agents transmissibles non conventionnels) comme ]la protéine prion.
En pεjxticulier, le médicament peut être inactivé virale'ment .
On entend par « inactivé viraleraent » que le médicament a subi au moins une méthode d'inactivation virale, connue de l'homme du métier par traitement avec des produits chinaiques , par exemple par solvant/détergent/ et/ou la chaleur, par exemple par chauffage à sec ou pasteurisation, et/ou par la nanofj[ltration.
L,es virus susceptibles d'être inactivés par l'une de ces ; méthodes comprennent : le virus de l ' immijnodéficience acquise humain (VIH), le virus de l'hépatite A (VHA), le virus de l'hépatite B (VHB), le parvcπjirus B19, le cytomégalovirus (CMV), le parvoyirus porcin, le poliovirus, le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) , etc..
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Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique lyophilisée et inactivée viralement, par exemple comme décrit ci-dessus, et comprenant du facteur H et des excipients et/ou véhicules pharmεtceutiquement acceptables .
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de purification du Facteur H comprenant les étapesi consistant à :
1) préparer le surnageant d'un cryoprécipité du plasma, 2) soumettre ce surnageant à une chromatographie sur gel/réjsine de type échangeur d'anions,
3) soumettre la fraction non retenue à une chromâtographie sur un(e) gel/résine comportant un ligand greffé de type Héparine,
4)Ajudter le pH de la fraction non retenue après la chroma;tographie de l'étape 3 pour permettre la liaison du Ffecteur H à un(e) gel/résine de support chromajtographique comportant un ligand greffé de type Héparijne,
5)Eluear le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage du gel/de la résjine,
6)Dilu|er la fraction éluée, puis la soumettre à une chromaitographie sur gel/résine de type échangeur de σationjs de type acide fort,
7)Eluejr le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage du gel/de la résine,
8) Diluer la fraction éluée, puis la soumettre à une chromatographie sur gel/résine de type échangeur d'anio'ns de type acide fort,
9)Laver le gel/la résine et éluer le facteur H,
10)Préparer un concentré de facteur H.
Dans ; un mode de réalisation particulier de l'invention, le support chromatographique sur lequel est greffe un ligand Héparine de l'étape 3) est un(e) gel/résine Héparine Sepharose.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support chromatographique sur lequel est greffé un ligand Héparine de l'étape 4) est un(e) gel/résine Héparine Sepharose.
Dans , un mode de réalisation particulier de l'invention, la chromatographie sur gel/résine de type échangeur de cations de type acide fort de l'étape 6) est une ch.romatograpb.ie de type SP Sepharose.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la chromatographie sur un(e) gel/résine de type échangeur d'anions de type acide fort de l'étape 8) est une chromatographie de type Q Sepharose FF ou équivalent.
Avantageusement, le pH de la fraction non retenue de l'étapje 4) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0.
Avantageusement, le pH de la fraction diluée à l'étape 8) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 6,5 à pH 7,5.
Le procédé de purification de l'invention est le seul procédé connu de purification d'un facteur H issu du plasma qui s'avère industriaϋsable, et qui permette d'obtenir un concentré de facteur H purifié en l'absence d'inhibiteurs de protéases chimiques ou synthétiques, ne laissant donc subsister aucune trace de cesj inhibiteurs dans le produit final.
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En effet, les procédés de purification de facteur H à partir; de plasma humain connus de l'état de la technique sont mis en oeuvre dans une optique de recherche fondamentale, en utilisant parfois des techniques de purification par précipitation (exemple PEG ; ! Sulfate d'ammonium) difficilement indust|rialisables, et des inhibiteurs de protéases. Ces inhibiteurs de protéases inhibent l'action des protéijnes de type trypsine, présentes dans le sérum et le pljasma, qui sont responsables du clivage de la liaisojn protéique joignant les acides aminés asn323 et asn 324 de la molécule du Facteur H. Par conséquent l'ajoujt d'inhibiteurs de protéases contribue à la diminution de la protéolyse de ce facteur et améliore, de ce 'fait, sa stabilité. Cependant, les inhibiteurs de pzjotéases sont souvent des composés hautement toxiques, ce qui les rend inadaptés à un procédé industlriel de production d'un facteur H destiné à une utilisation thérapeutique.
