JPH01121300A - 乳汁に由来するポリペプチド成長因子 - Google Patents
乳汁に由来するポリペプチド成長因子Info
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- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、乳汁に由来するポリペプチド成長因子の単離
および精製、該因子を含んでなる相乗性混合物および医
薬ならびに化粧品および食品組成物に関し、そしてさら
に傷の癒合および組織修復の促進および刺激、免疫応答
の抑制、癌の処置、哺乳類の成長の促進ならびに培養細
胞の増殖の促進を目的とした使用に関する。本明細書で
は、このポリペプチドを「乳成長因子(MGF)、と称
する。
および精製、該因子を含んでなる相乗性混合物および医
薬ならびに化粧品および食品組成物に関し、そしてさら
に傷の癒合および組織修復の促進および刺激、免疫応答
の抑制、癌の処置、哺乳類の成長の促進ならびに培養細
胞の増殖の促進を目的とした使用に関する。本明細書で
は、このポリペプチドを「乳成長因子(MGF)、と称
する。
成長因子は、特に高い親和性の細胞表面受容体を介して
、非常に低濃度で細胞の増殖および細胞分裂を促進する
ポリペプチドとして定義することができる。このものの
作用は、栄養素の摂取、DNA合成および細胞分裂をも
たらす他の細胞内シグナルを惹起し、その結果として組
織の増殖を誘発する。成長因子は、成人と胎児のどちら
の体細胞および体液中にも見出されており、今やすべて
でないとしても、はとんどの培養細胞によって放出され
ると信じられている(Goustin、A、S、等の総
説、(1986)、Cancer Re5earch、
46,1015 、参照〕。
、非常に低濃度で細胞の増殖および細胞分裂を促進する
ポリペプチドとして定義することができる。このものの
作用は、栄養素の摂取、DNA合成および細胞分裂をも
たらす他の細胞内シグナルを惹起し、その結果として組
織の増殖を誘発する。成長因子は、成人と胎児のどちら
の体細胞および体液中にも見出されており、今やすべて
でないとしても、はとんどの培養細胞によって放出され
ると信じられている(Goustin、A、S、等の総
説、(1986)、Cancer Re5earch、
46,1015 、参照〕。
しかしそうはいうものの、成長因子は内分泌状態では一
般に機能せず、おそらく細胞間隙を通して近隣周辺に拡
散するか、または自己分泌様式もしくは傍分泌様式で機
能するであろう。
般に機能せず、おそらく細胞間隙を通して近隣周辺に拡
散するか、または自己分泌様式もしくは傍分泌様式で機
能するであろう。
乳汁は、培養における細胞増殖を促進する因子を含むと
ころの体液の一種である。上皮細胞、普通のおよび形質
転換繊維芽細胞、平滑筋細胞ならびに軟骨細胞を包含す
る各種の細胞類は、乳汁を供給した血清フリーの培地で
増殖を示している(Klagsbrun、M、(198
0)、J、Ce1l Biol、+84+ 808
;Steimer+に、S、およびKlagsbrun
、M、(1981)、 J、Ce1lBio1.+88
+ 294H3ereni、A、およびBaserga
、 R,(1981) 。
ころの体液の一種である。上皮細胞、普通のおよび形質
転換繊維芽細胞、平滑筋細胞ならびに軟骨細胞を包含す
る各種の細胞類は、乳汁を供給した血清フリーの培地で
増殖を示している(Klagsbrun、M、(198
0)、J、Ce1l Biol、+84+ 808
;Steimer+に、S、およびKlagsbrun
、M、(1981)、 J、Ce1lBio1.+88
+ 294H3ereni、A、およびBaserga
、 R,(1981) 。
Ce1l Biol、Int、Rep、+ 5.338
) 6かかる活性は、ヒトに由来する(Klagsbr
un、M、(1978)、 Proc。
) 6かかる活性は、ヒトに由来する(Klagsbr
un、M、(1978)、 Proc。
Natl、Acad、Sci、USA、フニ5.505
7. )およびウシに由来する(Steimer、 K
、S、等、(1981)、J、Ce1l Physio
l、。
7. )およびウシに由来する(Steimer、 K
、S、等、(1981)、J、Ce1l Physio
l、。
109、223.)乳汁および初乳(分娩後の初期数日
間に分泌される乳汁)に見出されている。近年、多数の
成長因子が、それらの構造および生物学上の機能を特徴
付ける試みの下に乳汁から単離されそして均−物まで精
製されている。
間に分泌される乳汁)に見出されている。近年、多数の
成長因子が、それらの構造および生物学上の機能を特徴
付ける試みの下に乳汁から単離されそして均−物まで精
製されている。
最も初期に、かつよく特徴付けられた成長因子の1つは
表皮増殖因子(EGF)であり、このものは約6kdの
分子量を有するポリペプチドであり、イン・ビトロ(i
n vitr<z)およびイン・ビボ(新旦皿)のいず
れでも各種の細胞および組織に対して増殖および細胞分
裂促進効果を有する。EGFは、ヒトの乳汁(Carp
enter、 G、 (1980) 、 5cienc
e。
表皮増殖因子(EGF)であり、このものは約6kdの
分子量を有するポリペプチドであり、イン・ビトロ(i
n vitr<z)およびイン・ビボ(新旦皿)のいず
れでも各種の細胞および組織に対して増殖および細胞分
裂促進効果を有する。EGFは、ヒトの乳汁(Carp
enter、 G、 (1980) 、 5cienc
e。
210、198;Petrides、 P、E、等、(
1985) 、 FBBSLettsr!3187.8
9) 、ウシの乳汁(Yagi、 H,等、(1986
) 、Acta、5cand、Paed、75,233
)およびマウスの乳汁(Beardmere、 J、M
、およびRichards、 R,C,。
1985) 、 FBBSLettsr!3187.8
9) 、ウシの乳汁(Yagi、 H,等、(1986
) 、Acta、5cand、Paed、75,233
)およびマウスの乳汁(Beardmere、 J、M
、およびRichards、 R,C,。
(1983) 、 J、Endocrinol、96.
287 )の主要な成長促進剤であることも示されてい
る。
287 )の主要な成長促進剤であることも示されてい
る。
哺乳類由来の成長因子(MDGF)の名称を有する2種
の因子も乳汁から単離されている。ヒ) MDGF−■
は、約62kdの分子量および4.8の等電点(pI)
を有する還元剤に感受性のポリペプチドである(Ban
o、 M、等、(1985)J、Biol、Chem、
260.5745)。
の因子も乳汁から単離されている。ヒ) MDGF−■
は、約62kdの分子量および4.8の等電点(pI)
を有する還元剤に感受性のポリペプチドである(Ban
o、 M、等、(1985)J、Biol、Chem、
260.5745)。
このものはピコモル濃度で哺乳類細胞の増殖を促進し、
そしてこれらのコラーゲン産生レベルを高める。また、
MDGF−nも二硫化物の還元剤に対して感受性を有す
るが、しかしながら約17kdと低い分子量およびpI
4.4を有する(Ztniebel、J、A、等、(1
986)、Cancer Re5earch、 46.
933 )。
そしてこれらのコラーゲン産生レベルを高める。また、
MDGF−nも二硫化物の還元剤に対して感受性を有す
るが、しかしながら約17kdと低い分子量およびpI
4.4を有する(Ztniebel、J、A、等、(1
986)、Cancer Re5earch、 46.
933 )。
MDGF−IIが、へ431ヒト上皮癌細胞膜上のEG
F受容体に対する結合性についても放射能標識”’I−
t!GFと競合するとはいえ、TSK−3000S−ゲ
ル濾過カラム上で高いイオン強度の溶出緩衝液を用いる
ことによりヒトEC,FからMDGF−IIを溶離する
ことができる。MDGF−Uが軟寒天における正常なラ
ット腎臓(NRK)細胞の足場依願性に無関係な増殖を
促進し、ある種のトランスフォーミング成長因子(TG
F)の特徴を明らかに示し、さらにより大きいl型の分
子がEGF受容体にバインディングしないことから、M
DGF−nはTGF−且類に属する可能性があるようで
ある。
F受容体に対する結合性についても放射能標識”’I−
t!GFと競合するとはいえ、TSK−3000S−ゲ
ル濾過カラム上で高いイオン強度の溶出緩衝液を用いる
ことによりヒトEC,FからMDGF−IIを溶離する
ことができる。MDGF−Uが軟寒天における正常なラ
ット腎臓(NRK)細胞の足場依願性に無関係な増殖を
促進し、ある種のトランスフォーミング成長因子(TG
F)の特徴を明らかに示し、さらにより大きいl型の分
子がEGF受容体にバインディングしないことから、M
DGF−nはTGF−且類に属する可能性があるようで
ある。
さらにまた、ヒトの乳汁およびウシの乳汁は、一連の相
違する成長因子を含むことが報告されてきた。Shin
gおよびKlagsbrunは、ヒトの乳汁から3種の
成長因子を単離し、それらをl(MGF−111MGF
−IIおよびHMGF−117と命名した(1984.
Bndo−crinol、、 115.273)。
違する成長因子を含むことが報告されてきた。Shin
gおよびKlagsbrunは、ヒトの乳汁から3種の
成長因子を単離し、それらをl(MGF−111MGF
−IIおよびHMGF−117と命名した(1984.
Bndo−crinol、、 115.273)。
(lO)
HMGP−I[Iは、DNA合成により測定したところ
ではヒトの乳汁の総成長因子活性の75%以上を占める
と思われる。HMGF−IIIは、約6kdの分子量お
よびpI4.4〜4.7を有し、かつ還元剤の処理に対
して感受性を示さない。比較試験によれば、この分子は
EGFの可能性があることを示唆した。
ではヒトの乳汁の総成長因子活性の75%以上を占める
と思われる。HMGF−IIIは、約6kdの分子量お
よびpI4.4〜4.7を有し、かつ還元剤の処理に対
して感受性を示さない。比較試験によれば、この分子は
EGFの可能性があることを示唆した。
また、これらの研究者は、同様な分別手段を用いてそれ
が30〜35kdの分子量を有し、そして還元剤を用い
る処理で不活性化される主要な成長因子を構成し得ると
はいえ、この分子はウシの初乳には欠失していることを
示した。このいわゆるウシ初乳成長因子(BCGF)は
、HMGF−I[に対して生化学的に同一であり、もう
一つ別の分子は、ヒトの乳汁の総成長因子活性の約20
%の原因となる。
が30〜35kdの分子量を有し、そして還元剤を用い
る処理で不活性化される主要な成長因子を構成し得ると
はいえ、この分子はウシの初乳には欠失していることを
示した。このいわゆるウシ初乳成長因子(BCGF)は
、HMGF−I[に対して生化学的に同一であり、もう
一つ別の分子は、ヒトの乳汁の総成長因子活性の約20
%の原因となる。
イン・ビトロで骨髄細胞の増殖を促進し、そしてコロニ
ー形成顆粒球マクロファージの始原細胞(CFU−GM
)の分化を惹起するコロニー刺激因子(C3F)もまた
ヒトの乳汁から単離されている(Sinha、S、に、
およびYunis、A、A、 (1983)、Bioc
hem。
ー形成顆粒球マクロファージの始原細胞(CFU−GM
)の分化を惹起するコロニー刺激因子(C3F)もまた
ヒトの乳汁から単離されている(Sinha、S、に、
およびYunis、A、A、 (1983)、Bioc
hem。
Biophys、Res、Comm、 114+ 79
7) a ウシの乳汁かまたは初乳には存在しないこの
因子も、還元剤の作用に対して感受性を示さない。ゲル
濾過および等電点電気泳動試験は、それが他のC3F類
から生化学的に別個のものであり、そして240〜25
0kdの分子量とpI4.4〜4.9を有することを示
した。
7) a ウシの乳汁かまたは初乳には存在しないこの
因子も、還元剤の作用に対して感受性を示さない。ゲル
濾過および等電点電気泳動試験は、それが他のC3F類
から生化学的に別個のものであり、そして240〜25
0kdの分子量とpI4.4〜4.9を有することを示
した。
乳汁以外の起原に由来する本発明に関連して記載される
多数の他の成長因子または関連因子が存在する。
多数の他の成長因子または関連因子が存在する。
TCP−β分子を誘導するヒトの血小板、ヒトの胎盤お
よびウシの腎臓は、国際特許出願第一08470110
6号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第12884
9号公報に記載されている。ヨーロッパ特許第1690
16号公報および米国特許第4.627.982号明細
書は、ウシ脱塩骨(demineralized bo
ne)に由来する2種類のタンパク(CIF−Aおよび
CIF−B)の部分的な精製と、これらが軟骨形成の誘
導のための補助因子であることを報告している。CIF
−B(TGF−β2)は、イン・ビボで炎症細胞の機能
を阻害しくEP213776) 、イン・ビトロで腫瘍
細胞の増殖に対して阻害作用を有することが見出されて
いる(EP271211 )。これらのいわゆる軟骨誘
導因子のいずれも、TGF−βアッセイにおいてEGF
と組み合わせた場合に活性を示す。これらの因子の1つ
(CIF−A)は、ヒトの血小板に由来するTGF−β
に対し最初の30個までのアミノ酸が同一であるN−末
端配列を有するが、このものはCIF−Bのそれとは明
らかに相違している(Sporn、M、の総説、(19
86)、5cience、 233.532.および
Massague、 J、 。
よびウシの腎臓は、国際特許出願第一08470110
6号明細書およびヨーロッパ特許出願公開第12884
9号公報に記載されている。ヨーロッパ特許第1690
16号公報および米国特許第4.627.982号明細
書は、ウシ脱塩骨(demineralized bo
ne)に由来する2種類のタンパク(CIF−Aおよび
CIF−B)の部分的な精製と、これらが軟骨形成の誘
導のための補助因子であることを報告している。CIF
−B(TGF−β2)は、イン・ビボで炎症細胞の機能
を阻害しくEP213776) 、イン・ビトロで腫瘍
細胞の増殖に対して阻害作用を有することが見出されて
いる(EP271211 )。これらのいわゆる軟骨誘
導因子のいずれも、TGF−βアッセイにおいてEGF
と組み合わせた場合に活性を示す。これらの因子の1つ
(CIF−A)は、ヒトの血小板に由来するTGF−β
に対し最初の30個までのアミノ酸が同一であるN−末
端配列を有するが、このものはCIF−Bのそれとは明
らかに相違している(Sporn、M、の総説、(19
86)、5cience、 233.532.および
Massague、 J、 。
Ce1l、 49. 437〜438(1987) 、
参照〕。
参照〕。
CIF−B (Seyedin、S、M、等、 (19
87) 、 J、Biol、Chem。
87) 、 J、Biol、Chem。
」競:1946;EP169016)は、2つの他の最
近報告された成長因子と同一でないとしても、類似であ
る。
近報告された成長因子と同一でないとしても、類似であ
る。
Cheifetz、S、等は、ブタの血小板から単離し
、そのものが、同じ起原から単離された最初のブタTG
F−β(科学文献中で現在はTGF−β1と称されてい
る)に対するN−末端アミノ酸配列が相違することから
TGF−β2と命名した因子を公表している( (19
87) 、皿、 48:409)。さらに最近、叶an
n 。
、そのものが、同じ起原から単離された最初のブタTG
F−β(科学文献中で現在はTGF−β1と称されてい
る)に対するN−末端アミノ酸配列が相違することから
TGF−β2と命名した因子を公表している( (19
87) 、皿、 48:409)。さらに最近、叶an
n 。
nl等は、Tリンパ球に対して免疫抑制的であり、そし
てG−TsFと命名したヒト多形性神経膠芽細胞(gl
ioblastoma cell)に由来する因子を単
離した((1987)、EMBO,J、 6:1633
)。CIF−B、 TGF−β2およびG−TsFは
、N−末端におけるアミノ酸19まで同じアミノ酸配列
を有する。G−TsFは12.5kdの分子量を有する
にもかかわらず、CIF−BおよびTGF−β2はどち
らも約26kdの分子量を有する。
てG−TsFと命名したヒト多形性神経膠芽細胞(gl
ioblastoma cell)に由来する因子を単
離した((1987)、EMBO,J、 6:1633
)。CIF−B、 TGF−β2およびG−TsFは
、N−末端におけるアミノ酸19まで同じアミノ酸配列
を有する。G−TsFは12.5kdの分子量を有する
にもかかわらず、CIF−BおよびTGF−β2はどち
らも約26kdの分子量を有する。
タモキシフェンを添加したヒト前立腺癌細胞株から単離
され、24kdの分子量を有し、かつ2つのジスルフィ
ドにより結合した外観上同一のポリペプチド鎖から成る
ヒトTGFタイプβ2 (hTGF−β2)は、Mar
guardt、 H,等(J、Biol、Chem、、
’262゜12127〜12131(1987)
)およびIkeda、T、等(Biochem、26.
2406〜2410(1987) ”Jにより公表され
ている。
され、24kdの分子量を有し、かつ2つのジスルフィ
ドにより結合した外観上同一のポリペプチド鎖から成る
ヒトTGFタイプβ2 (hTGF−β2)は、Mar
guardt、 H,等(J、Biol、Chem、、
’262゜12127〜12131(1987)
)およびIkeda、T、等(Biochem、26.
