JPH01121300A - 乳汁に由来するポリペプチド成長因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、乳汁に由来するポリペプチド成長因子の単離
および精製、該因子を含んでなる相乗性混合物および医
薬ならびに化粧品および食品組成物に関し、そしてさら
に傷の癒合および組織修復の促進および刺激、免疫応答
の抑制、癌の処置、哺乳類の成長の促進ならびに培養細
胞の増殖の促進を目的とした使用に関する。本明細書で
は、このポリペプチドを「乳成長因子（ＭＧＦ）、と称
する。

〔発明の背景および従来技術〕

成長因子は、特に高い親和性の細胞表面受容体を介して
、非常に低濃度で細胞の増殖および細胞分裂を促進する
ポリペプチドとして定義することができる。このものの
作用は、栄養素の摂取、ＤＮＡ合成および細胞分裂をも
たらす他の細胞内シグナルを惹起し、その結果として組
織の増殖を誘発する。成長因子は、成人と胎児のどちら
の体細胞および体液中にも見出されており、今やすべて
でないとしても、はとんどの培養細胞によって放出され
ると信じられている（Ｇｏｕｓｔｉｎ、Ａ、Ｓ、等の総
説、（１９８６）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、
４６，１０１５　、参照〕。

しかしそうはいうものの、成長因子は内分泌状態では一
般に機能せず、おそらく細胞間隙を通して近隣周辺に拡
散するか、または自己分泌様式もしくは傍分泌様式で機
能するであろう。

乳汁は、培養における細胞増殖を促進する因子を含むと
ころの体液の一種である。上皮細胞、普通のおよび形質
転換繊維芽細胞、平滑筋細胞ならびに軟骨細胞を包含す
る各種の細胞類は、乳汁を供給した血清フリーの培地で
増殖を示している（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｍ、（１９８
０）、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、＋８４＋　８０８　　
；Ｓｔｅｉｍｅｒ＋に、Ｓ、およびＫｌａｇｓｂｒｕｎ
、Ｍ、（１９８１）、　Ｊ、Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．＋８８
＋　２９４Ｈ３ｅｒｅｎｉ、Ａ、およびＢａｓｅｒｇａ
、　Ｒ，（１９８１）　。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、Ｉｎｔ、Ｒｅｐ、＋　５．３３８
）　６かかる活性は、ヒトに由来する（Ｋｌａｇｓｂｒ
ｕｎ、Ｍ、（１９７８）、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、フニ５．５０５
７．　）およびウシに由来する（Ｓｔｅｉｍｅｒ、　Ｋ
、Ｓ、等、（１９８１）、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ、。

１０９、２２３．）乳汁および初乳（分娩後の初期数日
間に分泌される乳汁）に見出されている。近年、多数の
成長因子が、それらの構造および生物学上の機能を特徴
付ける試みの下に乳汁から単離されそして均−物まで精
製されている。

最も初期に、かつよく特徴付けられた成長因子の１つは
表皮増殖因子（ＥＧＦ）であり、このものは約６ｋｄの
分子量を有するポリペプチドであり、イン・ビトロ（ｉ
ｎ　ｖｉｔｒ＜ｚ）およびイン・ビボ（新旦皿）のいず
れでも各種の細胞および組織に対して増殖および細胞分
裂促進効果を有する。ＥＧＦは、ヒトの乳汁（Ｃａｒｐ
ｅｎｔｅｒ、　Ｇ、　（１９８０）　、　５ｃｉｅｎｃ
ｅ。

２１０、１９８；Ｐｅｔｒｉｄｅｓ、　Ｐ、Ｅ、等、（
１９８５）　、　ＦＢＢＳＬｅｔｔｓｒ！３１８７．８
９）　、ウシの乳汁（Ｙａｇｉ、　Ｈ，等、（１９８６
）　、Ａｃｔａ、５ｃａｎｄ、Ｐａｅｄ、７５，２３３
）およびマウスの乳汁（Ｂｅａｒｄｍｅｒｅ、　Ｊ、Ｍ
、およびＲｉｃｈａｒｄｓ、　Ｒ，Ｃ，。

（１９８３）　、　Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、９６．
２８７　）の主要な成長促進剤であることも示されてい
る。

哺乳類由来の成長因子（ＭＤＧＦ）の名称を有する２種
の因子も乳汁から単離されている。ヒ）　ＭＤＧＦ−■
は、約６２ｋｄの分子量および４．８の等電点（ｐＩ）
を有する還元剤に感受性のポリペプチドである（Ｂａｎ
ｏ、　Ｍ、等、（１９８５）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、
　２６０．５７４５）。

このものはピコモル濃度で哺乳類細胞の増殖を促進し、
そしてこれらのコラーゲン産生レベルを高める。また、
ＭＤＧＦ−ｎも二硫化物の還元剤に対して感受性を有す
るが、しかしながら約１７ｋｄと低い分子量およびｐＩ
４．４を有する（Ｚｔｎｉｅｂｅｌ、Ｊ、Ａ、等、（１
９８６）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　４６．
９３３　）。

ＭＤＧＦ−ＩＩが、へ４３１ヒト上皮癌細胞膜上のＥＧ
Ｆ受容体に対する結合性についても放射能標識”’Ｉ−
ｔ！ＧＦと競合するとはいえ、ＴＳＫ−３０００Ｓ−ゲ
ル濾過カラム上で高いイオン強度の溶出緩衝液を用いる
ことによりヒトＥＣ，ＦからＭＤＧＦ−ＩＩを溶離する
ことができる。ＭＤＧＦ−Ｕが軟寒天における正常なラ
ット腎臓（ＮＲＫ）細胞の足場依願性に無関係な増殖を
促進し、ある種のトランスフォーミング成長因子（ＴＧ
Ｆ）の特徴を明らかに示し、さらにより大きいｌ型の分
子がＥＧＦ受容体にバインディングしないことから、Ｍ
ＤＧＦ−ｎはＴＧＦ−且類に属する可能性があるようで
ある。

さらにまた、ヒトの乳汁およびウシの乳汁は、一連の相
違する成長因子を含むことが報告されてきた。Ｓｈｉｎ
ｇおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎは、ヒトの乳汁から３種の
成長因子を単離し、それらをｌ（ＭＧＦ−１１１ＭＧＦ
−ＩＩおよびＨＭＧＦ−１１７と命名した（１９８４．
　Ｂｎｄｏ−ｃｒｉｎｏｌ、、　１１５．２７３）。

（ｌＯ） ＨＭＧＰ−Ｉ［Ｉは、ＤＮＡ合成により測定したところ
ではヒトの乳汁の総成長因子活性の７５％以上を占める
と思われる。ＨＭＧＦ−ＩＩＩは、約６ｋｄの分子量お
よびｐＩ４．４〜４．７を有し、かつ還元剤の処理に対
して感受性を示さない。比較試験によれば、この分子は
ＥＧＦの可能性があることを示唆した。

また、これらの研究者は、同様な分別手段を用いてそれ
が３０〜３５ｋｄの分子量を有し、そして還元剤を用い
る処理で不活性化される主要な成長因子を構成し得ると
はいえ、この分子はウシの初乳には欠失していることを
示した。このいわゆるウシ初乳成長因子（ＢＣＧＦ）は
、ＨＭＧＦ−Ｉ［に対して生化学的に同一であり、もう
一つ別の分子は、ヒトの乳汁の総成長因子活性の約２０
％の原因となる。

イン・ビトロで骨髄細胞の増殖を促進し、そしてコロニ
ー形成顆粒球マクロファージの始原細胞（ＣＦＵ−ＧＭ
）の分化を惹起するコロニー刺激因子（Ｃ３Ｆ）もまた
ヒトの乳汁から単離されている（Ｓｉｎｈａ、Ｓ、に、
およびＹｕｎｉｓ、Ａ、Ａ、　（１９８３）、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ、　１１４＋　７９
７）　ａ　ウシの乳汁かまたは初乳には存在しないこの
因子も、還元剤の作用に対して感受性を示さない。ゲル
濾過および等電点電気泳動試験は、それが他のＣ３Ｆ類
から生化学的に別個のものであり、そして２４０〜２５
０ｋｄの分子量とｐＩ４．４〜４．９を有することを示
した。

乳汁以外の起原に由来する本発明に関連して記載される
多数の他の成長因子または関連因子が存在する。

ＴＣＰ−β分子を誘導するヒトの血小板、ヒトの胎盤お
よびウシの腎臓は、国際特許出願第一０８４７０１１０
６号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第１２８８４
９号公報に記載されている。ヨーロッパ特許第１６９０
１６号公報および米国特許第４．６２７．９８２号明細
書は、ウシ脱塩骨（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ　ｂｏ
ｎｅ）に由来する２種類のタンパク（ＣＩＦ−Ａおよび
ＣＩＦ−Ｂ）の部分的な精製と、これらが軟骨形成の誘
導のための補助因子であることを報告している。ＣＩＦ
−Ｂ（ＴＧＦ−β２）は、イン・ビボで炎症細胞の機能
を阻害しくＥＰ２１３７７６）　、イン・ビトロで腫瘍
細胞の増殖に対して阻害作用を有することが見出されて
いる（ＥＰ２７１２１１　）。これらのいわゆる軟骨誘
導因子のいずれも、ＴＧＦ−βアッセイにおいてＥＧＦ
と組み合わせた場合に活性を示す。これらの因子の１つ
（ＣＩＦ−Ａ）は、ヒトの血小板に由来するＴＧＦ−β
に対し最初の３０個までのアミノ酸が同一であるＮ−末
端配列を有するが、このものはＣＩＦ−Ｂのそれとは明
らかに相違している（Ｓｐｏｒｎ、Ｍ、の総説、（１９
８６）、５ｃｉｅｎｃｅ、　　２３３．５３２．および
Ｍａｓｓａｇｕｅ、　Ｊ、　。

Ｃｅ１ｌ、　４９．　４３７〜４３８（１９８７）　、
参照〕。

ＣＩＦ−Ｂ　（Ｓｅｙｅｄｉｎ、Ｓ、Ｍ、等、　（１９
８７）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

」競：１９４６；ＥＰ１６９０１６）は、２つの他の最
近報告された成長因子と同一でないとしても、類似であ
る。

Ｃｈｅｉｆｅｔｚ、Ｓ、等は、ブタの血小板から単離し
、そのものが、同じ起原から単離された最初のブタＴＧ
Ｆ−β（科学文献中で現在はＴＧＦ−β１と称されてい
る）に対するＮ−末端アミノ酸配列が相違することから
ＴＧＦ−β２と命名した因子を公表している（　（１９
８７）　、皿、　４８：４０９）。さらに最近、叶ａｎ
ｎ　。

ｎｌ等は、Ｔリンパ球に対して免疫抑制的であり、そし
てＧ−ＴｓＦと命名したヒト多形性神経膠芽細胞（ｇｌ
ｉｏｂｌａｓｔｏｍａ　ｃｅｌｌ）に由来する因子を単
離した（（１９８７）、ＥＭＢＯ，Ｊ、　６：１６３３
　）。ＣＩＦ−Ｂ、　ＴＧＦ−β２およびＧ−ＴｓＦは
、Ｎ−末端におけるアミノ酸１９まで同じアミノ酸配列
を有する。Ｇ−ＴｓＦは１２．５ｋｄの分子量を有する
にもかかわらず、ＣＩＦ−ＢおよびＴＧＦ−β２はどち
らも約２６ｋｄの分子量を有する。

タモキシフェンを添加したヒト前立腺癌細胞株から単離
され、２４ｋｄの分子量を有し、かつ２つのジスルフィ
ドにより結合した外観上同一のポリペプチド鎖から成る
ヒトＴＧＦタイプβ２　（ｈＴＧＦ−β２）は、Ｍａｒ
ｇｕａｒｄｔ、　Ｈ，等（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、
　　’２６２゜１２１２７〜１２１３１（１９８７）　
）およびＩｋｅｄａ、Ｔ、等（Ｂｉｏｃｈｅｍ、２６．
２４０６〜２４１０（１９８７）　”Ｊにより公表され
ている。

Ｂ１０−１アフリカ緑ザルの腎臓細胞から得て、ポリエ
ルギン（ｐｏｌｙｅｒｇｉｎ）と命名された成長阻害因
子ＢＳＣ−Ｉ　Ｇｌは、Ｒ，Ｗ、Ｈｏ１ｌｅｙ等により
精製および同定された（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ
、ｓｃｉ、ＵｓＡ、Ｖｏ１．７５＋１８６４〜１８６６
（１９７８）および同誌、Ｖｏｌ、７７、５９８９〜５
９９２（１９８０）　）。このものは、ＴＧＦ−β１が
有する生物学上の活性とほぼ同一であることを示し［Ｒ
，Ｆ。

Ｔｕｃｋｅｒ等、５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、■、７０５
〜７０７（１９８４）　］、そして胸腺細胞の増殖を強
く阻害することを示した（Ｈ，Ｊ、Ｒｉｓｔｏｗ、同誌
、　Ｖｏｌ、８３．５５３１〜５５３３（１９８６）　
）。最近、ＢＳＣ−Ｉ　ＧＩのアミノ酸配列は、ＢＳＣ
−１細胞のｃＤＮＡライブラリーに由来するｃＤＮＡか
ら推論したところでは、ＴＧＦ−β２のアミノ酸配列と
同等であることが見出されている。（Ｓ、に、Ｈａｎｋ
ｓ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡ、Ｖｏｌ
、８５．７９〜８２（１９８Ｂ））。

