PT88626B - Processo para a preparacao de um factor de crescimento polipeptidico proveniente de leite - Google Patents

Description

Antecedentes da Invenção

1. Domínio da invenção

A presente invenção diz respei to ao isolamento e purificação de um factor de crescimento polipeptideo proveniente de leite, a misturas sinérgicas e composições farmacêuticas, cosméticas e alimentares que o contêm, e às suas utilizações para a promoção e aceleração de cura de feridas e reconstituição de tecidos, à supressão de respostas imunes, ao tratamento de cancro e ao estimulo de crescimento de mamíferos e culturas de células. Este polipeptideo será designado na presente por Factor de Crescimento de Leite (FCL).

2. Antecedentes da invenção e técnica anterior

Os factores de crescimento podem ser definidos como polipeptideos que estimulam o crescimento e profiferação celulares em concentrações muito fracas, por intermédio de receptores de superfície com grande afinidade celular. Esta acção produz outros sinais intracelulares que originam captação de nutriente, síntese de ADN e divisão celular, e que acabam por conduzir a crescimento de tecido. Os factores de crescimento têm sido encontrados em vários tecidos e fluidos orgânicos, tanto no adulto como no embrião, e crê-se agora que são libertados pela maior parte, se não todas as células em cultura (cf. estudo de Goustin, À.S. et al.. (l986), Câncer Research,

46. 1015). Desta maneira, os factores de crescimento não funcionam em geral de maneira endocrina, mas, presumivelmen

te, difundem-se em pequenas distâncias através de espaços intercelulares, ou actuam de maneira autocrina.

leite é um desses fluidos orgânicos que contêm factores que estimulam o crescimento celular em cultura. Observou-se que diversos tipos de células, incluindo células epiteliais, fibroblastos normais e transformados, células de músculo liso e condrócitos, proliferam em meio de cultura livre de soro, completado com leite (Klagsbrun, M. (1980), J. Cell Biol,« 84 808; Steimer, K.S. e Klagsbrun, M. (1981), J. Cell Biol. , 88, 294; Sereni, A. e Baerga, R. (l98l), Cell Biol, Int. Rep.

2, 338). Essa actividade foi observada em leite e colostro (leite extraido durante os primeiros dias após o parto) obtidos de fontes humana (Klagsbrun, M. (1978), Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 75. 5057«) © bovina (steimer, K.S. et al., (1981), J. Cell. Physiol.. 109. 223). Em anos recentes, foram isolados alguns factores de crescimento a partir do leite e foram purificados até homogeneidade, com o propósito de caracterizar a sua estrutura e função biológica.

Um dos factores de crescimento caracter!zados mais cedo e melhor é o Factor de Crescimento Epidérmico (PCE), um polipeptídeo com um peso molecular de aproximadamente 6lcd e que tem efeitos de crescimento e proliferação sobre diversas células e tecidos tanto in vitro como in vivo. Observou-se também que o FCE e um importante agente de promoção de crescimento no leite humano (Carpenter, G, (l98O), Science. 210, 198; Petride, P.E. et al.. (1985), FEBS Letters, 187, 89), leite bovino (Yagi, H. et al.. (1986), Acta Scand. Paed. 75, 233), © leite murídeo (Beardmore, J.M. e Richards, R.C, (l9S3)> J. Endocrino1.

287).

Do leite também foram isolados dois factores denominados Factor d© Crescimento Derivado Mamário (FCDM). FCDM-I humano é um polipeptideo sensivel a agente redutor com um peso molecular de aproximadamente Ó2kd e um ponto isoeléctrico (pi) de 4,8 (Bano, M, et al., (1985) J. Biol. Chem. 260. 5745). Dm niveis picomolares, estimula o crescimento de células mamárias e aumenta os seus niveis de produção de colageneo. FCDM-II é também sensivel a agentes redutores dissulfureto, mas tem, no entanto, um peso molecular menor de aproximadamente 17kd e um pi de 4,4 (Zwiebel, J.A. et al., (1986), Câncer Research 46. 933). Utilizando tampões eluentes com grande resistência iónica, FCDM-II pode ser resolvido a partir de FCE numa coluna de filtração de gel TSK-3OOOSU, embora ainda compita 125 com I-FCE radioetiquetada para ligação ao receptor FCE sobre membrana de célula de carcinoma epidermóide humano â431, FCDM-II estimula também o crescimento independente de fixação de células de Rim de Rato Normal (HEM) em ágar macio, a caracteristica definidora de um Factor de Crescimento de Transformação (FCT). e afigura-se provável de FCDM-II pertença à familia FCT-bL visto que moléculas do tipo FCT-& não se ligam ao receptor FCE.

Foi também relatado que o leite humano e o leite bovino contêm diversos conjuntos de factores de crescimento. Shing e Klagsbrun (1984, Endocrinol.. 115. 273) isolaram três espécies de factor de crescimento proveniente de leite humano, que foram designados por FCLH-I, FCLH-II e FCLH-III. FCLH-III parece constituir mais de 75$ da actividade de factor de crescimento total do leite humano, medida por meio de sintese de ADN. FCLH-III tem um peso molecular de aproximadamente 6kd, um pi de 4,4r -4,7, e é insensível a tratamento com agentes redutores. Estudos comparativos indicaram que esta molécula é provável mente FCE. Utilizando os mesmos processos de· separação, estes trabalhadores mostraram também que o colostro bovino não tem esta molécula, embora tenha de facto um componente factor de crescimento importante que tem um peso molecular de 30-35 kd e seja inactividado por meio de tratamento com agentes redutores. Este denominado Pactor de Crescimento Colostro Bovino (PCCB) é bioquimicamente análogo ao FCLH-II, outra molécula que constitui aproximadamente 20$ da actividade factor de crescimento de leite humano.

Um Factor Estimulante de Colónia (FEC) que estimula in vitro a proliferação de células de medula óssea e que origina a diferenciação de células progenitoras de Macrófago Granulocxtico Formador de Colónia (MG-FUC) foi também isolado de leite humano (Sinha, S.K. e Ynnis, A.A. (l983), Biochera. Biophys. Res. Comm. Il4,

797). Este factor, que está ausente em leite ou colostro bovino, é também insensível à acção de agentes redutores. Experiências de filtração por gel e focagem isoelóctrica indicaram que este factor é bioquimicamente distinto de outros FEC's e tem um peso molecuhr de 240-250 kd e um pl de 4,4-4,9.

Existem alguns orfcros factores de crescimento ou factores relacionados que devem ser mencionados a respeito da presente invenção que foram derivados de fontes que não leite.

Moléculas FCT- ^derivadas de plaqueta humana, placenta humana e rim de bovino estão descritas no Pedido de Patente Internacional UO84/O11OÓ e EP 0128849. As Patentes No. EP OI69OI6 e USP 4.627.982 descrevem a purificação parcial de duas proteínas provenientes de osso desmineralizado de bovino (FIO-A e FIC-B), que são co-factores para a indução de formação de cartilagem.