2406〜2410(1987) ”Jにより公表され
ている。
B10−1アフリカ緑ザルの腎臓細胞から得て、ポリエ
ルギン(polyergin)と命名された成長阻害因
子BSC−I Glは、R,W、Ho1ley等により
精製および同定された(Proc、Natl、八cad
、sci、UsA、Vo1.75+1864〜1866
(1978)および同誌、Vol、77、5989〜5
992(1980) )。このものは、TGF−β1が
有する生物学上の活性とほぼ同一であることを示し[R
,F。
ルギン(polyergin)と命名された成長阻害因
子BSC−I Glは、R,W、Ho1ley等により
精製および同定された(Proc、Natl、八cad
、sci、UsA、Vo1.75+1864〜1866
(1978)および同誌、Vol、77、5989〜5
992(1980) )。このものは、TGF−β1が
有する生物学上の活性とほぼ同一であることを示し[R
,F。
Tucker等、5cience、Vol、■、705
〜707(1984) ]、そして胸腺細胞の増殖を強
く阻害することを示した(H,J、Ristow、同誌
、 Vol、83.5531〜5533(1986)
)。最近、BSC−I GIのアミノ酸配列は、BSC
−1細胞のcDNAライブラリーに由来するcDNAか
ら推論したところでは、TGF−β2のアミノ酸配列と
同等であることが見出されている。(S、に、Hank
s等、Proc、Natl、Sci、1ISA、Vol
、85.79〜82(198B))。
〜707(1984) ]、そして胸腺細胞の増殖を強
く阻害することを示した(H,J、Ristow、同誌
、 Vol、83.5531〜5533(1986)
)。最近、BSC−I GIのアミノ酸配列は、BSC
−1細胞のcDNAライブラリーに由来するcDNAか
ら推論したところでは、TGF−β2のアミノ酸配列と
同等であることが見出されている。(S、に、Hank
s等、Proc、Natl、Sci、1ISA、Vol
、85.79〜82(198B))。
今までのところ、これらの成長因子は乳汁中に存在する
ことが示されていない。
ことが示されていない。
すでに多数のポリペプチド成長因子が、単離され、特徴
付けられそしてクローン化されているとはいえ、これら
の物質のイン・ビボでの活性に対する研究は、主にかか
る研究のためには相対的に少量であるとの理由で少しし
か行われていない。
付けられそしてクローン化されているとはいえ、これら
の物質のイン・ビボでの活性に対する研究は、主にかか
る研究のためには相対的に少量であるとの理由で少しし
か行われていない。
本発明の成長因子の適用可能性のある重要な標的分野は
、傷の癒合の増進にある。傷の治療に数多くの薬剤が利
用し得るにもかかわらず、いまだ非常に多数の患者、特
に全く治癒しないか治癒が非常に遅い傷(外傷、火傷、
とこずれおよび糖尿病性の潰瘍を含む)をもつ老令の患
者が存在する。
、傷の癒合の増進にある。傷の治療に数多くの薬剤が利
用し得るにもかかわらず、いまだ非常に多数の患者、特
に全く治癒しないか治癒が非常に遅い傷(外傷、火傷、
とこずれおよび糖尿病性の潰瘍を含む)をもつ老令の患
者が存在する。
かかる患者は、傷の癒合過程を促進しそして加速するで
あろう医薬製剤にとって非常に興味深い目標を提供する
。小さな傷に属するものは、口内、特に歯茎ならびに例
えば顔面ならびに体表面の他の部分のカミソリの刃によ
って生じた傷である。
あろう医薬製剤にとって非常に興味深い目標を提供する
。小さな傷に属するものは、口内、特に歯茎ならびに例
えば顔面ならびに体表面の他の部分のカミソリの刃によ
って生じた傷である。
小人症の処置のごとき哺乳類の成長促進、さらにまたイ
ン・ビトロでの細胞培養物の増殖の促進にも本発明の成
長因子が使用できる可能性がある。
ン・ビトロでの細胞培養物の増殖の促進にも本発明の成
長因子が使用できる可能性がある。
驚くべきことに、本発明の成長因子は一定細胞型に対す
る抑制作用、すなわち免疫系細胞そしてさらに癌細胞の
抑制作用を有する。
る抑制作用、すなわち免疫系細胞そしてさらに癌細胞の
抑制作用を有する。
これらの指摘した処置に対する絶え間ない必要性が存在
することは疑問の余地がない。
することは疑問の余地がない。
本発明の目的は、「乳成長因子」またはrMGF」と称
される乳汁中に見出されたポリペプチド成長因子を利用
可能にすることであり、それを濃厚し、採取しそして精
製する方法を提供することであり、該成長因子を含んで
なる医薬、化粧品および食品組成物を提供することであ
り、ざらに哺乳類の細胞増殖および移動(migrat
ion)を促進し、そして組織の修復を促進するための
それらの使用方法を提供することである。さらに、本発
明の成長因子の投与により免疫応答を抑制しそして癌細
胞の増殖を抑制することも本発明の目的である。
される乳汁中に見出されたポリペプチド成長因子を利用
可能にすることであり、それを濃厚し、採取しそして精
製する方法を提供することであり、該成長因子を含んで
なる医薬、化粧品および食品組成物を提供することであ
り、ざらに哺乳類の細胞増殖および移動(migrat
ion)を促進し、そして組織の修復を促進するための
それらの使用方法を提供することである。さらに、本発
明の成長因子の投与により免疫応答を抑制しそして癌細
胞の増殖を抑制することも本発明の目的である。
またさらに、イン・ビトロで細胞の増殖および分裂を促
進することも本発明の目的である。
進することも本発明の目的である。
さらに、該成長因子およびある種の活性剤を含んでなる
相乗性混合物を提供することも本発明の目的である。
相乗性混合物を提供することも本発明の目的である。
本発明は、乳汁または乳製品から得られ、5OS−PA
GEにより測定した場合に約25kdの分子量を有し、
p19.O〜10.5の間の等電点を有することを特徴
とする濃厚および純粋な状態の乳成長因子(MGF)に
関する。
GEにより測定した場合に約25kdの分子量を有し、
p19.O〜10.5の間の等電点を有することを特徴
とする濃厚および純粋な状態の乳成長因子(MGF)に
関する。
本明細書で使用する[乳成長因子J (MGF)の語
は、該因子のすべての濃厚したまたは精製した、さらに
または部分的に精製した状態のものを意図している。こ
の濃厚物は、約103倍から107倍までであることが
でき、そしてほぼ100%の純度を有していてもよい。
は、該因子のすべての濃厚したまたは精製した、さらに
または部分的に精製した状態のものを意図している。こ
の濃厚物は、約103倍から107倍までであることが
でき、そしてほぼ100%の純度を有していてもよい。
本MGFは、乳汁中に見出される可能性があり、より少
ないかまたはより大きい分子量および相違するpI値を
有する他の成長因子、例えばEGFまたはHMGF m
(6kd) 。
ないかまたはより大きい分子量および相違するpI値を
有する他の成長因子、例えばEGFまたはHMGF m
(6kd) 。
MDGFI(62kd)、 MDGPII(17kd)
、 BCGF(30〜35kd )またはC3F (
240〜250kd)を実質的に含まないものである。
、 BCGF(30〜35kd )またはC3F (
240〜250kd)を実質的に含まないものである。
以下余白
特に本発明は、次のアミノ酸組成
〔但し、a)はペプチド1モル当たりのアミノ酸のモル
数であり、b)はペプチド1モル当たりのアミノ酸残基
ぢ示す概数である]を有する実質的に純粋な状態で存在
しており、かつ次式(上式中、X′7およびX18は未
同定アミノ酸を表す)で示されるN−末端アミノ酸配列
を有するウシの乳汁から入手され得るMGFまたはその
塩に関する。
数であり、b)はペプチド1モル当たりのアミノ酸残基
ぢ示す概数である]を有する実質的に純粋な状態で存在
しており、かつ次式(上式中、X′7およびX18は未
同定アミノ酸を表す)で示されるN−末端アミノ酸配列
を有するウシの乳汁から入手され得るMGFまたはその
塩に関する。
前記分子量は、Laemmli、U、に、の方法に従い
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(SO3−PAGII! )によって測定した(N
ature。
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動(SO3−PAGII! )によって測定した(N
ature。
227、680(1970) ) 、等電点は、B11
rk、 R,R,により概説されている方法により測定
した〔[動物細胞の制御機構(Control Mec
hanisms in AnimalCells) 、
、1 245〜257.Raven Press、Ne
w York<1980))。
rk、 R,R,により概説されている方法により測定
した〔[動物細胞の制御機構(Control Mec
hanisms in AnimalCells) 、
、1 245〜257.Raven Press、Ne
w York<1980))。
本発明のポリペプチドの陽イオン性は、塩基性アミノ酸
基、例えばアルギニン、リジンおよびヒスチジンの存在
に帰因する。MGFは、メルカプトエタノールおよびジ
チオスレイトールならびにそれらの塩のような還元剤に
感受性を有する熱安定性であり、かつ酸性で安定なポリ
ペプチドである。
基、例えばアルギニン、リジンおよびヒスチジンの存在
に帰因する。MGFは、メルカプトエタノールおよびジ
チオスレイトールならびにそれらの塩のような還元剤に
感受性を有する熱安定性であり、かつ酸性で安定なポリ
ペプチドである。
ある種の試薬によるMGFの処理は、2つのそれぞれ約
12.5kdの大きさの類僚または同一のサブユニット
から該分子が構成されていることを示しており、このも
のはおそらく1以上のシスティンジスルフィド結合によ
り1つに結合されていて、前記試薬による処理で開裂さ
れる。
12.5kdの大きさの類僚または同一のサブユニット
から該分子が構成されていることを示しており、このも
のはおそらく1以上のシスティンジスルフィド結合によ
り1つに結合されていて、前記試薬による処理で開裂さ
れる。
MGFが細胞の移動および増殖を促進する機能において
種特異性を示さないとの観察結果は、前記分子が相違す
る哺乳類の種間に高い保存性があり、従ってこの系統群
の他の分子と実質的に相同であることが期待されるとの
仮説を支持する。
種特異性を示さないとの観察結果は、前記分子が相違す
る哺乳類の種間に高い保存性があり、従ってこの系統群
の他の分子と実質的に相同であることが期待されるとの
仮説を支持する。
この点で、ポリペプチドについて用いられるところの「
実質的に相同」の語は、天然に由来するものか、合成品
であるか、または組換え手段で調製されたものであるか
を問わず、またさらに種や起源にかかわらず、アミノ酸
配列の相違が密接な種の活性に逆行した様式で影響を及
ぼさない該配列の相違を除いて、MGFと同一のアミノ
酸配列を有し、そして実質的に相同のポリペプチドであ
るところの分子を意味する。従って、最初はウシの乳汁
から単離された本発明のポリペプチド(MGF)は、別
種の補乳頻起源の乳汁に由来するものであるか、または
組換えDNA技術により調製されたものであってもよい
。容易に大量に入手することができ、そのために因子の
量が限定されることなく本明細書で概説する精製方法を
用いて生産することができることから、MGFの原料と
しては牛乳が好ましい。
実質的に相同」の語は、天然に由来するものか、合成品
であるか、または組換え手段で調製されたものであるか
を問わず、またさらに種や起源にかかわらず、アミノ酸
配列の相違が密接な種の活性に逆行した様式で影響を及
ぼさない該配列の相違を除いて、MGFと同一のアミノ
酸配列を有し、そして実質的に相同のポリペプチドであ
るところの分子を意味する。従って、最初はウシの乳汁
から単離された本発明のポリペプチド(MGF)は、別
種の補乳頻起源の乳汁に由来するものであるか、または
組換えDNA技術により調製されたものであってもよい
。容易に大量に入手することができ、そのために因子の
量が限定されることなく本明細書で概説する精製方法を
用いて生産することができることから、MGFの原料と
しては牛乳が好ましい。
分析目的で、均一なMGF (5(1〜loopmol
)試料を、乾燥し、次いで0.1%の液体フェノールを
含有する沸騰状態にある6NHC1,100ulを入れ
た密封した真空排気チューブ中で2時間150°Cにて
加水分解した。半システィンおよびメチオニンは、過ギ
酸酸化の後、酸加水分解することにより測定した。
)試料を、乾燥し、次いで0.1%の液体フェノールを
含有する沸騰状態にある6NHC1,100ulを入れ
た密封した真空排気チューブ中で2時間150°Cにて
加水分解した。半システィンおよびメチオニンは、過ギ
酸酸化の後、酸加水分解することにより測定した。
アミノ酸のO−フタルアルデヒド誘導体の分析は、蛍光
計および演算積算器を装備した変形アミノ酸分析器によ
り実施した。
計および演算積算器を装備した変形アミノ酸分析器によ
り実施した。
MGFのモル当たりのアミノ酸残基数は、見かけの分子
量25000ダルトンに基づく。
量25000ダルトンに基づく。
アミノ末端配列分析のために、MGF約500ピコモル
(Mr25.0OO)を還元し、次いでIMのトリス−
HC/2緩衝液(pH8,4)中の6Mのグアニジン−
H(l存在下でジチオスレイトールおよびヨ −ウ化−
(14C)酢酸を用いてS−カルボキシメチル化した。
(Mr25.0OO)を還元し、次いでIMのトリス−
HC/2緩衝液(pH8,4)中の6Mのグアニジン−
H(l存在下でジチオスレイトールおよびヨ −ウ化−
(14C)酢酸を用いてS−カルボキシメチル化した。
5ミクロンの50X4.6mmカラム上で0、1%のT
FAを含む0〜90%のアセトニトリルのダラージエン
ト(1分当たり1%)を用いて溶出するHPLCにより
過剰な試薬をカルボキシメチル化タンパクから分離した
。蛍光検出器を用いるアミノ酸分析によるタンパク量の
概算によれば、この工程での総回収率は96%であった
。
FAを含む0〜90%のアセトニトリルのダラージエン
ト(1分当たり1%)を用いて溶出するHPLCにより
過剰な試薬をカルボキシメチル化タンパクから分離した
。蛍光検出器を用いるアミノ酸分析によるタンパク量の
概算によれば、この工程での総回収率は96%であった
。
約500ピコモル(Mr12.500 )のS−カルボ
キシメチル化タンパクについて、気相シーケンサ−を用
いて自動エドマン分解を行った。PHT−アミノ酸をH
PLCシステムを用いて固定した。初期収率は約30%
であり、そして平均反応収率は約90%であった。その
結果、MGFの各2つのサブユニットの少なくとも最初
の19個のN−末端アミノ酸は同一であることを示し、
そしてSDS−PAGEによりMC,Fの還元体の単一
バンドを観察できることが確認できる。
キシメチル化タンパクについて、気相シーケンサ−を用
いて自動エドマン分解を行った。PHT−アミノ酸をH
PLCシステムを用いて固定した。初期収率は約30%
であり、そして平均反応収率は約90%であった。その
結果、MGFの各2つのサブユニットの少なくとも最初
の19個のN−末端アミノ酸は同一であることを示し、
そしてSDS−PAGEによりMC,Fの還元体の単一
バンドを観察できることが確認できる。
5t)S−PAGEによりウシMGFの分析は、いくつ
かのジスルフィド結合は、鎖間結合であることを示唆す
る。
かのジスルフィド結合は、鎖間結合であることを示唆す
る。
当該新規成長因子の塩基性基を介して、無機または有機
酸により酸付加塩を形成することができる。精製の目的
で、水および/またはアルコール不溶性塩、例えばテト
ラフェニル硼酸塩、Ca塩、AI!、塩およびZn塩等
が企図される。
酸により酸付加塩を形成することができる。精製の目的
で、水および/またはアルコール不溶性塩、例えばテト
ラフェニル硼酸塩、Ca塩、AI!、塩およびZn塩等
が企図される。
医薬としては、医薬として許容され得る塩、例えば水溶
性の金属またはアンモニウム塩、特に、アルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩、あるいはア
ンモニアまたは適当な有機アミンのアンモニウム塩が企
図される。好ましくは、無機酸、例えば塩酸、硫酸、も
しくはリン酸の酸付加塩であるか、有機酸、特に有機カ
ルボン酸もしくはスルホン酸、例えば低級アルカンカル
ボン酸もしくはジカルボン酸、例えばギ酸、酢酸、クエ
ン酸、およびトリフッ化酢酸等が挙げられる。
性の金属またはアンモニウム塩、特に、アルカリ金属ま
たはアルカリ土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩、マグネシウム塩またはカルシウム塩、あるいはア
ンモニアまたは適当な有機アミンのアンモニウム塩が企
図される。好ましくは、無機酸、例えば塩酸、硫酸、も
しくはリン酸の酸付加塩であるか、有機酸、特に有機カ
ルボン酸もしくはスルホン酸、例えば低級アルカンカル
ボン酸もしくはジカルボン酸、例えばギ酸、酢酸、クエ
ン酸、およびトリフッ化酢酸等が挙げられる。
本発明のMGFは、さらにその生物学的特性により特定
される。
される。
精製の各段階でのMGFの成長促進活性は、Btirk
、 R,R,により公表されているアッセイ法(Pro
c、Natl、Acad、Sci、USA、 70:3
69.(1973) )により測定され、そしてこの方
法は、MGFを含有する血清フリー培地の存在する正常
Ba1b/C3T3繊維芽細胞(またはそれらに由来す
る株)の単層培養で正常細胞が「傷害を受けた(wou
nded )細胞」に移動する数を、MGFまたはいず
れか他の既知ポリペプチド成長因子の不存在下の培地で
前記のように移動する細胞数と対比して測定するもので
ある。
、 R,R,により公表されているアッセイ法(Pro
c、Natl、Acad、Sci、USA、 70:3
69.(1973) )により測定され、そしてこの方
法は、MGFを含有する血清フリー培地の存在する正常
Ba1b/C3T3繊維芽細胞(またはそれらに由来す
る株)の単層培養で正常細胞が「傷害を受けた(wou
nded )細胞」に移動する数を、MGFまたはいず
れか他の既知ポリペプチド成長因子の不存在下の培地で
前記のように移動する細胞数と対比して測定するもので
ある。
前記の方法を用いる投与量応答試験は、培養物1−当た
り40±35ピコモルはどの少量の完全精製MGF濃度
が最大の移動応答の50%を引き出すのに十分であるこ
とを示した。MGFのこの濃度は、ヒト皮膚上皮細胞株
(NCTC2544)が指標細胞型として使用された場
合にも、前記アッセイで最大移動応答の50%を惹起し
た。
り40±35ピコモルはどの少量の完全精製MGF濃度
が最大の移動応答の50%を引き出すのに十分であるこ
とを示した。MGFのこの濃度は、ヒト皮膚上皮細胞株
(NCTC2544)が指標細胞型として使用された場
合にも、前記アッセイで最大移動応答の50%を惹起し
た。
さらに、MGFは、光学顕微鏡下で観察した場合の細胞
性DNA合成に対するその促進活性および前記単層培地
中で細胞分裂が見られることにより特徴付けられる。こ
の活性は、 (a)MGFを含有する血清フリー培地の存在下で増殖
した前記細胞の培養物中のいずれかの指定した視界領域
における細胞核の数を、MGFまたはいずれか他の既知
ポリペプチド成長因子の不存在下で増殖した培養物中の
いずれかの指定した視界領域における細胞核の数と対比
して計数すること。
性DNA合成に対するその促進活性および前記単層培地
中で細胞分裂が見られることにより特徴付けられる。こ
の活性は、 (a)MGFを含有する血清フリー培地の存在下で増殖
した前記細胞の培養物中のいずれかの指定した視界領域
における細胞核の数を、MGFまたはいずれか他の既知
ポリペプチド成長因子の不存在下で増殖した培養物中の
いずれかの指定した視界領域における細胞核の数と対比
して計数すること。
(b)MC,Fを含有する血清フリー培地の存在下で増
殖した前記細胞の培養物における放射能標識〔3H]−
チミジンの取り込み量を、MGFまたはいずれか他の既
知ポリペプチド成長因子の不存在下で増殖した培養物に
おける〔3H〕−チミジンの取り込み量と対比して測定
することのいずれかで定量した。
殖した前記細胞の培養物における放射能標識〔3H]−
チミジンの取り込み量を、MGFまたはいずれか他の既
知ポリペプチド成長因子の不存在下で増殖した培養物に
おける〔3H〕−チミジンの取り込み量と対比して測定
することのいずれかで定量した。
MGFの成長促進活性は、その分子の25kdの二量体
状態で特性を示すにすぎない。この活性は、5OS−P
AGEおよび窒素雰囲気下で50ミリモル濃度のギ酸で
一夜溶出した後、前記二量体を含有するゲル・スライス
から溶離した上澄中に回収することができる。12.5
kdの単量体調製品を含有するゲル・スライスからの溶
離物中には、いかなる活性も回収することが出来なかっ
た。また、MGFの成長促進活性は、哺乳類起源の細胞
培養物や前記Ba1b/C3T3繊維芽型以外の型の細
胞培養物で試験した場合にも発現し、ウシの乳汁に由来
するMGFに対する成長促進性応答が、その特質上程特
異的でないことを示唆している。
状態で特性を示すにすぎない。この活性は、5OS−P
AGEおよび窒素雰囲気下で50ミリモル濃度のギ酸で
一夜溶出した後、前記二量体を含有するゲル・スライス
から溶離した上澄中に回収することができる。12.5
kdの単量体調製品を含有するゲル・スライスからの溶
離物中には、いかなる活性も回収することが出来なかっ
た。また、MGFの成長促進活性は、哺乳類起源の細胞