今までのところ、これらの成長因子は乳汁中に存在する
ことが示されていない。

すでに多数のポリペプチド成長因子が、単離され、特徴
付けられそしてクローン化されているとはいえ、これら
の物質のイン・ビボでの活性に対する研究は、主にかか
る研究のためには相対的に少量であるとの理由で少しし
か行われていない。

本発明の成長因子の適用可能性のある重要な標的分野は
、傷の癒合の増進にある。傷の治療に数多くの薬剤が利
用し得るにもかかわらず、いまだ非常に多数の患者、特
に全く治癒しないか治癒が非常に遅い傷（外傷、火傷、
とこずれおよび糖尿病性の潰瘍を含む）をもつ老令の患
者が存在する。

かかる患者は、傷の癒合過程を促進しそして加速するで
あろう医薬製剤にとって非常に興味深い目標を提供する
。小さな傷に属するものは、口内、特に歯茎ならびに例
えば顔面ならびに体表面の他の部分のカミソリの刃によ
って生じた傷である。

小人症の処置のごとき哺乳類の成長促進、さらにまたイ
ン・ビトロでの細胞培養物の増殖の促進にも本発明の成
長因子が使用できる可能性がある。

驚くべきことに、本発明の成長因子は一定細胞型に対す
る抑制作用、すなわち免疫系細胞そしてさらに癌細胞の
抑制作用を有する。

これらの指摘した処置に対する絶え間ない必要性が存在
することは疑問の余地がない。

〔本発明の目的〕

本発明の目的は、「乳成長因子」またはｒＭＧＦ」と称
される乳汁中に見出されたポリペプチド成長因子を利用
可能にすることであり、それを濃厚し、採取しそして精
製する方法を提供することであり、該成長因子を含んで
なる医薬、化粧品および食品組成物を提供することであ
り、ざらに哺乳類の細胞増殖および移動（ｍｉｇｒａｔ
ｉｏｎ）を促進し、そして組織の修復を促進するための
それらの使用方法を提供することである。さらに、本発
明の成長因子の投与により免疫応答を抑制しそして癌細
胞の増殖を抑制することも本発明の目的である。

またさらに、イン・ビトロで細胞の増殖および分裂を促
進することも本発明の目的である。

さらに、該成長因子およびある種の活性剤を含んでなる
相乗性混合物を提供することも本発明の目的である。

〔発明の詳細な説明〕

本発明は、乳汁または乳製品から得られ、５ＯＳ−ＰＡ
ＧＥにより測定した場合に約２５ｋｄの分子量を有し、
ｐ１９．Ｏ〜１０．５の間の等電点を有することを特徴
とする濃厚および純粋な状態の乳成長因子（ＭＧＦ）に
関する。

本明細書で使用する［乳成長因子Ｊ　　（ＭＧＦ）の語
は、該因子のすべての濃厚したまたは精製した、さらに
または部分的に精製した状態のものを意図している。こ
の濃厚物は、約１０３倍から１０７倍までであることが
でき、そしてほぼ１００％の純度を有していてもよい。

本ＭＧＦは、乳汁中に見出される可能性があり、より少
ないかまたはより大きい分子量および相違するｐＩ値を
有する他の成長因子、例えばＥＧＦまたはＨＭＧＦ　ｍ
　（６ｋｄ）　。

ＭＤＧＦＩ（６２ｋｄ）、　ＭＤＧＰＩＩ（１７ｋｄ）
、　　ＢＣＧＦ（３０〜３５ｋｄ　）またはＣ３Ｆ　（
２４０〜２５０ｋｄ）を実質的に含まないものである。

以下余白 特に本発明は、次のアミノ酸組成 〔但し、ａ）はペプチド１モル当たりのアミノ酸のモル
数であり、ｂ）はペプチド１モル当たりのアミノ酸残基
ぢ示す概数である］を有する実質的に純粋な状態で存在
しており、かつ次式（上式中、Ｘ′７およびＸ１８は未
同定アミノ酸を表す）で示されるＮ−末端アミノ酸配列
を有するウシの乳汁から入手され得るＭＧＦまたはその
塩に関する。

前記分子量は、Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、の方法に従い
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＯ３−ＰＡＧＩＩ！　）によって測定した（Ｎ
ａｔｕｒｅ。

２２７、６８０（１９７０）　）　、等電点は、Ｂ１１
ｒｋ、　Ｒ，Ｒ，により概説されている方法により測定
した〔［動物細胞の制御機構（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ）　、
、１　２４５〜２５７．Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ　Ｙｏｒｋ＜１９８０））。

本発明のポリペプチドの陽イオン性は、塩基性アミノ酸
基、例えばアルギニン、リジンおよびヒスチジンの存在
に帰因する。ＭＧＦは、メルカプトエタノールおよびジ
チオスレイトールならびにそれらの塩のような還元剤に
感受性を有する熱安定性であり、かつ酸性で安定なポリ
ペプチドである。

ある種の試薬によるＭＧＦの処理は、２つのそれぞれ約
１２．５ｋｄの大きさの類僚または同一のサブユニット
から該分子が構成されていることを示しており、このも
のはおそらく１以上のシスティンジスルフィド結合によ
り１つに結合されていて、前記試薬による処理で開裂さ
れる。

ＭＧＦが細胞の移動および増殖を促進する機能において
種特異性を示さないとの観察結果は、前記分子が相違す
る哺乳類の種間に高い保存性があり、従ってこの系統群
の他の分子と実質的に相同であることが期待されるとの
仮説を支持する。

この点で、ポリペプチドについて用いられるところの「
実質的に相同」の語は、天然に由来するものか、合成品
であるか、または組換え手段で調製されたものであるか
を問わず、またさらに種や起源にかかわらず、アミノ酸
配列の相違が密接な種の活性に逆行した様式で影響を及
ぼさない該配列の相違を除いて、ＭＧＦと同一のアミノ
酸配列を有し、そして実質的に相同のポリペプチドであ
るところの分子を意味する。従って、最初はウシの乳汁
から単離された本発明のポリペプチド（ＭＧＦ）は、別
種の補乳頻起源の乳汁に由来するものであるか、または
組換えＤＮＡ技術により調製されたものであってもよい
。容易に大量に入手することができ、そのために因子の
量が限定されることなく本明細書で概説する精製方法を
用いて生産することができることから、ＭＧＦの原料と
しては牛乳が好ましい。

分析目的で、均一なＭＧＦ　（５（１〜ｌｏｏｐｍｏｌ
）試料を、乾燥し、次いで０．１％の液体フェノールを
含有する沸騰状態にある６ＮＨＣ１，１００ｕｌを入れ
た密封した真空排気チューブ中で２時間１５０°Ｃにて
加水分解した。半システィンおよびメチオニンは、過ギ
酸酸化の後、酸加水分解することにより測定した。

アミノ酸のＯ−フタルアルデヒド誘導体の分析は、蛍光
計および演算積算器を装備した変形アミノ酸分析器によ
り実施した。

ＭＧＦのモル当たりのアミノ酸残基数は、見かけの分子
量２５０００ダルトンに基づく。

アミノ末端配列分析のために、ＭＧＦ約５００ピコモル
（Ｍｒ２５．０ＯＯ）を還元し、次いでＩＭのトリス−
ＨＣ／２緩衝液（ｐＨ８，４）中の６Ｍのグアニジン−
Ｈ（ｌ存在下でジチオスレイトールおよびヨ　−ウ化−
（１４Ｃ）酢酸を用いてＳ−カルボキシメチル化した。

５ミクロンの５０Ｘ４．６ｍｍカラム上で０、１％のＴ
ＦＡを含む０〜９０％のアセトニトリルのダラージエン
ト（１分当たり１％）を用いて溶出するＨＰＬＣにより
過剰な試薬をカルボキシメチル化タンパクから分離した
。蛍光検出器を用いるアミノ酸分析によるタンパク量の
概算によれば、この工程での総回収率は９６％であった
。

約５００ピコモル（Ｍｒ１２．５００　）のＳ−カルボ
キシメチル化タンパクについて、気相シーケンサ−を用
いて自動エドマン分解を行った。ＰＨＴ−アミノ酸をＨ
ＰＬＣシステムを用いて固定した。初期収率は約３０％
であり、そして平均反応収率は約９０％であった。その
結果、ＭＧＦの各２つのサブユニットの少なくとも最初
の１９個のＮ−末端アミノ酸は同一であることを示し、
そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＭＣ，Ｆの還元体の単一
バンドを観察できることが確認できる。

５ｔ）Ｓ−ＰＡＧＥによりウシＭＧＦの分析は、いくつ
かのジスルフィド結合は、鎖間結合であることを示唆す
る。

当該新規成長因子の塩基性基を介して、無機または有機
酸により酸付加塩を形成することができる。精製の目的
で、水および／またはアルコール不溶性塩、例えばテト
ラフェニル硼酸塩、Ｃａ塩、ＡＩ！、塩およびＺｎ塩等
が企図される。

医薬としては、医薬として許容され得る塩、例えば水溶
性の金属またはアンモニウム塩、特に、アルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩、あるいはア
ンモニアまたは適当な有機アミンのアンモニウム塩が企
図される。好ましくは、無機酸、例えば塩酸、硫酸、も
しくはリン酸の酸付加塩であるか、有機酸、特に有機カ
ルボン酸もしくはスルホン酸、例えば低級アルカンカル
ボン酸もしくはジカルボン酸、例えばギ酸、酢酸、クエ
ン酸、およびトリフッ化酢酸等が挙げられる。

本発明のＭＧＦは、さらにその生物学的特性により特定
される。

精製の各段階でのＭＧＦの成長促進活性は、Ｂｔｉｒｋ
、　Ｒ，Ｒ，により公表されているアッセイ法（Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７０：３
６９．（１９７３）　）により測定され、そしてこの方
法は、ＭＧＦを含有する血清フリー培地の存在する正常
Ｂａ１ｂ／Ｃ３Ｔ３繊維芽細胞（またはそれらに由来す
る株）の単層培養で正常細胞が「傷害を受けた（ｗｏｕ
ｎｄｅｄ　）細胞」に移動する数を、ＭＧＦまたはいず
れか他の既知ポリペプチド成長因子の不存在下の培地で
前記のように移動する細胞数と対比して測定するもので
ある。

前記の方法を用いる投与量応答試験は、培養物１−当た
り４０±３５ピコモルはどの少量の完全精製ＭＧＦ濃度
が最大の移動応答の５０％を引き出すのに十分であるこ
とを示した。ＭＧＦのこの濃度は、ヒト皮膚上皮細胞株
（ＮＣＴＣ２５４４）が指標細胞型として使用された場
合にも、前記アッセイで最大移動応答の５０％を惹起し
た。

さらに、ＭＧＦは、光学顕微鏡下で観察した場合の細胞
性ＤＮＡ合成に対するその促進活性および前記単層培地
中で細胞分裂が見られることにより特徴付けられる。こ
の活性は、 （ａ）ＭＧＦを含有する血清フリー培地の存在下で増殖
した前記細胞の培養物中のいずれかの指定した視界領域
における細胞核の数を、ＭＧＦまたはいずれか他の既知
ポリペプチド成長因子の不存在下で増殖した培養物中の
いずれかの指定した視界領域における細胞核の数と対比
して計数すること。

（ｂ）ＭＣ，Ｆを含有する血清フリー培地の存在下で増
殖した前記細胞の培養物における放射能標識〔３Ｈ］−
チミジンの取り込み量を、ＭＧＦまたはいずれか他の既
知ポリペプチド成長因子の不存在下で増殖した培養物に
おける〔３Ｈ〕−チミジンの取り込み量と対比して測定
することのいずれかで定量した。

ＭＧＦの成長促進活性は、その分子の２５ｋｄの二量体
状態で特性を示すにすぎない。この活性は、５ＯＳ−Ｐ
ＡＧＥおよび窒素雰囲気下で５０ミリモル濃度のギ酸で
一夜溶出した後、前記二量体を含有するゲル・スライス
から溶離した上澄中に回収することができる。１２．５
ｋｄの単量体調製品を含有するゲル・スライスからの溶
離物中には、いかなる活性も回収することが出来なかっ
た。また、ＭＧＦの成長促進活性は、哺乳類起源の細胞
培養物や前記Ｂａ１ｂ／Ｃ３Ｔ３繊維芽型以外の型の細
胞培養物で試験した場合にも発現し、ウシの乳汁に由来
するＭＧＦに対する成長促進性応答が、その特質上程特
異的でないことを示唆している。

さらに、ＭＧＦは、ＥＧＦの存在下で相乗的に作用する
ことで特徴付けられる。この相乗作用は、軟寒天中での
正常ラット腎臓細胞（ＮＲＫ）の足場非依存性増殖のイ
ン・ビトロ誘発に対するアッセイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　
Ａ、Ｂ、等＋（１９８１）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８：５３３９　：ｌにおいて確認さ
れた。ＴＧＦ−β（ＴＧＦ−αに似ていない）が膜受容
体部位にバインディングするＥＧＦと競合せず、しかし
細胞コロニーの誘発に対するそれらの他の「活性化物質
（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）　Ｊ受容体の占
拠を要求するので、時にはこのアッセイを形質転換成長
因子β型（ＴＧＦ−β）アッセイと称する。この点で、
前記アッセイにおいてＥＧＦとかかる相乗作用を有する
タンパクの乳汁中における存在は、今まで報告されてい
なかった。ＭＧＦ単独では軟寒天中でＮＲＫ細胞の大き
なコロニーの形成を誘発するためには十分でないが、た
だマウスＥＧＦの存在下でそのように作用するのみであ
ろう。単独ではこのアッセイで顕著な効果を生ずるには
不十分である濃度（５ｎｇ−−’）のＥＧＦの存在下で
、ＭＧＦを０．１〜５００ｎｇｍＺ−’の濃度範囲内で
添加した場合には、ＭＧＦは大きなコロニー形成を誘発
する。