Par ailleurs, le procédé de l'invention présente un avantajge significatif en ce qu'il permet d'obtenir une concentré de facteur H dont les 3 types d'activités principales sont conservées, ce qu'aucun des facteurs H décrits dans l'état de la technique ne possède. Le Facteujr H obtenu par le procédé de l'invention peut donc rjemplir son activité de régulateur central de la voie alternative du complément, une activité qui se révèle! déficiente chez les patients atteints de SHU, et notamment de SHU atypique. En particulier, le Facteur H produit par le procédé de l'invention conseijve son activité de dissociation de la C3 convertase préformée dans la voie alternative du complément et se révèle susceptible d'être utilisé dans ile traitement du SHU grâce à son activité
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fonctionnelle complète.
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Le concentré de Facteur H obtenu par le procédé de 1' invention possède en outre une activité spécifique proche de 1 (AS=O.8 à 0.9), ce qui le rend plus efficej.ce qu'une solution de plasma frais congelé (AS=O.]008) gui, bien que thérapeutiquement efficace, comporte de nombreux désavantages, ainsi que cela a été d'écrit en introduction de la présente demande. Parmi I ces désavantages, l'administration de plasma introduit dans l'organisme des protéines supplémentaires inutiles pour le traitement du SHU (albumine, fibrinogène...} qui peuvent, en revanche déclenjcher des réactions indésirables liées à une surcharge protéique ou provoquer des réactions allergiques, connues sous le nom de « maladie sériqùe ».
Enfinj l ' inaσtivation des virus transmissibles présents dans le plasma se révèle généralement plus difficile et moins performante que celle mise en place pour άnactiver les virus présents dans les dérivés sanguins. Le concentré de Facteur H obtenu par le procédé de l'invention peut donc bénéficier des traitements reconnus et éprouvés apportant une sécurité virale documentée.
Exemples
Exemple 1 : Procédé de purification du facteur H
Le précédé mis en œuvre pour purifier le Facteur H est représenté sous forme schématique dans la Figure 1. Le plasma frais humain congelé est décongelé à une température comprise entre 1°C et 6°C, puis le surnageant plasiτiçttique du cryoprécipité est séparé de la traction insoluble du cryoprécipité par centriifugation.
Le sujrnageant plasmatique du cryoprécipité obtenu, dont ia concentration en Facteur H est comprise dans une gamme allant de environ 400 à environ 500 iïig de Facteur H/litre, est soumis à une chromatographie sur résinej/gel de type échangeur d'anions (par exemple, un(e) I gel/résine de type DEAE Sepha&ex) , afin de séparer les Facteurs dépendants de la vitamine K du surnageant plasnαatique par rétention de ces Facteurs sur la résine/le gel.
La fraction de surnageant plasmatique non retenue (fractjion A), dont la concentration en Facteur H est comprise dans une gamme allant de environ 400 à environ 500 iαg de Facteur H/litre, est ensuite soumise à une ! chroπiatographie d'affinité sur un(e) gel/résine de ty&e Héparine Sepharose FF, afin de séparer
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1 ' antifchrombine III de cette fraction A, par rétention de l'an I titîirombine in sur la résine/le gel.
Le pH 1ide la fraction A non retenue {fraction B), dont la concentration en Facteur H est comprise dans une gaïtime | allant de environ 300 à environ 400 mg de Facteut H/litre, est ajusté pour être compris dans une gamme "allant de pH 5,5 à pH 6,5 et, de préférence, pour être égal à pH 6,0.