培養物や前記Ba1b/C3T3繊維芽型以外の型の細
胞培養物で試験した場合にも発現し、ウシの乳汁に由来
するMGFに対する成長促進性応答が、その特質上程特
異的でないことを示唆している。
さらに、MGFは、EGFの存在下で相乗的に作用する
ことで特徴付けられる。この相乗作用は、軟寒天中での
正常ラット腎臓細胞(NRK)の足場非依存性増殖のイ
ン・ビトロ誘発に対するアッセイ(Roberts、
A、B、等+(1981) Proc、Natl、Ac
ad。
ことで特徴付けられる。この相乗作用は、軟寒天中での
正常ラット腎臓細胞(NRK)の足場非依存性増殖のイ
ン・ビトロ誘発に対するアッセイ(Roberts、
A、B、等+(1981) Proc、Natl、Ac
ad。
Sci、USA、78:5339 :lにおいて確認さ
れた。TGF−β(TGF−αに似ていない)が膜受容
体部位にバインディングするEGFと競合せず、しかし
細胞コロニーの誘発に対するそれらの他の「活性化物質
(activating agent) J受容体の占
拠を要求するので、時にはこのアッセイを形質転換成長
因子β型(TGF−β)アッセイと称する。この点で、
前記アッセイにおいてEGFとかかる相乗作用を有する
タンパクの乳汁中における存在は、今まで報告されてい
なかった。MGF単独では軟寒天中でNRK細胞の大き
なコロニーの形成を誘発するためには十分でないが、た
だマウスEGFの存在下でそのように作用するのみであ
ろう。単独ではこのアッセイで顕著な効果を生ずるには
不十分である濃度(5ng−−’)のEGFの存在下で
、MGFを0.1〜500ngmZ−’の濃度範囲内で
添加した場合には、MGFは大きなコロニー形成を誘発
する。
れた。TGF−β(TGF−αに似ていない)が膜受容
体部位にバインディングするEGFと競合せず、しかし
細胞コロニーの誘発に対するそれらの他の「活性化物質
(activating agent) J受容体の占
拠を要求するので、時にはこのアッセイを形質転換成長
因子β型(TGF−β)アッセイと称する。この点で、
前記アッセイにおいてEGFとかかる相乗作用を有する
タンパクの乳汁中における存在は、今まで報告されてい
なかった。MGF単独では軟寒天中でNRK細胞の大き
なコロニーの形成を誘発するためには十分でないが、た
だマウスEGFの存在下でそのように作用するのみであ
ろう。単独ではこのアッセイで顕著な効果を生ずるには
不十分である濃度(5ng−−’)のEGFの存在下で
、MGFを0.1〜500ngmZ−’の濃度範囲内で
添加した場合には、MGFは大きなコロニー形成を誘発
する。
イン・ビトロで正常Ba1b/c 3T3繊維芽細胞の
移動および増殖を促進するのにMGFのピコモル濃度で
足りるとは言え、相乗性応答はマウスEGFの存在下で
生ずる。Bjirk、 R,R,(1973) + P
roc、Natl 。
移動および増殖を促進するのにMGFのピコモル濃度で
足りるとは言え、相乗性応答はマウスEGFの存在下で
生ずる。Bjirk、 R,R,(1973) + P
roc、Natl 。
Acad、Sci、USA 70:369に記載され
ているアッセイによれば、マウスE G F 3.16
ng/ mlの存在下でMGF(10〜1009gmj
−1)の濃度範囲内)に対する最大移動応答は、EGF
の不存在下よりも30倍まで高いことを示した。
ているアッセイによれば、マウスE G F 3.16
ng/ mlの存在下でMGF(10〜1009gmj
−1)の濃度範囲内)に対する最大移動応答は、EGF
の不存在下よりも30倍まで高いことを示した。
また、本発明は組み合わせ、特にMGFおよびEGF受
容体とバインディングすることによりアゴニスト作用を
奏するポリペプチドとの相乗性併用剤に関する。かかる
ポリペプチドは、EGFそれ自体のほかに、例えばTG
F−αを挙げることができる。かかる併用剤は、重大な
事故または大がかりな手術により生じるような深い傷を
処置する上で特に有用である。MGFおよびEGFの等
モル量の併用剤が好ましい。
容体とバインディングすることによりアゴニスト作用を
奏するポリペプチドとの相乗性併用剤に関する。かかる
ポリペプチドは、EGFそれ自体のほかに、例えばTG
F−αを挙げることができる。かかる併用剤は、重大な
事故または大がかりな手術により生じるような深い傷を
処置する上で特に有用である。MGFおよびEGFの等
モル量の併用剤が好ましい。
さらに本発明は、乳成長因子(MGF)を含有する乳汁
またはいずれかの乳製品からMGFを採取し、必要によ
り得られたフリーのMGFを塩に転化するかまたは得ら
れた塩をフリーのMGFに転化することを特徴とする乳
成長因子(MGF)またはその塩の製造方法に関する。
またはいずれかの乳製品からMGFを採取し、必要によ
り得られたフリーのMGFを塩に転化するかまたは得ら
れた塩をフリーのMGFに転化することを特徴とする乳
成長因子(MGF)またはその塩の製造方法に関する。
本発明の成長因子は、それを含有する新鮮な乳汁または
乳製品のいずれかの原料から常法により採取される。M
GFの好ましい原料は、特にウシ類、例えば乳牛、ヤギ
、および羊等の乳汁または乳製品である。他の原料は、
乾燥脱脂粉乳のような商業的に入手できる粉末孔である
。
乳製品のいずれかの原料から常法により採取される。M
GFの好ましい原料は、特にウシ類、例えば乳牛、ヤギ
、および羊等の乳汁または乳製品である。他の原料は、
乾燥脱脂粉乳のような商業的に入手できる粉末孔である
。
より具体的に本発明の成長因子は、乳原料を各種のクロ
マトグラフ法、特に陽イオン交換クロマトグラフィー、
疎水的相互作用性クロマトグラフィー、サイズ排除クロ
マトグラフィーおよび/または、必要によりさらに精製
工程に付することにより採取される。プロテアーゼ阻害
剤、例えばフェニルメタンスルホニルフルオライドをM
GF含有原料に添加することが有利である。
マトグラフ法、特に陽イオン交換クロマトグラフィー、
疎水的相互作用性クロマトグラフィー、サイズ排除クロ
マトグラフィーおよび/または、必要によりさらに精製
工程に付することにより採取される。プロテアーゼ阻害
剤、例えばフェニルメタンスルホニルフルオライドをM
GF含有原料に添加することが有利である。
新鮮なウシの乳汁からM(1,Fを単離する方法は、低
圧および高圧技術の両者を組み合わせ使用する陽イオン
交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー工程に
より特徴付けられる。各分離工程後に集められた試料画
分であって、Ba1b/C3T3細胞における前記細胞
移動アッセイで生理活性を示す試料画分は、次の精製工
程に供される。
圧および高圧技術の両者を組み合わせ使用する陽イオン
交換クロマトグラフィー、疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー工程に
より特徴付けられる。各分離工程後に集められた試料画
分であって、Ba1b/C3T3細胞における前記細胞
移動アッセイで生理活性を示す試料画分は、次の精製工
程に供される。
集めた両分のそれぞれに由来する試料物質は、投与量応
答分析(前記細胞の同様なバイオアッセイを用いる)に
付され、これにより最大移動(migratory)応
答の50%を引き出すのに必要とされる物質量を評価す
ることが可能となる。前記量を本明細では「1単位」と
して定義しており、そしてこの値を、各活性プールの物
質量の値とを一緒に用いて、本発明の方法の各工程にお
ける精製収率、回収率および比活性を計算することがで
きる。最終精製工程に由来する純粋MQFの同質性は、 (i)一定の比活性、 (ii ) SDS−PAGEで追跡される約25〜2
6kdの単一バンドとしての移動度、 (iii)一定のアミノ酸組成、 (iv)一定のアミノ酸配列分析、により示される。
答分析(前記細胞の同様なバイオアッセイを用いる)に
付され、これにより最大移動(migratory)応
答の50%を引き出すのに必要とされる物質量を評価す
ることが可能となる。前記量を本明細では「1単位」と
して定義しており、そしてこの値を、各活性プールの物
質量の値とを一緒に用いて、本発明の方法の各工程にお
ける精製収率、回収率および比活性を計算することがで
きる。最終精製工程に由来する純粋MQFの同質性は、 (i)一定の比活性、 (ii ) SDS−PAGEで追跡される約25〜2
6kdの単一バンドとしての移動度、 (iii)一定のアミノ酸組成、 (iv)一定のアミノ酸配列分析、により示される。
特に、MGFの採取は、成長因子を含有する希釈した乳
汁または粉乳の水懸濁液を陽イオン交換樹脂で処理し、
該因子を装填した該樹脂を10mMのリン酸二水素ナト
リウム(pH7,0)の緩衝液系で洗浄し、40%エタ
ノール中の20mMのリン酸二水素カリウムから成る緩
衝液系(pH7,6)で樹脂から該因子を溶出し、特に
、酸付加塩の状態でそれを疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー次いでポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付し、そして所望によりさ
らに精製工程に付した後、所望により塩基の状態で得ら
れた成長因子を塩に転化するか、または塩の状態で得ら
れた成長因子をフリー塩基かもしくは他の塩に転化して
実施される。
汁または粉乳の水懸濁液を陽イオン交換樹脂で処理し、
該因子を装填した該樹脂を10mMのリン酸二水素ナト
リウム(pH7,0)の緩衝液系で洗浄し、40%エタ
ノール中の20mMのリン酸二水素カリウムから成る緩
衝液系(pH7,6)で樹脂から該因子を溶出し、特に
、酸付加塩の状態でそれを疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー次いでポリア
クリルアミドゲル電気泳動に付し、そして所望によりさ
らに精製工程に付した後、所望により塩基の状態で得ら
れた成長因子を塩に転化するか、または塩の状態で得ら
れた成長因子をフリー塩基かもしくは他の塩に転化して
実施される。
クロマトグラフィー前に、乳汁または粉乳を、例えば塩
化メチレンのような無極性有機溶媒で抽出するか、また
は粉乳の場合にはアセトンで抽出することにより、脂質
や他の無極性物質を除去してもよい。乳汁を蒸留水中に
希釈するには、乳汁中の水の割合は、容量で約1:3〜
1:10、好ましくは約1=4である。
化メチレンのような無極性有機溶媒で抽出するか、また
は粉乳の場合にはアセトンで抽出することにより、脂質
や他の無極性物質を除去してもよい。乳汁を蒸留水中に
希釈するには、乳汁中の水の割合は、容量で約1:3〜
1:10、好ましくは約1=4である。
粉乳を蒸留水中に懸濁するには、粉末中の水の割合は、
重量で約1:5〜約1:20、好ましくは約1:10で
ある。
重量で約1:5〜約1:20、好ましくは約1:10で
ある。
陽イオン交換クロマトグラフィーでは、いずれかの適当
な陽イオン交換樹脂、例えばバイオ・ラッド(Bio
Rad)へG5叶シリーズの樹脂、アンバーライト(A
mberlite) IRシリーズの樹脂、ゼオカーブ
(Zeocarb)22S 、ダイアイオン(Diai
on)SKシリーズの樹脂、ダウエックス(Dowex
) AG50−シリーズの樹脂を用いてもよい。固相マ
トリックス担体に結合する交換可能な対グループの状態
(ディスクまたはカートリッジの状態)でのイオン交換
は、例えばゼータペレプ(Zetaprep) 3Pシ
リーズの陽イオン交換体をも用いることができる。
な陽イオン交換樹脂、例えばバイオ・ラッド(Bio
Rad)へG5叶シリーズの樹脂、アンバーライト(A
mberlite) IRシリーズの樹脂、ゼオカーブ
(Zeocarb)22S 、ダイアイオン(Diai
on)SKシリーズの樹脂、ダウエックス(Dowex
) AG50−シリーズの樹脂を用いてもよい。固相マ
トリックス担体に結合する交換可能な対グループの状態
(ディスクまたはカートリッジの状態)でのイオン交換
は、例えばゼータペレプ(Zetaprep) 3Pシ
リーズの陽イオン交換体をも用いることができる。
好ましい陽イオン交換樹脂は、50〜100メツシユの
ダウエックスAG 50WX 2である。この樹脂は、
使用前にアセトン、エタノールおよび/または水で洗浄
してもよい。対応する金属水酸化物、例えばアルカリ金
属水酸化物で処理して、例えばナトリウムまたはカリウ
ムのようなアルカリ金属陽イオンで交換した後、樹脂を
中性になるまで洗浄し、次いで適当な低イオン強度の緩
衝液(pH7,0)、好ましくはリン酸二水素ナトリウ
、ム緩衝液(10mM)で平衡にする。新鮮な乳汁また
は再構成孔を同じアルカリ金属水酸化物で同じpHに調
節し、次いで樹脂と接触せしめる。この負荷した樹脂を
、洗液にポリペプチドが見られなくなるまで、即ち28
0nmにおける光学濃度が基線に達するまでpH7,0
の同一の緩衝液で洗浄する。次に、所期の成長因子を、
特に40%のエタノールの存在下で700mMの酢酸カ
リウムを有する高いイオン強度のアルカリ金属塩水性緩
衝液(pH7,6)を用いて溶出する。
ダウエックスAG 50WX 2である。この樹脂は、
使用前にアセトン、エタノールおよび/または水で洗浄
してもよい。対応する金属水酸化物、例えばアルカリ金
属水酸化物で処理して、例えばナトリウムまたはカリウ
ムのようなアルカリ金属陽イオンで交換した後、樹脂を
中性になるまで洗浄し、次いで適当な低イオン強度の緩
衝液(pH7,0)、好ましくはリン酸二水素ナトリウ
、ム緩衝液(10mM)で平衡にする。新鮮な乳汁また
は再構成孔を同じアルカリ金属水酸化物で同じpHに調
節し、次いで樹脂と接触せしめる。この負荷した樹脂を
、洗液にポリペプチドが見られなくなるまで、即ち28
0nmにおける光学濃度が基線に達するまでpH7,0
の同一の緩衝液で洗浄する。次に、所期の成長因子を、
特に40%のエタノールの存在下で700mMの酢酸カ
リウムを有する高いイオン強度のアルカリ金属塩水性緩
衝液(pH7,6)を用いて溶出する。
所期の活性を示す両分を集め、そして所望により蒸発に
より濃縮する。初期の総括性の約10%に当たるものが
、1000倍上昇した比活性を有するものとして得られ
る。
より濃縮する。初期の総括性の約10%に当たるものが
、1000倍上昇した比活性を有するものとして得られ
る。
集めた両分を、相互作用性疎水基を担持する電荷をもた
ないマトリックスから成る樹脂の疎水的相互作用性クロ
マトグラフィーにかける。適当な樹脂としては、例えば
フェニルセファロースまたはオクチルセファロースを用
いることができる。
ないマトリックスから成る樹脂の疎水的相互作用性クロ
マトグラフィーにかける。適当な樹脂としては、例えば
フェニルセファロースまたはオクチルセファロースを用
いることができる。
好ましい疎水的相互作用性樹脂は、フェニルセファロー
スCL−4Bである。
スCL−4Bである。
使用スる前に、該フェニルセファロースをアルコール、
例えばn−ブタノールおよびエタノールで、次いで水で
連続的に洗浄して再生する。ダウエックス・クロマトグ
ラフィーから集めた両分を、その両分中で一部フェニル
セファロース樹脂を直接撹拌することにより該樹脂に吸
着させる。次に、この樹脂をカラムに充填し、0.6
Mの酢酸アンモニウム(pH5,0)で洗浄し、次いで
同じ溶液(pl+5.0)中でエタノール量を逐次増量
(例えば、28%〜40%)するグラージエントにより
所期の活性を十分に溶出する。
例えばn−ブタノールおよびエタノールで、次いで水で
連続的に洗浄して再生する。ダウエックス・クロマトグ
ラフィーから集めた両分を、その両分中で一部フェニル
セファロース樹脂を直接撹拌することにより該樹脂に吸
着させる。次に、この樹脂をカラムに充填し、0.6
Mの酢酸アンモニウム(pH5,0)で洗浄し、次いで
同じ溶液(pl+5.0)中でエタノール量を逐次増量
(例えば、28%〜40%)するグラージエントにより
所期の活性を十分に溶出する。
このフェニルセファロース疎水的相互作用性クロマトグ
ラフィー工程の活性画分を集め、凍結乾燥し次いで小量
の高いイオン強度の緩衝液、例えば2Mの酢酸アンモニ
ウム(pH5,5)に再溶解するか、またはそのまま高
性能液体クロマトグラフィー(HPLC)の第1活性製
品を調製するブチル・ポリオール疎水的相互作用性クロ
マトグラフィーカラムにかける。このカラムを同じ緩衝
液で洗浄し、次いでエタノール量が直線的に上昇する(
例えば、20〜25%)グラージエントにより所期の活
性を十分に溶出する。
ラフィー工程の活性画分を集め、凍結乾燥し次いで小量
の高いイオン強度の緩衝液、例えば2Mの酢酸アンモニ
ウム(pH5,5)に再溶解するか、またはそのまま高
性能液体クロマトグラフィー(HPLC)の第1活性製
品を調製するブチル・ポリオール疎水的相互作用性クロ
マトグラフィーカラムにかける。このカラムを同じ緩衝
液で洗浄し、次いでエタノール量が直線的に上昇する(
例えば、20〜25%)グラージエントにより所期の活
性を十分に溶出する。
ブチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマトグラフィ
ー工程の活性画分を集め、大量の、好ましくは等容量の
同一緩衝溶液、即ち2Mの酢酸アンモニウム(pH5,
5)と混合し、)IPLCシステムの第2活性製品を調
製するオクチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマト
グラフィーカラムにかける。このカラムを同じ緩衝液で
洗浄し、次いでエタノール量が直線的に上昇する(例え
ば、40〜45%)ダラージエントにより所期の活性を
十分に溶出する。
ー工程の活性画分を集め、大量の、好ましくは等容量の
同一緩衝溶液、即ち2Mの酢酸アンモニウム(pH5,
5)と混合し、)IPLCシステムの第2活性製品を調
製するオクチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマト
グラフィーカラムにかける。このカラムを同じ緩衝液で
洗浄し、次いでエタノール量が直線的に上昇する(例え
ば、40〜45%)ダラージエントにより所期の活性を
十分に溶出する。
オクチル・ポリオール疎水的相互作用性クロマトグラフ
ィー工程の活性画分を集め、凍結乾燥し次いで少量の、
好ましくは100I11の7部の60%のエタノールと
3部の2Mの酢酸アンモニウム(pH5,5)から成る
緩衝溶液に再溶解せしめ、そしてHPLCシステムの第
3活性製品を調製するTSKG 200OSWカラムの
サイズ排除クロマトグラフィーに付す。溶出方法は、同
じ緩衝溶液を用いる同様な溶出条件下で実施し、活性含
有画分を集め、凍結乾燥し次いで使用するまで一20°
Cで貯蔵する。
ィー工程の活性画分を集め、凍結乾燥し次いで少量の、
好ましくは100I11の7部の60%のエタノールと
3部の2Mの酢酸アンモニウム(pH5,5)から成る
緩衝溶液に再溶解せしめ、そしてHPLCシステムの第
3活性製品を調製するTSKG 200OSWカラムの
サイズ排除クロマトグラフィーに付す。溶出方法は、同
じ緩衝溶液を用いる同様な溶出条件下で実施し、活性含
有画分を集め、凍結乾燥し次いで使用するまで一20°
Cで貯蔵する。
得られる成長因子は、5DS−PAGEにより約25〜
26kdの分子量を有する単一バンドとして移動し、約
95%〜100%の純度を有するであろう。
26kdの分子量を有する単一バンドとして移動し、約
95%〜100%の純度を有するであろう。
所望により、前記1以上のクロマト処理またはポリペプ
チド精製の技術分野で使用される他の方法、例えば向流
分配法、等電点分離法、クロマトフオーカシング、透析
、塩および溶媒沈殿、他のゲルを用いる吸着、セルロー
ス・イオン交換クロマトグラフィー、多孔質ガラスピー
ズ上での電気泳動クロマトグラフィーならびに固定化亜
鉛キレートHPLCによるクロマトグラフィー等により
本発明の成長因子をさらなる精製を行うことができる。
チド精製の技術分野で使用される他の方法、例えば向流
分配法、等電点分離法、クロマトフオーカシング、透析
、塩および溶媒沈殿、他のゲルを用いる吸着、セルロー
ス・イオン交換クロマトグラフィー、多孔質ガラスピー
ズ上での電気泳動クロマトグラフィーならびに固定化亜
鉛キレートHPLCによるクロマトグラフィー等により
本発明の成長因子をさらなる精製を行うことができる。
分子内塩の形で得られるフリーのMGFは、当該分野で
既知の方法、特に所望の陰イオン等を負荷したイオン交
換樹脂を介して酸もしくは塩基で処理して所望の塩を調
製してもよく、また得られる塩は、フリー塩基もしくは
他の塩に転化してもよい。
既知の方法、特に所望の陰イオン等を負荷したイオン交
換樹脂を介して酸もしくは塩基で処理して所望の塩を調
製してもよく、また得られる塩は、フリー塩基もしくは
他の塩に転化してもよい。
その精製工程中の各種の両分中の成長因子の存在は、2
80nmにおける光学濃度を測定し、そして特にそれが
特徴付けられる各種の特性を測定することによりチエツ
クすることができる。好ましい方法としては、Bjir
k、 R,Rの移動アッセイ(Migration八5
say) へProc、Natl、Acad、Sci
、USA、 70(1973):370)による各両
分の細胞移動促進特性の測定が挙げられる。2X105
個の3T3−B細胞(BaIb/c 3T3細胞に由来
する〕のクローンA31を、35胴プラスチック製ペト
リ皿(Nunc)中にウシ胎児血清を10%含有するダ
ルベツコ変性イーグルの培地2.5 +n!に接種する
。37°Cで3日放置した後2、皿の底上に無菌のカミ
ソリの刃を押し付けて集密的細胞単層中に傷を付けて細