イン・ビトロで正常Ｂａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３繊維芽細胞の
移動および増殖を促進するのにＭＧＦのピコモル濃度で
足りるとは言え、相乗性応答はマウスＥＧＦの存在下で
生ずる。Ｂｊｉｒｋ、　Ｒ，Ｒ，（１９７３）　＋　Ｐ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７０：３６９に記載され
ているアッセイによれば、マウスＥ　Ｇ　Ｆ　３．１６
ｎｇ／　ｍｌの存在下でＭＧＦ（１０〜１００９ｇｍｊ
−１）の濃度範囲内）に対する最大移動応答は、ＥＧＦ
の不存在下よりも３０倍まで高いことを示した。

また、本発明は組み合わせ、特にＭＧＦおよびＥＧＦ受
容体とバインディングすることによりアゴニスト作用を
奏するポリペプチドとの相乗性併用剤に関する。かかる
ポリペプチドは、ＥＧＦそれ自体のほかに、例えばＴＧ
Ｆ−αを挙げることができる。かかる併用剤は、重大な
事故または大がかりな手術により生じるような深い傷を
処置する上で特に有用である。ＭＧＦおよびＥＧＦの等
モル量の併用剤が好ましい。

さらに本発明は、乳成長因子（ＭＧＦ）を含有する乳汁
またはいずれかの乳製品からＭＧＦを採取し、必要によ
り得られたフリーのＭＧＦを塩に転化するかまたは得ら
れた塩をフリーのＭＧＦに転化することを特徴とする乳
成長因子（ＭＧＦ）またはその塩の製造方法に関する。

本発明の成長因子は、それを含有する新鮮な乳汁または
乳製品のいずれかの原料から常法により採取される。Ｍ
ＧＦの好ましい原料は、特にウシ類、例えば乳牛、ヤギ
、および羊等の乳汁または乳製品である。他の原料は、
乾燥脱脂粉乳のような商業的に入手できる粉末孔である
。

より具体的に本発明の成長因子は、乳原料を各種のクロ
マトグラフ法、特に陽イオン交換クロマトグラフィー、
疎水的相互作用性クロマトグラフィー、サイズ排除クロ
マトグラフィーおよび／または、必要によりさらに精製
工程に付することにより採取される。プロテアーゼ阻害
剤、例えばフェニルメタンスルホニルフルオライドをＭ
ＧＦ含有原料に添加することが有利である。

新鮮なウシの乳汁からＭ（１，Ｆを単離する方法は、低
圧および高圧技術の両者を組み合わせ使用する陽イオン
交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー工程に
より特徴付けられる。各分離工程後に集められた試料画
分であって、Ｂａ１ｂ／Ｃ３Ｔ３細胞における前記細胞
移動アッセイで生理活性を示す試料画分は、次の精製工
程に供される。

集めた両分のそれぞれに由来する試料物質は、投与量応
答分析（前記細胞の同様なバイオアッセイを用いる）に
付され、これにより最大移動（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ）応
答の５０％を引き出すのに必要とされる物質量を評価す
ることが可能となる。前記量を本明細では「１単位」と
して定義しており、そしてこの値を、各活性プールの物
質量の値とを一緒に用いて、本発明の方法の各工程にお
ける精製収率、回収率および比活性を計算することがで
きる。最終精製工程に由来する純粋ＭＱＦの同質性は、 （ｉ）一定の比活性、 （ｉｉ　）　ＳＤＳ−ＰＡＧＥで追跡される約２５〜２
６ｋｄの単一バンドとしての移動度、 （ｉｉｉ）一定のアミノ酸組成、 （ｉｖ）一定のアミノ酸配列分析、により示される。

特に、ＭＧＦの採取は、成長因子を含有する希釈した乳
汁または粉乳の水懸濁液を陽イオン交換樹脂で処理し、
該因子を装填した該樹脂を１０ｍＭのリン酸二水素ナト
リウム（ｐＨ７，０）の緩衝液系で洗浄し、４０％エタ
ノール中の２０ｍＭのリン酸二水素カリウムから成る緩
衝液系（ｐＨ７，６）で樹脂から該因子を溶出し、特に
、酸付加塩の状態でそれを疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー次いでポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付し、そして所望によりさ
らに精製工程に付した後、所望により塩基の状態で得ら
れた成長因子を塩に転化するか、または塩の状態で得ら
れた成長因子をフリー塩基かもしくは他の塩に転化して
実施される。

クロマトグラフィー前に、乳汁または粉乳を、例えば塩
化メチレンのような無極性有機溶媒で抽出するか、また
は粉乳の場合にはアセトンで抽出することにより、脂質
や他の無極性物質を除去してもよい。乳汁を蒸留水中に
希釈するには、乳汁中の水の割合は、容量で約１：３〜
１：１０、好ましくは約１＝４である。

粉乳を蒸留水中に懸濁するには、粉末中の水の割合は、
重量で約１：５〜約１：２０、好ましくは約１：１０で
ある。

陽イオン交換クロマトグラフィーでは、いずれかの適当
な陽イオン交換樹脂、例えばバイオ・ラッド（Ｂｉｏ　
Ｒａｄ）へＧ５叶シリーズの樹脂、アンバーライト（Ａ
ｍｂｅｒｌｉｔｅ）　ＩＲシリーズの樹脂、ゼオカーブ
（Ｚｅｏｃａｒｂ）２２Ｓ　、ダイアイオン（Ｄｉａｉ
ｏｎ）ＳＫシリーズの樹脂、ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ
）　ＡＧ５０−シリーズの樹脂を用いてもよい。固相マ
トリックス担体に結合する交換可能な対グループの状態
（ディスクまたはカートリッジの状態）でのイオン交換
は、例えばゼータペレプ（Ｚｅｔａｐｒｅｐ）　３Ｐシ
リーズの陽イオン交換体をも用いることができる。

好ましい陽イオン交換樹脂は、５０〜１００メツシユの
ダウエックスＡＧ　５０ＷＸ　２である。この樹脂は、
使用前にアセトン、エタノールおよび／または水で洗浄
してもよい。対応する金属水酸化物、例えばアルカリ金
属水酸化物で処理して、例えばナトリウムまたはカリウ
ムのようなアルカリ金属陽イオンで交換した後、樹脂を
中性になるまで洗浄し、次いで適当な低イオン強度の緩
衝液（ｐＨ７，０）、好ましくはリン酸二水素ナトリウ
、ム緩衝液（１０ｍＭ）で平衡にする。新鮮な乳汁また
は再構成孔を同じアルカリ金属水酸化物で同じｐＨに調
節し、次いで樹脂と接触せしめる。この負荷した樹脂を
、洗液にポリペプチドが見られなくなるまで、即ち２８
０ｎｍにおける光学濃度が基線に達するまでｐＨ７，０
の同一の緩衝液で洗浄する。次に、所期の成長因子を、
特に４０％のエタノールの存在下で７００ｍＭの酢酸カ
リウムを有する高いイオン強度のアルカリ金属塩水性緩
衝液（ｐＨ７，６）を用いて溶出する。

所期の活性を示す両分を集め、そして所望により蒸発に
より濃縮する。初期の総括性の約１０％に当たるものが
、１０００倍上昇した比活性を有するものとして得られ
る。

集めた両分を、相互作用性疎水基を担持する電荷をもた
ないマトリックスから成る樹脂の疎水的相互作用性クロ
マトグラフィーにかける。適当な樹脂としては、例えば
フェニルセファロースまたはオクチルセファロースを用
いることができる。

好ましい疎水的相互作用性樹脂は、フェニルセファロー
スＣＬ−４Ｂである。

使用スる前に、該フェニルセファロースをアルコール、
例えばｎ−ブタノールおよびエタノールで、次いで水で
連続的に洗浄して再生する。ダウエックス・クロマトグ
ラフィーから集めた両分を、その両分中で一部フェニル
セファロース樹脂を直接撹拌することにより該樹脂に吸
着させる。次に、この樹脂をカラムに充填し、０．６　
Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５，０）で洗浄し、次いで
同じ溶液（ｐｌ＋５．０）中でエタノール量を逐次増量
（例えば、２８％〜４０％）するグラージエントにより
所期の活性を十分に溶出する。

このフェニルセファロース疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー工程の活性画分を集め、凍結乾燥し次いで小量
の高いイオン強度の緩衝液、例えば２Ｍの酢酸アンモニ
ウム（ｐＨ５，５）に再溶解するか、またはそのまま高
性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の第１活性製
品を調製するブチル・ポリオール疎水的相互作用性クロ
マトグラフィーカラムにかける。このカラムを同じ緩衝
液で洗浄し、次いでエタノール量が直線的に上昇する（
例えば、２０〜２５％）グラージエントにより所期の活
性を十分に溶出する。

ブチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマトグラフィ
ー工程の活性画分を集め、大量の、好ましくは等容量の
同一緩衝溶液、即ち２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５，
５）と混合し、）ＩＰＬＣシステムの第２活性製品を調
製するオクチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマト
グラフィーカラムにかける。このカラムを同じ緩衝液で
洗浄し、次いでエタノール量が直線的に上昇する（例え
ば、４０〜４５％）ダラージエントにより所期の活性を
十分に溶出する。

オクチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマトグラフ
ィー工程の活性画分を集め、凍結乾燥し次いで少量の、
好ましくは１００Ｉ１１の７部の６０％のエタノールと
３部の２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５，５）から成る
緩衝溶液に再溶解せしめ、そしてＨＰＬＣシステムの第
３活性製品を調製するＴＳＫＧ　２００ＯＳＷカラムの
サイズ排除クロマトグラフィーに付す。溶出方法は、同
じ緩衝溶液を用いる同様な溶出条件下で実施し、活性含
有画分を集め、凍結乾燥し次いで使用するまで一２０°
Ｃで貯蔵する。

得られる成長因子は、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより約２５〜
２６ｋｄの分子量を有する単一バンドとして移動し、約
９５％〜１００％の純度を有するであろう。

所望により、前記１以上のクロマト処理またはポリペプ
チド精製の技術分野で使用される他の方法、例えば向流
分配法、等電点分離法、クロマトフオーカシング、透析
、塩および溶媒沈殿、他のゲルを用いる吸着、セルロー
ス・イオン交換クロマトグラフィー、多孔質ガラスピー
ズ上での電気泳動クロマトグラフィーならびに固定化亜
鉛キレートＨＰＬＣによるクロマトグラフィー等により
本発明の成長因子をさらなる精製を行うことができる。

分子内塩の形で得られるフリーのＭＧＦは、当該分野で
既知の方法、特に所望の陰イオン等を負荷したイオン交
換樹脂を介して酸もしくは塩基で処理して所望の塩を調
製してもよく、また得られる塩は、フリー塩基もしくは
他の塩に転化してもよい。

その精製工程中の各種の両分中の成長因子の存在は、２
８０ｎｍにおける光学濃度を測定し、そして特にそれが
特徴付けられる各種の特性を測定することによりチエツ
クすることができる。好ましい方法としては、Ｂｊｉｒ
ｋ、　Ｒ，Ｒの移動アッセイ（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ八５
ｓａｙ）　　へＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、ＵＳＡ、　　７０（１９７３）：３７０）による各両
分の細胞移動促進特性の測定が挙げられる。２Ｘ１０５
個の３Ｔ３−Ｂ細胞（ＢａＩｂ／ｃ　３Ｔ３細胞に由来
する〕のクローンＡ３１を、３５胴プラスチック製ペト
リ皿（Ｎｕｎｃ）中にウシ胎児血清を１０％含有するダ
ルベツコ変性イーグルの培地２．５　＋ｎ！に接種する
。３７°Ｃで３日放置した後２、皿の底上に無菌のカミ
ソリの刃を押し付けて集密的細胞単層中に傷を付けて細
胞シートを切断しそして「スタート・ライン」を標識す
る。

カミソリの刃を端に向かってゆっくり動かしてこのシー
トの一部を取り出す。吸引により液体培地および細胞デ
ブリを取り出し、血清を含まないイーグルの培地２．５
　ｍＺに再接種し、次いで成長因子を含有する両分の適
当量について試験する。

３７°Ｃで２２時間放置した後、その細胞を室温でライ
シュマン（Ｌｅｉｓｈｍａｎｎ）の溶液を用いて固定し
そして染色する。移動活性は、カミソリの刃で甲された
「スタート・ライン」のｌ１ｍ１＋にわたる細胞数とし
て定義される。