FIC-B (FCT-p₂) mostrou-se inibidor de função celular infla matéria in vivo (EP 213 776) e exibiu um efeito inihidor in vitro sobre a proliferação de células de tumor (EP 271 211). Ambos estes denominados Factores Indutores de Cartila· gem são activos quando combinados com FCE na experiência FCT-^?. Um dos seus factores (FIC-A) tem uma sequência terminal N que é igual nos primeiros trinta amino ácidos à da FCT-derivada de placenta humana, mas que é significativamente diferente de FIC-B /~cf, também artigos de análise de Sporn, M, (1986), Science 233« 532 e Massagué, J,, Cell 4£, 437-438 (1987).7.

FIC-B /~Seyedin., S.M. et al. , (1987), J. Biol. Chem. 262. 1946; EP l690l6_7 é análogo, se não igual, a dois outros factores de crescimento recentemente mencionados. Cheifetz, S. et al.. (1987) Cell. 48.

409) descreveram um factor por eles isolado a partir de plaquetas de porcino e que denominaram FCT-^2, visto que tem uma sequência amino ácida com terminal N diferente do do FCT-\Òporcino (que é agora designado por FCT-j^l na literatura cientifica) isolado da mesma fonte. Mais recentemente, Wrahn, M. et al., (1987) EMBO J. 6, 1633) isolaram um factor a partir de células glioblastoma humanas que é imunosupressor para linfécitos T e é designado por FTs-C, FIC-B, FCT-^-⁵ 2 e FTs-C têm a mesma sequência amino ácida no terminal N até ao amino ácido 19. FIC-B e FCT-fô 2 têm o mesmo peso molecular de aproximadamente 26 kd, ao passo que FTs-C tem um peso molecular de 12,5 kd. Um tipol^2 FCT humano (FCIh-2) com um peso molecular de 24 kd, e constituído por duas cadeias polipeptideas ligadas por dissulfure to aparentemente iguais, isolado a partir da linha celular adenocarcinoma prostático humano completado com tamoxifeno, foi descrito por Marquardt, H. et al., J, Biol. C&em.. 262, 12127-12131 (l987) e Ikeda, T. et al.. Biochem. 26, 24o6-2410 (1987).

Um inibidor de crescimento IC BSC-1, denominado poliergina, obtido a partir de BSC-1 de células de rim de macaco verde africano, foi identificado e purificado por R.U. Holley et al.. Proc. Natl, Acad.Sei. USA. Vol. 75, pp. 1864-1866 (1978) e R.U. Holley et al., ihid. Vol. 77, PP. 5989-5992 (l98O). R.F. Tucker et al., Science, Vol. 226, 705-707 (1984) mostraram que este inibidor tinha actividade biológica quase igual à de FCT- 1 e H.J. Ristow, ibid. Vol. 83, pp. 5531-5533 (1986) mostrou que este factor é um forte inibidor de proliferação timocítica. A sequencia amino ácida de IC BSC-1, deduzida a partir do cADN de uma biblioteca cADN de célula BSC-1, segundo recentemente averiguado, é igual à sequência amino ácida de FCT-^2 / S.K. Hauks et al. . Proc. Natl. Sei. USA. Vol. 85, pp. 79-82 (19S8)_7.

Até agora não se mostrou que estes factores de crescimento estivessem presentes em leite

Embora já tenham sido isolados caracterizados e clonados vários factores de crescimento polipeptideos, tem havido poucos estudos sobre a actividade destes materiais in vivo, principalmente devido às relativa mente pequenas quantidades disponíveis para essas experiências. Uma zona de indicação importante para a aplicação potencial do presente factor de crescimento é a acentuação da cura de ferimentos. Apesar das muitas preparações disponíveis para o tratamento de ferimentos, há ainda grandes numeros de pacientes, particularmente os mais lodosos, com ferimentos (incluindo traumas, queimaduras, decúbitos e úlceras diabéticas) que cicatrizam lentamente ou não se curam mesmo. Esses pacientes constituem um grupo alvo signifi cativamente válido para uma preparação farmacêutica que promova e acelere o processo de cura de ferimento. Um tipo de pequenos ferimentos são os que se produzem na boca, especialmente na gengiva, e também os causados, por exemplo por uma lâmina de barbear na face ou outras partes da superfície corporal. 0 estimulo do crescimento de mamíferos, por exemplo no tratamento de nanismo, e ds culturas celulares in vitro são também possibilidades para a utilização do presente factor de crescimento.

Surpreendentemente, o presente factor de crescimento contem também actividades supressoras sobre certos tipos de células, designadamente as do sistema imune e também de células de cancro.

É perfeitamente obvio que existe uma necessidade permanente para o tratamento destas indicações.

Objecto da presente invenção objecto da presente invenção é tornar disponivel ura factor de crescimento polipeptídeo encontrado em leite que é denominado Factor de Crescimento de Leite ou FCL, descrever um processo para o seu enriquecimento, recuperação e purificação, e composições farmacêuticas, cosméticas e alimentares que o contêm, além daõ suas utilizações para promover a proliferação de células, sua migração e cicatrização de tecidos.

Outros objectos são a supressão das respostas imunes e a proliferação de células cancero sas por meio da administração do presente factor de crescimento.

Àinda outro objecto é o estimulo do crescimento e proliferação de células in vitro.

Outro objecto ainda é proporcionar misturas sinergéticas que compreendem o factor de crescimento e um agente activante.

Descrição pormenorizada da invenção

A presente invenção diz respeito a um Factor de Crescimento de Leite (FCL) em forma enriquecida e pura, caracterizado por poder ser obtido a partir de leite ou produtos lácteos, que tem um peso molecular entre 25 θ 26 kd, detexminado por SGPA-SDS e um ponto isoeléctrico entre pi 9,0 o 10,5, ou um seu sal.

termo Factor de Crescimento de Leite (FCL) utilizado na presente designa qualquer estado enriquecido ou purificado, e também parcialmente purificado, deste factor. Este enriquecimento pode ser desde aproximadamente 10 vezes até mais de 10 * vezes e o factc pode ter uma pureza até 100^o. 0 FCL é essencialmente isento de outros factores de crescimento que podem ser encontrados em leite e têm um peso molecular menor ou maior e um pi diferente, por exemplo FCE ou FCLH III (6kd, IFCDM (62kd), IIFCDM (I7kd), FCCB (30 - 35 kd) ou FSC (24o - 250kd).

Em particular, a presente inven ção diz respeito ao FCL proveniente de leite bovino na sua · forma aproximadamente purificada que tem a seguinte composição amino ácida

A.

Amino Ácido

Amino Ácidos/Mole

a) b)

ASP + ASN GLU + GLN SER THR GLY.

ALA

ARG

PRO

VAL

MET

ILE

LEU

TRP

PHE

CYS

LYS

HIS

TYR

21.10	20
24.68	24
19.00	18
10.02	10
10.62	10
14.64	14
9.50	10
12.92	12
10.68	10
0.16	2
11.04	10
22.40	22
não de-t	erminado
7.78	8 .
11.16	12
16.14	16
5.84	6
13.38	14

/a): moles de amino ácido por mole de peptideo;

b): arredondado para dar residuos amino ácidos por mole de peptideo_7 e a seguinte sequência amino ácida N-terminal.