胞シートを切断しそして「スタート・ライン」を標識す
る。
80nmにおける光学濃度を測定し、そして特にそれが
特徴付けられる各種の特性を測定することによりチエツ
クすることができる。好ましい方法としては、Bjir
k、 R,Rの移動アッセイ(Migration八5
say) へProc、Natl、Acad、Sci
、USA、 70(1973):370)による各両
分の細胞移動促進特性の測定が挙げられる。2X105
個の3T3−B細胞(BaIb/c 3T3細胞に由来
する〕のクローンA31を、35胴プラスチック製ペト
リ皿(Nunc)中にウシ胎児血清を10%含有するダ
ルベツコ変性イーグルの培地2.5 +n!に接種する
。37°Cで3日放置した後2、皿の底上に無菌のカミ
ソリの刃を押し付けて集密的細胞単層中に傷を付けて細
胞シートを切断しそして「スタート・ライン」を標識す
る。
カミソリの刃を端に向かってゆっくり動かしてこのシー
トの一部を取り出す。吸引により液体培地および細胞デ
ブリを取り出し、血清を含まないイーグルの培地2.5
mZに再接種し、次いで成長因子を含有する両分の適
当量について試験する。
トの一部を取り出す。吸引により液体培地および細胞デ
ブリを取り出し、血清を含まないイーグルの培地2.5
mZに再接種し、次いで成長因子を含有する両分の適
当量について試験する。
37°Cで22時間放置した後、その細胞を室温でライ
シュマン(Leishmann)の溶液を用いて固定し
そして染色する。移動活性は、カミソリの刃で甲された
「スタート・ライン」のl1m1+にわたる細胞数とし
て定義される。
シュマン(Leishmann)の溶液を用いて固定し
そして染色する。移動活性は、カミソリの刃で甲された
「スタート・ライン」のl1m1+にわたる細胞数とし
て定義される。
さらに、本発明は、投与製剤中に乳成長因子の有効量か
、またはその医薬として許容され得る塩を含んでなる医
薬組成物に関する。
、またはその医薬として許容され得る塩を含んでなる医
薬組成物に関する。
かかる組成物は、それぞれ非経口的、例えば筋肉内また
は静脈内に注入する溶液または製剤であるか、あるいは
経口または特に局所、即ち局所的投与のための注入液ま
たは製剤の剤型として存在する。溶液は、好ましくは使
用前に調製することができる、例えば活性成分を単独で
含むか、または医薬として許容され得る担体を一緒に含
む凍結乾燥調製品に由来する等張性水溶液または懸濁液
である。非経口的使用のための溶液は、一般に水溶液で
ある。これらは常法により調製され、活性成分に、さら
に生理食塩水、ヒト血清アルブミンのような安定剤、ア
ルギニンまたはグリシンのようなアミノ酸、およびグル
コース、マンノース、デキストランまたはヒドロキシエ
チル澱粉のような炭水化物を含めてもよい。pHは、緩
衝剤、例えばリン酸塩、琥珀酸塩またはアミノ酸により
約4.5〜7に調整してもよい。一般に、バイアルは、
長期貯蔵用としては溶液を充填した後凍結乾燥される。
は静脈内に注入する溶液または製剤であるか、あるいは
経口または特に局所、即ち局所的投与のための注入液ま
たは製剤の剤型として存在する。溶液は、好ましくは使
用前に調製することができる、例えば活性成分を単独で
含むか、または医薬として許容され得る担体を一緒に含
む凍結乾燥調製品に由来する等張性水溶液または懸濁液
である。非経口的使用のための溶液は、一般に水溶液で
ある。これらは常法により調製され、活性成分に、さら
に生理食塩水、ヒト血清アルブミンのような安定剤、ア
ルギニンまたはグリシンのようなアミノ酸、およびグル
コース、マンノース、デキストランまたはヒドロキシエ
チル澱粉のような炭水化物を含めてもよい。pHは、緩
衝剤、例えばリン酸塩、琥珀酸塩またはアミノ酸により
約4.5〜7に調整してもよい。一般に、バイアルは、
長期貯蔵用としては溶液を充填した後凍結乾燥される。
洗口液も常法で調製される。これらは活性成分を例えば
水または水性アルコール(例えば、約30〜60%)に
溶解して含み、味覚を増進するために常用される添加剤
、例えばポリエチレングリコール、グリセロールおよび
エーテル性油、例えばハツカ油を含んでもよい。局所に
使用するための医薬製剤は、粉末、錬歯磨を含むクリー
ム、チューインガム、ローションおよびチンキ剤等を含
んでなり、そしてこれらも同様に常法で調製される。
水または水性アルコール(例えば、約30〜60%)に
溶解して含み、味覚を増進するために常用される添加剤
、例えばポリエチレングリコール、グリセロールおよび
エーテル性油、例えばハツカ油を含んでもよい。局所に
使用するための医薬製剤は、粉末、錬歯磨を含むクリー
ム、チューインガム、ローションおよびチンキ剤等を含
んでなり、そしてこれらも同様に常法で調製される。
粉末は、通常タルク、活性成分および場合により他の添
加剤、例えば安定剤および芳香剤から成っている。クリ
ームや軟膏は、−船釣な特性のものであり、モノステア
リン酸ソルビタンまたはモノステアリン酸ポリオキシエ
チレンステアリン酸のようなステアリン酸エステル、ト
リオレイン酸ソルビタンのようなオレイン酸エステル、
セチルアルコールまたはプロピ1/ングリコールのよう
なアルコール、ラノリンのようなパラフィンまたは微結
晶ワックス、硫酸マグネシウムまたは錬歯磨用のクリ−
ジン粉末のよう7J粉末、および防腐剤等を含んでなる
ものでもよい。舌下または咽頭投用のための固型投与剤
は、普通の医薬製剤上の賦形剤、例えば(a)シューク
ロース、デキストロース1、ラクトース、マニトールも
しくはソルビトールのような希釈剤およびロゼンジ基材
、(b)澱粉糊、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースのような結合剤、(
C)ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウ
ム、タルクもしくは水素化野菜油のような潤滑剤、そし
て場合により((1)着色剤、香料、香味料等を用いて
調製される砥削であってもよい。
加剤、例えば安定剤および芳香剤から成っている。クリ
ームや軟膏は、−船釣な特性のものであり、モノステア
リン酸ソルビタンまたはモノステアリン酸ポリオキシエ
チレンステアリン酸のようなステアリン酸エステル、ト
リオレイン酸ソルビタンのようなオレイン酸エステル、
セチルアルコールまたはプロピ1/ングリコールのよう
なアルコール、ラノリンのようなパラフィンまたは微結
晶ワックス、硫酸マグネシウムまたは錬歯磨用のクリ−
ジン粉末のよう7J粉末、および防腐剤等を含んでなる
ものでもよい。舌下または咽頭投用のための固型投与剤
は、普通の医薬製剤上の賦形剤、例えば(a)シューク
ロース、デキストロース1、ラクトース、マニトールも
しくはソルビトールのような希釈剤およびロゼンジ基材
、(b)澱粉糊、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロースのような結合剤、(
C)ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウ
ム、タルクもしくは水素化野菜油のような潤滑剤、そし
て場合により((1)着色剤、香料、香味料等を用いて
調製される砥削であってもよい。
他方、ゼラチンおよびグリセロールを主成分とするか、
またはアラビアゴムおよび糖の混合物を用いて調製され
る香錠は、口内でゆっくり溶解することを目的に使用す
ることができる。
またはアラビアゴムおよび糖の混合物を用いて調製され
る香錠は、口内でゆっくり溶解することを目的に使用す
ることができる。
呑み込むことによる経口的摂取用の固型剤形は、錠剤ま
たはゼラチンカプセルであることができる。
たはゼラチンカプセルであることができる。
活性物質は、適当な通常用いられている医薬製剤上の賦
形剤および添加剤、例えば錠剤としては、(a)希釈剤
、例えばラクトース、澱粉、セルロース、ソルビトール
、リン酸カルシウムもしくは硫酸カルシウム、(b)結
合剤、例えば澱粉糊、ゼラチン、ポリビニルピロリドン
、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくは他の適
当なセルロースエーテル、(C)崩壊剤、例えば澱粉、
スターチグリコール酸ナトリウム、ナトリウムカルボキ
シメチルセルロース、クロスポビドン(crospov
idone)、(d)潤滑剤および滑沢剤、例えばステ
アリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステ
アリン酸、タルク、コロイド状二酸化シリコン、水素化
野菜油、そして場合により(e)界面活性剤、例えばラ
ウリル硫酸ナトリウム、着色剤等と一緒に処方される。
形剤および添加剤、例えば錠剤としては、(a)希釈剤
、例えばラクトース、澱粉、セルロース、ソルビトール
、リン酸カルシウムもしくは硫酸カルシウム、(b)結
合剤、例えば澱粉糊、ゼラチン、ポリビニルピロリドン
、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくは他の適
当なセルロースエーテル、(C)崩壊剤、例えば澱粉、
スターチグリコール酸ナトリウム、ナトリウムカルボキ
シメチルセルロース、クロスポビドン(crospov
idone)、(d)潤滑剤および滑沢剤、例えばステ
アリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステ
アリン酸、タルク、コロイド状二酸化シリコン、水素化
野菜油、そして場合により(e)界面活性剤、例えばラ
ウリル硫酸ナトリウム、着色剤等と一緒に処方される。
錠剤のコアーは、胃液に対して抵抗性であるかまたは抵
抗性でない適当な被覆により提供される。外側のコアー
は、糖を主体とするか、またはセルロースニーチルもし
くはアクリル系樹脂に基づく薄い膜から成るものであっ
てもよい。糖衣は、濃厚糖シロップを用いて処理し、次
いで普通に使用される被覆成分、例えばタルク、ポリビ
ニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび染料も
しくは色素を含有する懸濁液被覆することができる。フ
ィルム被覆剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
のようなフィルム形成剤、ポリエチレングリコールのよ
うな可塑剤、タルクのような抗粘結剤、色素ならびに二
酸化チタンおよび酸化鉄のような乳白剤を含んでいても
よい水溶液または水性懸濁液として適用される。腸溶皮
は、胃液には溶解しないが、腸液に溶解する、例えば酢
酸セルロース、有機溶媒中のフタル酸エステルまたはメ
タクリル酸共重合体であるポリマー・のラッカー溶液を
用いて得られる。
抗性でない適当な被覆により提供される。外側のコアー
は、糖を主体とするか、またはセルロースニーチルもし
くはアクリル系樹脂に基づく薄い膜から成るものであっ
てもよい。糖衣は、濃厚糖シロップを用いて処理し、次
いで普通に使用される被覆成分、例えばタルク、ポリビ
ニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび染料も
しくは色素を含有する懸濁液被覆することができる。フ
ィルム被覆剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロース
のようなフィルム形成剤、ポリエチレングリコールのよ
うな可塑剤、タルクのような抗粘結剤、色素ならびに二
酸化チタンおよび酸化鉄のような乳白剤を含んでいても
よい水溶液または水性懸濁液として適用される。腸溶皮
は、胃液には溶解しないが、腸液に溶解する、例えば酢
酸セルロース、有機溶媒中のフタル酸エステルまたはメ
タクリル酸共重合体であるポリマー・のラッカー溶液を
用いて得られる。
カプセルは、調製した硬質ゼラチン外皮を用いて医薬製
剤を充填するか、またはゼラチンおよびグリセリンまた
はソルビトールのような軟化剤の混合物から調製された
軟質ゼラチン外皮を用い、そして医薬製剤を充填する工
程中に密封して調製される。硬質ゼラチンカプセルは、
錠剤用として(a)および(d)に前述したような希釈
剤、潤滑剤および滑沢剤により調製される粉末混合物を
含むか、または錠剤に圧縮成型するために使用されるも
のおよび前述の(a)〜(d)にN僚する成分による顆
粒化物を含んでいてもよい。また、硬質ゼラチンカプセ
ルは、活性成分を適当な液体または半固体基材、例えば
ポリエチレングリコール、脂肪油またはポリオキシエチ
レン化グリセライド誘導体を有し、必要によりワックス
またはコロイド状二酸化シリコンのような増粘剤および
/またはポリソルベートのような界面活性剤を有する液
体、糊または固形塊を含んでいてもよい。軟質カプセル
では、好ましくは活性成分が適当な液体、例えば脂肪油
、パラフィンまたはポリエチレングリコールに溶解され
るか懸濁される。
剤を充填するか、またはゼラチンおよびグリセリンまた
はソルビトールのような軟化剤の混合物から調製された
軟質ゼラチン外皮を用い、そして医薬製剤を充填する工
程中に密封して調製される。硬質ゼラチンカプセルは、
錠剤用として(a)および(d)に前述したような希釈
剤、潤滑剤および滑沢剤により調製される粉末混合物を
含むか、または錠剤に圧縮成型するために使用されるも
のおよび前述の(a)〜(d)にN僚する成分による顆
粒化物を含んでいてもよい。また、硬質ゼラチンカプセ
ルは、活性成分を適当な液体または半固体基材、例えば
ポリエチレングリコール、脂肪油またはポリオキシエチ
レン化グリセライド誘導体を有し、必要によりワックス
またはコロイド状二酸化シリコンのような増粘剤および
/またはポリソルベートのような界面活性剤を有する液
体、糊または固形塊を含んでいてもよい。軟質カプセル
では、好ましくは活性成分が適当な液体、例えば脂肪油
、パラフィンまたはポリエチレングリコールに溶解され
るか懸濁される。
活性成分は、経口摂取用の多重単位投与剤形を構成する
小さなペレットに取り込まれていてもよい。ペレット中
への医薬の分配は、用意したべしく43) ットの表面上に溶液または懸濁液をスプレーすることに
より実施するか、または医薬と適当な希釈剤を含有する
混合物からペレットを形成することにより実施される。
小さなペレットに取り込まれていてもよい。ペレット中
への医薬の分配は、用意したべしく43) ットの表面上に溶液または懸濁液をスプレーすることに
より実施するか、または医薬と適当な希釈剤を含有する
混合物からペレットを形成することにより実施される。
表面上への加工用ペレットは、市販の砂糖と澱粉を含有
するノンパレイユ砂糖球であるか、または押し出し加工
次いで水で湿気を与えてかたまりにした微結晶セルロー
スおよびラクトースのような賦形剤を用いて球状化する
ことにより調製され得るものである。後者の工程を用い
て、ペレットに医薬を取り込むことができる。
するノンパレイユ砂糖球であるか、または押し出し加工
次いで水で湿気を与えてかたまりにした微結晶セルロー
スおよびラクトースのような賦形剤を用いて球状化する
ことにより調製され得るものである。後者の工程を用い
て、ペレットに医薬を取り込むことができる。
ペレットは、有機溶媒における溶液または水性分散物と
して適用されるポリマーく例えばエチルセルロース、ポ
リメタクリレート樹脂、酢酸フタル酸セルロース等を用
いる保護または放出調整ラッカーで被覆されていてもよ
い。該ペレットは、硬質ゼラチンカプセルに充填するか
、または適当な錠剤成形用賦形剤と共に錠剤に成形する
こともできる。
して適用されるポリマーく例えばエチルセルロース、ポ
リメタクリレート樹脂、酢酸フタル酸セルロース等を用
いる保護または放出調整ラッカーで被覆されていてもよ
い。該ペレットは、硬質ゼラチンカプセルに充填するか
、または適当な錠剤成形用賦形剤と共に錠剤に成形する
こともできる。
組成物は、例えば防腐剤、安定剤、湿潤剤および/また
は乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および/または緩
衝剤の通常用いられている補助剤を含む。本発明の医薬
組成物は、場合によりさらに薬理学上有用な物質を含ん
でいてもよく、そしてこのものはそれ自体既知の、例え
ば通常の混合、溶解、凍結乾燥および/または滅菌方法
により調製でき、そして活性成分の100%までの凍結
乾燥標品として製剤のg当り約1ng〜100■、特に
約10ng〜10■含む。
は乳化剤、可溶化剤、浸透圧調整用塩および/または緩
衝剤の通常用いられている補助剤を含む。本発明の医薬
組成物は、場合によりさらに薬理学上有用な物質を含ん
でいてもよく、そしてこのものはそれ自体既知の、例え
ば通常の混合、溶解、凍結乾燥および/または滅菌方法
により調製でき、そして活性成分の100%までの凍結
乾燥標品として製剤のg当り約1ng〜100■、特に
約10ng〜10■含む。
またさらに、本発明は、本発明の医薬活性化合物を常法
、例えば医薬として許容され得る担体と混合処理するこ
とを特徴とする医薬組成物の製造方法に関する。
、例えば医薬として許容され得る担体と混合処理するこ
とを特徴とする医薬組成物の製造方法に関する。
また、本発明は、MGFまたはその医薬として許容され
得る塩の有効量を含んでなる錬歯磨にも関連する。この
錬歯磨は、特に歯茎の傷、例えば歯根膜炎または歯肉炎
の予防および/または治療に有用である。
得る塩の有効量を含んでなる錬歯磨にも関連する。この
錬歯磨は、特に歯茎の傷、例えば歯根膜炎または歯肉炎
の予防および/または治療に有用である。
さらに、本発明は、MGFまたはその医薬として許容さ
れ得る塩の有効量を含んでなる洗口液およびその製造方
法にも関する。本洗口液は、口内または喉の傷、例えば
歯根膜塩、歯肉塩または喉の炎症を介して生じる傷の予
防および/または治許容され得る塩の有効量を含んでな
る化粧品組成物にも関する。本化粧品組成物は、局所医
薬組成物と類似するものであってもよく、さらに芳香性
化合物を含んでもよい。かかる組成物は、通常用いられ
るシェービング石ケン、ホーム、クリームおよびローシ
ョンに含められる。
れ得る塩の有効量を含んでなる洗口液およびその製造方
法にも関する。本洗口液は、口内または喉の傷、例えば
歯根膜塩、歯肉塩または喉の炎症を介して生じる傷の予
防および/または治許容され得る塩の有効量を含んでな
る化粧品組成物にも関する。本化粧品組成物は、局所医
薬組成物と類似するものであってもよく、さらに芳香性
化合物を含んでもよい。かかる組成物は、通常用いられ
るシェービング石ケン、ホーム、クリームおよびローシ
ョンに含められる。
またさらに、本発明は、医薬組成物、洗口液、錬歯磨お
よび化粧品調製物の調製のためのMGFの使用にも関す
る。
よび化粧品調製物の調製のためのMGFの使用にも関す
る。
MGFは、一方ではある型の体細胞、即ち繊維芽細胞お
よび他の間充繊細胞の増殖を促進し、他方ではその他の
型の体細胞、即ち腫瘍細胞および免疫系の細胞の増殖を
阻害する如き二元的な特徴を有する。
よび他の間充繊細胞の増殖を促進し、他方ではその他の
型の体細胞、即ち腫瘍細胞および免疫系の細胞の増殖を
阻害する如き二元的な特徴を有する。
場合により塩、例えば特に無毒性の医薬として許容され
得る酸付加塩の剤形中に存在してもよい本発明の新規な
成長因子および場合により医薬製 ・剤の剤形中
に存在してもよい該成長因子は、有効量で適用される。
得る酸付加塩の剤形中に存在してもよい本発明の新規な
成長因子および場合により医薬製 ・剤の剤形中
に存在してもよい該成長因子は、有効量で適用される。
「有効量」の語では、主に癒合または化粧用に効果督奏
する量、例えば所期の細胞の増殖を促進し、かつその細
胞に毒性を示さない量を意味する。このような量は、例
えばイン・ビトロ増殖試験により決定することができる
。
する量、例えば所期の細胞の増殖を促進し、かつその細
胞に毒性を示さない量を意味する。このような量は、例
えばイン・ビトロ増殖試験により決定することができる
。
MGFの二元的な特性のため、「有効量」とは、腫瘍細
胞および免疫系細胞の増殖および分裂を意義ある程度に
阻害する量でもある。ヒトまたは家畜への使用が意図さ
れる場合には、その量は処置される特有の組織、投与の
様式、疾病の激しさ、ならびに処置される宿主の年令お
よび一般的な状態に適合させねばならない。一般に、成
人に対する投与量は、成長促進作用および阻害作用のい
ずれに対しても約0.1〜1000■の範囲にあるであ
るう。処置される特有の種に由来する成長因子の使用、
即ちヒトを処置するためにはヒトの乳汁由来の成長因子
を、牛を処置するためには乳牛の乳汁由来の成長因子を
使用することによりアレルギー反応を避は得る可能性が
ある。
胞および免疫系細胞の増殖および分裂を意義ある程度に
阻害する量でもある。ヒトまたは家畜への使用が意図さ
れる場合には、その量は処置される特有の組織、投与の
様式、疾病の激しさ、ならびに処置される宿主の年令お
よび一般的な状態に適合させねばならない。一般に、成
人に対する投与量は、成長促進作用および阻害作用のい
ずれに対しても約0.1〜1000■の範囲にあるであ
るう。処置される特有の種に由来する成長因子の使用、
即ちヒトを処置するためにはヒトの乳汁由来の成長因子
を、牛を処置するためには乳牛の乳汁由来の成長因子を
使用することによりアレルギー反応を避は得る可能性が
ある。
Hの の 上の′
活性成分がMGFまたは適当な活性剤、好ましくはEG
FとMGFとの組み合わせである、本発明の医薬組成物
は、傷の癒合の場合における動物、特に哺乳類、より具
体的には人間、就中、老令の人間の処置における臨床上
の用途を有する。プロトコールI〜■でいくつかの結果
を提供しこの事実を裏付ける。
FとMGFとの組み合わせである、本発明の医薬組成物