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La fralction 3, dont le pH a été ajusté, est soumise à j
une chromatographie sur un(e-) deuxième gel/résine de type Héparine Sepharose FF ou sur tout autre support chromatographique comportant des ligands greffés de type HJéparine. La plupart des protéines contenues dans la fraction plasmatique B sont alors éluées avec le filtrât de chromatographie. Les protéines faiblement adsorfoées sur le gel/la résine sont éliminées par une série ; I de lavages et de pré-élυtions . Le facteur H retemj sur le gel/la, résine est ensuite élue en utilisant un tampon présentant une force ionique supérieure à celle du tampon utilisé pour équilibrer le geJj/la résine,
La frφction éluée contenant le Facteur H (Fraction C) est djiluée, puis soumise à une σhromatographie sur gel/résine de type échangeur de cations de type acide fort, ! par exemple un(e) gel/résine de type SP
Sephattose PF ou un équivalent . Les protéines faiblement adsorbées sur le gel/la résine sont éliminées par une série de lavages et de pré-élutions.
Le Facteur H retenu sur le gel/la résine est ensuite élue .en utilisant un tampon présentant une force ionique supérieure à celle du tampon utilisé pour i
équilibrer le gel/la résine.
La fraction éluée contenant le Facteur H (Fraction D) est alors soumise à une étape d'inactivation virale par traitement par un solvant de type détergent, par exemple le Polysorbate 80 et le TnBP. Un tel traitement permet notamment d' inactiver efficacement les virus, et en particulier, les virus de type virus enveloppés .
La Fraction D est ensuite diluée, et le pH de cette fraction est ajusté pour être compris dans une gamme allant de pH 6,5 à pH 7,5. La fraction D est ensuite
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soumisie à une chromatographie sur un(e) gel/résine de type jéchangeur d'anions de type acide fort, par exemple un(e) gel/résine de type Q Sepharose FF ou un équivajlent. Après une série de lavages, le Facteur H retenu' sur le gel/la résine est élue en utilisant un tampon présentant une force ionique supérieure à celle du tamipon utilisé pour équilibrer le gel/la résine. Les agents précédemment introduits pour réaliser l'inadtivation virale par traitement par un solvant de type détergent sont éliminés au cours de cette étape chroma1tographique, et le degré de pureté du Facteur H est au .gmenté.
La fraction éluée contenant le Facteur H (Fraction E) est ensuite soumise à une étape d'élimination virale par nànofiltration sur un filtre ayant une porosité d' environ 15 nm. Ce traitement d'élimination virale permet d'éliminer efficacement les virus, et en
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particulier les virus non-enveloppés de petite taille. La solution résultante (fraction F) est enfin concentrée et ajustée par ultrafiltration puis filtrée sur filtre 0.22 μm.
Le rφdement du procédé de purification décrit ci- dessus et l'activité spécifique du Facteur H purifié par ce procédé ont été mesurés sur deux lots distincts. Les résultats correspondants sont présentés dans le Tableau 1. L'activité spécifique (A. S.) est exprimée en mg d'antigène de type Facteur H/ mg protéine.
Figure imgf000020_0001
Exemple 2 : Méthode de dosage de l'activité du Facteur H Les puits d'une plaque ELISA (de type 96 puits) sont recouverts par une solution de protéine C3b purifiée, ayant une concentration de 2,5 g/ml (Calbiochem : réf. 341274) en tampon carbonate de Sodium 0.2 M. Pour ce faire, 100 μl de solution sont introduits dans les puits ' et les plaques sont mises à incuber pendant 1 heure 'à 37°C et 1 nuit à 4°C.
Trois ; lavages de 300μl/puits sont effectués avec une solution de tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCl 25 mM, Tween 20 0.1%, pH 7.2.
Les sites aspécifiques sont ensuite saturés par une incubation d'une heure à 37°C avec 300μl/puits d'une solution de tampon phosphate de Sodium 10 mM, NaCl 25 mM, pH 7.2, Tween 20 0.05%, et contenant 1% de BSA.
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Puis un lavage des puits est réalisé avec la solution de layage décrite précédemment .