18 , na qual X θ X são amino ácidos indeterminados, ou um seu sal.

peso molecular é determinado por Electroforese de Gel Poliacrilamida-Sulfato Dodecilo de Sodio (EGPÀ-SDS), de acordo com o método de Laemmli,

U.IÍ. (1970) Nature. 227 680. 0 ponto isoelectrico ó determinado pelo método indicado por Burle, P.R. (l98O) em Control Mechanisms in Animal Cells pp. 245-257, Raven Press, Nova York. A natureza cationica deste polipeptideo ó devida à presença de grupos amino ácidos básicos como arginina, lisina e histidina. FCL ó um polipeptideo estável ao calor e estável aos ácidos que ó sensivel a agentes redutores como mercaptoetanol, ditiotreitol e seus sais. 0 tratamento de FCL com esses agentes indica que a molécula é composta por duas subunidades similares ou idênticas, cada uma com a dimensão 12,5 kd aproximadamente, que são presumivelmente mantidas juntas por uma ou mais ligações dissulfureto de cisteína e que se tornam clivadas por meio de tratamento com os referidos agentes.

A observação de que FCL não se afigura espécie especifica na sua acção de promoção de migração e proliferação celular, serve de base à hipótese de que a referida molécula é muito conservada entre as diversas espécies de mamíferos, e espera-se, portanto, que seja substancialmente homóloga de outras moléculas desta familia.

Neste aspecto, o termo substan cialmente homóloga aplicado a um polipeptideo, designa as moléculas nativas, sintéticas ou formadas reconfeinantemente, independentemente de espécie ou origem, que tem a mesma sequência amino ácida que FCL, e polipeptideos com sequência amino ácido substancialmente homóloga mas diferente, cujas diferenças não prejudicam actividade de espécie cruzada.

Por conseguinte, o polipeptideo desta invenção, FCL, originalmente isolado a partir de leito de vaca, pode ser derivado de leites de origens mamíferas diversas ou feito por meio de tecnologia ADN recombinante.

leite de vaca é uma fonte nativa preferida de FCL, visto que pode ser obtido facilmente em grandes quantidades que desta maneira não limitara a quantidade de factor que pode ser produzida com o emprego dos processos de purificação indicados esquematicamente.

Para fins analíticos, tornaram-se amostras de FCL homogéneo (50-100 pmol) até secagem e hidrolisaram-se em tubos vedados e evacuados a 150^0 durante 2 horas em 100 μΐ de HC1 éN fervente constante que continha fenol liquido a 0,1$. Determinaram-se meia-cisteína e metionina por oxidação de ácido performico, seguida por hidrólise ácida. Fizeram-se análises de derivados de o-ftalaldeído dos amino ácidos num analisador de amino ácido modificado equipado com um fluorímetro e integrador de computação.

número de resíduos amino ácidos por mole de FCL é baseado no peso molecular aparente de 25000 Dalton.

Para análise de sequência amino -terminal, reduziram-se aproximadamente 500 picomoles (M 25.000) de FCL e S-carboximetilaram-se com ditiotreitol e ácido iodo-/^C/acético na presença de guanidina-HC1 6m em tampão Tris-IíCl IM, pH 8,4, Os excessos de reagentes foram separados de proteína carboximetilados por CLG-P sobre uma coluna de 5 microns 50 x 4,6 mm eluido com um gradiente de 0-90$ de acetonitrilo (l$ por min) em ATF a 0,1$. A recuperação global do processo foi de 96$, com base em estima tiva da quantidade de proteína por meio de análise amino ácida utilizando detecção com fluoresceína.

Efectuou-se degradação Edman automatizada sobre aproximadamente 500 pmoles (M_r 12.500) da proteína S-carboximetilada com um sequenciador de fase gasosa. Identificaram-se amino ácidos-PHT utilizando um sistema de CLGP. 0 rendimento inicial foi de cerca de 30$ e o rendimento repetitivo foi de cerca de 90$. Os resultados indicam que a sequência de pelo menos os primeiros dezanove amino ácidos N-terminais de cada uma das suas subuni dades de FCM são idênticos e confirmam as observações de uma só faixa de proteína da forma reduzida de FCL por EGPA-SDS.

A análise de FCL bovino por

EGPA-SDS indica que algumas das ligações dis sulfureto são intercadeia.

Devido aos seus grupos básicos, o novo factor de crescimento pode formar sais de adição de ácidos com ácidos inorgânicos ou orgânicos. Para o efeito de purificação, consideram-se sais insolúveis em água e/ou álcool, por exemplo tetrafenilborato, sais de Ca, Al, Zn e análogos.

Para fins farmacêuticos, consideram-se sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sais metálicos ou de amónio solúveis em água, especialmente sais de metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, por exemplo sais de sódio, sal de potássio, sal de magnésio ou sal de cálcio, ou sais de amónio com amoníaco ou uma amina orgânica apropriada. São preferidos sais de adição de ácido com um ácido inorgânico, por exemplo ácido clorídrico, ácido sulfurico, ou ácido fosfórico, ou com um ácido orgânico, especialmente um ácido orgânico carbónico ou sulfónico, por exemplo um ácido alcano inferior carboxílico ou dicarboxilico, p.e. ácido fórmico ou ácido acótico, ácido cítrico, ácido trifluoroacêtico e análogos.

FCL da presente invenção é definido também pelas suas propriedades biológicas.

As actividades promotoras de crescimento de FCL nos seus diversos estados de purificação são determinadas de acordo com a experiência descrita por Burk, R.R. (1973) Proc. Natl. Aod. Sei. USA 70: 369, que mede o número de células fibroblasto Balb/C 3T3 normais (ou estirpes derivadas delas) que migram para uma cultura monocamada ferida das referidas células, na presença de um meio isento de soro que contém FCL, em comparação com o número de células que migram na ausência de FCL ou qualquer outro factor de crescimento polipeptideo conhecido.

Experiências de resposta a dose nas quais se aplicou o referido método mostraram que concen χ

trações do FCL completamente purificado de 40 - 35 picrogramas por mililitro de meio de cultura são suficientes para extrair 50$ da resposta migratória máxima. Esta concentração de FCL extrai também 50$ da resposta migratória máxima na referida experiência quando se utiliza uma linha de célula epitelial de pele humana (NCTC 2544) como indicador de tipo de célula.

FCL é ainda caracterizado pela sua actividade estimulante sobre sintese ADN celular e divisão celular aparente nas referidas culturas monocamada quando observadas sob o microscópio luminoso. Esta actividade foi quantificada:

a) por contagem do número de núcleos de célula, em qualquer campo de vista dado, em culturas das referidas células cultivadas na ppresença de meio isento de soro que contém FCL, em comparação com o número de núcleos de célulasi contados, em qualquer campo dado, em culturas cultivadas na ausência de FCL ou qualquer outro factor de crescimen to polipeptideo conhecido.

rádio-etiquetada em culturas das referidas células cul-

F'CL ou qualquer outro factor de crescimento polipeptideo conhecido.

A actividade promotora de crescimento de FCL é apenas uma propriedade da forma dimérica 25 kd da molécula. Esta actividade pode ser recuperada nos eluatos sobrenadantes provenientes de fatias de gel que contêm o referido dímero, a seguir a SGPA-SDS e eluição durante toda a noite em ácido férmico 50 milimolar sob uma atmosfera de azoto. Não se pode recuperar nenhuma actividade em eluatos provenientes de fatias de gel que continham a forma monoraera 12,5 kd. A actividade promotora de crescimento de FCL é também posta em evidência quando experimentada em culturas de células de uma origem mamifera e tipo que não o tipo fibroblasto Balb/c 3T3, o que indica que a resposta de promoção de crescimento a FCL derivada de leite bovino não tem natureza especifica de espécie.

