JPH02215730A

JPH02215730A - 細胞増殖抑制剤

Info

Publication number: JPH02215730A
Application number: JP1037811A
Authority: JP
Inventors: Hiroyoshi Hoshi; 宏良星
Original assignee: BIO KAGAKU KENKYUSHO KK
Current assignee: BIO KAGAKU KENKYUSHO KK
Priority date: 1989-02-16
Filing date: 1989-02-16
Publication date: 1990-08-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は細胞増殖抑制剤に関する。さらに詳細には、ト
ランスフォーミングクローズファクターβ（Ｔｒａｎｓ
ｆ’ｏｒｍ１ｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−β、
以下「ＴＧＦ−β」と称する）を有効成分とする肝癌細
胞に対する細胞増殖抑制剤に関する。

〈従来の技術及び発明が解決しようとする課題〉ＴＧＦ
−βは、同一である２本のポリペプチド（１１２残基）
がジスルフィド結合で連結された分子量的２５．０００
のホモダイマーポリペプチドであり、ウシ腎臓、ヒト血
小板、ヒト胎盤、レトロウィルス形質転換ラット細胞等
の多くのソースから単離されている成長因子である。

ＴＧＦ−βには、現在、３種類の相同性のある蛋白質が
知られており、それぞれＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及
びＴＧＦ−β３と称されている。

ＴＧＦ−β１を形成する各鎖は、３９０個のアミノ酸を
含む前駆体蛋白質からなり、プロセッシングを受けてア
ミノ酸敗１１２個からなるフラグメントとなる。ＴＧＦ
−β２はそりよりもやや大きい４１４個のアミノ酸を含
む前駆体蛋白質からなり、プロセッシングを受けてアミ
ノ酸１１２個からなるフラグメントとなる。ＴＧＦ−β
１とＴＧＦ−β２の相同性は７１％であり、ＴＧＦ−β
１のアミノ酸配列はヒト、牛、豚、猿で同一であり、マ
ウスでも１個のアミノ酸が異なるのみである。

またＴＧＦ−β２についても、アミノ酸配列のＮ末端か
ら３０番目までを調べると、ヒト、牛、豚ではまったく
同一であることが知られている。このようにＴＧＦ−β
は種特異的でない因子である。

（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ（１９８８）、　Ｖｏｌ
、５７．　ｐｐ５９４−６００等参照）。また、ＴＧＦ
−β３は最近見出されたＴＧＦ−βであり、ＴＧＦ−β
１及びＴＧＦ−β２と７０〜７５％の相同性を有するこ
とが知られている（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、
　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　Ｖｏｌ、８５．　ｐｐ４７１５−
４７１９．１９８８　、　　Ｍｏ１．　Ｅｎｄｏｃｒｌ
ｎｏｌ、　Ｖｏｌ、２．　ｐｐ７４７−７５５．１９８
８）。

これらのＴ　Ｇ　Ｆ−βの生理的作用は路間−であり、
前脂肪細胞の最終的分化の阻害、Ｉｎ　ｖｌｔｒｏでの
創傷治療の促進、骨吸収の促進、コラーゲン合成の刺激
など、細胞の増殖、分化、機能等の種々の作用をもたら
す。しかしながら、ＴＧＦ−βのヒト癌細胞増殖抑制作
用は殆ど知られておらず、わずかにヒト結腸癌細胞（Ｃ
ＡＮＣＥＲＲＥＳＥＡＲＣＨＶｏｌ。

４７、　ｐｐ２９５０−２９５４．１９８７）、ニスト
ロジエンレセプターをもたないヒト乳癌細胞（ＣＡＮＣ
ＥＲＲＨ９ＥＡＲＣＨＶｏ１．４８．　ｐｐ３８９８−
３９０４．１９８８）の増殖を抑制することが報告され
ているのみである。

一方、本発明の対象とする肝癌の化学療法としては、ア
ドリアマイシン、エトポシド、マイトマイシンＣ等の抗
癌剤を用いる方法が知られているが、これらの抗癌剤は
副作用が強いという問題がある。また、肝癌細胞の増殖
抑制に腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　
Ｆａｃｔｏｒ）が有効であることも報告されているが、
腫瘍壊死因子は、臨床上その安全性に懸念があるとされ
る。

本発明は上記のような従来技術の欠点を解消するために
創案されたもので、本発明者が鋭意研究を重ねた結果、
ＴＧＦ−βが肝芽腫由来及び細胞肝癌由来のヒト肝癌の
いずれの増殖も著しく抑制することを見出し、この知見
に基づいて本発明を完成した。

く課題を解決するための手段〉上記の課題を解決すべくなされた本発明は、ＴＧＦ−β
を有効成分とする肝癌細胞に対する細胞増殖抑制剤であ
る。

前記のように、ＴＧＦ−βがある種の腫瘍細胞に対して
増殖阻害効果を有することは知られているが、ＴＧＦ−
βが肝芽腫由来及び細胞肝癌由来のヒト肝癌のいずれの
増殖をも抑制することは、従来まったく予期し得なかっ
た新規な知見である。