100 ul d'une solution contenant :
75' μl d'une solution mère de NiCl2 20 mM (concentration finale 1.5 mM ) ?
~ 4 μl de Facteur B (Calbioσhem réf. 341262) à une concentration de lmg/ml ;
- 3 μl de Facteur D (Calbiochem réf. 341273) à une concentration de lmg/ml ; et
- 918, μl de tampon phosphate de Sodium 10 mM, NaCl 25 mM, pip: 7,2, et 4% de BSA ;
sont déposés dans chaque puits avant de procéder à une incubation de 2h à 37°C.
Trois lavages successifs de 300 μl/puits sont ensuite réalisés avec une solution de tampon phosphate de Sodium. 10 mM, NaCl 25 mM, Tween 20 0.1%, pH 7.2,
Une gamme de solutions de facteur H ayant des concen Itrations respectives en Facteur H de 20 μg/ml,
10 μgi/ml, 1 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0,0625 μg/ml, 0.015625 μg/mli 0,00390625 μg/ml et 0,001 μg/ml est préparée. 100 μil de chaque solution sont déposés dans un puits différent et une incubation de 30 mn à 37°C est réalisée. Troisj lavages successifs de 300 μl/puits sont ensuite réalisés , avec une solution de tampon phosphate de Sodium 10 mM, NaCl 25 mM, Tween 20 0.1%, pH 7.2.
Une solution d'anticorps de chèvre anti-facteur E humain (Calbioσhem réf : 341272) est diluée au 1/2000 dans iun tampon PBS (Sigma P-3813), pH 7.4, contenant
0,1% !de BSA, puis 100 μl de la solution diluée sont déposés dans les puits et une incubation est réalisée pendant Ih à 37° Ç,
Trois 'lavages successifs de 300 μl/puits sont réalisés avec une solution de PBS, Tween 20 0,1%, pH 7.2. Puis
100 μ^. d'une solution contenant un anticorps de lapin anti-chèvre marqué à la péroxydase (Calbiochem réf.
401515 Img/ml), et diluée au 1/10000 dans du PBS contenant Q,l% de BSA, sont déposés dans les puits avant .de procéder à une incubation de 20 à 25 minutes à température ambiante.
Trois ! lavages successifs de 300 μ 1/puits sont réalisés avec une solution de PBS, Tween 20 0.1%.
Le substrat de la péroxydase OPD (Sigma) , à une concentration de 5mg/10ml dans une solution de citrate de Sodium, est ajouté aux puits, ainsi que lOμl de H3O3 , à raison de 100 μl/puits au final. Le mélange réactionnel est laissé en contact avec les puits pendant environ 10 minutes avant de procéder à l'arrêt de la' réaction par l'ajout de 50 ul de H-SO4 4N par puits . L'absorbance de la solution contenue dans les puits est aliors mesurée à une longueur 'd'onde de 492 nm. Les résultats correspondants sont présentés sur la Figure 2. Lefe représentations graphiques figurant dans la figure 2 donnent la valeur de l'absorbance mesurée en fonctipn de la concentration en Facteur H ou en fonction de la concentration en protéine (SAH) .
Une méthode de dosage de l'activité du facteur H similaire est décrite dans le document McRae et al., The jojurnal of immunology, 2005, 174 : 6250-6256.

Claims

REVENDICATIONS
1, utilisation du Facteur H pour la fabrication d'un, médicament destiné au traitement du Syndrome Bémolytique Urénαique (SHU) .
2, Utilisation selon la revendication 1; caractérisée en ce Que le médicament est destiné au traitement de la forme typique du SHU.
3 , Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement de la forme atypique du SHU.
;
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit 'Facteur H est purifié à partir de plasma frais humaiïi ou d'une fraction plasmatique,
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3/ caractérisée en ce que ledit Facteur H est produit par génie génétique par l'expression du gène du facteur H dans une cellule choisie dans le groupe composé des bactéries, levures, champignons ou des cellules de mammifères.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit médicament est préparé sous forme lyophilisée.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit \ médicament a subi au moins une méthode d'élimination ou d'inactivatiσn d'au moins xxxx agent infectiieux.