FCL é também caracterizado pelo factor de actuar sinergisticamente na presença de FCE.

Esta sinergia é observada numa experiência para a indução in vitro de células de Crescimento Independente de Fixação de Rim de Rato Normal (RRN) em ágar macio (Roberts, A.B.

et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78; 5339).

Esta experiência é por vezes denominada experiência do Factor de Crescimento de Transformação tipo Beta (FCT-^), visto que FCT-j'^? (ao contrário de FCT- ) não compete com FCE para ligação a locais receptores de membrana, mas necessita de facto da ocupação dos seus outros locais receptores de «agente activante” para a indução de colónias de células. Neste aspecto, a presença em leite de proteínas que têm essa acção sinergística com FCE na referida experiência não foi mencionada anteriormente. 0 FCL isoladamente não é suficiente para induzir a formação de grandes colónias de células RRN em ágar macio, e só o faz na presença de murídeo FCE. Na presença de uma concentração de FCE (5 ng ml ) que por si só é insuficiente para provocar um efeito apercebivel nesta experiência, o FCL induz a formação de grande colónia quando é adicionado sobre uma gama de contracção desde 0,1 a 500 ng ml

Embora concentrações picomolares de FCL sejam suficientes para promover a migração e proliferação de células fibroblasto Balb/C 3T3 normais in vitro. há uma resposta sinergística na presença de murídeo FCE. Na experiência descrita por Burk, R.R. (1973) Proc. Natl, Acad, Sei. USA 70:3^9 a resposta migratória máxima a FCL (numa gama de concentração desde 10 até 100 pg ml *) na presença de 3»ló ng/ml de murídeo FCE mostrou ser até 3θ vezes maior que na ausência de FCE.

A invenção diz também respeito a uma combinação, especialmente uma combinação sinergística de FCL e qualquer polipeptídeo, a qual exerce um efeito agonístico por ligação a receptor FCE, Esse polipeptideo, além do próprio FCE, é FCT-^-por exemplo. Essa combinação, é especialmente útil para o tratamento de ferimentos mais profundos, como os provocados por acidentes graves ou cirurgia. Ê preferida uma combinação equimolar de FCL e FCE.

A invenção diz também respeito a um processo para a preparação de um Factor de Crescimento de Leite (FCL) ou de um seu sal, caracterizado por ser recuperado FCL a partir de leite ou de qualquer produto lácteo que o contenha, e, quando for necessário, a transformação de um FCL livre que possa ser obtido num sal ou um sal que possa ser obtido no FCL livre.

presente factor de crescimento é recuperado por métodos convencionais a partir de qualquer fonte de leite ou produto lácteo fresco que o contenha. São fontes de FCL preferidas o leite ou produtos lácteos, em particular de bovídeos, p.e. vacas, cabras, ovelhas, etc. Outra fonte é leite em pó à venda no mercado, por exemplo leite em pó desnatado seco.

Mais especificamente, o factor de crescimento ó recuperado submetendo a fonte de leite a diversos métodos cromatográficos, especialraente cromatografia de permuta de catiões, cromatografia de interacção hidréfoba, cromatografia de exclusão de dimensão, electroforese de gel poliacrilamida, e/ou, se for necessário, processos de purificação adicional, $ vantajosa a adição de um inibidor protease, por exemplo fluoreto de fenil metanosulfonilo, à fonte que contém FCL, processo para o isolamento de FCL a partir de leite bovino áresco é caracterizado, p.e. por fases de cromatografia de permuta de catiões, cromato-19grafia de interacção hidrófoba e cromatografia de exclusão de dimensão, empregando uma combinação de técnicas de baixa pressão e de alta pressão. Fracções amostras recolhidas de cada fase de separação subsequente, e que manifestam actividade biológica na referida experiência de migração de células sobre células Balb/c 3T3, são reunidas e enviadas para a fase de separação seguinte. 0 material amostra de cada uma das fracções reunidas é sujeito a uma análise de resposta a dose (utilizando o mesmo método de bioexperiência nas referidas células), permitindo desta maneira uma estimativa do volume de material necessário para extrair 50/ da resposta migratória máxima. Este referido volume é definido na presente como uma unidade e utilizando este valor, juntamente com os valores do volume de material em cada conjunto activo, podem ser calculados os rendimentos de purificação, recuperações e actividade especifica em cada fase do processo. À homogeneidade do FCL puro proveniente da fase de purificação final é demonstrada por:

i) Actividade especifica constante ii) Migração como faixa única de aproximadamente 25-2ókd depois de EGPA-SDS iii) Composição amino ácida constante iv) Análise de sequência amino ácida constante.

Em particular, efectua-se a recueperação do FCL por meio do tratamento de leite diluido que contém o factor de crescimento ou uma suspensão aquosa do leite em pó com uma resina permutadora de catiões, lavagem da resina carregada com o factor com um sistema tampão de fosfato di-hidrogénio de sódio (10 mM) com pH 7,0, elui-20-

ção do factor a partir da resina com um sistema tampão consttiuido por fosfato di-hidrogénio de potássio (20 mM) em etanol a 40$, com pH 7,6, submetendo-o, em particular na forma de um stl de adição de ácido do mesmo, a cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de exclusão de dimensão e electroforese de gel poliacrilamida, e, se se desejar, processos de purificação adicional, e, se se desejar, a transformação do factor de crescimento obtido na forma da base num sal, ou a transformação do factor de crescimento obtido na forma de sal na base livre ou noutro sal.

Antes da cromatografia, o leite ou leite em pé pode ser liberto de gordura e outro material não polar, p.e. extraindo com um dissolvente orgânico não polar, por exemplo cloreto de metileno, ou, no caso do leite em pé, com acetona. Dilui-se leite em água destilada numa proporção leite:água de aproximadamente 1:3 a 1:10, de preferência aproximadamente 1:4 em volume.

leite em pé é posto em suspen são em água destilada numa proporção pé:água de aproximadamente 1 para 5 até 1 para 20, de preferência aproximadamente 1 para 10 em peso.

Para a cromatografia de permuta de catiões pode ser utilizada qualquer resina permutadora de catiões, por exemplo resinas da série Bio Rad AG 50¥, resinas da série Amberlite IR, resinas das séries Zeocarb 22S, Diaion SK, Série Dowex ÀG 50¥. Também se podem empregar permutadores de iões na forma de contragrupos permutáveis ligados a suportes de matriz sólida (na forma de discos ou cartuchos), por exemplo permutadores de catiões série Zetaprep 3P.