は、傷の癒合の場合における動物、特に哺乳類、より具
体的には人間、就中、老令の人間の処置における臨床上
の用途を有する。プロトコールI〜■でいくつかの結果
を提供しこの事実を裏付ける。
本発明の組成物は、細胞移動および細胞増殖を促進する
。傷の癒合が細胞移動と細胞増殖とに関連するのでイン
・ビトロにおけるこれらのパターンが直接イン・ビボに
おける傷の癒合過程に関連することがわかってきた。
。傷の癒合が細胞移動と細胞増殖とに関連するのでイン
・ビトロにおけるこれらのパターンが直接イン・ビボに
おける傷の癒合過程に関連することがわかってきた。
本発明の組成物の活性成分が有する重要な特性は、イン
・ビトロまたはイン・ビポのいずれにおいてもそれらの
活性について種特異的な組み合わせが要求されないこと
、即ち、ある種、例えばウシに由来するMGFが別の種
、例えばマウスEGFに由来する活性剤により活性化す
ることができることである。さらに、イン・ビトロまた
はイン・ビボのいずれかにおける移動および/または増
殖が促進される細胞としては、組成物の活性成分から相
違する種のものまたは別の型、例えば繊維芽細胞もしく
は上皮細胞(これら2つの前記細胞の増殖促進が最大の
医療上の有用性を有するであろうと考えられるものであ
るが)を挙げることができる。MGFとEGFの相乗作
用は、皮膚が適する標的であることを示唆する。床擦れ
(褥庶性潰瘍)は、入院患者、特に老人医学上の患者お
よび車椅子患者において頻繁に生ずるので床擦れの予防
または治療が好ましい目的である。老令の人々では傷の
癒合が緩慢であり、そしてこのグループの患者は癒合が
緩慢であるかほとんど癒合しない傷(Wf性潰瘍および
糖尿病性潰瘍だけでなく、外傷および火傷等をも含む)
の高い罹病率を示すf頃向にある。
・ビトロまたはイン・ビポのいずれにおいてもそれらの
活性について種特異的な組み合わせが要求されないこと
、即ち、ある種、例えばウシに由来するMGFが別の種
、例えばマウスEGFに由来する活性剤により活性化す
ることができることである。さらに、イン・ビトロまた
はイン・ビボのいずれかにおける移動および/または増
殖が促進される細胞としては、組成物の活性成分から相
違する種のものまたは別の型、例えば繊維芽細胞もしく
は上皮細胞(これら2つの前記細胞の増殖促進が最大の
医療上の有用性を有するであろうと考えられるものであ
るが)を挙げることができる。MGFとEGFの相乗作
用は、皮膚が適する標的であることを示唆する。床擦れ
(褥庶性潰瘍)は、入院患者、特に老人医学上の患者お
よび車椅子患者において頻繁に生ずるので床擦れの予防
または治療が好ましい目的である。老令の人々では傷の
癒合が緩慢であり、そしてこのグループの患者は癒合が
緩慢であるかほとんど癒合しない傷(Wf性潰瘍および
糖尿病性潰瘍だけでなく、外傷および火傷等をも含む)
の高い罹病率を示すf頃向にある。
本発明の組成物投与の2つのタイプは、特に動物薬と人
間薬として提供される。
間薬として提供される。
第1のもので、かつ好ましい投与は、傷の癒合が著しく
緩慢である特に老人の表面的な傷の癒合を促進するため
の局所的なものである。処置され得る傷の型としてはい
かなる制限もなく、そしてこれらには(限定されるもの
でないが)、褥疹(床擦れ)性、糖尿病性、歯科性、口
内性、静脈瘤性および血友病患者の潰瘍;火傷(第二度
および第三度);外科的切開(歯科領域上のおよび美容
上の手術のものを含む);不慮の傷(切開、貫入、裂傷
および他の外傷を含む)および治療上惹起される傷(放
射線療法を通じて誘発されるものを含む)を含む表面的
な潰瘍が挙げられる。局所的に投与される場合に本発明
の組成物は、他の成分、例えば補助薬、担体、可溶化剤
およびその他の既知の、または未だ知られていない第二
の成長因子と組み合わされていてもよい。これらの成分
の性質としては、投与のために医薬として、かつ生物学
上許容され得るものでなければならず、そして組成物の
活性成分の活性を低下せしめるか、または有害な毒性を
示してはならないことを除いていかなる制限もない。本
発明の組成物が表面上の潰瘍、火傷、外科的または不慮
の傷に対して投与される場合には、該組成物は、好まし
くは粉末、ゲル、軟膏もしくはイリガント(irrig
ant) 、、またはトランスデルマル(transd
ermal)中に該組成物を含浸せしめた粘剤、硬剤お
よび包帯の剤形中に含まれていることが好ましく、そし
てまた好ましくは液体もしくは半流動剤形中に含まれて
いるか、あるいはそれらが錬歯磨中に取り込まれている
かまたはチューイング用のガムもしくは樹脂に取り込ま
れていてもよい。
緩慢である特に老人の表面的な傷の癒合を促進するため
の局所的なものである。処置され得る傷の型としてはい
かなる制限もなく、そしてこれらには(限定されるもの
でないが)、褥疹(床擦れ)性、糖尿病性、歯科性、口
内性、静脈瘤性および血友病患者の潰瘍;火傷(第二度
および第三度);外科的切開(歯科領域上のおよび美容
上の手術のものを含む);不慮の傷(切開、貫入、裂傷
および他の外傷を含む)および治療上惹起される傷(放
射線療法を通じて誘発されるものを含む)を含む表面的
な潰瘍が挙げられる。局所的に投与される場合に本発明
の組成物は、他の成分、例えば補助薬、担体、可溶化剤
およびその他の既知の、または未だ知られていない第二
の成長因子と組み合わされていてもよい。これらの成分
の性質としては、投与のために医薬として、かつ生物学
上許容され得るものでなければならず、そして組成物の
活性成分の活性を低下せしめるか、または有害な毒性を
示してはならないことを除いていかなる制限もない。本
発明の組成物が表面上の潰瘍、火傷、外科的または不慮
の傷に対して投与される場合には、該組成物は、好まし
くは粉末、ゲル、軟膏もしくはイリガント(irrig
ant) 、、またはトランスデルマル(transd
ermal)中に該組成物を含浸せしめた粘剤、硬剤お
よび包帯の剤形中に含まれていることが好ましく、そし
てまた好ましくは液体もしくは半流動剤形中に含まれて
いるか、あるいはそれらが錬歯磨中に取り込まれている
かまたはチューイング用のガムもしくは樹脂に取り込ま
れていてもよい。
第二の投与は、外科的な処置が不可能であるかまたは要
求されない内部器官の組織に対する損傷または術後の内
面性の傷の癒合のための全身系のものである。さらに、
処置される組織または傷の型としてはいかなる制限もな
く、そしてこれらとしては(限定されるものでないが)
、内部器官および組織に対する深い外科的な切開;骨お
よび軟骨(骨折後の);胃、十二指腸およびその他の腸
の潰瘍が挙げられる。全身的に投与される場合、本発明
の組成物は、経腸投与にあっては液剤九剤、錠剤、砥削
として製剤されてもよく、また非経口的な注入では液剤
として製剤されてもよい。術後の内面的な切開の処置で
は、それらはイリガントの剤形であってもよく、好まし
くは生理食塩水との併用剤形であってもよい。さらに、
本発明の組成物の活性成分は、他の成分、例えば補助薬
、担体、可溶化剤およびその他の既知の、または未だ知
られていない第二の成長因子と組み合わされていてもよ
い。これらの成分の性質としては、投与のために医薬と
して、かつ生物学上許容され得るものでなければならず
、そして組成物の活性成分の活性を低下せしめるか、ま
たは有害な毒性を示してはならないことを除いていかな
る制限もない。
求されない内部器官の組織に対する損傷または術後の内
面性の傷の癒合のための全身系のものである。さらに、
処置される組織または傷の型としてはいかなる制限もな
く、そしてこれらとしては(限定されるものでないが)
、内部器官および組織に対する深い外科的な切開;骨お
よび軟骨(骨折後の);胃、十二指腸およびその他の腸
の潰瘍が挙げられる。全身的に投与される場合、本発明
の組成物は、経腸投与にあっては液剤九剤、錠剤、砥削
として製剤されてもよく、また非経口的な注入では液剤
として製剤されてもよい。術後の内面的な切開の処置で
は、それらはイリガントの剤形であってもよく、好まし
くは生理食塩水との併用剤形であってもよい。さらに、
本発明の組成物の活性成分は、他の成分、例えば補助薬
、担体、可溶化剤およびその他の既知の、または未だ知
られていない第二の成長因子と組み合わされていてもよ
い。これらの成分の性質としては、投与のために医薬と
して、かつ生物学上許容され得るものでなければならず
、そして組成物の活性成分の活性を低下せしめるか、ま
たは有害な毒性を示してはならないことを除いていかな
る制限もない。
また、本発明は、医薬組成物そしてまたは化粧用組成物
の投与を含んでなる哺乳類の損傷を予防または治療する
ための方法にも関する。
の投与を含んでなる哺乳類の損傷を予防または治療する
ための方法にも関する。
傷の癒合に対して投与される活性成分の量は、まったく
臨界的でない。一般には、傷のICTl!当り約0.1
〜LOttgのMGFの一日量で、だいたい有意な癒合
効果を有する。内部使用にあっては、体液中でのMGF
の希釈のため投与の様式に応じてより高めの量が投与さ
れる。高めの量でも安全であることは、MGFが乳汁中
に存在するとの事実により認められる。
臨界的でない。一般には、傷のICTl!当り約0.1
〜LOttgのMGFの一日量で、だいたい有意な癒合
効果を有する。内部使用にあっては、体液中でのMGF
の希釈のため投与の様式に応じてより高めの量が投与さ
れる。高めの量でも安全であることは、MGFが乳汁中
に存在するとの事実により認められる。
驚くべきことに、本発明のMGFは、プロトコール■お
よびVで明らかにするように広範なスペクトラムの免疫
抑制活性を有する。
よびVで明らかにするように広範なスペクトラムの免疫
抑制活性を有する。
従って、本発明は、MGFまたはその医薬として許容さ
れ得る塩の免疫抑制の有効量を投与することを含んでな
る免疫応答の抑制方法にも関する。
れ得る塩の免疫抑制の有効量を投与することを含んでな
る免疫応答の抑制方法にも関する。
本発明のMGFの免疫抑制作用は、臓器移植手術におい
て、そしてまたは炎症のような自己免疫疾患を予防しそ
して処置するためにも使用することができる。
て、そしてまたは炎症のような自己免疫疾患を予防しそ
して処置するためにも使用することができる。
さらに、本発明のMCFは、メラノーマ細胞系A375
(プロトコール■)およびヒト乳癌細胞(プロトコー
ル■)に対する抗増殖作用によって示され得るように、
抗腫瘍活性(例えば、メラノーマ細胞に対して)を有す
る。
(プロトコール■)およびヒト乳癌細胞(プロトコー
ル■)に対する抗増殖作用によって示され得るように、
抗腫瘍活性(例えば、メラノーマ細胞に対して)を有す
る。
従って、本発明は、MGFまたはその医薬としく54)
て許容され得る塩の抗増殖性に有効量を投与することを
含んでなる癌の処置方法にも関する。
含んでなる癌の処置方法にも関する。
要求される活性剤の量は、たとえ試験がほぼ等モル量が
好ましいことを示唆するとしても、本発明の適切な組成
物中に存在するMGF量に左右されるであろう。本発明
の組成物のいずれかの外来の成分を伴う活性成分の的確
な量は、MGFおよび/または活性化剤の比活性、処置
される疾病(例えば、傷のサイズ、傷の性状および傷の
局在場所)により左右される。黒色腫を含有する表面的
な傷に対する局所投与剤では、1m1当りlng〜1■
のMGFが存在するであろう。本発明の活性成分は、受
容体部位にバインディングし次いで増殖および移動が促
進されている細胞により利用されことによって効果を奏
するので、該組成物の連続的または周期的な再投与が好
ましい。
好ましいことを示唆するとしても、本発明の適切な組成
物中に存在するMGF量に左右されるであろう。本発明
の組成物のいずれかの外来の成分を伴う活性成分の的確
な量は、MGFおよび/または活性化剤の比活性、処置
される疾病(例えば、傷のサイズ、傷の性状および傷の
局在場所)により左右される。黒色腫を含有する表面的
な傷に対する局所投与剤では、1m1当りlng〜1■
のMGFが存在するであろう。本発明の活性成分は、受
容体部位にバインディングし次いで増殖および移動が促
進されている細胞により利用されことによって効果を奏
するので、該組成物の連続的または周期的な再投与が好
ましい。
M否」コ刈1Q使月−
乳汁の主要な役割が新生児の栄養源として明らかである
とは言え、MGFもまた局所的な組織レベルだけでなく
ヒト成長ホルモン(HGH)と類イ以の様式で動物その
ものの成長を促進する効果をも有する。この点で、本発
明の組成物は成長過程にある若い動物、例えば子牛、子
羊、子馬、子豚および若鶏の飼料添加剤としても有用で
あると想像される。
とは言え、MGFもまた局所的な組織レベルだけでなく
ヒト成長ホルモン(HGH)と類イ以の様式で動物その
ものの成長を促進する効果をも有する。この点で、本発
明の組成物は成長過程にある若い動物、例えば子牛、子
羊、子馬、子豚および若鶏の飼料添加剤としても有用で
あると想像される。
従って、本発明は、さらにMGFまたはその塩の成長を
促進する量を含んでなる飼料組成物、およびMC,Fま
たはその塩の成長を促進する量を含んでなる飼料組成物
を前記動物の成長を促進する量を投与することを含んで
なる動物の成長の促進方法に関する。
促進する量を含んでなる飼料組成物、およびMC,Fま
たはその塩の成長を促進する量を含んでなる飼料組成物
を前記動物の成長を促進する量を投与することを含んで
なる動物の成長の促進方法に関する。
さらなる適用は、通常の培地条件下では増殖することが
困難な培養細胞、例えばSV40ウィルスの形質転換胎
児性ヒト繊維芽細胞系WI−38VA13の増殖のため
にMGFを使用することである。その上、MGFはタン
パクが不足しているかまたは実質的にタンパクを含まな
い培地中で一定の細胞を増殖するために使用することが
でき、これによって細胞の培地として使用される血清の
節約を可能とする。従って、R,R,Bjirkに従う
試験が示すように、血清フリーの培地において、約11
−1O00pのピコモル濃度で本発明の因子がBa1b
/c 3T3細胞の移動および増殖を促進する。
困難な培養細胞、例えばSV40ウィルスの形質転換胎
児性ヒト繊維芽細胞系WI−38VA13の増殖のため
にMGFを使用することである。その上、MGFはタン
パクが不足しているかまたは実質的にタンパクを含まな
い培地中で一定の細胞を増殖するために使用することが
でき、これによって細胞の培地として使用される血清の
節約を可能とする。従って、R,R,Bjirkに従う
試験が示すように、血清フリーの培地において、約11
−1O00pのピコモル濃度で本発明の因子がBa1b
/c 3T3細胞の移動および増殖を促進する。
従って、本発明は、またMGFまたはその塩の増殖の促
進を刺激する量を含んでなる実質的に他のタンパクを含
まない細胞増殖培地にも関し、さらにMGFまたはその
塩の増殖を促進する量を前記培地に添加することを含ん
でなる実質的に他のタンパクを含まない培地を用いるイ
ン・ビトロでの細胞の増殖方法にも関する。
進を刺激する量を含んでなる実質的に他のタンパクを含
まない細胞増殖培地にも関し、さらにMGFまたはその
塩の増殖を促進する量を前記培地に添加することを含ん
でなる実質的に他のタンパクを含まない培地を用いるイ
ン・ビトロでの細胞の増殖方法にも関する。
以下の例は、本発明を説明するために提供するが、それ
らを限定するものとして解釈できない。
らを限定するものとして解釈できない。
ダウエックス(Dowex)AG 50WX 2.50
〜100メツシユの樹脂(30ffi ; H+型)を
適当なサイズのクロマトグラフィー用カラムに充填し、
最初に50%エタノール中IMの水酸化ナトリウム2〜
3ベツド量で洗浄し、次いで蒸留水3〜6ベツド量で洗
浄した。次に、0.OIMのリン酸二水素ナトリウム(
pH7,0)の2〜3ベツド量でNa+型に平衡化した
。新鮮な乳汁(250〜400j2)を4倍量の蒸留水
で希釈し、次いで0.1 Mのフェニルメタンスルホニ
ルフルオライド(PMSF) (生の乳汁に対するプロ
テアーゼ阻害剤)40mZを添加した。次に、この希釈
した乳汁溶液を4°Cでカラムベツドを通してゆっくり
とポンプで流し、これによって樹脂に適当に含まれる乳
タンパクの吸収を可能にした。
〜100メツシユの樹脂(30ffi ; H+型)を
適当なサイズのクロマトグラフィー用カラムに充填し、
最初に50%エタノール中IMの水酸化ナトリウム2〜
3ベツド量で洗浄し、次いで蒸留水3〜6ベツド量で洗
浄した。次に、0.OIMのリン酸二水素ナトリウム(
pH7,0)の2〜3ベツド量でNa+型に平衡化した
。新鮮な乳汁(250〜400j2)を4倍量の蒸留水
で希釈し、次いで0.1 Mのフェニルメタンスルホニ
ルフルオライド(PMSF) (生の乳汁に対するプロ
テアーゼ阻害剤)40mZを添加した。次に、この希釈
した乳汁溶液を4°Cでカラムベツドを通してゆっくり
とポンプで流し、これによって樹脂に適当に含まれる乳
タンパクの吸収を可能にした。
充填後、この樹脂を0.OIMのリン酸二水素ナトリウ
ム(pI(7,0)の11/2ベツド量で洗浄した。
ム(pI(7,0)の11/2ベツド量で洗浄した。
次に、このカラムを0.02Mのリン酸二水素カリウム
の2172ベツド量で溶出し、次いで40%エタノール
中0.7Mの酢酸カリウム(pH7,6)で280nm
の0.0.がベースラインに戻るまで溶出した。酢酸で
各両分を直ちにp)14.5〜5.5に調整した。
の2172ベツド量で溶出し、次いで40%エタノール
中0.7Mの酢酸カリウム(pH7,6)で280nm
の0.0.がベースラインに戻るまで溶出した。酢酸で
各両分を直ちにp)14.5〜5.5に調整した。
280nmに小さな吸収ピークを有する酢酸カリウムの
溶離液が所期の活性の大部分を含んでいた。第1図に集
めた画分の移動(migration)活性と共に、溶
離相に関する280nmにおける吸収を示した。活性画
分(Nα8〜17)を集め、ロータリー・エバポレ・−
ターで2〜3倍濃縮し、次に使用するまで4℃に貯蔵し
た。
溶離液が所期の活性の大部分を含んでいた。第1図に集
めた画分の移動(migration)活性と共に、溶
離相に関する280nmにおける吸収を示した。活性画
分(Nα8〜17)を集め、ロータリー・エバポレ・−
ターで2〜3倍濃縮し、次に使用するまで4℃に貯蔵し
た。
b) ・ 互 クロマトグラフィーIフェニル
・セファロースCL4B (ファルマシア(Pharm
acia)製〕を、1カラム容量のn−ブタノール、1
容量のエタノール次いで約10容量の蒸留水で洗浄して
再生した。a)項に由来する活性画分の集めたもの(減
圧下でロータリー・エバポレーターで減少せしめた総量
は通常40〜50I!、)を、適当なサイズの容器中I
Mの水酸化アンモニウムでpH5,0に調整した。前記
のごとく調製したフェニル・セファロースCL4B樹脂
約750 +nZを前記容器に添加し、4°Cで一部穏
やかに内容物を撹拌した。
・セファロースCL4B (ファルマシア(Pharm
acia)製〕を、1カラム容量のn−ブタノール、1
容量のエタノール次いで約10容量の蒸留水で洗浄して
再生した。a)項に由来する活性画分の集めたもの(減
圧下でロータリー・エバポレーターで減少せしめた総量
は通常40〜50I!、)を、適当なサイズの容器中I
Mの水酸化アンモニウムでpH5,0に調整した。前記
のごとく調製したフェニル・セファロースCL4B樹脂
約750 +nZを前記容器に添加し、4°Cで一部穏
やかに内容物を撹拌した。
撹拌を停止した後、樹脂が定着するまで静置し、次いで
上澄物を注意深くデカントして廃棄した。
上澄物を注意深くデカントして廃棄した。
次に、樹脂を大きなガラス漏斗に移し、0.6Mの酢酸
アンモニウムから成る緩衝液を流出液がもはや不透明で
なくなるのに必要な量用いて徹底的に洗浄した。次に、
適当なサイズのクロマトグラフィー用カラムにその樹脂
を移し、充填したカラムをさらに0.6 Mの酢酸アン
モニウム(pH5,0)2容量で洗浄し、次いで所期の
活性の溶離が十分になされるように0.2Mの酢酸(p
H5,0>中28%および40%エタノールで段階的に
溶出させた。
アンモニウムから成る緩衝液を流出液がもはや不透明で
なくなるのに必要な量用いて徹底的に洗浄した。次に、
適当なサイズのクロマトグラフィー用カラムにその樹脂
を移し、充填したカラムをさらに0.6 Mの酢酸アン
モニウム(pH5,0)2容量で洗浄し、次いで所期の
活性の溶離が十分になされるように0.2Mの酢酸(p
H5,0>中28%および40%エタノールで段階的に
溶出させた。
28%の段階のものを無視して容量を減らすことができ
た。第2図に集めた両分の移動活性と共に、溶離相に関
する280nmにおける吸収を示した。活性画分(No
、 113〜180)を集め、次に使用するまで4℃に
貯蔵した。
た。第2図に集めた両分の移動活性と共に、溶離相に関
する280nmにおける吸収を示した。活性画分(No
、 113〜180)を集め、次に使用するまで4℃に
貯蔵した。
C) ・ クロマ グーフィーII (H
PLC)b)項に由来する活性画分の集めたもの(通常
、総量は2〜2.5 A )を、乾燥するまで凍結乾燥
し次いで60%エタノール7部と2Mの酢酸アンモニウ
ム(pH5,0)3部から成る混合液の小量(通常、5
0rR1)に再溶解するか、または減圧蒸発により3〜
10倍濃縮した。このものに、さらに2Mの酢酸アンモ
ニウム(pH5,5)から成る緩衝液の1〜2容量を添
加し、次いで室温下、ブチル。
PLC)b)項に由来する活性画分の集めたもの(通常
、総量は2〜2.5 A )を、乾燥するまで凍結乾燥
し次いで60%エタノール7部と2Mの酢酸アンモニウ
ム(pH5,0)3部から成る混合液の小量(通常、5