さらに、本発明は、投与製剤中に乳成長因子の有効量か
、またはその医薬として許容され得る塩を含んでなる医
薬組成物に関する。

かかる組成物は、それぞれ非経口的、例えば筋肉内また
は静脈内に注入する溶液または製剤であるか、あるいは
経口または特に局所、即ち局所的投与のための注入液ま
たは製剤の剤型として存在する。溶液は、好ましくは使
用前に調製することができる、例えば活性成分を単独で
含むか、または医薬として許容され得る担体を一緒に含
む凍結乾燥調製品に由来する等張性水溶液または懸濁液
である。非経口的使用のための溶液は、一般に水溶液で
ある。これらは常法により調製され、活性成分に、さら
に生理食塩水、ヒト血清アルブミンのような安定剤、ア
ルギニンまたはグリシンのようなアミノ酸、およびグル
コース、マンノース、デキストランまたはヒドロキシエ
チル澱粉のような炭水化物を含めてもよい。ｐＨは、緩
衝剤、例えばリン酸塩、琥珀酸塩またはアミノ酸により
約４．５〜７に調整してもよい。一般に、バイアルは、
長期貯蔵用としては溶液を充填した後凍結乾燥される。

洗口液も常法で調製される。これらは活性成分を例えば
水または水性アルコール（例えば、約３０〜６０％）に
溶解して含み、味覚を増進するために常用される添加剤
、例えばポリエチレングリコール、グリセロールおよび
エーテル性油、例えばハツカ油を含んでもよい。局所に
使用するための医薬製剤は、粉末、錬歯磨を含むクリー
ム、チューインガム、ローションおよびチンキ剤等を含
んでなり、そしてこれらも同様に常法で調製される。

粉末は、通常タルク、活性成分および場合により他の添
加剤、例えば安定剤および芳香剤から成っている。クリ
ームや軟膏は、−船釣な特性のものであり、モノステア
リン酸ソルビタンまたはモノステアリン酸ポリオキシエ
チレンステアリン酸のようなステアリン酸エステル、ト
リオレイン酸ソルビタンのようなオレイン酸エステル、
セチルアルコールまたはプロピ１／ングリコールのよう
なアルコール、ラノリンのようなパラフィンまたは微結
晶ワックス、硫酸マグネシウムまたは錬歯磨用のクリ−
ジン粉末のよう７Ｊ粉末、および防腐剤等を含んでなる
ものでもよい。舌下または咽頭投用のための固型投与剤
は、普通の医薬製剤上の賦形剤、例えば（ａ）シューク
ロース、デキストロース１、ラクトース、マニトールも
しくはソルビトールのような希釈剤およびロゼンジ基材
、（ｂ）澱粉糊、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースのような結合剤、（
Ｃ）ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウ
ム、タルクもしくは水素化野菜油のような潤滑剤、そし
て場合により（（１）着色剤、香料、香味料等を用いて
調製される砥削であってもよい。

他方、ゼラチンおよびグリセロールを主成分とするか、
またはアラビアゴムおよび糖の混合物を用いて調製され
る香錠は、口内でゆっくり溶解することを目的に使用す
ることができる。

呑み込むことによる経口的摂取用の固型剤形は、錠剤ま
たはゼラチンカプセルであることができる。

活性物質は、適当な通常用いられている医薬製剤上の賦
形剤および添加剤、例えば錠剤としては、（ａ）希釈剤
、例えばラクトース、澱粉、セルロース、ソルビトール
、リン酸カルシウムもしくは硫酸カルシウム、（ｂ）結
合剤、例えば澱粉糊、ゼラチン、ポリビニルピロリドン
、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくは他の適
当なセルロースエーテル、（Ｃ）崩壊剤、例えば澱粉、
スターチグリコール酸ナトリウム、ナトリウムカルボキ
シメチルセルロース、クロスポビドン（ｃｒｏｓｐｏｖ
ｉｄｏｎｅ）、（ｄ）潤滑剤および滑沢剤、例えばステ
アリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステ
アリン酸、タルク、コロイド状二酸化シリコン、水素化
野菜油、そして場合により（ｅ）界面活性剤、例えばラ
ウリル硫酸ナトリウム、着色剤等と一緒に処方される。

錠剤のコアーは、胃液に対して抵抗性であるかまたは抵
抗性でない適当な被覆により提供される。外側のコアー
は、糖を主体とするか、またはセルロースニーチルもし
くはアクリル系樹脂に基づく薄い膜から成るものであっ
てもよい。糖衣は、濃厚糖シロップを用いて処理し、次
いで普通に使用される被覆成分、例えばタルク、ポリビ
ニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび染料も
しくは色素を含有する懸濁液被覆することができる。フ
ィルム被覆剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
のようなフィルム形成剤、ポリエチレングリコールのよ
うな可塑剤、タルクのような抗粘結剤、色素ならびに二
酸化チタンおよび酸化鉄のような乳白剤を含んでいても
よい水溶液または水性懸濁液として適用される。腸溶皮
は、胃液には溶解しないが、腸液に溶解する、例えば酢
酸セルロース、有機溶媒中のフタル酸エステルまたはメ
タクリル酸共重合体であるポリマー・のラッカー溶液を
用いて得られる。

カプセルは、調製した硬質ゼラチン外皮を用いて医薬製
剤を充填するか、またはゼラチンおよびグリセリンまた
はソルビトールのような軟化剤の混合物から調製された
軟質ゼラチン外皮を用い、そして医薬製剤を充填する工
程中に密封して調製される。硬質ゼラチンカプセルは、
錠剤用として（ａ）および（ｄ）に前述したような希釈
剤、潤滑剤および滑沢剤により調製される粉末混合物を
含むか、または錠剤に圧縮成型するために使用されるも
のおよび前述の（ａ）〜（ｄ）にＮ僚する成分による顆
粒化物を含んでいてもよい。また、硬質ゼラチンカプセ
ルは、活性成分を適当な液体または半固体基材、例えば
ポリエチレングリコール、脂肪油またはポリオキシエチ
レン化グリセライド誘導体を有し、必要によりワックス
またはコロイド状二酸化シリコンのような増粘剤および
／またはポリソルベートのような界面活性剤を有する液
体、糊または固形塊を含んでいてもよい。軟質カプセル
では、好ましくは活性成分が適当な液体、例えば脂肪油
、パラフィンまたはポリエチレングリコールに溶解され
るか懸濁される。

活性成分は、経口摂取用の多重単位投与剤形を構成する
小さなペレットに取り込まれていてもよい。ペレット中
への医薬の分配は、用意したべしく４３） ットの表面上に溶液または懸濁液をスプレーすることに
より実施するか、または医薬と適当な希釈剤を含有する
混合物からペレットを形成することにより実施される。

表面上への加工用ペレットは、市販の砂糖と澱粉を含有
するノンパレイユ砂糖球であるか、または押し出し加工
次いで水で湿気を与えてかたまりにした微結晶セルロー
スおよびラクトースのような賦形剤を用いて球状化する
ことにより調製され得るものである。後者の工程を用い
て、ペレットに医薬を取り込むことができる。

ペレットは、有機溶媒における溶液または水性分散物と
して適用されるポリマーく例えばエチルセルロース、ポ
リメタクリレート樹脂、酢酸フタル酸セルロース等を用
いる保護または放出調整ラッカーで被覆されていてもよ
い。該ペレットは、硬質ゼラチンカプセルに充填するか
、または適当な錠剤成形用賦形剤と共に錠剤に成形する
こともできる。

組成物は、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤および／また
は乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および／または緩
衝剤の通常用いられている補助剤を含む。本発明の医薬
組成物は、場合によりさらに薬理学上有用な物質を含ん
でいてもよく、そしてこのものはそれ自体既知の、例え
ば通常の混合、溶解、凍結乾燥および／または滅菌方法
により調製でき、そして活性成分の１００％までの凍結
乾燥標品として製剤のｇ当り約１ｎｇ〜１００■、特に
約１０ｎｇ〜１０■含む。

またさらに、本発明は、本発明の医薬活性化合物を常法
、例えば医薬として許容され得る担体と混合処理するこ
とを特徴とする医薬組成物の製造方法に関する。

また、本発明は、ＭＧＦまたはその医薬として許容され
得る塩の有効量を含んでなる錬歯磨にも関連する。この
錬歯磨は、特に歯茎の傷、例えば歯根膜炎または歯肉炎
の予防および／または治療に有用である。

さらに、本発明は、ＭＧＦまたはその医薬として許容さ
れ得る塩の有効量を含んでなる洗口液およびその製造方
法にも関する。本洗口液は、口内または喉の傷、例えば
歯根膜塩、歯肉塩または喉の炎症を介して生じる傷の予
防および／または治許容され得る塩の有効量を含んでな
る化粧品組成物にも関する。本化粧品組成物は、局所医
薬組成物と類似するものであってもよく、さらに芳香性
化合物を含んでもよい。かかる組成物は、通常用いられ
るシェービング石ケン、ホーム、クリームおよびローシ
ョンに含められる。

またさらに、本発明は、医薬組成物、洗口液、錬歯磨お
よび化粧品調製物の調製のためのＭＧＦの使用にも関す
る。

ＭＧＦは、一方ではある型の体細胞、即ち繊維芽細胞お
よび他の間充繊細胞の増殖を促進し、他方ではその他の
型の体細胞、即ち腫瘍細胞および免疫系の細胞の増殖を
阻害する如き二元的な特徴を有する。

場合により塩、例えば特に無毒性の医薬として許容され
得る酸付加塩の剤形中に存在してもよい本発明の新規な
成長因子および場合により医薬製　　　　・剤の剤形中
に存在してもよい該成長因子は、有効量で適用される。

「有効量」の語では、主に癒合または化粧用に効果督奏
する量、例えば所期の細胞の増殖を促進し、かつその細
胞に毒性を示さない量を意味する。このような量は、例
えばイン・ビトロ増殖試験により決定することができる
。

ＭＧＦの二元的な特性のため、「有効量」とは、腫瘍細
胞および免疫系細胞の増殖および分裂を意義ある程度に
阻害する量でもある。ヒトまたは家畜への使用が意図さ
れる場合には、その量は処置される特有の組織、投与の
様式、疾病の激しさ、ならびに処置される宿主の年令お
よび一般的な状態に適合させねばならない。一般に、成
人に対する投与量は、成長促進作用および阻害作用のい
ずれに対しても約０．１〜１０００■の範囲にあるであ
るう。処置される特有の種に由来する成長因子の使用、
即ちヒトを処置するためにはヒトの乳汁由来の成長因子
を、牛を処置するためには乳牛の乳汁由来の成長因子を
使用することによりアレルギー反応を避は得る可能性が
ある。

Ｈの　　　の　　上の′ 活性成分がＭＧＦまたは適当な活性剤、好ましくはＥＧ
ＦとＭＧＦとの組み合わせである、本発明の医薬組成物
は、傷の癒合の場合における動物、特に哺乳類、より具
体的には人間、就中、老令の人間の処置における臨床上
の用途を有する。プロトコールＩ〜■でいくつかの結果
を提供しこの事実を裏付ける。

本発明の組成物は、細胞移動および細胞増殖を促進する
。傷の癒合が細胞移動と細胞増殖とに関連するのでイン
・ビトロにおけるこれらのパターンが直接イン・ビボに
おける傷の癒合過程に関連することがわかってきた。

本発明の組成物の活性成分が有する重要な特性は、イン
・ビトロまたはイン・ビポのいずれにおいてもそれらの
活性について種特異的な組み合わせが要求されないこと
、即ち、ある種、例えばウシに由来するＭＧＦが別の種
、例えばマウスＥＧＦに由来する活性剤により活性化す
ることができることである。さらに、イン・ビトロまた
はイン・ビボのいずれかにおける移動および／または増
殖が促進される細胞としては、組成物の活性成分から相
違する種のものまたは別の型、例えば繊維芽細胞もしく
は上皮細胞（これら２つの前記細胞の増殖促進が最大の
医療上の有用性を有するであろうと考えられるものであ
るが）を挙げることができる。ＭＧＦとＥＧＦの相乗作
用は、皮膚が適する標的であることを示唆する。床擦れ
（褥庶性潰瘍）は、入院患者、特に老人医学上の患者お
よび車椅子患者において頻繁に生ずるので床擦れの予防
または治療が好ましい目的である。老令の人々では傷の
癒合が緩慢であり、そしてこのグループの患者は癒合が
緩慢であるかほとんど癒合しない傷（Ｗｆ性潰瘍および
糖尿病性潰瘍だけでなく、外傷および火傷等をも含む）
の高い罹病率を示すｆ頃向にある。

本発明の組成物投与の２つのタイプは、特に動物薬と人
間薬として提供される。

第１のもので、かつ好ましい投与は、傷の癒合が著しく
緩慢である特に老人の表面的な傷の癒合を促進するため
の局所的なものである。処置され得る傷の型としてはい
かなる制限もなく、そしてこれらには（限定されるもの
でないが）、褥疹（床擦れ）性、糖尿病性、歯科性、口
内性、静脈瘤性および血友病患者の潰瘍；火傷（第二度
および第三度）；外科的切開（歯科領域上のおよび美容
上の手術のものを含む）；不慮の傷（切開、貫入、裂傷
および他の外傷を含む）および治療上惹起される傷（放
射線療法を通じて誘発されるものを含む）を含む表面的
な潰瘍が挙げられる。局所的に投与される場合に本発明
の組成物は、他の成分、例えば補助薬、担体、可溶化剤
およびその他の既知の、または未だ知られていない第二
の成長因子と組み合わされていてもよい。これらの成分
の性質としては、投与のために医薬として、かつ生物学
上許容され得るものでなければならず、そして組成物の
活性成分の活性を低下せしめるか、または有害な毒性を
示してはならないことを除いていかなる制限もない。本
発明の組成物が表面上の潰瘍、火傷、外科的または不慮
の傷に対して投与される場合には、該組成物は、好まし
くは粉末、ゲル、軟膏もしくはイリガント（ｉｒｒｉｇ
ａｎｔ）　、、またはトランスデルマル（ｔｒａｎｓｄ
ｅｒｍａｌ）中に該組成物を含浸せしめた粘剤、硬剤お
よび包帯の剤形中に含まれていることが好ましく、そし
てまた好ましくは液体もしくは半流動剤形中に含まれて
いるか、あるいはそれらが錬歯磨中に取り込まれている
かまたはチューイング用のガムもしくは樹脂に取り込ま
れていてもよい。