Λ

-21Uma resina permutadora de catiões preferida é Dowex AG 5 OU malha 50-100· A resina pode ser lavada antes da sua utilização com acetona, etanol e/ou água. Depois de carregar com um catião, por exemplo um catião metal alcalino como sódio ou potássio, por meio de tratamento com o hidróxido de metal correspondente, p.e. hidróxido de metal alcalino, a resina é lavada até se tornar neutra e é depois quilibrada para um pH 7,0 com um tampão com fraca resistência iónica apropriado, de preferência um tampão fosfato di-hidrogénio de sódio (lO Wl).

leite fresco ou reconstituído é ajustado para o mesmo pil com o mesmo hidróxido de metal alcalino e é depois posto em contacto com a resina. À resina carregada é lavada com o mesmo tampão de pH 7,0 até a lavagem ficar isenta de polipeptideo, isto é, até se atingir a linha de base da densidade óptica em 280 nm. 0 factor de crescimento desejado é depois eluido com uma solução tampão aquosa de sal de metal alcalino com grande resistência iónica, em particular com acetato de potássio (70 mM) na presença de etanol a 4o$, com píl 7,6. As fracções que manifestara a actividade desejada são reunidas e, se se desejar, concentradas por evaporação. Cerca de 10$ da actividade inicial é obtida com um aumento de actividade especifica de 1000 vezes.

Às fracções reunidas são submetidas a cromatografia de interacção hidréfoba sobre uma resina constituída por uma matriz não carregada que suporta grupos hidréfobos interactuantes. Pode empregar-se qualquer resina apropriada, por exemplo fenil sefarose ou octilo sefarose. Uma resina de interacção hidréfoba preferida é fenil sefarose CL-4B.

Antes da utilização, a fenil se farose é regenerada por meio de lavagens consecutivas com um álcool, p.e. com n-butanol e etanol, e, em seguida, com água. As fracções reunidas provenientes da cromatografia

Dovex são aplicadas a coluna de fenil sefarose agitando a resina directamente, durante toda a noite, dentro do conjunto, A resina é depois carregada sobre a coluna que é lavada com acetato de amónio O,ÓM com pH 5,0, seguindo-se um gradiente de fase com quantidade de etanol crescente, p.e. de 28^c/ para 4-0$ no mesmo dissolvente com pH 5,0 que ó suficiente para eluir a actividade desejada.

As fracções actuantes da fase de cromatografia de intercação hidrófoba de fenil sefarose são reunidas e, quer liofilizadas e redissolvidas numa pequena quantidade de uma solução tampão com grande resistência iónica, por exemplo acetato de amónio 2M com pH 5,5 quer aplicadas directamente a uma coluna de cromatografia de interacção hidrófoba de butil-poliol que forma o primeiro componente activo de um sistema de cromatografia liquida de grande potência (CLGP). A coluna é lavada com o mesmo tampão, seguindo-se um gradiente linear com uma quantidade de etanol, por exemplo 40-45^, que é suficiente para eluir a actividade desejada.

As fracções activas da jsse hidrófoba octil-poliol são reunidas, liofilizadas e redissoj. vidas num volume pequeno, de preferência 100 μΐ, de uma solução tampão constituida por 7 partes de etanol a 60$ para 3 partes de acetato de amónio 214 com píl 5,5, θ submetidas a cromatografia de exclusão de dimensão numa coluna TSK G2000 SW que constitui o terceiro compoente activo do siste ma CLG-P. 0 processo de eluição é realizado em condições de eluição isocrática, empregando a mesma solução tampão, e as fracções que contêm a actividade são reunidas, liofiliza das e armazenadas a -20^sC até utilização ulterior.

factor de crescimento obtido migra como uma faixa única com um peso molecular de aproximadamente 25-26kd de acordo com EGPA-SDS, e pode ser desde aproximadamente 95$ até 100$ puro

Se for necessário, pode fazer-se purificação adicional do factor de crescimento por um ou mais dos métodos cromatográficos mencionados acima, ou por outros métodos aplicados na técnica de purificação polipeptidica, por exemplo distribuição em contracorrente, electroconcentração, cromatoconcentração, diálise, precipitação de sal e dissolvente, adsorção com outros geles, cromatografia de permuta de iões celulose, cromatografia de electroforese sobre contas de vidro porosas, cromatografia sobre quelato de zinco imobilizad© CLG-P e análogos.

Um EGL obtido, que está na forma de um sal interior, pode ser tratado com um ácido ou uma base para formar o sal desejado, ou pode transformar-se um sal obtido na base livre ou noutro sal por métodos conhecido pelos técnicos da especialidade, especialmente com o auxilio de resinas permutadoras de iões carregadas com o anião desejado e análogos.

A presença do factor de crescimento nas diversas fraeções durante a sua purificação pode ser verificada por meio da medição da densidade optica a 280 nm, e especialmente, por meio da determinação das diversas propriedades que o caracterizam. Um método preferido é a determinação das propriedades estimulantes da migração celular das fraeções de acordo com a Experiência de Migração de Burk, R.R. (1973) Proo. Natl. Acad. Sei, USA 70:

370· Semeiam-se 2 x lCr células 3T?3 (um derivado de células Balb/C 3T3 clone A31 em 2,5 ml de meio de Eagle Dulbeccos modificado que contém soro de vitela a 10$ em pratos petri de plástico de 35 mm (Nunc). Decorridos 3 dias a 37°C, fazuma ferida na monocamada de célula confluente, comprimindo uma lâmina de barbear esterilizada sobre o fundo do prato para cortar a folha de célula e marcar uma linha de partida”

A lâmina é deslocada cautelosamente para o lado para separar parte desta folha. 0 meio fluido e os detritos de célula são separados por sucção e substituidos por 2,5 ml de meio de Eagle sem soro, seguindo-se uma quantidade apropriada da fracção que contém o factor de crescimento a experimentar. Decorridas 22 horas a 37^eC de temperatura ambiente, as células são fixadas e manchadas com solução de Leishraann. A actividade de migração é definida como o número de células que atravessam 1 mm da linha de partida feita pela lâmina de barbear.

A presente invenção diz também respeito a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade efectiva de um Factor de Crescimento de Leite ou um seu sal farmaceuticamente aceitável em forma de unidade de dosagem.

Essa composição está na forma de soluções ou preparações de infusão para administração parentérica, por exemplo intramuscular ou intravenosa, oral ou, especialmente, administração local, isto ó, tópica, respectivamente. As soluções são de preferência soluções ou suspensões aquosas isoténicas que podem ser preparadas antes de utilização, por exemplo a partir de preparações liofilizadas que contem o ingrediente activo isolado ou conjuntamente com um portador farmaceuticamente aceitável.

As soluções para utilização parentérica são em geral soluções aquosas. Estas são preparadas de maneira convencional e podem conter, além de solução saturada de cloreto de sódio fisiológica, como ingrediente activo, um estabilizador, por exemplo albumina de soro humana, amino ácidos, por exemplo arginina ou glicina, e um hidrato de carbono, por exemplo glucose, manose, dextrano ou hidroxietil amido. 0 pH pode ser ajustado com um tampão, p.e, um fosfato, succinato ou um amino ácido para aproximadamente 4,5 a 7. Em geral, os frasquinhos são cheios com a solução e liofilizados para armazenamento de maior duração.