0rR1)に再溶解するか、または減圧蒸発により3〜
10倍濃縮した。このものに、さらに2Mの酢酸アンモ
ニウム(pH5,5)から成る緩衝液の1〜2容量を添
加し、次いで室温下、ブチル。
ポリオール5i500(10,1/11ポアー・サイズ
)の疎水的相互作用性クロマトグラフィー用カラム上に
、1分当たり1−の流速で前記溶液をポンプで流した。
)の疎水的相互作用性クロマトグラフィー用カラム上に
、1分当たり1−の流速で前記溶液をポンプで流した。
このカラムを同じ緩衝液で洗浄した後、次いでエタノー
ルの量を高めてい(直線的なグラジェント(本例では、
グラジェントの平坦な部分を通じて21〜24%)を用
いて溶出した。なお、この方法は所期の活性を溶離する
のに十分であった。第3図に集めた両分の移動活性と共
に、溶離相に関する280nmにおける吸収を示した。
ルの量を高めてい(直線的なグラジェント(本例では、
グラジェントの平坦な部分を通じて21〜24%)を用
いて溶出した。なお、この方法は所期の活性を溶離する
のに十分であった。第3図に集めた両分の移動活性と共
に、溶離相に関する280nmにおける吸収を示した。
活性画分(No、31〜40)を集め、次に使用するま
で蒸発を避けるため密封容器中で−20’Cに貯蔵した
。
で蒸発を避けるため密封容器中で−20’Cに貯蔵した
。
d) ・ クロマトグーフィーIII (
)IPLc)0項)に由来する活性成分を集めたもの(
通常、総量20〜40mZ)を2Mの酢酸アンモニウム
緩衝液(pH5,5)の等量と混合し、室温下でオクチ
ル・ポリオール5i500(10声ボアー・サイズ)上
にポンプを用い流速1公告たり1mlで流した。次に、
このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、次いでエタノールの
量を高めていく直線的なグラジェント(本例では、グラ
ジェントの平坦な部分を通じて40〜42%)を用いて
溶出した。なおこの方法は所期の活性を溶離するのに十
分であった。最後にカラムを0〜100%の直線的エタ
ノールのグラジェントを繰り返して脱着せしめた。第4
図に集めた両分の移動活性と共に、溶離相に関する28
0nmにおける吸収を示した。活性画分(Nα39〜4
2)を集め、使用するまで一20℃にて貯蔵した。
)IPLc)0項)に由来する活性成分を集めたもの(
通常、総量20〜40mZ)を2Mの酢酸アンモニウム
緩衝液(pH5,5)の等量と混合し、室温下でオクチ
ル・ポリオール5i500(10声ボアー・サイズ)上
にポンプを用い流速1公告たり1mlで流した。次に、
このカラムを同じ緩衝液で洗浄し、次いでエタノールの
量を高めていく直線的なグラジェント(本例では、グラ
ジェントの平坦な部分を通じて40〜42%)を用いて
溶出した。なおこの方法は所期の活性を溶離するのに十
分であった。最後にカラムを0〜100%の直線的エタ
ノールのグラジェントを繰り返して脱着せしめた。第4
図に集めた両分の移動活性と共に、溶離相に関する28
0nmにおける吸収を示した。活性画分(Nα39〜4
2)を集め、使用するまで一20℃にて貯蔵した。
e)サイズ 、クロマトグー7に(HPLC)d)項に
由来する活性画分の集めもの(通常、総量は2〜10−
)を、乾燥するまで凍結乾燥し次いで60%エタノール
7部と2Mの酢酸アンモニウム(pH5,5)3部から
成る緩衝液100−に再溶解した。次に、再溶解物をT
SKG200サイズ排除カラムに注入し、次いで室温下
で同じ緩衝液を用い、流速1公告たり0.2 rdで定
常的に溶出を行った。第5図に集めた両分の移動活性と
共に、全定常溶離相に関する280n111における吸
収を示した。
由来する活性画分の集めもの(通常、総量は2〜10−
)を、乾燥するまで凍結乾燥し次いで60%エタノール
7部と2Mの酢酸アンモニウム(pH5,5)3部から
成る緩衝液100−に再溶解した。次に、再溶解物をT
SKG200サイズ排除カラムに注入し、次いで室温下
で同じ緩衝液を用い、流速1公告たり0.2 rdで定
常的に溶出を行った。第5図に集めた両分の移動活性と
共に、全定常溶離相に関する280n111における吸
収を示した。
活性画分(No、86〜91)を凍結乾燥し、そして使
用するまで一20°Cにて個別に貯蔵した。
用するまで一20°Cにて個別に貯蔵した。
e)項に由来する活性画分中にMGFは存在し、ほぼ1
00%の純度を有する製品として含まれていて、そのも
のは約25000の分子量を存する。この値は、α−キ
モトリプシン標準に対して530nmで走査した1、
5 mm厚の銀染色5DS−PAGEゲル(15%のア
クリルアミドを含有する)から概算した(島津C5−9
30デュアル波長走査デンシトメーターを使用)。銀染
色法は、B11rk、 R,R,等、Methods
tnEnzymolo’gy、 91,247〜254
(1983) 、に準じて行った。
00%の純度を有する製品として含まれていて、そのも
のは約25000の分子量を存する。この値は、α−キ
モトリプシン標準に対して530nmで走査した1、
5 mm厚の銀染色5DS−PAGEゲル(15%のア
クリルアミドを含有する)から概算した(島津C5−9
30デュアル波長走査デンシトメーターを使用)。銀染
色法は、B11rk、 R,R,等、Methods
tnEnzymolo’gy、 91,247〜254
(1983) 、に準じて行った。
フラット・ベツド等電点電気泳動条件下で、活性物質は
pttc+、o〜10.5の区画から採取された。
pttc+、o〜10.5の区画から採取された。
[[弛少flな 、′からのMC,Fの他の哺乳類原料
、例えばヒト、羊または山羊に由来する新鮮な乳汁の適
当量を最初に工程1a)のごとく希釈し、例1a)〜l
e)と同様に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的
相互作用性クロマトグラフィー次いでサイズ排除クロマ
トグラフィーを実施し、乳成長因子(MGF)を得た。
、例えばヒト、羊または山羊に由来する新鮮な乳汁の適
当量を最初に工程1a)のごとく希釈し、例1a)〜l
e)と同様に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的
相互作用性クロマトグラフィー次いでサイズ排除クロマ
トグラフィーを実施し、乳成長因子(MGF)を得た。
劃」罎監規jり見M 八′のMGFの市販の乾燥ウ
シ脱脂粉乳(25〜50kg)をアセトン50〜100
!に懸濁し、20°Cにて1時間撹拌して洗浄し、次い
で洗浄粉末を大きな真空乾燥器中室温下で一夜乾燥した
。100 g未満の乾燥物がアセトン中に移るがこのも
のを廃棄した。アセトン洗浄粉末を使用するまで室温に
放置した。4°Cで蒸留水250〜500!にこのアセ
トン洗浄粉乳(25〜50kg)を添加し、1時間起泡
を避けて穏やかに撹拌し、次いでINの水酸化ナトリウ
ムでこの混合物を約pH6,7〜pn’7.oに調整し
た。さらに洗浄物を希釈し、粉乳を再し、例1a)〜l
e)と同様に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的
相互作用性クロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロ
マトグラフィーを実施してウシの乳成長因子を得た。
シ脱脂粉乳(25〜50kg)をアセトン50〜100
!に懸濁し、20°Cにて1時間撹拌して洗浄し、次い
で洗浄粉末を大きな真空乾燥器中室温下で一夜乾燥した
。100 g未満の乾燥物がアセトン中に移るがこのも
のを廃棄した。アセトン洗浄粉末を使用するまで室温に
放置した。4°Cで蒸留水250〜500!にこのアセ
トン洗浄粉乳(25〜50kg)を添加し、1時間起泡
を避けて穏やかに撹拌し、次いでINの水酸化ナトリウ
ムでこの混合物を約pH6,7〜pn’7.oに調整し
た。さらに洗浄物を希釈し、粉乳を再し、例1a)〜l
e)と同様に陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水的
相互作用性クロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロ
マトグラフィーを実施してウシの乳成長因子を得た。
以下余白
ソルビタンモノステアレート 2.0ポリオキ
シエチレンソルビタン モノステアレート 3.0セチルア
ルコール 5.0軽質液状パラフイ
ン 8.0イソプロピルミリステート
2.0 活性物質(MG F ) 1.0
・10−5プロピレングリコール 2.
0グリセリン 2.0脱イオン水
76.0防腐剤および他の安
定剤 必要量該水溶液を55〜60°C
に加熱し、その中に活性物質を溶解し、次いで激しく撹
拌しその中に溶融した脂質相を分散させた。室温に冷却
し、均一化した。
シエチレンソルビタン モノステアレート 3.0セチルア
ルコール 5.0軽質液状パラフイ
ン 8.0イソプロピルミリステート
2.0 活性物質(MG F ) 1.0
・10−5プロピレングリコール 2.
0グリセリン 2.0脱イオン水
76.0防腐剤および他の安
定剤 必要量該水溶液を55〜60°C
に加熱し、その中に活性物質を溶解し、次いで激しく撹
拌しその中に溶融した脂質相を分散させた。室温に冷却
し、均一化した。
同様に、それぞれ0.4.4または20■/mfを含ん
でなるクリームを調製することができた。
でなるクリームを調製することができた。
傷の1d当たりこのクリーム100111を投与した。
ソルビタントリオレエート 5.0微結晶
ワツクス 3.0軽質液状パラフ
イン 9.0イソプロピルミリステー
ト 10.0ラノリンアルコール
3.0活性物質(MGF)
1.0・10−5プロピレングリコール
2.0グリセリン 2.0
マグネシウムサルフエート、水和物 0.7脱イオン
水 65.3防腐剤
必要量穏やかに撹拌しながら活性物質
を水相に溶解し、次いで溶融した脂質相中にその溶液を
分散した。
ワツクス 3.0軽質液状パラフ
イン 9.0イソプロピルミリステー
ト 10.0ラノリンアルコール
3.0活性物質(MGF)
1.0・10−5プロピレングリコール
2.0グリセリン 2.0
マグネシウムサルフエート、水和物 0.7脱イオン
水 65.3防腐剤
必要量穏やかに撹拌しながら活性物質
を水相に溶解し、次いで溶融した脂質相中にその溶液を
分散した。
室温に冷却し、均一化した。
同様に、それぞれ0.4.4または20■/−を含んで
なる軟膏を調製することができた。傷の1d当りこの軟
膏の100#を投与した。
なる軟膏を調製することができた。傷の1d当りこの軟
膏の100#を投与した。
以下余白
■旦:迭旦浪
一一一−1シーー氷−−−−− %
活性物質(MGF)1.0・10−3
ポリエチレングリコール(7)−
グリセリルココエート 4.0脱イオ
ン水 13.0グリセリン86
% 18.0ペパーミント油
10.0エタノール
55.0脱イオン水に活性物質を溶解した。こ
の溶液にpEc (7)−グリセリルココエートおよび
グリセリンを添加し、そして溶解した。エタノールにペ
ノマーミント油を溶解し、撹拌しながら2つの溶液を混
合した。
ン水 13.0グリセリン86
% 18.0ペパーミント油
10.0エタノール
55.0脱イオン水に活性物質を溶解した。こ
の溶液にpEc (7)−グリセリルココエートおよび
グリセリンを添加し、そして溶解した。エタノールにペ
ノマーミント油を溶解し、撹拌しながら2つの溶液を混
合した。
使用前にこの溶液を1710まで希釈した。
以下余白
!lLL:11旧1液
活性物質(M G F ) 11ng/
m!±ヒト血清アルブミン 1■/mlアル
ギニンまたはグリシン 20■/m1±炭水化物
5〜20■/m1pH7 炭水化物は、グルコース、マンノース、デキストラン、
ヒドロキシエチル澱粉またはこれらの混合物である。
m!±ヒト血清アルブミン 1■/mlアル
ギニンまたはグリシン 20■/m1±炭水化物
5〜20■/m1pH7 炭水化物は、グルコース、マンノース、デキストラン、
ヒドロキシエチル澱粉またはこれらの混合物である。
pHは、リン酸塩、琥珀酸塩、アミノ酸またはこれらの
混合物を用いて調整した。
混合物を用いて調整した。
0.5■MGF/ 0.5 mlを含むバイアルを調製
しそして凍結乾燥した。
しそして凍結乾燥した。
以下余白
側8:MJL!昏
活性物質(MGF)1.0・to−5gメチルセルロー
ス 0.8 g炭酸カルシウム
30.0 gコロイド状シリカ
3.0g軽質液状パラフィン 2.0g
グリセリン 20.0 g甘味側 芳香剤 防腐剤 脱イオン水で 総重量を1.OOQgとした。
ス 0.8 g炭酸カルシウム
30.0 gコロイド状シリカ
3.0g軽質液状パラフィン 2.0g
グリセリン 20.0 g甘味側 芳香剤 防腐剤 脱イオン水で 総重量を1.OOQgとした。
粉末を脱イオン水、パラフィンおよびグリセリンの一部
を含むメチルセルロースと活性物質の混合物を用いて湿
潤させた。この添加物を溶液に加えた。残りの水を調合
した後、ペーストを均一化した。
を含むメチルセルロースと活性物質の混合物を用いて湿
潤させた。この添加物を溶液に加えた。残りの水を調合
した後、ペーストを均一化した。
以下のプロトコールは、本発明の組成物がイン。
ビポで有効であり、かつMGFが交雑種に使用し得るこ
とを示す。
とを示す。
以下余白
プロトコール■、10カ マウスの 止ユウシMGF
のイン・ビボ活性は、Zimmerli等、(19B2
) J、Infect、Dis、 皿487および5p
orn、 M。
のイン・ビボ活性は、Zimmerli等、(19B2
) J、Infect、Dis、 皿487および5p
orn、 M。
B1等、(1983)Science 219:132
9に記載されているプロトコールに基づき方法により測
定した。
9に記載されているプロトコールに基づき方法により測
定した。
それぞれに約250個の一定の間隔を保つ穴(径1mm
)により穴があけられており、そして両端が同質の材料
の蓋で密閉された中空の硬質ポリメチルアクリレートま
たはポリテトラフルオロエチレンチューブ(内径および
外径がそれぞれ10および12閣、長さが32肛)を、
ガス滅菌し十分麻酔をかけたウィスター・ラット(約1
0カ月令)の背面脇腹の対称性のある皮下に外科的に挿
入した。−のガス殺菌ケージを各々の脇腹に移植し、切
開部を金属性クリップで閉じ、そのケージを術後5日目
に取り出した。挿入処理後、そのケージは繊維性の結合
組織で包囲されてくるが、ケージそれ自体の内部には相
当する細胞が存在しなかった。従って、このモデルは、
傷の癒合を定量することができるなにものち存在せず、
限定されそしく70) て包囲された空間を我々に提供する。これらのラットを
切開部が十分に癒合し、そして組織ケージの移植後2週
目に試験に用いた。このとき、MGF(0,l+nf、
滅菌ヒスチジン緩衝溶液(HBS)10.5%の「に1
ucel O」ビヒクル緩衝液〕を、左側のケージ内部
(チェンバーA)に向けて連日注入を開始した。1日量
は、それぞれチェンバー当り1000゜100または1
0ngのMGFであった。MGFの比活性は、Ba1b
/c 3T3繊維芽細胞を用いる量応答アッセイにより
測定した場合に1■当り約107単位であった。
)により穴があけられており、そして両端が同質の材料
の蓋で密閉された中空の硬質ポリメチルアクリレートま
たはポリテトラフルオロエチレンチューブ(内径および
外径がそれぞれ10および12閣、長さが32肛)を、
ガス滅菌し十分麻酔をかけたウィスター・ラット(約1
0カ月令)の背面脇腹の対称性のある皮下に外科的に挿
入した。−のガス殺菌ケージを各々の脇腹に移植し、切
開部を金属性クリップで閉じ、そのケージを術後5日目
に取り出した。挿入処理後、そのケージは繊維性の結合
組織で包囲されてくるが、ケージそれ自体の内部には相
当する細胞が存在しなかった。従って、このモデルは、
傷の癒合を定量することができるなにものち存在せず、
限定されそしく70) て包囲された空間を我々に提供する。これらのラットを
切開部が十分に癒合し、そして組織ケージの移植後2週
目に試験に用いた。このとき、MGF(0,l+nf、
滅菌ヒスチジン緩衝溶液(HBS)10.5%の「に1
ucel O」ビヒクル緩衝液〕を、左側のケージ内部
(チェンバーA)に向けて連日注入を開始した。1日量
は、それぞれチェンバー当り1000゜100または1
0ngのMGFであった。MGFの比活性は、Ba1b
/c 3T3繊維芽細胞を用いる量応答アッセイにより
測定した場合に1■当り約107単位であった。
別の試験を開始しない限り、MGF活性を活性化するた
めに、少量(20ng)のラットEGFをすべてのMG
F注入液に含ませた。右側の対何チェンバー(チェンバ
ーB)を、製薬対照として用い、緩衝液媒体単独か、ま
たは総タンパクが左側チェンバーに注入されたMGF量
と等しくなるような量のウシ血清アルブミン(BSA)
を含ませた緩衝液媒を注入した。注入は5日間で1日行
い、すべての注入物は滅菌、内毒素除去および発熱物除
去を行った。注入の最後のシリーズ後の6時間目にラッ
トを殺した後、無菌的にすべてのチェンバーを動物から
取り出した。チェンバー内の繊維状物質を「湿った」状
態で目方を量り、希薄なチェンバー流体中の総タンパク
をLoivry等の方法(J、Bio、Chem、 1
93,265)1951) )で測定した。チェンバー
内容物の無菌性は、プレイン/ハート(Bratn/)
Ieart)インフュージョン板上でサンプルを37°
Cで72時間インキュベーションしてチエツクした。デ
ータの統計学的な解析は、チェンバーの対応する対(A
対B)の比較によって行った。
めに、少量(20ng)のラットEGFをすべてのMG
F注入液に含ませた。右側の対何チェンバー(チェンバ
ーB)を、製薬対照として用い、緩衝液媒体単独か、ま
たは総タンパクが左側チェンバーに注入されたMGF量
と等しくなるような量のウシ血清アルブミン(BSA)
を含ませた緩衝液媒を注入した。注入は5日間で1日行
い、すべての注入物は滅菌、内毒素除去および発熱物除
去を行った。注入の最後のシリーズ後の6時間目にラッ
トを殺した後、無菌的にすべてのチェンバーを動物から
取り出した。チェンバー内の繊維状物質を「湿った」状
態で目方を量り、希薄なチェンバー流体中の総タンパク
をLoivry等の方法(J、Bio、Chem、 1
93,265)1951) )で測定した。チェンバー
内容物の無菌性は、プレイン/ハート(Bratn/)
Ieart)インフュージョン板上でサンプルを37°
Cで72時間インキュベーションしてチエツクした。デ
ータの統計学的な解析は、チェンバーの対応する対(A
対B)の比較によって行った。
第1表は、5日間のMGF連日注入が、凝集処理のみを
施された右側の対何対照チェンバーに比較されるように
、左側のチェンバー中の総繊維状物質の蓄積を投与量に
対応して明らかに高めた(ほぼ3倍)ことを示す(試験
1〜3)。
施された右側の対何対照チェンバーに比較されるように
、左側のチェンバー中の総繊維状物質の蓄積を投与量に
対応して明らかに高めた(ほぼ3倍)ことを示す(試験
1〜3)。
活性化剤としてのEGFを投与したとしても、関連する
チェンバー中に見出される総繊維状物質のレベルにおい
て、そのもの単独では全く有意な効果を示さなかった(
試験4)。また、MGFは、凝集処理のみが施された対
何の右側のチェンバーに比較されるように、左側のチェ
ンバー中の漿液性流体タンパクの総量を有意に高めた(
試験1〜3)。さらに、EGFは関連するチェンバー中
の漿液性流体タンパクの総量に対するレベルにおいても
、単独では効果が小さい(試験4)。
チェンバー中に見出される総繊維状物質のレベルにおい
て、そのもの単独では全く有意な効果を示さなかった(
試験4)。また、MGFは、凝集処理のみが施された対
何の右側のチェンバーに比較されるように、左側のチェ
ンバー中の漿液性流体タンパクの総量を有意に高めた(
試験1〜3)。さらに、EGFは関連するチェンバー中
の漿液性流体タンパクの総量に対するレベルにおいても
、単独では効果が小さい(試験4)。
以−ド余白
試験の末期での解剖生検では、対応する対の対照チェン
バーよりもMGF処理チェンバーが体壁の周りの結合組
織に対してより親和性をもって固定されていること、そ
してMGF処理チェンバーの近隣の繊維状物質の厚さは
関連の対応する対照チェンバーの周りのものよりもはる
かに大きいことが一貫して観察された。この観察は、M
GFの作用が関連するチェンバーの近隣では顕性である
ことも示唆するであろう。試験4では、チェンバーの周
りの繊維状物質の厚さにまったく差違がないことが観察
された。また、これの対何チェンバーが対照に対して少
しの増加に左右されることを示すのは、MGFの循環を
通してこのチェンバーに伝達されることで説明されるで
あろう。
バーよりもMGF処理チェンバーが体壁の周りの結合組
織に対してより親和性をもって固定されていること、そ
してMGF処理チェンバーの近隣の繊維状物質の厚さは
関連の対応する対照チェンバーの周りのものよりもはる
かに大きいことが一貫して観察された。この観察は、M
GFの作用が関連するチェンバーの近隣では顕性である
ことも示唆するであろう。試験4では、チェンバーの周
りの繊維状物質の厚さにまったく差違がないことが観察
された。また、これの対何チェンバーが対照に対して少
しの増加に左右されることを示すのは、MGFの循環を
通してこのチェンバーに伝達されることで説明されるで
あろう。
組織学上の調製物は、試験1〜3におけるMGF処置左
側チェンバーの周りの高められた組織の厚さの程度およ
び血管が多(なっていることを明らかにし、しかも各チ
ェンバーの内側の繊維性顆粒形成組織の内容物の中で繊