第二の投与は、外科的な処置が不可能であるかまたは要
求されない内部器官の組織に対する損傷または術後の内
面性の傷の癒合のための全身系のものである。さらに、
処置される組織または傷の型としてはいかなる制限もな
く、そしてこれらとしては（限定されるものでないが）
、内部器官および組織に対する深い外科的な切開；骨お
よび軟骨（骨折後の）；胃、十二指腸およびその他の腸
の潰瘍が挙げられる。全身的に投与される場合、本発明
の組成物は、経腸投与にあっては液剤九剤、錠剤、砥削
として製剤されてもよく、また非経口的な注入では液剤
として製剤されてもよい。術後の内面的な切開の処置で
は、それらはイリガントの剤形であってもよく、好まし
くは生理食塩水との併用剤形であってもよい。さらに、
本発明の組成物の活性成分は、他の成分、例えば補助薬
、担体、可溶化剤およびその他の既知の、または未だ知
られていない第二の成長因子と組み合わされていてもよ
い。これらの成分の性質としては、投与のために医薬と
して、かつ生物学上許容され得るものでなければならず
、そして組成物の活性成分の活性を低下せしめるか、ま
たは有害な毒性を示してはならないことを除いていかな
る制限もない。

また、本発明は、医薬組成物そしてまたは化粧用組成物
の投与を含んでなる哺乳類の損傷を予防または治療する
ための方法にも関する。

傷の癒合に対して投与される活性成分の量は、まったく
臨界的でない。一般には、傷のＩＣＴｌ！当り約０．１
〜ＬＯｔｔｇのＭＧＦの一日量で、だいたい有意な癒合
効果を有する。内部使用にあっては、体液中でのＭＧＦ
の希釈のため投与の様式に応じてより高めの量が投与さ
れる。高めの量でも安全であることは、ＭＧＦが乳汁中
に存在するとの事実により認められる。

驚くべきことに、本発明のＭＧＦは、プロトコール■お
よびＶで明らかにするように広範なスペクトラムの免疫
抑制活性を有する。

従って、本発明は、ＭＧＦまたはその医薬として許容さ
れ得る塩の免疫抑制の有効量を投与することを含んでな
る免疫応答の抑制方法にも関する。

本発明のＭＧＦの免疫抑制作用は、臓器移植手術におい
て、そしてまたは炎症のような自己免疫疾患を予防しそ
して処置するためにも使用することができる。

さらに、本発明のＭＣＦは、メラノーマ細胞系Ａ３７５
　（プロトコール■）およびヒト乳癌細胞（プロトコー
ル■）に対する抗増殖作用によって示され得るように、
抗腫瘍活性（例えば、メラノーマ細胞に対して）を有す
る。

従って、本発明は、ＭＧＦまたはその医薬としく５４） て許容され得る塩の抗増殖性に有効量を投与することを
含んでなる癌の処置方法にも関する。

要求される活性剤の量は、たとえ試験がほぼ等モル量が
好ましいことを示唆するとしても、本発明の適切な組成
物中に存在するＭＧＦ量に左右されるであろう。本発明
の組成物のいずれかの外来の成分を伴う活性成分の的確
な量は、ＭＧＦおよび／または活性化剤の比活性、処置
される疾病（例えば、傷のサイズ、傷の性状および傷の
局在場所）により左右される。黒色腫を含有する表面的
な傷に対する局所投与剤では、１ｍ１当りｌｎｇ〜１■
のＭＧＦが存在するであろう。本発明の活性成分は、受
容体部位にバインディングし次いで増殖および移動が促
進されている細胞により利用されことによって効果を奏
するので、該組成物の連続的または周期的な再投与が好
ましい。

Ｍ否」コ刈１Ｑ使月− 乳汁の主要な役割が新生児の栄養源として明らかである
とは言え、ＭＧＦもまた局所的な組織レベルだけでなく
ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）と類イ以の様式で動物その
ものの成長を促進する効果をも有する。この点で、本発
明の組成物は成長過程にある若い動物、例えば子牛、子
羊、子馬、子豚および若鶏の飼料添加剤としても有用で
あると想像される。

従って、本発明は、さらにＭＧＦまたはその塩の成長を
促進する量を含んでなる飼料組成物、およびＭＣ，Ｆま
たはその塩の成長を促進する量を含んでなる飼料組成物
を前記動物の成長を促進する量を投与することを含んで
なる動物の成長の促進方法に関する。

さらなる適用は、通常の培地条件下では増殖することが
困難な培養細胞、例えばＳＶ４０ウィルスの形質転換胎
児性ヒト繊維芽細胞系ＷＩ−３８ＶＡ１３の増殖のため
にＭＧＦを使用することである。その上、ＭＧＦはタン
パクが不足しているかまたは実質的にタンパクを含まな
い培地中で一定の細胞を増殖するために使用することが
でき、これによって細胞の培地として使用される血清の
節約を可能とする。従って、Ｒ，Ｒ，Ｂｊｉｒｋに従う
試験が示すように、血清フリーの培地において、約１１
−１Ｏ００ｐのピコモル濃度で本発明の因子がＢａ１ｂ
／ｃ　３Ｔ３細胞の移動および増殖を促進する。

従って、本発明は、またＭＧＦまたはその塩の増殖の促
進を刺激する量を含んでなる実質的に他のタンパクを含
まない細胞増殖培地にも関し、さらにＭＧＦまたはその
塩の増殖を促進する量を前記培地に添加することを含ん
でなる実質的に他のタンパクを含まない培地を用いるイ
ン・ビトロでの細胞の増殖方法にも関する。

以下の例は、本発明を説明するために提供するが、それ
らを限定するものとして解釈できない。

ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）ＡＧ　５０ＷＸ　２．５０
〜１００メツシユの樹脂（３０ｆｆｉ　；　Ｈ＋型）を
適当なサイズのクロマトグラフィー用カラムに充填し、
最初に５０％エタノール中ＩＭの水酸化ナトリウム２〜
３ベツド量で洗浄し、次いで蒸留水３〜６ベツド量で洗
浄した。次に、０．ＯＩＭのリン酸二水素ナトリウム（
ｐＨ７，０）の２〜３ベツド量でＮａ＋型に平衡化した
。新鮮な乳汁（２５０〜４００ｊ２）を４倍量の蒸留水
で希釈し、次いで０．１　Ｍのフェニルメタンスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）　（生の乳汁に対するプロ
テアーゼ阻害剤）４０ｍＺを添加した。次に、この希釈
した乳汁溶液を４°Ｃでカラムベツドを通してゆっくり
とポンプで流し、これによって樹脂に適当に含まれる乳
タンパクの吸収を可能にした。

充填後、この樹脂を０．ＯＩＭのリン酸二水素ナトリウ
ム（ｐＩ（７，０）の１１／２ベツド量で洗浄した。

次に、このカラムを０．０２Ｍのリン酸二水素カリウム
の２１７２ベツド量で溶出し、次いで４０％エタノール
中０．７Ｍの酢酸カリウム（ｐＨ７，６）で２８０ｎｍ
の０．０．がベースラインに戻るまで溶出した。酢酸で
各両分を直ちにｐ）１４．５〜５．５に調整した。

２８０ｎｍに小さな吸収ピークを有する酢酸カリウムの
溶離液が所期の活性の大部分を含んでいた。第１図に集
めた画分の移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）活性と共に、溶
離相に関する２８０ｎｍにおける吸収を示した。活性画
分（Ｎα８〜１７）を集め、ロータリー・エバポレ・−
ターで２〜３倍濃縮し、次に使用するまで４℃に貯蔵し
た。

ｂ）　　　・　互　　　クロマトグラフィーＩフェニル
・セファロースＣＬ４Ｂ　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）製〕を、１カラム容量のｎ−ブタノール、１
容量のエタノール次いで約１０容量の蒸留水で洗浄して
再生した。ａ）項に由来する活性画分の集めたもの（減
圧下でロータリー・エバポレーターで減少せしめた総量
は通常４０〜５０Ｉ！、）を、適当なサイズの容器中Ｉ
Ｍの水酸化アンモニウムでｐＨ５，０に調整した。前記
のごとく調製したフェニル・セファロースＣＬ４Ｂ樹脂
約７５０　＋ｎＺを前記容器に添加し、４°Ｃで一部穏
やかに内容物を撹拌した。

撹拌を停止した後、樹脂が定着するまで静置し、次いで
上澄物を注意深くデカントして廃棄した。

次に、樹脂を大きなガラス漏斗に移し、０．６Ｍの酢酸
アンモニウムから成る緩衝液を流出液がもはや不透明で
なくなるのに必要な量用いて徹底的に洗浄した。次に、
適当なサイズのクロマトグラフィー用カラムにその樹脂
を移し、充填したカラムをさらに０．６　Ｍの酢酸アン
モニウム（ｐＨ５，０）２容量で洗浄し、次いで所期の
活性の溶離が十分になされるように０．２Ｍの酢酸（ｐ
Ｈ５，０＞中２８％および４０％エタノールで段階的に
溶出させた。

２８％の段階のものを無視して容量を減らすことができ
た。第２図に集めた両分の移動活性と共に、溶離相に関
する２８０ｎｍにおける吸収を示した。活性画分（Ｎｏ
、　１１３〜１８０）を集め、次に使用するまで４℃に
貯蔵した。

Ｃ）　　　・　　　　　クロマ　グーフィーＩＩ　（Ｈ
ＰＬＣ）ｂ）項に由来する活性画分の集めたもの（通常
、総量は２〜２．５　Ａ　）を、乾燥するまで凍結乾燥
し次いで６０％エタノール７部と２Ｍの酢酸アンモニウ
ム（ｐＨ５，０）３部から成る混合液の小量（通常、５
０ｒＲ１）に再溶解するか、または減圧蒸発により３〜
１０倍濃縮した。このものに、さらに２Ｍの酢酸アンモ
ニウム（ｐＨ５，５）から成る緩衝液の１〜２容量を添
加し、次いで室温下、ブチル。

ポリオール５ｉ５００（１０，１／１１ポアー・サイズ
）の疎水的相互作用性クロマトグラフィー用カラム上に
、１分当たり１−の流速で前記溶液をポンプで流した。

このカラムを同じ緩衝液で洗浄した後、次いでエタノー
ルの量を高めてい（直線的なグラジェント（本例では、
グラジェントの平坦な部分を通じて２１〜２４％）を用
いて溶出した。なお、この方法は所期の活性を溶離する
のに十分であった。第３図に集めた両分の移動活性と共
に、溶離相に関する２８０ｎｍにおける吸収を示した。

活性画分（Ｎｏ、３１〜４０）を集め、次に使用するま
で蒸発を避けるため密封容器中で−２０’Ｃに貯蔵した
。

ｄ）　　　・　　　　　クロマトグーフィーＩＩＩ　（
）ＩＰＬｃ）０項）に由来する活性成分を集めたもの（
通常、総量２０〜４０ｍＺ）を２Ｍの酢酸アンモニウム
緩衝液（ｐＨ５，５）の等量と混合し、室温下でオクチ
ル・ポリオール５ｉ５００（１０声ボアー・サイズ）上
にポンプを用い流速１公告たり１ｍｌで流した。次に、
このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、次いでエタノールの
量を高めていく直線的なグラジェント（本例では、グラ
ジェントの平坦な部分を通じて４０〜４２％）を用いて
溶出した。なおこの方法は所期の活性を溶離するのに十
分であった。最後にカラムを０〜１００％の直線的エタ
ノールのグラジェントを繰り返して脱着せしめた。第４
図に集めた両分の移動活性と共に、溶離相に関する２８
０ｎｍにおける吸収を示した。活性画分（Ｎα３９〜４
２）を集め、使用するまで一２０℃にて貯蔵した。

ｅ）サイズ　、クロマトグー７に（ＨＰＬＣ）ｄ）項に
由来する活性画分の集めもの（通常、総量は２〜１０−
）を、乾燥するまで凍結乾燥し次いで６０％エタノール
７部と２Ｍの酢酸アンモニウム（ｐＨ５，５）３部から
成る緩衝液１００−に再溶解した。次に、再溶解物をＴ
ＳＫＧ２００サイズ排除カラムに注入し、次いで室温下
で同じ緩衝液を用い、流速１公告たり０．２　ｒｄで定
常的に溶出を行った。第５図に集めた両分の移動活性と
共に、全定常溶離相に関する２８０ｎ１１１における吸
収を示した。