Também se preparam de maneira convencional soluções de elixires dentifricos. Estas contêm o ingrediente activo dissolvido, por exemplo, em água ou etanol aquoso p.e, de aproximadamente 3θ & 6θ$, e podem conter aditivos usuais, por exemplo uma glicerina polietile no glicol, e um óleo volátil, p.e. óleo de hortelã, para melhorar o sabor. As preparações farmacêuticas para uso tópico compreendem pós, cremes, incluindo pastas dentifricas, gomas de mascar, loções, tinturas, etc. que são preparados analogamente de maneira convencional. Qs pós são convencionalmente constituídos por talco e pelo ingrediente activo e, opcionalmente, outros aditivos, por exemplo estabilizadores e perfumes. Qs cremes e pomadas são de natureza convencional e podem compreender um estearato, por exemplo estearato de sorbitano ou polioxietileno sorbitano, um oleato, por exemplo trioleato de sorbitano, um álcool, por exemplo cetilo ou lanolina, álcool ou propileno glicol, uma parafina ou cera microcristalina, um pó, por exemplo sulfato de magnésio, ou, para uma pasta dentifrica, um pó de limpeza convencional, preservantes, etc. Formas de dosagem sólidas para administração bucal ou faringica, podem ser comprimidos preparados com o emprego de excipientes farmacêuticos de uso corrente, p.e. a) diluentes e bases de comprimidos como sacarose, dextrose, lactose, manitol ou sorbitol, b) ligantes como pasta de amido, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropil metilcelulose, c) lubrificantes como estearatos de magnésio ou cálcio, ácido esteái-ico, talco ou óleos vegetais hidrogenados, e, se se desejar, d) corantes, aromatizantes, edulcorantes, etc. Como variante, podem usar-se pastilhas feitas com uma base de gelatina e glicerol ou uma mistura de acácia e açúcar, para dissolução lenta na boca

Formas de dosagem sólidas para ingestão oral por deglutição podem ser comprimidos ou cápsu las de gelatina. A substância aetiva é misturada com excipientes e aditivos farmacêuticos de uso corrente apropriados por exemplo para comprimidos.

a) diluentes como lactose, amido, celulose, sorbitol, fosfato de cálcio ou sulfato de cálcio,

b) ligantes como pasta de amido, gelatina, polivinilpirrolidona, hidroxipropil metilcelulose ou outros éteres de celulose apropriados,

c) desintegrantes como amido, glicolato de amido sódio, carboximetilcelulose de sódio, crospovidona,

d) lubrificantes e deslizantes como estearatos de magnésio ou cálcio, ácido esteárico, talco, dióxido de silício coloidal, óleos vegetais hidrogenados, e, se se desejar,

e) agentes tensioactivos como sulfato lauril de sódio, corantes, etc. Os núcleos de comprimidos podem ter um revestimento apropriado que pode ser ou não resistente a suco gástrico.

Os revestimentos exteriores podem ser baseados em açúcar ou podem constituir películas delgadas baseadas em éteres de celulose ou resinas acrílicas Podem aplicar-se revestimentos de açúcar utilizando xarsQpes de açúcar concentrados, assim como supensões de revestimento que contem ingredientes de revestimentos de uso corrente como talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicóis e corantes ou pigmentos. Qs revestimentos de pelicula apli.cam-se de preferência na forma de soluções ou suspensões aquosas e podem conter agentes de formação de pelicula como hidroxipropil metilcelulose, plastificantes como polietileno glicol, antiaderentes como talco, pigmentos coloridos e opacificadores como dióxido de titânio e óxidos de ferro. Obtêm-se revestimentos entéricos com soluções de laca de polimeros que são insolúveis em suco gástrico mas solúveis em suco intestinal, por exemplo acetato de celulose, ftalato ou copolimeros de ácido metacrilico em dissolventes orgânicos .

Podem produzir-se cápsulas quer utilizando invólucros de gelatina dura para encher com a preparação de medicamento quer utilizando invólucros de gelatina macia formados e vedados durante o processo de enchi mento a partir de uma mistura de gelatina e um agente amaci dor como glicerina ou sorbitol.

As cápsulas de gelatina dura podem conter misturas de pós preparadas com diluentes, lubrificantes e deslizantes, conforme se indicou em relação aos comprimidos em a) e b) ou podem ser granuladas com ingredientes análogos aos utilizados para, compressão em comprimidos e mencionados acima em a)-d). Como variante, as cápsulas de gelatina dura podem conter liquidos, pastas ou massas sólidas com a substância activa dissolvida ou disper sa em liquidos ou bases semi-sólidas apropriados, por exemplo polietileno glicóis, óleos gordos ou derivados de glicerídeos polioxietilados, se se desejar com agentes engrossadores como ceras ou dióxido de silício coloidal e/ou agen tes tensioactivos como polisorbat os ♦ Em cápsulas macias, o ingrediente activo ó de preferência dissolvido ou posto em suspensão em liquidos apropriados como óleos gordos, parafi nas ou polietileno glicóis. A substância activa pode também ser incorporada em pequenas pílulas para constituir uma for

ma de dosagem de unidades múltiplas para ingestão oral. A distribuição do medicamento entre as pílulas pode ser feita aspergindo uma solução ou suspensão sobre a superfície de pílulas preparadas ou formando pílulas a partir de uma mistura que contém o medicamento o diluentes apropriados. Para aplicação na superfície, as pílulas podem ser esferas de açúcar ”non-pareil existentes no mercado que contêm açúcar e amido, ou podem ser produzidas por extrusão e esferonização com o emprego de excipientes como celulose microcristalina e lactose amassada com água. Este último processo pode ser utilizado para incorporar o medicamento no interior das pílulas. As pílulas podem ser revestidas com lacas protectoras ou reguladoras de libertação, empregando polímeros como etilcelulose, resinas polimetacrilato, ftalato acetato de celulose, etc., aplicados na forma de soluções em dissolventes orgânicos ou de dispersões aquosas. As pílulas podem ser introduzidas em cápsulas de gelatina dura ou comprimidos em pastilhas conjuntamente com excipientes apropriados para a produção de pastilhas.

As composições contêm produtos auxiliares convencionais, por exemplo preservantes, estabilizadores, agentes molhantes e/ou emulsionantes, solubilizan tes, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. As composições farmacêuticas da presente invenção, que, se se desejar, podem conter substâncias farmacologicamente valiosa adicionais, são produzidas de maneira já conhecida, por exem pio por meio de processos convencionais de mistura, dissolução, liofilização e/ou esterilização, e contêm desde aproximadamente 1 ng até 100 pg/g, especialmente desde aproximadamente 10 ng até 10 çtg/g de preparação, e, no caso de liofilisantes, até 100$, do ingrediente activo.

A invenção refere-se também a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por um composto farmacologicamente activo da presente invenção ser tratado de maneira convencional, p.e. misturado com um portador farmaceuticamente aceitável.

A invenção diz também respeito a uma pasta dentxfrica que compreende uma quantidade efectiva de FCL, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, e a um processo para a sua preparação. A pasta dentxfrica e especialmente últil para a prevenção e/ou tratamento de ferimentos nas gengivas, p.e. periodontite ou gengivite.

A invenção refere-se também a um elixir dentxfrico que compreende uma quantidade efectiva de FCL, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, e a um processo para a sua preparação. 0 elixir dentxfrico e útil para a prevenção e/ou tratamento de ferimentos na boca e garganta, p.e, como os que se formam durante periodontite, gengivite ou inflamação da garganta.

A invenção diz também respeito a uma composição cosmética que compreende uma quantidade efectiva de FCL, ou de um seu sal cosmeticamente aceitável.