本発明で使用されるＴＧＦ−βとしては、医薬として用
いられる程度に精製されたものであれば特に限定されな
い。前述のように、ＴＧＦ−βは種蒔異的ではないので
、ヒト以外の動物起源、例えば、牛由来、豚由来等のＴ
ＧＦ−βを用いてもよい。より具体的には、例えば、ヒ
ト血小板由来ＴＧＦ−β、ヒト尿由来ＴＧＦ−β、ブタ
血小板由来ＴＧＦ−β等が挙げられる。また、本発明で
使用されるＴＧＦ−βは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２
及びＴＧＦ−β３のいずれも用いることができ、また適
宜混合して使用することもできる。

さらに、本発明におけるＴＧＦ−βには、前述のような
ＴＧＦ−β前駆体及び本明細書に記載した試験法におい
て有効である限り、将来同定されるＴＧＦ−βも包含さ
れる。

本発明で使用されるＴＧＦ−βとしては、既に市販され
ているＴＧ’Ｆ−βを使用してもよく、またロパーツら
の方法（Ｂｌｏｃｈｅｓｌｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、２２．
　ｐｐ５［１９２−５８９８，１９８３）の方法に準じ
て、ＴＧＦ−βを含む細胞から、酸・エタノール抽出、
ゲル濾過、２段階の高速液体クロマトグラフィーの処理
をして精製されたＴＧＦ−βであってもよい。

本発明の対象とする癌細胞は唾乳動物の肝癌細胞、特に
肝芽腫由来及び細胞肝癌由来の肝癌細胞であり、更に具
体的にはヒト肝芽腫瘍由来肝癌細胞Ｈｅ　ｐ　Ｇ　２　
（Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、２８２．　ｐｐ６１５．１
９７９参照）、ヒト細胞肝癌由来肝癌細胞Ｈｅｐ３ＢＳ
ＨｕＨ−７及びＰＬＣ／ＰＲＦ１５　（夫々５ｃ１ｅｎ
ｅｅ。

Ｖｏｌ、２０９．　ｐｐ４９７．１９８０．　ＣＡＮＣ
ＥＲｌ？ＥｓＥＡＲｃＨ，Ｖｏｌ。

４２、　ｐｐ３４Ｂ５．　１９８２及びＢｒ、　　Ｊ、
　Ｃａｎｃｅｒ、　ＶＯｌ、３４゜ｐｐ５０９．１９７
Ｂ参照）等が例示される。

本発明の細胞増殖抑制剤は、患者の疾患の程度、肝癌の
種類、投与方法等を考慮して、ＴＧＦ−βを単独で又は
他の医薬との合剤して調剤され、さらに必要に応じて薬
理的に許容される担体と複合して用いられる。ＴＧＦ−
βの投与量は、患者の年齢、体重、症状等により適宜決
定されるが、般に０．０１〜１０μｇ／ｋｇ体重・日、
好ましくは０．１〜１μｇ　／　ｋｇ体重・日である。

水剤の製剤形態としては液剤、凍結乾燥製剤等が例示さ
れる。ＴＧＦ−βは熱及び酸に安定であるので液剤とし
ても保存性が損なわれることはないが、凍結乾燥製剤と
するのが好ましく、これら製剤は慣用の方法で得ること
ができる。なお、製剤化に際して使用される担体として
は、例えば、生理食塩水、緩衝液、アミノ酸、アルブミ
ン、グロブリン、ゼラチン、マンニトール、グルコース
、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、エチレン
グリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テル等が挙げられる。また、ＴＧＦβは製剤化前に滅菌
しておくことが好ましく、滅菌は０．２μ程度のフィル
ターを用いる膜濾過により行なうことができる。凍結乾
燥製剤は、用時、注射用蒸溜水等で適宜溶解して用いら
れる。

〈発明の効果〉本発明にかかる細胞増殖抑制剤は、肝癌細胞にＲ＝ｔ　
Ｌ−ｒ強い細胞増殖抑制作用を示すので、肝癌の予防及
び治療に有用である。

〈実施例〉以下、試験例及び実施例に基づいて、本発明をより詳細
に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。

試験例以下の試験例において、使用した物質及び材料は下記の
通りである。

（１）　Ｔ　Ｇ　Ｆ−β：Ｒ＆Ｄ　　Ｓｙｓｔｅｍ社製ヒト血小板由来ＴＧＦ−β
（純度９７％以上）（２）ＭＣＤＢ１０７培地：極東製薬工業株製ＭＣＤＢ１０７培地（３）肝癌細胞：ヒト肝芽腫由来ＨｅｐＧ２（ＮＡＴＵＲＥ、　Ｖｏｌ、２ｇ２．　ｐｐ６１５．１
９７９参照）ヒト細胞肝癌由来Ｈｅｐ３ＢＳＨｕＨ−７
及びＰＬＣ／ＰＲＦ１５（夫々５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、２０９．　ｐｐ４９
７．１９８０　。

ＣＡＮＣＥＲＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｖｏｌ、４２．　ｐｐ
ａ４ａ！Ｉｔ、　！９８２及びＢｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃ
ｅｒ、　Ｖｏｌ、３４．　Ｉ）ｐ５０９．１９７Ｂ参照
）試験例ＩＴＧＦ−βのヒト肝癌細胞に対する増殖抑制効コラーゲ
ンで表面処理した２４−ウェル・カルチュアー・プレー
トに、各々ヒト肝癌細胞を５×１０３個／ウェル播種し
、２％牛脂児血清を含有するＭＣＤＢ１０７培地（以下
、コントロール培地という）に種々の濃度のＴＧＦ−β
を添加した培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２の条件で
５日間培養（単層）した。また、対照としてＴＧＦ−β
を含まないコントロール培地で同様に培養した。

培養後、トリプシン（シグマ社製、２５０μｇ／ｙｉ　
）及びＥＤＴＡ　（１００μｇ／　ｘｌ　）を用いて細
胞を分散させ、コールタ−カウンター法により細胞数を
求め、該細胞数をコントロール培地における細胞数で除
することにより細胞増殖率（％）を算出した。

その結果を第１図に示す。第１図中、・−・はＨｅｐ３
Ｂ細胞、Ｏ−ｏはＨｕＨ−７細胞、Ｃ−ＣはＰＬＣ／Ｐ
ＲＦ１５細胞、■−■はＨｅｐＧ２細胞を示す。

また、第１図より各細胞に対するＴＧＦ−βの５０％細
胞増殖抑制濃度（ＩＤ５ｏ）を求め、その結果を第１表
に示した。また、第１表には、コントロール培地にＴＧ
Ｆ−βを３００μｇ／ｙｆ添加した培地における各細胞
の最大増殖阻害率（％）を併せて示した。

第１表＊：コントロール培地に対してＴＧＦ−βが５０％阻害
活性を示す濃度＊＊：コントロール培地に対するパーセント第１図及び
第１表から明らかなように、ＴＧＦ−βは各細胞に対し
て濃度依存的に著しい細胞増殖抑制効果を示し、またＩ
Ｄ５ｏも低く、低濃度で細胞増殖抑制作用を有すること
が示される。

試験例２ＴＧＦ−βのヒト肝癌細胞に対する増殖抑制の可逆性試
験コラーゲンで表面処理した３５ｍ＋諺カルチャーデイツ
シュに、各々ヒト肝癌細胞を５００個／デイツシュ播種
し、それぞれ下記Ａ−Ｃの培養条件で１２日間培養した
。培養後、２％グルタルアルデヒド液でコロニーを固定
化し、次いで０．１％クリスタルバイオレット液でコロ
ニーを染色し、写真を撮影し、コロニー形成率を求めた
。但し、いずれの系も培養開始７日目に培地を交換した
。その結果を第２表に示す。

培養条件：Ａ：コントロール培地で１２日間培養した。

Ｂ：０〜３日間はＴＧＦ−β（５００ｐｇ／　ｉｆ）を
含有するコントロール培地で培養し、次いでＴＧＦ−β
を含まないコントロール培地で９日間培養した。

Ｃ：ＴＧＦ−β（５００ｐｇ／　ｉｆ）を含有するコン
トロール培地で］−２日間培養した。

第２表第２表に示されるように、いずれの細胞種においても、
培養条件ＣのＴＧＦ−βを含有する培地ではコロニーの
形成は観察されなかった。また、３日間ＴＧＦ−βを含
有する培地で培養後、ＴＧＦ−β不含の培地で培養した
培養条件Ｂの系でもコロニーの形成は観察されなかった
。このことから、ＴＧＦ−βは略完全に非可逆的に細胞
の増殖を阻害していることが判った。

実施例ヒト血小板由来ＴＧＦ−βを適当量の生理食塩水（１０
％ヒト血清アルブミン及び２０％マンニトール含有）に
溶解し、ｐＨ調整を行った後、滅菌したミリポアフィル
タ−で除菌濾過し、バイアル瓶に充填して凍結乾燥する
ことにより注射用粉末製剤を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＴＧＦ−βの各種ヒト肝癌細胞に対する細胞
増殖抑制効果を示す図である。同図中、・−・はＨｅｐ
３Ｂ細胞、Ｏ−ＯはＨｕＨ−７細胞、０−０はＰＬＣ／
ＰＲＦ１５細胞、■−■はＨｅ　ｐＧ２細胞を示す。第１図ＴＧＦ−β濃度（ｐｇ／ｌ

Claims

【特許請求の範囲】

１、トランスフォーミングクローズファクターβを有効
成分とする肝癌細胞に対する細胞増殖抑制剤。