活性画分（Ｎｏ、８６〜９１）を凍結乾燥し、そして使
用するまで一２０°Ｃにて個別に貯蔵した。

ｅ）項に由来する活性画分中にＭＧＦは存在し、ほぼ１
００％の純度を有する製品として含まれていて、そのも
のは約２５０００の分子量を存する。この値は、α−キ
モトリプシン標準に対して５３０ｎｍで走査した１、　
５　ｍｍ厚の銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１５％のア
クリルアミドを含有する）から概算した（島津Ｃ５−９
３０デュアル波長走査デンシトメーターを使用）。銀染
色法は、Ｂ１１ｒｋ、　Ｒ，Ｒ，等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｔｎＥｎｚｙｍｏｌｏ’ｇｙ、　９１，２４７〜２５４
（１９８３）　、に準じて行った。

フラット・ベツド等電点電気泳動条件下で、活性物質は
ｐｔｔｃ＋、ｏ〜１０．５の区画から採取された。

［［弛少ｆｌな　、′からのＭＣ，Ｆの他の哺乳類原料
、例えばヒト、羊または山羊に由来する新鮮な乳汁の適
当量を最初に工程１ａ）のごとく希釈し、例１ａ）〜ｌ
ｅ）と同様に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的
相互作用性クロマトグラフィー次いでサイズ排除クロマ
トグラフィーを実施し、乳成長因子（ＭＧＦ）を得た。

劃」罎監規ｊり見Ｍ　　　八′のＭＧＦの市販の乾燥ウ
シ脱脂粉乳（２５〜５０ｋｇ）をアセトン５０〜１００
！に懸濁し、２０°Ｃにて１時間撹拌して洗浄し、次い
で洗浄粉末を大きな真空乾燥器中室温下で一夜乾燥した
。１００　ｇ未満の乾燥物がアセトン中に移るがこのも
のを廃棄した。アセトン洗浄粉末を使用するまで室温に
放置した。４°Ｃで蒸留水２５０〜５００！にこのアセ
トン洗浄粉乳（２５〜５０ｋｇ）を添加し、１時間起泡
を避けて穏やかに撹拌し、次いでＩＮの水酸化ナトリウ
ムでこの混合物を約ｐＨ６，７〜ｐｎ’７．ｏに調整し
た。さらに洗浄物を希釈し、粉乳を再し、例１ａ）〜ｌ
ｅ）と同様に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的
相互作用性クロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロ
マトグラフィーを実施してウシの乳成長因子を得た。

以下余白 ソルビタンモノステアレート　　　　　２．０ポリオキ
シエチレンソルビタン モノステアレート　　　　　　　　　　３．０セチルア
ルコール　　　　　　　　　　５．０軽質液状パラフイ
ン　　　　　　　　　８．０イソプロピルミリステート
２．０ 活性物質（ＭＧ　Ｆ　）　　　　　　　　　　１．０　
・１０−５プロピレングリコール　　　　　　　　２．
０グリセリン　　　　　　　　　　　２．０脱イオン水
　　　　　　　　　　　　７６．０防腐剤および他の安
定剤　　　　　　　　必要量該水溶液を５５〜６０°Ｃ
に加熱し、その中に活性物質を溶解し、次いで激しく撹
拌しその中に溶融した脂質相を分散させた。室温に冷却
し、均一化した。

同様に、それぞれ０．４．４または２０■／ｍｆを含ん
でなるクリームを調製することができた。

傷の１ｄ当たりこのクリーム１００１１１を投与した。

ソルビタントリオレエート　　　　　　　５．０微結晶
ワツクス　　　　　　　　　　　３．０軽質液状パラフ
イン　　　　　　　　　９．０イソプロピルミリステー
ト　　　　　　１０．０ラノリンアルコール　　　　　
　　　　３．０活性物質（ＭＧＦ）　　　　　　　　　
　１．０・１０−５プロピレングリコール　　　　　　
　　２．０グリセリン　　　　　　　　　　　　２．０
マグネシウムサルフエート、水和物　　０．７脱イオン
水　　　　　　　　　　　６５．３防腐剤　　　　　　
　　　　　　　　必要量穏やかに撹拌しながら活性物質
を水相に溶解し、次いで溶融した脂質相中にその溶液を
分散した。

室温に冷却し、均一化した。

同様に、それぞれ０．４．４または２０■／−を含んで
なる軟膏を調製することができた。傷の１ｄ当りこの軟
膏の１００＃を投与した。

以下余白 ■旦：迭旦浪 一一一−１シーー氷−−−−−　　％ 活性物質（ＭＧＦ）１．０・１０−３ ポリエチレングリコール（７）− グリセリルココエート　　　　　　　　　４．０脱イオ
ン水　　　　　　　　　　　　１３．０グリセリン８６
％　　　　　　　　　１８．０ペパーミント油　　　　
　　　　　　　１０．０エタノール　　　　　　　　　
　　　　５５．０脱イオン水に活性物質を溶解した。こ
の溶液にｐＥｃ　（７）−グリセリルココエートおよび
グリセリンを添加し、そして溶解した。エタノールにペ
ノマーミント油を溶解し、撹拌しながら２つの溶液を混
合した。

使用前にこの溶液を１７１０まで希釈した。

以下余白 ！ｌＬＬ：１１旧１液 活性物質（Ｍ　Ｇ　Ｆ　）　　　　　　　　１１ｎｇ／
ｍ！±ヒト血清アルブミン　　　　　　１■／ｍｌアル
ギニンまたはグリシン　　　　２０■／ｍ１±炭水化物
　　　　　　　　　５〜２０■／ｍ１ｐＨ７ 炭水化物は、グルコース、マンノース、デキストラン、
ヒドロキシエチル澱粉またはこれらの混合物である。

ｐＨは、リン酸塩、琥珀酸塩、アミノ酸またはこれらの
混合物を用いて調整した。

０．５■ＭＧＦ／　０．５　ｍｌを含むバイアルを調製
しそして凍結乾燥した。

以下余白 側８：ＭＪＬ！昏 活性物質（ＭＧＦ）１．０・ｔｏ−５ｇメチルセルロー
ス　　　　　　　　０．８　ｇ炭酸カルシウム　　　　
　　　　３０．０　ｇコロイド状シリカ　　　　　　　
　３．０ｇ軽質液状パラフィン　　　　　　　２．０ｇ
グリセリン　　　　　　　　　２０．０　ｇ甘味側 芳香剤 防腐剤 脱イオン水で　　　　　総重量を１．ＯＯＱｇとした。

粉末を脱イオン水、パラフィンおよびグリセリンの一部
を含むメチルセルロースと活性物質の混合物を用いて湿
潤させた。この添加物を溶液に加えた。残りの水を調合
した後、ペーストを均一化した。

以下のプロトコールは、本発明の組成物がイン。

ビポで有効であり、かつＭＧＦが交雑種に使用し得るこ
とを示す。

以下余白 プロトコール■、１０カ　　マウスの　止ユウシＭＧＦ
のイン・ビボ活性は、Ｚｉｍｍｅｒｌｉ等、（１９Ｂ２
）　Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　皿４８７および５ｐ
ｏｒｎ、　Ｍ。

Ｂ１等、（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：１３２
９に記載されているプロトコールに基づき方法により測
定した。

それぞれに約２５０個の一定の間隔を保つ穴（径１ｍｍ
）により穴があけられており、そして両端が同質の材料
の蓋で密閉された中空の硬質ポリメチルアクリレートま
たはポリテトラフルオロエチレンチューブ（内径および
外径がそれぞれ１０および１２閣、長さが３２肛）を、
ガス滅菌し十分麻酔をかけたウィスター・ラット（約１
０カ月令）の背面脇腹の対称性のある皮下に外科的に挿
入した。−のガス殺菌ケージを各々の脇腹に移植し、切
開部を金属性クリップで閉じ、そのケージを術後５日目
に取り出した。挿入処理後、そのケージは繊維性の結合
組織で包囲されてくるが、ケージそれ自体の内部には相
当する細胞が存在しなかった。従って、このモデルは、
傷の癒合を定量することができるなにものち存在せず、
限定されそしく７０） て包囲された空間を我々に提供する。これらのラットを
切開部が十分に癒合し、そして組織ケージの移植後２週
目に試験に用いた。このとき、ＭＧＦ（０，ｌ＋ｎｆ、
滅菌ヒスチジン緩衝溶液（ＨＢＳ）１０．５％の「に１
ｕｃｅｌ　Ｏ」ビヒクル緩衝液〕を、左側のケージ内部
（チェンバーＡ）に向けて連日注入を開始した。１日量
は、それぞれチェンバー当り１０００゜１００または１
０ｎｇのＭＧＦであった。ＭＧＦの比活性は、Ｂａ１ｂ
／ｃ　３Ｔ３繊維芽細胞を用いる量応答アッセイにより
測定した場合に１■当り約１０７単位であった。

別の試験を開始しない限り、ＭＧＦ活性を活性化するた
めに、少量（２０ｎｇ）のラットＥＧＦをすべてのＭＧ
Ｆ注入液に含ませた。右側の対何チェンバー（チェンバ
ーＢ）を、製薬対照として用い、緩衝液媒体単独か、ま
たは総タンパクが左側チェンバーに注入されたＭＧＦ量
と等しくなるような量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
を含ませた緩衝液媒を注入した。注入は５日間で１日行
い、すべての注入物は滅菌、内毒素除去および発熱物除
去を行った。注入の最後のシリーズ後の６時間目にラッ
トを殺した後、無菌的にすべてのチェンバーを動物から
取り出した。チェンバー内の繊維状物質を「湿った」状
態で目方を量り、希薄なチェンバー流体中の総タンパク
をＬｏｉｖｒｙ等の方法（Ｊ、Ｂｉｏ、Ｃｈｅｍ、　１
９３，２６５）１９５１）　）で測定した。チェンバー
内容物の無菌性は、プレイン／ハート（Ｂｒａｔｎ／）
Ｉｅａｒｔ）インフュージョン板上でサンプルを３７°
Ｃで７２時間インキュベーションしてチエツクした。デ
ータの統計学的な解析は、チェンバーの対応する対（Ａ
対Ｂ）の比較によって行った。

第１表は、５日間のＭＧＦ連日注入が、凝集処理のみを
施された右側の対何対照チェンバーに比較されるように
、左側のチェンバー中の総繊維状物質の蓄積を投与量に
対応して明らかに高めた（ほぼ３倍）ことを示す（試験
１〜３）。

活性化剤としてのＥＧＦを投与したとしても、関連する
チェンバー中に見出される総繊維状物質のレベルにおい
て、そのもの単独では全く有意な効果を示さなかった（
試験４）。また、ＭＧＦは、凝集処理のみが施された対
何の右側のチェンバーに比較されるように、左側のチェ
ンバー中の漿液性流体タンパクの総量を有意に高めた（
試験１〜３）。さらに、ＥＧＦは関連するチェンバー中
の漿液性流体タンパクの総量に対するレベルにおいても
、単独では効果が小さい（試験４）。

以−ド余白 試験の末期での解剖生検では、対応する対の対照チェン
バーよりもＭＧＦ処理チェンバーが体壁の周りの結合組
織に対してより親和性をもって固定されていること、そ
してＭＧＦ処理チェンバーの近隣の繊維状物質の厚さは
関連の対応する対照チェンバーの周りのものよりもはる
かに大きいことが一貫して観察された。この観察は、Ｍ
ＧＦの作用が関連するチェンバーの近隣では顕性である
ことも示唆するであろう。試験４では、チェンバーの周
りの繊維状物質の厚さにまったく差違がないことが観察
された。また、これの対何チェンバーが対照に対して少
しの増加に左右されることを示すのは、ＭＧＦの循環を
通してこのチェンバーに伝達されることで説明されるで
あろう。

組織学上の調製物は、試験１〜３におけるＭＧＦ処置左
側チェンバーの周りの高められた組織の厚さの程度およ
び血管が多（なっていることを明らかにし、しかも各チ
ェンバーの内側の繊維性顆粒形成組織の内容物の中で繊
維細胞の増殖が生じていることを明らかにした。差違と
して、右側の対照チェンバー中では多形核白血球のわず
かな優勢が示され、試験１〜３のＭＧＦが施された左側
のチェンバー中ではマクロファージの個体群の優勢が示
されるといえ、処置チェンバーと対照チェンバーのいず
れの漿液性流体中にも炎症細胞の無菌的な浸潤が見られ
る。試験１〜４のすべての４０個のチェンバーの内容物
は、各チェンバーの内容物をプレイン・ハート・インフ
ュージョン上で７２時間３７°Ｃでインキュベーション
した後に無菌であることを確認した。

プロトコール 紅： 傷の癒合作用が年令が高まるにつれて低下してくること
は長い間に注目の当であったが、はんの最近試験され（
Ｇｒｏｖｅ，Ｇ．Ｌ．（１９８２）　Ａｒｃｈ．Ｄｅｒ
ｍａｔｏｌ。

Ｒｅｓ．２７肚３８１　）　、そしてこのことが老年医
学の医薬に多くの問題を提起した。従って、傷の癒合環
境の部分的な欠除または低下（即ち、老令の動物）にお
ける部分的肥大性の傷（第２度の火傷による）を用い、
そしてＳｃｈｕｌｔｚ＋Ｇ．Ｓ．等、（１９８７）　Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ２３虹３５０に記載の方法に従い、傷の癒
合応答に対するウシＭＧＦの作用を研究することを決意
した。