A composição cosmética pode ser análoga à preparação farmacêutica tópica, e pode conter adicionalmente compostos perfumados.

A invenção refere-se também à utilização do FCL na preparação de uma composição farmacêutica, solução de elixir dentxfrico, pasta dentxfrica e preparação cosmética.

FCL tem natureza dual no sentido de que, por um lado, estimula a proliferação de um tipo de células orgânicas designadamente fxbroblastos e outras células mesênquxmas, e, por outro lado, inibe a proliferação de outro tipo de células orgânicas, designadamente células de tumores e células do sistema imune.

novo factor de crescimento, opcionalmente na forma de um sal, como, em particular, um sal de adição de ácido farmacêutico não toxico, opcionalmente na forma de uma preparação farmacêutica, é aplicado numa quantidade efectiva. A expressão quantidade efectiva designa uma quantidade que exerce um efeito curativo ou cos mético significativo, p.e. uma quantidade que estimula as células desejadas a crescer e que não é toxica para as células. Esta quantidade pode ser determinada, p.e. por meio de experiências de crescimento in vitro. Devido à natureza dual do FCL, uma quantidade efectiva é também aquela que inibe em medida significativa o crescimento e proliferação de células de tumor e células do sistema imune» Se se pretende utilização humana ou veterinária, a quantidade tem de ser ajustada ao tecido particular a tratar, ao modo de apli cação, à gravidade da doença, e à idade e estado geral do hospedeiro a tratar. Sm geral, as doses para adultos variarão desde aproximadamente 0,1 até 1000 pg, tanto para o efeito estimulante como para o efeito inibitório. Podem evitar-se reacções alérgicas com o emprego do factor de crescimento proveniente da espécie particular a tratar, isto e, utilizando o factor de crescimento proveniente de leite humano para o tratamento de seres humanos, proveniente de leite de vaca para o tratamento de gado vacum, etc.

Utilizações Clinicas das Composições da Presente Invenção

As composições farmacêuticas da presente invenção, cujos ingredientes activos são FCL ou FCL em combinação com um agente activante apropriado, de preferência FCS, tem utilização clinica no tratamento de animais, em particular mamiferos, mais particularmente seres humanos, e, no caso de cura de ferimentos, de maneira muitíssimo particular seres humanos idosos. Apresentam-se alguns resultados para apoio deste indício nos Protocolos I a VII.

As composições da presente invenção promovem a migração e proliferação de células. Visto que a cicatrização de feridas implica tipos de migração de células e proliferação de células, estas observações in vitro tornam-se directamente relevantes para o processo de cicatrização de ferimentos in vivo.

Uma característica dos componentes das composições da presente invenção é não serem necessárias combinações especificas de espécie para a sua actividade in vitro ou in vivo, isto é, FCL proveniente de uma espécie, por exemplo bovina, pode ser activado por um agente activante proveniente de outra espécie, por exemplo FCS murídeo. Por outro lado, as células cuja migração e/ou crescimento está sendo promovido, in vitro como in vivo, também podem ser de espécie diferente da dos componentes da composição, ou de outros tipos, por exemplo fibroblasto ou epitélia (embora se considere que a promoção de crescimento dostes dois referidos tipos de células terão a maior utilidade médica). A sinergia de FCL com FCE indica que a pele é um alvo apropriado. A prevenção ou tratamento de escaras (úlceras de decúbito) é um objectivo preferido porque ocorrem frequentemente em pacientes de hospital, em particular pacientes geriátricos e de cadeira de rodas.

Em pessoas idosas, o processo de cicati-ização de feridas ó raais lento e este grupo de pacientes tende para apresentar maior incidência de ferimentos (não somente úlceras de decúbito e diabéticas mas também traumatismos, queimaduras, etc), que cicatrizam lentamente ou não cicatrizam.

Propõem-se dois tipos de aplicação das composições da presente invenção para a medicina veterinária, e, em particular, a medicina humana.

A primeira aplicação, a preferida é uma aplicação tópica para a promoção de cicatrização de ferimento superficial, em particular em seres humanos idosos, em que os processos de cicatrização de ferimentos são apreciavelmente mais lentos. Não há limitações quanto ao tipo de ferimento que pode ser tratado, e estes incluem (mas não lhes estão limitados): úlceras superficiais, inclui indo úlceras superficiais de decúbito (escaras), diabéticaSj dentárias, orais, de varicose e hemofílicas; queimaduras (especialmente de segundo e terceiro grau); incisões cirúrgicas (incluindo as de cirurgia dentária e cosmética); ferimentos acidentais (incluindo incisões, penetrações, lacerações e outros traumatismos) e ferimentos terapeuticamente induzidos (incluindo os induzidos durante radioterapia), quando são aplicadas topicamente, as composições podem ser combinadas com outros ingredientes, por exemplo adjuvantes, portadores, agentes solubilisantes e quaisquer outros factor(es) de crescimento secundários conhecidos, ou ainda desconhecidos. Não há limitações quanto à natureza destes ingredientes, excepto que devem ser farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis para administração e não devem degradar a actividade, ou tornar perniciosamente tóxicos, os ingredientes activos das composições. Quando as composições da presente invenção são aplicadas a úlceras superficiais, queimaduras e ferimentos cirúrgicos ou acidentais, as composições estão de preferência na forma de pó, gel, pomada, unguento ou irrigante, ou podem estar impregnadas em emp lajes tros transdórmicos, adesivos e ligaduras, de preferência em forma liquida ou semilíquida, ou podem ser incorporadas numa pasta dentífrica ou numa goma ou resina de mascar.

A segunda aplicação é sistémica para cura de ferimentos internos quer depois de cirurgia quer de danos causados aos tecidos dos orgãos internos onde a cirurgia é impossível ou não é necessária. Também não há limitações quanto ao tipo de tecido ou ferimento a tratar e estes incluem (mas não lhes estão limitados) incisões cirúrgicas profundas nos orgãos e tecidos internos; osso e cartilagem (após fractura); úlceras gástricas, duodenais e outras úlceras intestinais. Quando são aplicadas sistemicamente, as composições da presente invenção podem ser apresentadas na forma de líquidos, pílulas, comprimidos, pastilhas para administração entérica, ou em forma líquida para injecção parentérica. Para o tratamento de incisões internas que se sucedem a cirurgia, as composições podem estar na forma de um irrigante, de preferência em combinação com uma solução saturada de cloreto de sódio fisiologicamente aceitável. Os ingredientes activos das composições também podem ser combinados com outros ingredientes, por exemplo adjuvantes, portadores, agentes solubilizantes e quaisquer outros factor(es) de crescimento secundários conhecidos ou ainda desconhecidos. Não há limitações quanto à natureza destes ingredientes, excepto que devem ser farmacêutica e fisiologicamente aceitável para administração e não deve degradar a actividade, ou tornar perniciosamente tóxicos os ingredientes activos destas composições.

k invenção refere-se também a um método para a prevenção ou tratamento de traumas em mamíferos, que compreende a administração de uma composição farmacêutica ou também de uma composição cosmética.