維細胞の増殖が生じていることを明らかにした。差違と
して、右側の対照チェンバー中では多形核白血球のわず
かな優勢が示され、試験1〜3のMGFが施された左側
のチェンバー中ではマクロファージの個体群の優勢が示
されるといえ、処置チェンバーと対照チェンバーのいず
れの漿液性流体中にも炎症細胞の無菌的な浸潤が見られ
る。試験1〜4のすべての40個のチェンバーの内容物
は、各チェンバーの内容物をプレイン・ハート・インフ
ュージョン上で72時間37°Cでインキュベーション
した後に無菌であることを確認した。
側チェンバーの周りの高められた組織の厚さの程度およ
び血管が多(なっていることを明らかにし、しかも各チ
ェンバーの内側の繊維性顆粒形成組織の内容物の中で繊
維細胞の増殖が生じていることを明らかにした。差違と
して、右側の対照チェンバー中では多形核白血球のわず
かな優勢が示され、試験1〜3のMGFが施された左側
のチェンバー中ではマクロファージの個体群の優勢が示
されるといえ、処置チェンバーと対照チェンバーのいず
れの漿液性流体中にも炎症細胞の無菌的な浸潤が見られ
る。試験1〜4のすべての40個のチェンバーの内容物
は、各チェンバーの内容物をプレイン・ハート・インフ
ュージョン上で72時間37°Cでインキュベーション
した後に無菌であることを確認した。
プロトコール
紅:
傷の癒合作用が年令が高まるにつれて低下してくること
は長い間に注目の当であったが、はんの最近試験され(
Grove,G.L.(1982) Arch.Der
matol。
は長い間に注目の当であったが、はんの最近試験され(
Grove,G.L.(1982) Arch.Der
matol。
Res.27肚381 ) 、そしてこのことが老年医
学の医薬に多くの問題を提起した。従って、傷の癒合環
境の部分的な欠除または低下(即ち、老令の動物)にお
ける部分的肥大性の傷(第2度の火傷による)を用い、
そしてSchultz+G.S.等、(1987) S
cience23虹350に記載の方法に従い、傷の癒
合応答に対するウシMGFの作用を研究することを決意
した。
学の医薬に多くの問題を提起した。従って、傷の癒合環
境の部分的な欠除または低下(即ち、老令の動物)にお
ける部分的肥大性の傷(第2度の火傷による)を用い、
そしてSchultz+G.S.等、(1987) S
cience23虹350に記載の方法に従い、傷の癒
合応答に対するウシMGFの作用を研究することを決意
した。
背中を予め剃りそして市販のクリームタイプの脱毛剤で
脱毛し、麻酔をかけた老令の(480〜600日令)
C57/BL6マウスを、湯浴で80°Cにした真鍮黄
銅の型板(IXlcm、8g)で10秒間個々に処置す
ることにより、それぞれに中程度の熱損傷を与えた。生
じた庖疹を外科的に除去し、次いでこの火傷を一定した
少量(20ng)のマウスEGFの存在下で各量のMG
Fを含有(500ng. 100ngまたはLong
; M G Fの比活性は、Balb/c 3T3繊維
芽細胞を用いる投与量応答アッセイにより測定した場合
に1 mg当り約107単位であった)する25mの滅
菌賦形薬で局所的に5日間連日処置するか未処置のまま
残した。局所投与用のすべての材料は、滅菌、内毒素除
去および発熱物質除去したものであり、そして試験の期
間を通じてすべてのマウスを個々のケージに入れた。
脱毛し、麻酔をかけた老令の(480〜600日令)
C57/BL6マウスを、湯浴で80°Cにした真鍮黄
銅の型板(IXlcm、8g)で10秒間個々に処置す
ることにより、それぞれに中程度の熱損傷を与えた。生
じた庖疹を外科的に除去し、次いでこの火傷を一定した
少量(20ng)のマウスEGFの存在下で各量のMG
Fを含有(500ng. 100ngまたはLong
; M G Fの比活性は、Balb/c 3T3繊維
芽細胞を用いる投与量応答アッセイにより測定した場合
に1 mg当り約107単位であった)する25mの滅
菌賦形薬で局所的に5日間連日処置するか未処置のまま
残した。局所投与用のすべての材料は、滅菌、内毒素除
去および発熱物質除去したものであり、そして試験の期
間を通じてすべてのマウスを個々のケージに入れた。
MGF処置の5日後、マウスに麻酔をかけ、火傷から庖
疹(もし存在するならば)を外科的に除去し、次いで火
傷部の写真をとった。均一な厚さのプラスチックフィル
ム(「スコッチ」■オーバーヘッドプロジェクター用フ
ィルム)上に再生した上皮を有する火傷の領域の輪郭を
描き、癒合した当初の火傷面積にパーセンテージをパラ
−メーターで測定した。結果を、試験の期間中処置しな
いままの同様な中程度の火傷を有する若い(56〜84
日令) C57/BL6マウスにおける上皮の再生具合
とも比較した。すべてのマウスは個々のケージに入れら
れ、そして試験群は1グループ当り5匹のマウスから成
っている。
疹(もし存在するならば)を外科的に除去し、次いで火
傷部の写真をとった。均一な厚さのプラスチックフィル
ム(「スコッチ」■オーバーヘッドプロジェクター用フ
ィルム)上に再生した上皮を有する火傷の領域の輪郭を
描き、癒合した当初の火傷面積にパーセンテージをパラ
−メーターで測定した。結果を、試験の期間中処置しな
いままの同様な中程度の火傷を有する若い(56〜84
日令) C57/BL6マウスにおける上皮の再生具合
とも比較した。すべてのマウスは個々のケージに入れら
れ、そして試験群は1グループ当り5匹のマウスから成
っている。
以下余白
第1表(マウス、480目令以上)
4 老令 +20ng EGF D
78±55 老令 賦形剤 E 91
±56 老令 未処置 F 90±
67 若年 未処置 G 36±7
第2表は面積測定分析の結果を示し、少量のマウスEC
,Fの存在下で適当な賦形剤中に含ませたMGFの5日
間連日局所投与は、EGF単独、賦形剤単独または未処
置の傷を有するもの(それぞれ試験4〜6)と比較した
場合に、投与量に応じた態様で老令マウスの上皮の再生
を促進しかつ活性化することを示しく試験1〜3)た。
78±55 老令 賦形剤 E 91
±56 老令 未処置 F 90±
67 若年 未処置 G 36±7
第2表は面積測定分析の結果を示し、少量のマウスEC
,Fの存在下で適当な賦形剤中に含ませたMGFの5日
間連日局所投与は、EGF単独、賦形剤単独または未処
置の傷を有するもの(それぞれ試験4〜6)と比較した
場合に、投与量に応じた態様で老令マウスの上皮の再生
を促進しかつ活性化することを示しく試験1〜3)た。
一方、若いマウスはいずれのMGF投与処置をしなくて
も、それらの傷を首尾よく再上皮化するに足りる適応能
を有することが明らかとなった(試験7)。
も、それらの傷を首尾よく再上皮化するに足りる適応能
を有することが明らかとなった(試験7)。
この一連の試験における実験的に誘発した傷の組織学的
な解析は、上皮の基底(発芽)層までへの傷の伸展(お
よび可能性を含む)を示した。鉛直方向と側方平面とへ
の細胞の分裂および移動を含む工程での第一の癒合によ
る前記のような傷の癒合は、再生上皮の肥厚または角化
症を後に誘発するだけでなく傷の再上皮化および再閉鎖
をもたらす。また、組織学的解析は、MGFで処置した
動物(試験1〜3)におけるこの再生上皮化の進行の促
進(または活性化)の伸展を示したが、対照群(試験4
〜6)のいずれも新規な上皮がほとんど存在しないこと
を示した。一方、若い動物は、それらの傷の顕著な再上
皮化を示した(試験7)。
な解析は、上皮の基底(発芽)層までへの傷の伸展(お
よび可能性を含む)を示した。鉛直方向と側方平面とへ
の細胞の分裂および移動を含む工程での第一の癒合によ
る前記のような傷の癒合は、再生上皮の肥厚または角化
症を後に誘発するだけでなく傷の再上皮化および再閉鎖
をもたらす。また、組織学的解析は、MGFで処置した
動物(試験1〜3)におけるこの再生上皮化の進行の促
進(または活性化)の伸展を示したが、対照群(試験4
〜6)のいずれも新規な上皮がほとんど存在しないこと
を示した。一方、若い動物は、それらの傷の顕著な再上
皮化を示した(試験7)。
’ MGF 1100n、 MGF 1100nおよび
EGF 1100nの混合物、EGF 1100n単独
、賦形剤単独、未処置の老令マウスおよび未処置の若い
マウスによる同様な試験の結果を第3表にまとめた。
EGF 1100nの混合物、EGF 1100n単独
、賦形剤単独、未処置の老令マウスおよび未処置の若い
マウスによる同様な試験の結果を第3表にまとめた。
以下余白
1じし表
1 老令 1100n MGF 46±9
3 老令 1100n EGF 76±9
4 老令 賦形剤単独 78±55 老令
未処置 81±96 若年 未処置
34±5第3表は、EGFの存在下または不存在
下でMGFを含む粘性賦形剤により5日間連日処置した
老令のC57BL/6Jマウスの各群における部分的肥
厚性火傷の上皮での再生を示す。各群は5匹の動物から
成る。示した値は、各傷に対する3種の独立した評価範
囲と意義を有する。
3 老令 1100n EGF 76±9
4 老令 賦形剤単独 78±55 老令
未処置 81±96 若年 未処置
34±5第3表は、EGFの存在下または不存在
下でMGFを含む粘性賦形剤により5日間連日処置した
老令のC57BL/6Jマウスの各群における部分的肥
厚性火傷の上皮での再生を示す。各群は5匹の動物から
成る。示した値は、各傷に対する3種の独立した評価範
囲と意義を有する。
プロトコール■ の にお番る の・、入:
1同一品種の2匹の健康な「若い」牝豚(2〜3月
令月俸;25〜30kg)と共に、2匹の「老令」の牝
豚(7〜8才;体重250〜300kg )を選び、そ
れらの傷を舐めたり傷の上に横たわることを防ぐため試
験の間中堅牢な固定枠に分離して繋いだ。
1同一品種の2匹の健康な「若い」牝豚(2〜3月
令月俸;25〜30kg)と共に、2匹の「老令」の牝
豚(7〜8才;体重250〜300kg )を選び、そ
れらの傷を舐めたり傷の上に横たわることを防ぐため試
験の間中堅牢な固定枠に分離して繋いだ。
豚はそれらの通常の寿命が終わる前に一般に処分される
(稀には4年以上の長期に渡って育種条件下に維持され
る牝豚もいる)ので、種および品種における平均寿命は
知られていないが、10年目に子を生みそして15〜2
0才に達していることが知られている牝豚を実験動物と
して維持した。豚は、上皮の構造、形態および細胞の代
謝回転速度がヒトに類似するので、ヒトの局所的な肥厚
性の傷に対する適当なモデルとして選んだ。
(稀には4年以上の長期に渡って育種条件下に維持され
る牝豚もいる)ので、種および品種における平均寿命は
知られていないが、10年目に子を生みそして15〜2
0才に達していることが知られている牝豚を実験動物と
して維持した。豚は、上皮の構造、形態および細胞の代
謝回転速度がヒトに類似するので、ヒトの局所的な肥厚
性の傷に対する適当なモデルとして選んだ。
傷つける前にすべての動物は毛を剃り、市販の脱毛クリ
ームで脱毛した。
ームで脱毛した。
豚には、十分な麻酔を施した後複数の傷を付けた。麻酔
は、鎮静剤としてアザペロン(Azaperone)(
STRESNYL O、Janssen、 Beers
e、 BelgiumH1mg −kg−’)を耳の中
央の静脈を介して各豚に静脈投与し、その20分後に同
じ投与経路によって塩酸メトミデート(Metomid
ate Hydrochloride)(HYPNOD
ILL■。
は、鎮静剤としてアザペロン(Azaperone)(
STRESNYL O、Janssen、 Beers
e、 BelgiumH1mg −kg−’)を耳の中
央の静脈を介して各豚に静脈投与し、その20分後に同
じ投与経路によって塩酸メトミデート(Metomid
ate Hydrochloride)(HYPNOD
ILL■。
Janssen;Beerse、Belgium;4m
g Hkg−’ )を投与した。
g Hkg−’ )を投与した。
湯浴で真鍮黄銅の型板(3■3cm;78g)を90°
Cに熱して、各豚の脱毛した背側の皮膚表面に正確に1
0秒間しっかりと接触して多数の局所的な肥厚性の火傷
を誘発し、そして生じた庖疹を除去した。
Cに熱して、各豚の脱毛した背側の皮膚表面に正確に1
0秒間しっかりと接触して多数の局所的な肥厚性の火傷
を誘発し、そして生じた庖疹を除去した。
老令豚の背側の胸郭上の複数の局所的な肥厚性の火傷を
、それぞれMGF(4,5N、0.9眉もしくは0.4
5■)、EC;F (4,5硝、0.9■もしくは0.
45■)または再考の等量組み合わせ物(MGF 4.
5x+EGF4.5Ng、 MGFo、9Jrg+t!
GF0.9i 、 MGF 0.45g+EGF 0.
45x)を含有する賦形剤225Iで9日間連日処置し
た。これらの投与量は、前記の試験でマウスに施したの
と同様に、傷表面積の1 afl当り同じ量の薬剤が豚
に施せるように選んだ。各動物における対照としては、
賦形剤単独処置するかまたは未処置のまま残した。さら
なる対照としては、同様な単一の局所的な肥厚性の火傷
を施した若い豚を試験の期間を通じて未処置のまま放置
したものである。各火傷に対する再生上皮の程度は、1
0日口の面積測定および限定した量の生検標本の組織学
的試験によって評価した。
、それぞれMGF(4,5N、0.9眉もしくは0.4
5■)、EC;F (4,5硝、0.9■もしくは0.
45■)または再考の等量組み合わせ物(MGF 4.
5x+EGF4.5Ng、 MGFo、9Jrg+t!
GF0.9i 、 MGF 0.45g+EGF 0.
45x)を含有する賦形剤225Iで9日間連日処置し
た。これらの投与量は、前記の試験でマウスに施したの
と同様に、傷表面積の1 afl当り同じ量の薬剤が豚
に施せるように選んだ。各動物における対照としては、
賦形剤単独処置するかまたは未処置のまま残した。さら
なる対照としては、同様な単一の局所的な肥厚性の火傷
を施した若い豚を試験の期間を通じて未処置のまま放置
したものである。各火傷に対する再生上皮の程度は、1
0日口の面積測定および限定した量の生検標本の組織学
的試験によって評価した。
第4表に面積測定解析の結果を示す。未処置の傷の正常
な再生上皮化は、10日の試験期間経過後では老令のも
の(処置11)より若い豚(処置12)において著しく
優れていた。先の試験のように、MGFの連日局所投与
は、EGFの存在下または不存在下のいずれにおいても
(処置1〜6)、未処置の傷を有する若い動物(処置1
2)に見られるものに似た再生上皮化のレベルと同程度
で、老令の動物における傷の修復の進展を著しく改善し
た。火傷面積の1d当り100〜500ng濃度の間で
の賦形剤単独(処置10)またはEGF単独(処置7〜
9)の連日投与は、老令の豚の再生上皮化の進展につい
てわずかな効果を有するにすぎない。
な再生上皮化は、10日の試験期間経過後では老令のも
の(処置11)より若い豚(処置12)において著しく
優れていた。先の試験のように、MGFの連日局所投与
は、EGFの存在下または不存在下のいずれにおいても
(処置1〜6)、未処置の傷を有する若い動物(処置1
2)に見られるものに似た再生上皮化のレベルと同程度
で、老令の動物における傷の修復の進展を著しく改善し
た。火傷面積の1d当り100〜500ng濃度の間で
の賦形剤単独(処置10)またはEGF単独(処置7〜
9)の連日投与は、老令の豚の再生上皮化の進展につい
てわずかな効果を有するにすぎない。
生検標本の光学顕微鏡観察は、面積測定解析の結果を追
認し、そしてMGFで処置した(EGFの存在または不
存在を問わず)傷の再生上皮化を促進し、各偶の周りの
無傷の領域における上皮細胞層と薄い表皮がほとんど相
異しないものから成ることを明らかにした。新たに再生
した上皮においてなんらの異形成の可視的な証拠は存在
しないが、各偶の周界ではマウスのすべての群で角化症
が生じたのとはわずかに相違がある。他の一般的な観察
では、MCFで処置した(EGFの存在または不存在を
問わず)傷は、未処置のままか、またはEGF単独もし
くは賦形剤単独処置を施した傷よりも、新たな再生上皮
の主に下方に、より多く顆粒組織を含むことが明らかに
なった。−船釣に、同様な観察結果が、豚の試験から人
手し得る制限された量の生検標本中では見られたが、老
令の動物における傷の周りの無傷の表皮の外観上の構造
は、若い動物に特徴的であるよく解明されている多層配
置によく偵ている。
認し、そしてMGFで処置した(EGFの存在または不
存在を問わず)傷の再生上皮化を促進し、各偶の周りの
無傷の領域における上皮細胞層と薄い表皮がほとんど相
異しないものから成ることを明らかにした。新たに再生
した上皮においてなんらの異形成の可視的な証拠は存在
しないが、各偶の周界ではマウスのすべての群で角化症
が生じたのとはわずかに相違がある。他の一般的な観察
では、MCFで処置した(EGFの存在または不存在を
問わず)傷は、未処置のままか、またはEGF単独もし
くは賦形剤単独処置を施した傷よりも、新たな再生上皮
の主に下方に、より多く顆粒組織を含むことが明らかに
なった。−船釣に、同様な観察結果が、豚の試験から人
手し得る制限された量の生検標本中では見られたが、老
令の動物における傷の周りの無傷の表皮の外観上の構造
は、若い動物に特徴的であるよく解明されている多層配
置によく偵ている。
第1Jし (老令のブタ)
EGFの存在下または不存在下でMGFを含む粘性賦形
剤で9日間連日処置した2匹の老令の大きな白牝豚にお
ける局所的な肥厚性の火傷の上皮の再生を示す。示した
値は、各偶に対する3種の独立した評価範囲と意義を有
する。
剤で9日間連日処置した2匹の老令の大きな白牝豚にお
ける局所的な肥厚性の火傷の上皮の再生を示す。示した
値は、各偶に対する3種の独立した評価範囲と意義を有
する。
プロトコールI−mに示した結果は、イン・ビボにおい
て、例えば凝集や活性他剤単独で傷の癒合を活性化し、
かつ高める応答を誘発しないのにもかかわらず、MGF
は、第1義および第2義的な目的でも明らかに傷の癒合
を活性化し、かつ高めることができることを示した。
て、例えば凝集や活性他剤単独で傷の癒合を活性化し、
かつ高める応答を誘発しないのにもかかわらず、MGF
は、第1義および第2義的な目的でも明らかに傷の癒合
を活性化し、かつ高めることができることを示した。
TC96プレート・ウェル中イン・ビトロで2つの異種
のマウスに由来する白血球を共に混合(ウェル中の各棟
、2X105細胞、CBAリンパ球を「応答細胞」とし
、そして照射Ba1b/cリンパ球を「刺激細胞」とし
た)し、次いで72時間後の3H−チミジンの取り込み
による増殖応答を測定した。
のマウスに由来する白血球を共に混合(ウェル中の各棟
、2X105細胞、CBAリンパ球を「応答細胞」とし
、そして照射Ba1b/cリンパ球を「刺激細胞」とし
た)し、次いで72時間後の3H−チミジンの取り込み
による増殖応答を測定した。
結果:MGFの=xooopg −m−’が増殖の50
%阻害を惹起した。
%阻害を惹起した。
クローン T ア・・セイ(マウス):前もって抗原
でパルス処理したマウス腸腔マクロファージ(ウェル当
り2X105細胞)を有するTC96プレート・ウェル
中イン・ビトロで溶性抗原(チロシンのヒ素塩)に特異
的なマウスの長期培養T細胞クローン(ウェル当り10
5細胞)をインキュベーションした。72時間後に、T
細胞の増殖およびγ−インターフェロンの産生を測定し
た。
でパルス処理したマウス腸腔マクロファージ(ウェル当
り2X105細胞)を有するTC96プレート・ウェル
中イン・ビトロで溶性抗原(チロシンのヒ素塩)に特異
的なマウスの長期培養T細胞クローン(ウェル当り10
5細胞)をインキュベーションした。72時間後に、T
細胞の増殖およびγ−インターフェロンの産生を測定し
た。
結果:MGFの! soopg −mZ−’が増殖およ
びINF−γの放出双方の50%阻害を惹起した。
びINF−γの放出双方の50%阻害を惹起した。
マ スの1ンパ ア・・セイ:
リボ多糖(LPS、ウェル当り2.5 n )を用いて
、TC96プレート・ウェル中イン・ビトロで感作して
いないマウスリンパ球(ウェル当り105細胞)を刺激
し、72時間後の3H−チミジンの取り込みによる増殖
応答を測定した。
、TC96プレート・ウェル中イン・ビトロで感作して
いないマウスリンパ球(ウェル当り105細胞)を刺激
し、72時間後の3H−チミジンの取り込みによる増殖
応答を測定した。
結果:MGFの=1000pg −mZ−’が本アッセ
イにおける増殖の50%阻害を惹起した。
イにおける増殖の50%阻害を惹起した。
ヒトのTリンパ′ア・・セイ:
それぞれa)植物凝集素(フォトへマグルチニン) A
(PHA、 0.5%)、b)アンチ−T3抗原十ホ
ルボールエステル(PDBu、 lng mf−’)
、またはC)イオノマイシン(tonomycin)
(0,25gm1’−’)十PDBu (10ngm1
−’)を用いて、TC96ブレート・ウェル中イン・ビ
トロで感作していないヒトTリンパ球(ウェル当り10
5細胞)を刺激した。72時間後に、3H−チミジンの
取り込みによる増殖応答を測定した。
(PHA、 0.5%)、b)アンチ−T3抗原十ホ
ルボールエステル(PDBu、 lng mf−’)
、またはC)イオノマイシン(tonomycin)
(0,25gm1’−’)十PDBu (10ngm1
−’)を用いて、TC96ブレート・ウェル中イン・ビ
トロで感作していないヒトTリンパ球(ウェル当り10
5細胞)を刺激した。72時間後に、3H−チミジンの
取り込みによる増殖応答を測定した。
結果:a)MGFの=lQpgmj−’が増殖の50%
阻害を惹起した。
阻害を惹起した。
b)MGFの=1pgm!−’が増殖の50%阻害を惹
起した。
起した。
c)MGFの! 10 pgml−’が増殖の50%阻
害を惹起した。
害を惹起した。