8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ledit ; médicament a subi au moins une méthode d'inaαtivation virale.
9. Composition pharmaceutique lyophilisée, inactivée viralement comprenant du facteur H et des excipients et/ou véhicules pharma'ceutiquement acceptables.
10. Procédé de purification du Facteur H comprenant les étapes consistant à :
1) préparer le surnageant d'un cryoprécipité du plasma, 2) soumettre ce surnageant à une chromatographie sur gel/résine de type éσhangeur d'anions,
3 ) soumettre la fraction non retenue à une chromgjtographie sur uα(e) gel/résine comportant un ligand greffé de type Héparine,
4)Ajuster le pH de la fraction non retenue après la chromeftographie de l'étape 3 pour permettre la liaison. du Flacteur H à un(e) gel/résine de support chromatographique comportant un ligand greffé de type
Héparine,
S)EIu^r le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage du gel/de la résine,
6) Diluer la fraction éluée, puis la soumettre à une chromaitographie sur gel/résine de type échangeur de cationjs de type acide fort,
7)Eluer le facteur H par un tampon de force ionique supérieure à celle du tampon d'équilibrage du gel/de la résine,
8)Dilu'er la fraction éluée, puis la soumettre à une chromatographie sur gel/résine de type échangeur d'anions de type acide fort,
9)Lavgr le gel/la résine et éluer le facteur H,
10) Préparer un concentré de facteur M.
11. Procédé selon la revendication 10, dans lequel le support chromatographique comportant un ligandj greffé de type Héparine de l'étape 3) est un{e) gel/réisine Héparine Sepharose.
12. Procédé selon l'une des revendiications 10 ou 11, dans lequel le support chromajtographique comportant un ligand greffé de type Héparine de l'étape 4) est tin(e) gel/résine Héparine
Sepharpse .
13. Procédé selon l'une des revendications 10 à 12, dans lequel la chroma;tographie sur gel/résine de type échangeυr de cations de type acide fort de l'étape 6) est une chromaitographie de type SP Sepharose.
; 14. Procédé selon l'une des revendications 10 à 13, dans lequel la chromaitographie sur uπ(e) gel/résine de type échangeur d'anions de type acide fort de l'étape 8) est une chromaitographie de type Q Sepharose FF ou équivalent .
15. Procédé selon l'une des revendications 10 à 14, dans lequel le pH de la fraction non retenue de l'étape 4) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 5,5 à pH 6,5 et de préférence pour être égal à pH 6,0.
16. Procédé selon l'une des revend!cations 10 à 15, dans lequel le pH de la fraction diluée à l'étape 8) est ajusté pour être compris dans la gamme allant de pH 6,5 à pH 7,5,
17. Concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16.
18. Concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16 pour utilisation dans le traitement de maladies résultant d'un contrôle déficient de l'activation du complément.
19 , Concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une Ides revendications 10 à 16 pour utilisation dans le traitement du Syndrome Hémolytique Urémique (SHU) .
20, Concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16 pour utilisation dans le traitement de la forme atypique du Syndrome Hémolytique Urémique (SHUa) .
21. Utilisation d'un concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16 pour contrôler • l'activation du complément in vitro ou ex vivo.
22. Utilisation d'un concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement thérapeutique ou prophylactique de maladies résultant d'un contrôle déficient de l'activation du complément.
23. Utilisation d'un concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement thérapeutique ou prophylactique du Syndrome Hémolytique Urémique (SHU) .
24. Utilisation d'un concentré de Facteur H obtenu par le procédé selon l'une des revendications 10 à 16 pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement thérapeutique ou prophylactique de la forme atypique du Syndrome Hémolytique Urémique (SHUa) .
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