背中を予め剃りそして市販のクリームタイプの脱毛剤で
脱毛し、麻酔をかけた老令の（４８０〜６００日令）　
Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、湯浴で８０°Ｃにした真鍮黄
銅の型板（ＩＸｌｃｍ、８ｇ）で１０秒間個々に処置す
ることにより、それぞれに中程度の熱損傷を与えた。生
じた庖疹を外科的に除去し、次いでこの火傷を一定した
少量（２０ｎｇ）のマウスＥＧＦの存在下で各量のＭＧ
Ｆを含有（５００ｎｇ．　１００ｎｇまたはＬｏｎｇ　
；　Ｍ　Ｇ　Ｆの比活性は、Ｂａｌｂ／ｃ　３Ｔ３繊維
芽細胞を用いる投与量応答アッセイにより測定した場合
に１　ｍｇ当り約１０７単位であった）する２５ｍの滅
菌賦形薬で局所的に５日間連日処置するか未処置のまま
残した。局所投与用のすべての材料は、滅菌、内毒素除
去および発熱物質除去したものであり、そして試験の期
間を通じてすべてのマウスを個々のケージに入れた。

ＭＧＦ処置の５日後、マウスに麻酔をかけ、火傷から庖
疹（もし存在するならば）を外科的に除去し、次いで火
傷部の写真をとった。均一な厚さのプラスチックフィル
ム（「スコッチ」■オーバーヘッドプロジェクター用フ
ィルム）上に再生した上皮を有する火傷の領域の輪郭を
描き、癒合した当初の火傷面積にパーセンテージをパラ
−メーターで測定した。結果を、試験の期間中処置しな
いままの同様な中程度の火傷を有する若い（５６〜８４
日令）　Ｃ５７／ＢＬ６マウスにおける上皮の再生具合
とも比較した。すべてのマウスは個々のケージに入れら
れ、そして試験群は１グループ当り５匹のマウスから成
っている。

以下余白 第１表（マウス、４８０目令以上） ４　老令　　＋２０ｎｇ　ＥＧＦ　　　　Ｄ　　　　　
７８±５５　老令　　　賦形剤　　　　Ｅ　　　　９１
±５６　老令　　　未処置　　　　Ｆ　　　　　９０±
６７　若年　　　未処置　　　　Ｇ　　　　　３６±７
第２表は面積測定分析の結果を示し、少量のマウスＥＣ
，Ｆの存在下で適当な賦形剤中に含ませたＭＧＦの５日
間連日局所投与は、ＥＧＦ単独、賦形剤単独または未処
置の傷を有するもの（それぞれ試験４〜６）と比較した
場合に、投与量に応じた態様で老令マウスの上皮の再生
を促進しかつ活性化することを示しく試験１〜３）た。

一方、若いマウスはいずれのＭＧＦ投与処置をしなくて
も、それらの傷を首尾よく再上皮化するに足りる適応能
を有することが明らかとなった（試験７）。

この一連の試験における実験的に誘発した傷の組織学的
な解析は、上皮の基底（発芽）層までへの傷の伸展（お
よび可能性を含む）を示した。鉛直方向と側方平面とへ
の細胞の分裂および移動を含む工程での第一の癒合によ
る前記のような傷の癒合は、再生上皮の肥厚または角化
症を後に誘発するだけでなく傷の再上皮化および再閉鎖
をもたらす。また、組織学的解析は、ＭＧＦで処置した
動物（試験１〜３）におけるこの再生上皮化の進行の促
進（または活性化）の伸展を示したが、対照群（試験４
〜６）のいずれも新規な上皮がほとんど存在しないこと
を示した。一方、若い動物は、それらの傷の顕著な再上
皮化を示した（試験７）。

’　ＭＧＦ　１１００ｎ、　ＭＧＦ　１１００ｎおよび
ＥＧＦ　１１００ｎの混合物、ＥＧＦ　１１００ｎ単独
、賦形剤単独、未処置の老令マウスおよび未処置の若い
マウスによる同様な試験の結果を第３表にまとめた。

以下余白 １じし表 １　　　老令　　１１００ｎ　ＭＧＦ　　　　４６±９
３　　　老令　　１１００ｎ　ＥＧＦ　　　　７６±９
４　　　老令　　賦形剤単独　　７８±５５　　　老令
　　　未処置　　　８１±９６　　　若年　　　未処置
　　　３４±５第３表は、ＥＧＦの存在下または不存在
下でＭＧＦを含む粘性賦形剤により５日間連日処置した
老令のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの各群における部分的肥
厚性火傷の上皮での再生を示す。各群は５匹の動物から
成る。示した値は、各傷に対する３種の独立した評価範
囲と意義を有する。

プロトコール■　　　の　にお番る　の・、入：　　　
　　１同一品種の２匹の健康な「若い」牝豚（２〜３月
令月俸；２５〜３０ｋｇ）と共に、２匹の「老令」の牝
豚（７〜８才；体重２５０〜３００ｋｇ　）を選び、そ
れらの傷を舐めたり傷の上に横たわることを防ぐため試
験の間中堅牢な固定枠に分離して繋いだ。

豚はそれらの通常の寿命が終わる前に一般に処分される
（稀には４年以上の長期に渡って育種条件下に維持され
る牝豚もいる）ので、種および品種における平均寿命は
知られていないが、１０年目に子を生みそして１５〜２
０才に達していることが知られている牝豚を実験動物と
して維持した。豚は、上皮の構造、形態および細胞の代
謝回転速度がヒトに類似するので、ヒトの局所的な肥厚
性の傷に対する適当なモデルとして選んだ。

傷つける前にすべての動物は毛を剃り、市販の脱毛クリ
ームで脱毛した。

豚には、十分な麻酔を施した後複数の傷を付けた。麻酔
は、鎮静剤としてアザペロン（Ａｚａｐｅｒｏｎｅ）（
ＳＴＲＥＳＮＹＬ　Ｏ、Ｊａｎｓｓｅｎ、　Ｂｅｅｒｓ
ｅ、　ＢｅｌｇｉｕｍＨ１ｍｇ　−ｋｇ−’）を耳の中
央の静脈を介して各豚に静脈投与し、その２０分後に同
じ投与経路によって塩酸メトミデート（Ｍｅｔｏｍｉｄ
ａｔｅ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＨＹＰＮＯＤ
ＩＬＬ■。

Ｊａｎｓｓｅｎ；Ｂｅｅｒｓｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ；４ｍ
ｇ　Ｈｋｇ−’　）を投与した。

湯浴で真鍮黄銅の型板（３■３ｃｍ；７８ｇ）を９０°
Ｃに熱して、各豚の脱毛した背側の皮膚表面に正確に１
０秒間しっかりと接触して多数の局所的な肥厚性の火傷
を誘発し、そして生じた庖疹を除去した。

老令豚の背側の胸郭上の複数の局所的な肥厚性の火傷を
、それぞれＭＧＦ（４，５Ｎ、０．９眉もしくは０．４
５■）、ＥＣ；Ｆ　（４，５硝、０．９■もしくは０．
４５■）または再考の等量組み合わせ物（ＭＧＦ　４．
５ｘ＋ＥＧＦ４．５Ｎｇ、　ＭＧＦｏ、９Ｊｒｇ＋ｔ！
ＧＦ０．９ｉ　、　ＭＧＦ　０．４５ｇ＋ＥＧＦ　０．
４５ｘ）を含有する賦形剤２２５Ｉで９日間連日処置し
た。これらの投与量は、前記の試験でマウスに施したの
と同様に、傷表面積の１　ａｆｌ当り同じ量の薬剤が豚
に施せるように選んだ。各動物における対照としては、
賦形剤単独処置するかまたは未処置のまま残した。さら
なる対照としては、同様な単一の局所的な肥厚性の火傷
を施した若い豚を試験の期間を通じて未処置のまま放置
したものである。各火傷に対する再生上皮の程度は、１
０日口の面積測定および限定した量の生検標本の組織学
的試験によって評価した。

第４表に面積測定解析の結果を示す。未処置の傷の正常
な再生上皮化は、１０日の試験期間経過後では老令のも
の（処置１１）より若い豚（処置１２）において著しく
優れていた。先の試験のように、ＭＧＦの連日局所投与
は、ＥＧＦの存在下または不存在下のいずれにおいても
（処置１〜６）、未処置の傷を有する若い動物（処置１
２）に見られるものに似た再生上皮化のレベルと同程度
で、老令の動物における傷の修復の進展を著しく改善し
た。火傷面積の１ｄ当り１００〜５００ｎｇ濃度の間で
の賦形剤単独（処置１０）またはＥＧＦ単独（処置７〜
９）の連日投与は、老令の豚の再生上皮化の進展につい
てわずかな効果を有するにすぎない。

生検標本の光学顕微鏡観察は、面積測定解析の結果を追
認し、そしてＭＧＦで処置した（ＥＧＦの存在または不
存在を問わず）傷の再生上皮化を促進し、各偶の周りの
無傷の領域における上皮細胞層と薄い表皮がほとんど相
異しないものから成ることを明らかにした。新たに再生
した上皮においてなんらの異形成の可視的な証拠は存在
しないが、各偶の周界ではマウスのすべての群で角化症
が生じたのとはわずかに相違がある。他の一般的な観察
では、ＭＣＦで処置した（ＥＧＦの存在または不存在を
問わず）傷は、未処置のままか、またはＥＧＦ単独もし
くは賦形剤単独処置を施した傷よりも、新たな再生上皮
の主に下方に、より多く顆粒組織を含むことが明らかに
なった。−船釣に、同様な観察結果が、豚の試験から人
手し得る制限された量の生検標本中では見られたが、老
令の動物における傷の周りの無傷の表皮の外観上の構造
は、若い動物に特徴的であるよく解明されている多層配
置によく偵ている。

第１Ｊし　（老令のブタ） ＥＧＦの存在下または不存在下でＭＧＦを含む粘性賦形
剤で９日間連日処置した２匹の老令の大きな白牝豚にお
ける局所的な肥厚性の火傷の上皮の再生を示す。示した
値は、各偶に対する３種の独立した評価範囲と意義を有
する。

プロトコールＩ−ｍに示した結果は、イン・ビボにおい
て、例えば凝集や活性他剤単独で傷の癒合を活性化し、
かつ高める応答を誘発しないのにもかかわらず、ＭＧＦ
は、第１義および第２義的な目的でも明らかに傷の癒合
を活性化し、かつ高めることができることを示した。

ＴＣ９６プレート・ウェル中イン・ビトロで２つの異種
のマウスに由来する白血球を共に混合（ウェル中の各棟
、２Ｘ１０５細胞、ＣＢＡリンパ球を「応答細胞」とし
、そして照射Ｂａ１ｂ／ｃリンパ球を「刺激細胞」とし
た）し、次いで７２時間後の３Ｈ−チミジンの取り込み
による増殖応答を測定した。

結果：ＭＧＦの＝ｘｏｏｏｐｇ　−ｍ−’が増殖の５０
％阻害を惹起した。

クローン　Ｔ　　ア・・セイ（マウス）：前もって抗原
でパルス処理したマウス腸腔マクロファージ（ウェル当
り２Ｘ１０５細胞）を有するＴＣ９６プレート・ウェル
中イン・ビトロで溶性抗原（チロシンのヒ素塩）に特異
的なマウスの長期培養Ｔ細胞クローン（ウェル当り１０
５細胞）をインキュベーションした。７２時間後に、Ｔ
細胞の増殖およびγ−インターフェロンの産生を測定し
た。

結果：ＭＧＦの！　ｓｏｏｐｇ　−ｍＺ−’が増殖およ
びＩＮＦ−γの放出双方の５０％阻害を惹起した。

マ　スの１ンパ　ア・・セイ： リボ多糖（ＬＰＳ、ウェル当り２．５　ｎ　）を用いて
、ＴＣ９６プレート・ウェル中イン・ビトロで感作して
いないマウスリンパ球（ウェル当り１０５細胞）を刺激
し、７２時間後の３Ｈ−チミジンの取り込みによる増殖
応答を測定した。

結果：ＭＧＦの＝１０００ｐｇ　−ｍＺ−’が本アッセ
イにおける増殖の５０％阻害を惹起した。

ヒトのＴリンパ′ア・・セイ： それぞれａ）植物凝集素（フォトへマグルチニン）　Ａ
　（ＰＨＡ、　０．５％）、ｂ）アンチ−Ｔ３抗原十ホ
ルボールエステル（ＰＤＢｕ、　ｌｎｇ　ｍｆ−’）　
、またはＣ）イオノマイシン（ｔｏｎｏｍｙｃｉｎ）　
（０，２５ｇｍ１’−’）十ＰＤＢｕ　（１０ｎｇｍ１
−’）を用いて、ＴＣ９６ブレート・ウェル中イン・ビ
トロで感作していないヒトＴリンパ球（ウェル当り１０
５細胞）を刺激した。７２時間後に、３Ｈ−チミジンの
取り込みによる増殖応答を測定した。

結果：ａ）ＭＧＦの＝ｌＱｐｇｍｊ−’が増殖の５０％
阻害を惹起した。

ｂ）ＭＧＦの＝１ｐｇｍ！−’が増殖の５０％阻害を惹
起した。

ｃ）ＭＧＦの！　１０　ｐｇｍｌ−’が増殖の５０％阻
害を惹起した。

ヒトＴ１ンパ　ア・・セイ： 特異性抗原テタヌス毒素を用いて、ＴＣ９６プレート・
ウェル中イン・ビトロで新鮮な単離ヒトＴリンパ球（ウ
ェル当り１０５細胞）を刺激し、３Ｈ−チミジンの取り
込みによる増殖応答を測定した。