ヒトT1ンパ ア・・セイ:
特異性抗原テタヌス毒素を用いて、TC96プレート・
ウェル中イン・ビトロで新鮮な単離ヒトTリンパ球(ウ
ェル当り105細胞)を刺激し、3H−チミジンの取り
込みによる増殖応答を測定した。
ウェル中イン・ビトロで新鮮な単離ヒトTリンパ球(ウ
ェル当り105細胞)を刺激し、3H−チミジンの取り
込みによる増殖応答を測定した。
結果二MGFの=5Qpgml−’が増殖の50%阻害
を惹起した。
を惹起した。
クローン T )ア・・セイ ヒト
a)予め抗原を加えた同種ヒト単球(ウェル当り105
細胞)、または b)エプスタイン・バールウィルス(EBV)で形質転
換したB細胞株に由来する同種細胞(ウェル当り8X1
0’細胞)と共に、TC96プレート・ウェル中イン・
ビトロで溶性抗原〔ミコバクテリア(PPD)に由来す
る精製タンパク〕に特異的なヒト長期培養T細胞クロー
ン(T4” /T8− )(ウェル当り2X10’細胞
)をインキュベーションした。
細胞)、または b)エプスタイン・バールウィルス(EBV)で形質転
換したB細胞株に由来する同種細胞(ウェル当り8X1
0’細胞)と共に、TC96プレート・ウェル中イン・
ビトロで溶性抗原〔ミコバクテリア(PPD)に由来す
る精製タンパク〕に特異的なヒト長期培養T細胞クロー
ン(T4” /T8− )(ウェル当り2X10’細胞
)をインキュベーションした。
72時間後に3H−チミジンの取り込みによる増殖応答
を測定した。
を測定した。
結果:a)MGFの=500 pgmZ−’が増殖の5
0%阻害を惹起した。
0%阻害を惹起した。
b)MGFの=lQpgmZ−’が増殖の50%阻害を
惹起した。
惹起した。
ヒトConAリンパ・の142−2沃
組み換えインターロイキン2 (rIj2−2.3また
は9Hgmf−’)の存在下に、TC96プレート・ウ
ェル中イン・ビトロでヒト・コンカナバリンA(Con
A)リンパ球(ウェル当り104細胞)をインキュベー
ションし、96時間後の3H−チミジンの取り込みによ
る増殖応答を測定した。
は9Hgmf−’)の存在下に、TC96プレート・ウ
ェル中イン・ビトロでヒト・コンカナバリンA(Con
A)リンパ球(ウェル当り104細胞)をインキュベー
ションし、96時間後の3H−チミジンの取り込みによ
る増殖応答を測定した。
結果:MGFの=o、t pgml−’が増殖の50%
阻害を惹起した。
阻害を惹起した。
ヒトTリンパ のIf−4抹
組み換えインターロイキン4 (rRl−4,10ng
mZ−’)を加えたPDBu (10ngmf−’)の
存在下に、TC96プレート・ウェル中イン・ビトロで
感作していないヒトTリンパ球(793%T3”)(ウ
ェル当り105細胞)をインキュベーションし、96時
間後の3H−チミジンの取り込みによる増殖応答を測定
した。
mZ−’)を加えたPDBu (10ngmf−’)の
存在下に、TC96プレート・ウェル中イン・ビトロで
感作していないヒトTリンパ球(793%T3”)(ウ
ェル当り105細胞)をインキュベーションし、96時
間後の3H−チミジンの取り込みによる増殖応答を測定
した。
結果:MGFの=500 pgml−’が増殖の50%
阻害を惹起した。
阻害を惹起した。
プロトコールV ′ c)k =ハプテンと担
体の抱合体〔ジニトロフェニル−ニワトリγ−グロブリ
ン(DNP−CGG) 、マウス当り200pg〕でマ
ウスをイン・ビボ感作した。2ケ月後、多量の抗ハプテ
ン(DNP)を用いてTC96プレート・ウェル中イン
・ビトロで、肺臓細胞を攻撃した。4日後、シャーン(
Jerne)プラーク試験により抗ハプテン(DNP)
抗体形成細胞数を測定した。
体の抱合体〔ジニトロフェニル−ニワトリγ−グロブリ
ン(DNP−CGG) 、マウス当り200pg〕でマ
ウスをイン・ビボ感作した。2ケ月後、多量の抗ハプテ
ン(DNP)を用いてTC96プレート・ウェル中イン
・ビトロで、肺臓細胞を攻撃した。4日後、シャーン(
Jerne)プラーク試験により抗ハプテン(DNP)
抗体形成細胞数を測定した。
結果:MGFの! 50 pgml−’が抗体形成り細
胞の50%阻害を惹起した。また、 MGFの=1000pgm!−’が増殖の50%阻害を
惹起した。
胞の50%阻害を惹起した。また、 MGFの=1000pgm!−’が増殖の50%阻害を
惹起した。
各種の濃度のMGFを用いTC96プレートで付着性ヒ
ト単球を24時間刺激した。単球を一度洗浄した後、メ
ラノーマA375標的細胞を添加した。対照は、マクロ
ファージおよび腫瘍細胞単独ならびに標的細胞を有する
刺激していないマクロアージ、Klucel溶媒(プロ
トコールI参照)およびMAF標準の混合物を含んでい
る。
ト単球を24時間刺激した。単球を一度洗浄した後、メ
ラノーマA375標的細胞を添加した。対照は、マクロ
ファージおよび腫瘍細胞単独ならびに標的細胞を有する
刺激していないマクロアージ、Klucel溶媒(プロ
トコールI参照)およびMAF標準の混合物を含んでい
る。
72時間インキュベーション後、細胞の単層を一度洗浄
し、固定化し、次いでクリスタル紫を用いて15分間染
色した。即座に結合していない染料を洗い出した。酢酸
で残存する染色細胞を溶解し、オリベラティ(Oliv
etti)M24PCを装備したマルチスキャン−8・
チャネル光度計(Multiskan−8Channe
l Photometer)を用いて590聴における
ODを測定し、試験化合物の活性を算出した。データは
ED、。とじて示した。
し、固定化し、次いでクリスタル紫を用いて15分間染
色した。即座に結合していない染料を洗い出した。酢酸
で残存する染色細胞を溶解し、オリベラティ(Oliv
etti)M24PCを装備したマルチスキャン−8・
チャネル光度計(Multiskan−8Channe
l Photometer)を用いて590聴における
ODを測定し、試験化合物の活性を算出した。データは
ED、。とじて示した。
結果:MGF処置は、腫瘍細胞溶解活性に対する単球を
刺激した。そのED3゜値は、0.17±0.14ng
・−一1濃度(n−4試験体)で見出された。X1uc
el対照は活性でなかった。
刺激した。そのED3゜値は、0.17±0.14ng
・−一1濃度(n−4試験体)で見出された。X1uc
el対照は活性でなかった。
ミエローマA375 の にt るTC96プレ
ート中で5%のFe2を加えたC−RPMI培地でMG
Fを希釈した。対照は培地単独およびKlucel (
Klucel 50 triにMGF 1100nを溶
解し、次いで5%のFe2を加えたC−RPMI培地で
希釈した)。
ート中で5%のFe2を加えたC−RPMI培地でMG
Fを希釈した。対照は培地単独およびKlucel (
Klucel 50 triにMGF 1100nを溶
解し、次いで5%のFe2を加えたC−RPMI培地で
希釈した)。
各ウェルにA375標的細胞1.2 XIO’を添加し
た。
た。
5%OCO□中37℃で72時間インキュベーションし
た後、^375腫瘍細胞の単層を染色し、MAFアッセ
イについて記載したのと同様に細胞毒性活性を算出した
。
た後、^375腫瘍細胞の単層を染色し、MAFアッセ
イについて記載したのと同様に細胞毒性活性を算出した
。
結果:MGFは、メラノーマA375腫瘍細胞の増殖に
対して細胞毒性を示した。そのED、。値は、0.18
±0.12ng−m! −’濃度(n=4試験体)で見
出された。
対して細胞毒性を示した。そのED、。値は、0.18
±0.12ng−m! −’濃度(n=4試験体)で見
出された。
これらの試験は、腫瘍細胞に対する単球を刺激するMG
F濃度と腫瘍細胞毒活性に向けられたMGF濃度が非常
に近似することを示す(0,17±0.14対0.18
±0.12)。
F濃度と腫瘍細胞毒活性に向けられたMGF濃度が非常
に近似することを示す(0,17±0.14対0.18
±0.12)。
1豊
別々のTC96プレート中でエストラジオール受容体を
有する2種のヒト癌腫細胞株0’ICF−7およびZR
−75−1)ならびに測定し得るエストラジオール受容
体が存在しないヒト癌腫細胞株(MDA−MB−231
)をウェル当り3〜6X103細胞濃度で接種し、Kl
ucel溶液(プロトコールI参照)における各種濃度
のMGFで刺激した。対照は、癌腫細胞単独およびKl
ucel溶液のみの存在下で培養した癌腫細胞を含む。
有する2種のヒト癌腫細胞株0’ICF−7およびZR
−75−1)ならびに測定し得るエストラジオール受容
体が存在しないヒト癌腫細胞株(MDA−MB−231
)をウェル当り3〜6X103細胞濃度で接種し、Kl
ucel溶液(プロトコールI参照)における各種濃度
のMGFで刺激した。対照は、癌腫細胞単独およびKl
ucel溶液のみの存在下で培養した癌腫細胞を含む。
限定した血清フリー条件下で8〜10日間インキュベー
ションした後、付着性細胞単層を洗浄し、次いで固定し
そしてクリスタル紫で15分間染色した。結合した染料
が核に対するものに限定されるまですべての未結合染料
を十分洗い出した。この技術は細胞増殖および分裂を測
定するための比色アッセイを提供する。オリベラティM
24PCを装備したマルチスキャン−8・チャネル光度
計を用い590nmで0.D、を測定し、試験期間を通
じて増殖する癌腫細胞上の試験化合物の活性を算出した
。
ションした後、付着性細胞単層を洗浄し、次いで固定し
そしてクリスタル紫で15分間染色した。結合した染料
が核に対するものに限定されるまですべての未結合染料
を十分洗い出した。この技術は細胞増殖および分裂を測
定するための比色アッセイを提供する。オリベラティM
24PCを装備したマルチスキャン−8・チャネル光度
計を用い590nmで0.D、を測定し、試験期間を通
じて増殖する癌腫細胞上の試験化合物の活性を算出した
。
結果:未処置の対照細胞に比較した場合、10−9〜1
0−l3M濃度のMGFで処置したエストラジオール依
存性細胞株(MCF−7およびZR−75−1の双方)
とエストラジオール非依存性細胞株(MD^−MB−2
31)ともその増殖が阻害された。このアッセイにおい
て、Klucel溶媒はすべての細胞株に対して効果を
示さなかった。
0−l3M濃度のMGFで処置したエストラジオール依
存性細胞株(MCF−7およびZR−75−1の双方)
とエストラジオール非依存性細胞株(MD^−MB−2
31)ともその増殖が阻害された。このアッセイにおい
て、Klucel溶媒はすべての細胞株に対して効果を
示さなかった。
第1図は、例1a)による陽イオン交換クロマトグラフ
ィーの結果を示し;第2図は、例tb)による疎水的相
互作用性クロマトグラフィー■の結果を示し;第3図は
、例1c)による疎水的相互作用性クロマトグラフィー
■の結果を示し;第4図は、例1d)による疎水的相互
作用性クロマトグラフィー■の結果を示し;そして第5
図は、例1e)によるサイズ排除クロマトグラフィーの
結果を示す。 なお、第1図〜第5図は、多様なりロフトグラフ処理工
程中のMGF精製の進捗状況を示す。表示は、各両分に
対する280nmにおける光学濃度(0,0,)の測定
による吸光度およびBijrk、 R,R,(1973
)Proc、Natl、Acad、Sci、USA 7
0+ 369の試験における移動活性である。
ィーの結果を示し;第2図は、例tb)による疎水的相
互作用性クロマトグラフィー■の結果を示し;第3図は
、例1c)による疎水的相互作用性クロマトグラフィー
■の結果を示し;第4図は、例1d)による疎水的相互
作用性クロマトグラフィー■の結果を示し;そして第5
図は、例1e)によるサイズ排除クロマトグラフィーの
結果を示す。 なお、第1図〜第5図は、多様なりロフトグラフ処理工
程中のMGF精製の進捗状況を示す。表示は、各両分に
対する280nmにおける光学濃度(0,0,)の測定
による吸光度およびBijrk、 R,R,(1973
)Proc、Natl、Acad、Sci、USA 7
0+ 369の試験における移動活性である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、乳汁または乳製品から入手でき、SDS−PAGE
による測定で約25kdの分子量を有しており、かつp
I9.0〜10.5の等電点を有することを特徴とする
乳成長因子(MGF)またはその塩。 2、10^3〜10^7倍の濃厚状態で乳汁から得られ
る請求項1記載の乳成長因子。 3、より低い分子量かまたはより高い分子量を有し、か
つ相違するpI値を有する乳汁中に見出されている他の
成長因子と実質的にフリーである請求項1記載の乳成長
因子あるいはその塩。 4、請求項1記載の実質的に純粋な乳成長因子。 5、次のアミノ酸組成 ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔但し、a)はペプチド1モル当たりのアミノ酸のモル
数であり、b)はペプチド1モル当たりのアミノ酸残基
を示す概数である〕を有する実質的に純粋な状態で存在
しており、かつ次式 【遺伝子配列があります】 (上式中、X^1^7およびX^1^8は未同定アミノ
酸を表す)で示されるN−末端アミノ酸配列を有するウ
シの乳汁から入手され得る請求項1記載の乳成長因子ま
たはその塩。 6、請求項1記載の乳成長因子の酸付加塩。 7、請求項1記載の乳成長因子の酢酸塩。 8、EGFの受容体にバインディングすることによりア
ゴニスト作用を奏するMGFおよびいずれかのポリペプ
チドの併用剤。 9、ほぼ等モル量で乳成長因子およびEGFを含んでな
る請求項8記載の相乗性併用剤。10、乳成長因子(M
GF)を含有する乳汁またはいずれかの乳製品からMG
Fを採取し、必要により得られたフリーのMGFを塩に
転化するかまたは得られた塩をフリーのMGFに転化す
ることを特徴とする乳成長因子(MGF)またはその塩
の製造方法。 11、MGFを新鮮なウシ乳汁から採取することを特徴
とする請求項10記載の方法。 12、MGFをウシの脱脂粉乳から採取することを特徴
とする請求項10記載の方法。 13、MGFの原料を1以上のクロマトグラフ法に付す
ることを特徴とする請求項10記載の方法。 14、MGFの原料を陽イオン交換クロマトグラフィー
、疎水的相互作用性クロマトグラフィー、サイズ排除ク
ロマトグラフィーおよび/または、必要によりさらに精
製工程に付することを特徴とする請求項10記載の方法
。 15、乳成長因子を実質的に例に記載するように製造す
ることを特徴とする請求項10記載の方法。 16、請求項10〜15のいずれかの一の記載に従って
製造される乳成長因子。 17、投与単位剤中に請求項1記載の乳成長因子または
その医薬として許容され得る塩を有効量含んでなる医薬
製剤。 18、EGFの受容体にバインディングすることにより
アゴニスト作用を奏するMGFおよびいずれかのポリペ
プチドの併用剤の有効量を含んでなる医薬製剤。 19、錬歯磨または洗口液である請求項17記載の医薬
製剤。 20、請求項1記載の乳成長因子またはその塩の有効量
を含んでなる化粧用組成物。 21、MGFまたはその塩の成長促進する量を含んでな
る食品組成物。 22、請求項17記載の医薬製剤を投与することを含ん
でなる哺乳類の損傷の予防または治療方法。 23、MGFまたはその医薬として許容され得る塩の免
疫抑制に有効な量を投与することを含んでなる免疫応答
の抑制方法。 24、MGFまたはその医薬として許容され得る塩の抗
細胞増殖の有効量を投与することを含んでなる癌の処置
方法。 25、請求項21記載の食品組成物を哺乳動物の成長を
促進する量で投与することを含んでなる哺乳類の成長促
進方法。 26、請求項1記載のMGFまたはその塩の成長促進を
刺激する量を添加することを含んでなる細胞増殖培地。 27、請求項1記載のMGFまたはその塩の細胞増殖を
刺激する量を前記培地に添加することを含んでなる培地
におけるイン・ビトロ(¥invitro¥)での細胞
増殖の刺激方法。 28、投与単位剤中にMGFまたはその医薬として許容
され得る塩の有効量を含んでなる医薬製剤を調製するた
めのMGFまたはその医薬として許容され得る塩の使用
。 29、投与単位剤中にMGFまたはその医薬として許容
され得る塩の有効量を含んでなる錬歯磨または洗口液の
調製のためのMGFまたはその医薬として許容され得る
塩の使用。30、MGFまたはその化粧品として許容さ
れ得る塩の有効量を含んでなる化粧用組成物の調製のた
めのMGFまたはその化粧品として許容され得る塩の使
用。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB8723094 | 1987-10-01 | ||
GB878723094A GB8723094D0 (en) | 1987-10-01 | 1987-10-01 | Polypeptide growth factor from milk |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01121300A true JPH01121300A (ja) | 1989-05-12 |
Family
ID=10624661
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63244685A Pending JPH01121300A (ja) | 1987-10-01 | 1988-09-30 | 乳汁に由来するポリペプチド成長因子 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0313515B1 (ja) |
JP (1) | JPH01121300A (ja) |
AT (1) | ATE73342T1 (ja) |
AU (1) | AU617126B2 (ja) |
DE (1) | DE3869054D1 (ja) |
DK (1) | DK167845B1 (ja) |
ES (1) | ES2034367T3 (ja) |
GB (1) | GB8723094D0 (ja) |
GR (1) | GR3004842T3 (ja) |
IE (1) | IE62425B1 (ja) |
PT (1) | PT88626B (ja) |
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---|---|---|---|---|
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JP2002508151A (ja) * | 1997-11-12 | 2002-03-19 | グロペップ・リミテッド | 哺乳類乳汁成長因子 |
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JPWO2014042120A1 (ja) * | 2012-09-13 | 2016-08-18 | ライオン株式会社 | 発泡性口腔用組成物、発泡性口腔用固形製剤及び発泡性口腔用製品 |
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WO1992000994A1 (en) * | 1990-07-13 | 1992-01-23 | Gropep Pty. Ltd. | Growth-promoting agent |
US7033610B2 (en) | 1990-07-13 | 2006-04-25 | Gropep Pty, Ltd. | Growth-promoting agent |
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1987
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-
1988
- 1988-09-22 DE DE8888810650T patent/DE3869054D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-22 EP EP88810650A patent/EP0313515B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-22 AT AT88810650T patent/ATE73342T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-09-22 ES ES88810650T patent/ES2034367T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-09-29 PT PT88626A patent/PT88626B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-09-30 IE IE296988A patent/IE62425B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-09-30 JP JP63244685A patent/JPH01121300A/ja active Pending
- 1988-09-30 DK DK546388A patent/DK167845B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-09-30 AU AU23326/88A patent/AU617126B2/en not_active Ceased
-
1992
- 1992-06-05 GR GR910402105T patent/GR3004842T3/el unknown
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