結果二ＭＧＦの＝５Ｑｐｇｍｌ−’が増殖の５０％阻害
を惹起した。

クローン　Ｔ　）ア・・セイ　ヒト ａ）予め抗原を加えた同種ヒト単球（ウェル当り１０５
細胞）、または ｂ）エプスタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）で形質転
換したＢ細胞株に由来する同種細胞（ウェル当り８Ｘ１
０’細胞）と共に、ＴＣ９６プレート・ウェル中イン・
ビトロで溶性抗原〔ミコバクテリア（ＰＰＤ）に由来す
る精製タンパク〕に特異的なヒト長期培養Ｔ細胞クロー
ン（Ｔ４”　／Ｔ８−　）（ウェル当り２Ｘ１０’細胞
）をインキュベーションした。

７２時間後に３Ｈ−チミジンの取り込みによる増殖応答
を測定した。

結果：ａ）ＭＧＦの＝５００　ｐｇｍＺ−’が増殖の５
０％阻害を惹起した。

ｂ）ＭＧＦの＝ｌＱｐｇｍＺ−’が増殖の５０％阻害を
惹起した。

ヒトＣｏｎＡリンパ・の１４２−２沃 組み換えインターロイキン２　（ｒＩｊ２−２．３また
は９Ｈｇｍｆ−’）の存在下に、ＴＣ９６プレート・ウ
ェル中イン・ビトロでヒト・コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ
Ａ）リンパ球（ウェル当り１０４細胞）をインキュベー
ションし、９６時間後の３Ｈ−チミジンの取り込みによ
る増殖応答を測定した。

結果：ＭＧＦの＝ｏ、ｔ　ｐｇｍｌ−’が増殖の５０％
阻害を惹起した。

ヒトＴリンパ　のＩｆ−４抹 組み換えインターロイキン４　（ｒＲｌ−４，１０ｎｇ
ｍＺ−’）を加えたＰＤＢｕ　（１０ｎｇｍｆ−’）の
存在下に、ＴＣ９６プレート・ウェル中イン・ビトロで
感作していないヒトＴリンパ球（７９３％Ｔ３”）（ウ
ェル当り１０５細胞）をインキュベーションし、９６時
間後の３Ｈ−チミジンの取り込みによる増殖応答を測定
した。

結果：ＭＧＦの＝５００　ｐｇｍｌ−’が増殖の５０％
阻害を惹起した。

プロトコールＶ　　′　　　　ｃ）ｋ　＝ハプテンと担
体の抱合体〔ジニトロフェニル−ニワトリγ−グロブリ
ン（ＤＮＰ−ＣＧＧ）　、マウス当り２００ｐｇ〕でマ
ウスをイン・ビボ感作した。２ケ月後、多量の抗ハプテ
ン（ＤＮＰ）を用いてＴＣ９６プレート・ウェル中イン
・ビトロで、肺臓細胞を攻撃した。４日後、シャーン（
Ｊｅｒｎｅ）プラーク試験により抗ハプテン（ＤＮＰ）
抗体形成細胞数を測定した。

結果：ＭＧＦの！　５０　ｐｇｍｌ−’が抗体形成り細
胞の５０％阻害を惹起した。また、 ＭＧＦの＝１０００ｐｇｍ！−’が増殖の５０％阻害を
惹起した。

各種の濃度のＭＧＦを用いＴＣ９６プレートで付着性ヒ
ト単球を２４時間刺激した。単球を一度洗浄した後、メ
ラノーマＡ３７５標的細胞を添加した。対照は、マクロ
ファージおよび腫瘍細胞単独ならびに標的細胞を有する
刺激していないマクロアージ、Ｋｌｕｃｅｌ溶媒（プロ
トコールＩ参照）およびＭＡＦ標準の混合物を含んでい
る。

７２時間インキュベーション後、細胞の単層を一度洗浄
し、固定化し、次いでクリスタル紫を用いて１５分間染
色した。即座に結合していない染料を洗い出した。酢酸
で残存する染色細胞を溶解し、オリベラティ（Ｏｌｉｖ
ｅｔｔｉ）Ｍ２４ＰＣを装備したマルチスキャン−８・
チャネル光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ−８Ｃｈａｎｎｅ
ｌ　Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて５９０聴における
ＯＤを測定し、試験化合物の活性を算出した。データは
ＥＤ、。とじて示した。

結果：ＭＧＦ処置は、腫瘍細胞溶解活性に対する単球を
刺激した。そのＥＤ３゜値は、０．１７±０．１４ｎｇ
・−一１濃度（ｎ−４試験体）で見出された。Ｘ１ｕｃ
ｅｌ対照は活性でなかった。

ミエローマＡ３７５　　　の　　にｔ　るＴＣ９６プレ
ート中で５％のＦｅ２を加えたＣ−ＲＰＭＩ培地でＭＧ
Ｆを希釈した。対照は培地単独およびＫｌｕｃｅｌ　（
Ｋｌｕｃｅｌ　５０　ｔｒｉにＭＧＦ　１１００ｎを溶
解し、次いで５％のＦｅ２を加えたＣ−ＲＰＭＩ培地で
希釈した）。

各ウェルにＡ３７５標的細胞１．２　ＸＩＯ’を添加し
た。

５％ＯＣＯ□中３７℃で７２時間インキュベーションし
た後、＾３７５腫瘍細胞の単層を染色し、ＭＡＦアッセ
イについて記載したのと同様に細胞毒性活性を算出した
。

結果：ＭＧＦは、メラノーマＡ３７５腫瘍細胞の増殖に
対して細胞毒性を示した。そのＥＤ、。値は、０．１８
±０．１２ｎｇ−ｍ！　−’濃度（ｎ＝４試験体）で見
出された。

これらの試験は、腫瘍細胞に対する単球を刺激するＭＧ
Ｆ濃度と腫瘍細胞毒活性に向けられたＭＧＦ濃度が非常
に近似することを示す（０，１７±０．１４対０．１８
±０．１２）。

１豊 別々のＴＣ９６プレート中でエストラジオール受容体を
有する２種のヒト癌腫細胞株０’ＩＣＦ−７およびＺＲ
−７５−１）ならびに測定し得るエストラジオール受容
体が存在しないヒト癌腫細胞株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１
）をウェル当り３〜６Ｘ１０３細胞濃度で接種し、Ｋｌ
ｕｃｅｌ溶液（プロトコールＩ参照）における各種濃度
のＭＧＦで刺激した。対照は、癌腫細胞単独およびＫｌ
ｕｃｅｌ溶液のみの存在下で培養した癌腫細胞を含む。

限定した血清フリー条件下で８〜１０日間インキュベー
ションした後、付着性細胞単層を洗浄し、次いで固定し
そしてクリスタル紫で１５分間染色した。結合した染料
が核に対するものに限定されるまですべての未結合染料
を十分洗い出した。この技術は細胞増殖および分裂を測
定するための比色アッセイを提供する。オリベラティＭ
２４ＰＣを装備したマルチスキャン−８・チャネル光度
計を用い５９０ｎｍで０．Ｄ、を測定し、試験期間を通
じて増殖する癌腫細胞上の試験化合物の活性を算出した
。

結果：未処置の対照細胞に比較した場合、１０−９〜１
０−ｌ３Ｍ濃度のＭＧＦで処置したエストラジオール依
存性細胞株（ＭＣＦ−７およびＺＲ−７５−１の双方）
とエストラジオール非依存性細胞株（ＭＤ＾−ＭＢ−２
３１）ともその増殖が阻害された。このアッセイにおい
て、Ｋｌｕｃｅｌ溶媒はすべての細胞株に対して効果を
示さなかった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、例１ａ）による陽イオン交換クロマトグラフ
ィーの結果を示し；第２図は、例ｔｂ）による疎水的相
互作用性クロマトグラフィー■の結果を示し；第３図は
、例１ｃ）による疎水的相互作用性クロマトグラフィー
■の結果を示し；第４図は、例１ｄ）による疎水的相互
作用性クロマトグラフィー■の結果を示し；そして第５
図は、例１ｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーの
結果を示す。 なお、第１図〜第５図は、多様なりロフトグラフ処理工
程中のＭＧＦ精製の進捗状況を示す。表示は、各両分に
対する２８０ｎｍにおける光学濃度（０，０，）の測定
による吸光度およびＢｉｊｒｋ、　Ｒ，Ｒ，（１９７３
）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７
０＋　３６９の試験における移動活性である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、乳汁または乳製品から入手でき、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
   による測定で約２５ｋｄの分子量を有しており、かつｐ
   Ｉ９．０〜１０．５の等電点を有することを特徴とする
   乳成長因子（ＭＧＦ）またはその塩。 ２、１０＾３〜１０＾７倍の濃厚状態で乳汁から得られ
   る請求項１記載の乳成長因子。 ３、より低い分子量かまたはより高い分子量を有し、か
   つ相違するｐＩ値を有する乳汁中に見出されている他の
   成長因子と実質的にフリーである請求項１記載の乳成長
   因子あるいはその塩。 ４、請求項１記載の実質的に純粋な乳成長因子。 ５、次のアミノ酸組成 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔但し、ａ）はペプチド１モル当たりのアミノ酸のモル
   数であり、ｂ）はペプチド１モル当たりのアミノ酸残基
   を示す概数である〕を有する実質的に純粋な状態で存在
   しており、かつ次式 【遺伝子配列があります】 （上式中、Ｘ＾１＾７およびＸ＾１＾８は未同定アミノ
   酸を表す）で示されるＮ−末端アミノ酸配列を有するウ
   シの乳汁から入手され得る請求項１記載の乳成長因子ま
   たはその塩。 ６、請求項１記載の乳成長因子の酸付加塩。 ７、請求項１記載の乳成長因子の酢酸塩。 ８、ＥＧＦの受容体にバインディングすることによりア
   ゴニスト作用を奏するＭＧＦおよびいずれかのポリペプ
   チドの併用剤。 ９、ほぼ等モル量で乳成長因子およびＥＧＦを含んでな
   る請求項８記載の相乗性併用剤。１０、乳成長因子（Ｍ
   ＧＦ）を含有する乳汁またはいずれかの乳製品からＭＧ
   Ｆを採取し、必要により得られたフリーのＭＧＦを塩に
   転化するかまたは得られた塩をフリーのＭＧＦに転化す
   ることを特徴とする乳成長因子（ＭＧＦ）またはその塩
   の製造方法。 １１、ＭＧＦを新鮮なウシ乳汁から採取することを特徴
   とする請求項１０記載の方法。 １２、ＭＧＦをウシの脱脂粉乳から採取することを特徴
   とする請求項１０記載の方法。 １３、ＭＧＦの原料を１以上のクロマトグラフ法に付す
   ることを特徴とする請求項１０記載の方法。 １４、ＭＧＦの原料を陽イオン交換クロマトグラフィー
   、疎水的相互作用性クロマトグラフィー、サイズ排除ク
   ロマトグラフィーおよび／または、必要によりさらに精
   製工程に付することを特徴とする請求項１０記載の方法
   。 １５、乳成長因子を実質的に例に記載するように製造す
   ることを特徴とする請求項１０記載の方法。 １６、請求項１０〜１５のいずれかの一の記載に従って
   製造される乳成長因子。 １７、投与単位剤中に請求項１記載の乳成長因子または
   その医薬として許容され得る塩を有効量含んでなる医薬
   製剤。 １８、ＥＧＦの受容体にバインディングすることにより
   アゴニスト作用を奏するＭＧＦおよびいずれかのポリペ
   プチドの併用剤の有効量を含んでなる医薬製剤。 １９、錬歯磨または洗口液である請求項１７記載の医薬
   製剤。 ２０、請求項１記載の乳成長因子またはその塩の有効量
   を含んでなる化粧用組成物。 ２１、ＭＧＦまたはその塩の成長促進する量を含んでな
   る食品組成物。 ２２、請求項１７記載の医薬製剤を投与することを含ん
   でなる哺乳類の損傷の予防または治療方法。 ２３、ＭＧＦまたはその医薬として許容され得る塩の免
   疫抑制に有効な量を投与することを含んでなる免疫応答
   の抑制方法。 ２４、ＭＧＦまたはその医薬として許容され得る塩の抗
   細胞増殖の有効量を投与することを含んでなる癌の処置
   方法。 ２５、請求項２１記載の食品組成物を哺乳動物の成長を
   促進する量で投与することを含んでなる哺乳類の成長促
   進方法。 ２６、請求項１記載のＭＧＦまたはその塩の成長促進を
   刺激する量を添加することを含んでなる細胞増殖培地。 ２７、請求項１記載のＭＧＦまたはその塩の細胞増殖を
   刺激する量を前記培地に添加することを含んでなる培地
   におけるイン・ビトロ（￥ｉｎｖｉｔｒｏ￥）での細胞
   増殖の刺激方法。 ２８、投与単位剤中にＭＧＦまたはその医薬として許容
   され得る塩の有効量を含んでなる医薬製剤を調製するた
   めのＭＧＦまたはその医薬として許容され得る塩の使用
   。 ２９、投与単位剤中にＭＧＦまたはその医薬として許容
   され得る塩の有効量を含んでなる錬歯磨または洗口液の
   調製のためのＭＧＦまたはその医薬として許容され得る
   塩の使用。３０、ＭＧＦまたはその化粧品として許容さ
   れ得る塩の有効量を含んでなる化粧用組成物の調製のた
   めのＭＧＦまたはその化粧品として許容され得る塩の使
   用。