Para cicatrizar os ferimentos, a quantidade de ingrediente activo a aplicar não é muito rigorosa. Em geral, uma quantidade diária desde aproximadamente 0,1 até 10 ç.g de FCL por 1 cm de ferimento já tem um efeito cicatrizante significativo. Para uso interno, deve aplicar-se uma quantidade maior, conforme o modo de administração devido à diluição do FCL nos fluidos orgânicos. A segurança para quantidades maiores é dada pelo facto de haver FCL no leite.

Surpreendentemente, o FCL da presente invenção tem também um amplo espectro de actividades imunosupressoras, conforme se pode observar nos Protocolos III, IV e V.

Consequentemente, a presente invenção fiz também respeito a um método para a supressão de respostas imunes que compreende a administração de uma quantidade imunosupressoramente efectiva de FCL, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

efeito imunosupressor do presente FCL pode ser utilizado em operações de transplantação de órgãos ou também para evitar e tratar doenças auto-imunes, por exemplo inflamações.

Além disso, o FCL da presente invenção tem actividades ant&tumor, p.e. contra células de melanoma, conforme pode ser posto em destaque pelos efeitos antiproliferantes contra linha de célula de melanoma A 375 (Protocolo VI) e células de cancro de seio humano (Protocolo VII).

Por conseguinte, a presente invenção diz também respeito a um método para o tratamento de cancro que compreende a administração de uma quantidade de FCL antiproliferantemente efectiva, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

A quantidade de agente activo necessária dependerá da quantidade de FCL presente nas composições relevantes da presente invenção, embora experiências indiquem que são preferidas quantidades aproximadamente equimolares. As quantidades exactas dos componentes acti vos, juntamente com qualquer ingrediente extra das composições da presente invenção dependem da actividade especifica do FCL e/ou do agente activante, a doença a tratar, p.e. também da dimensão, natureza e localização do ferimento. Para aplicação tópica a ferimentos superficiais, incluindo melanoma, o FCL deve estar presente numa quantidade de pelo menos 1 nanograma até 1 miligrama por mililitro. Visto que os componentes activos da presente invenção exercem os seus efeitos por ligação a locais receptores e são depois utiliz dos pelas células cujo crescimento e migração se estão a estimular, prefere-se uma re-aplicação contínua ou periódica das composições.

Outras utilizações de FCL

Smbora o papel mais importante do leite esteja claramente na nutrição do recém-nascido, o FCL pode ter também efeitos, não exactamente ao nivel dos tecidos locais, mas pode promover o crescimento do animal

-36completo de maneira análoga à Hormona de Crescimento Humano (lICH), Neste aspecto, considera-se que as composições da presente invenção também podem ser uteis como aditivos alimentares na criação de animais novos, por exemplo vitelas, cordeiros, potros, leitões e frangos.

Assim, a presente invenção diz ainda respeito a uma composição alimentar que compreende uma quantidade promotora de crescimento de FCL ou de um seu sal e um método para estímulo do crescimento de um mamífero que compreende a administração ao referido animal de uma quantidade estimulante de crescimento de uma composição alimentar, que compreende uma quantidade promotora de FCL ou de um seu sal.

Outra aplicação e a utilização de FCL para o crescimento de células de cultura que têm dificuldade em crescer em condições de cultura normais, p.e. a linha de célula de carcinoma mamário FCL-7. Adicionalmente pode utilizar-se FCL para cultura de certas células em meios pobres em proteina ou essencialmente isentos de proteína, permitindo economizar soro utilizado na cultura de células. Assim, conforme indica a experiência de acordo com R.R. Búrk concentrações picomolares de aproximadamente 1 a 1000 pM do factor estimulam a migração e crescimento de células Balb/C 3T3 ^em meio isento de soro.

Por conseguinte, a presente invenção refere-se também a um meio de crescimento de células essencialmente isento de outras proteínas, que compreende uma quantidade estimulante de promoção de crescimento de um FCL ou de urnsu sal, e a um método para o estimulo de crescimento celular in vitro num meio essencialmente isento de outras proteínas, que compreende a adição ao referido meio de uma quantidade estimulante de crescimento de um FCL ou de um seu sal.

Breve Descrição das Figuras

As figuras 1 a 5 descrevem o progresso da purificação de FCL durante várias fases cromato gráficas. Para cada fracção são registadas a absorvencia por meio da medição da densidade ôptica (D.O.) a 280 nm, e a actividade de migração na experiência de Burk, R.R. (1973) Proc. Natl. Acad, Sei. USA 70, 369.

A Figura 1 representa os resultados da Cromatografia Permutadora de Catiões de acordo com o Exemplo la)

A Figura 2 representa os resultados da Cromatografia de Interacção Hidrófoba I de acordo com o Exemplo lb)

A Figura 3 representa os resultados da Cromatografia de Interaeção Hidrófoba II de acordo com o Exemplo lc)

A Figura % representa os resultados da Cromatografia de Intercação Hidrófoba II de acordo com o Exemplo ld)

A Figura 5 representa os resultados da Cromatografia de Exclusão de Dimensão de acordo com o Exemplo le).

Os exemplos que se seguem servem para descrever a presente invenção, mas não devem ser considerados uma limitação da mesma.

EXEMPLO 1:

Isolamento de Factor de Crescimento de Leite a partir de leite de bovino fresco

a) Cromatografia de Permuta de Catiões

Introduziu-se resina Dowex AG 50W X2 malha 50-100 (30 litros; forma H^r) numa coluna de cromatografia com a dimensão apropriada e lavou-se primeiramente com 2-3 volumes de leito de hidróxido de sódio IM em metanol a 50$, seguindo-se 3-6 volumes de leito de água destilada. A resina é depois equilibrada (na forma Na*) com 2-3 volumes de leito de fosfato di-hidrogenio de sódio 0,011-í, pil 7,0. Dilui-se leite fresco (250-400 1. ), com 4 volumes de água destilada, seguindo-se a adição de 4o ml de fluoreto de fenilmetanossulfonilo O,1M (FFMS), um inibidor protease, ao leite impuro. A solução de leite diluida é depois transferida lentamente por uma bomba através do leite de coluna a 4°C, permitindo por este meio a absorção das proteinas de leite carregado apráspriadamente à resina.

Depois de introdução, a resina é lavada com 1,5 volumes de leito de fosfato de di-hidrogénio de sódio 0,01M, pH 7,0. A coluna é depois eluida com aproximadamente 2,5 volumes de leito de fosfato di-hidrogénio de potássio 0,02M e acetato de potássio 0,7M em etanoL a 4o$, com pH 7,6 até a D.O. 280 nm voltar à linha de base. Cada fracção é imediatamente ajustada ao pH 4,5-5,5 com ácido acético, 0 acetato de potássio elui um pouco pequeno com absorvência a 280 nm e que contém muita da actividade desejada. A Figura 1 representa a absorvância a 280 nm na fase eluição, juntamente com a actividade de migração das fracções recolhidas. As fracções activas (Nos. 8-17) são reunidas, concentradas 2-3 vezes por evaporação rotativa, e armazenadas a 4°C até serem necessárias

b) Cromatografia de Intercação Hidrofoba I

Regenera-se Sefarose Fenilo CL 4b de Pharmacia, lavando com 1 volume de coluna de n-butanol, 1 volume de etanol e aproximadamente 10 volumes de água destilada. A reunião das fracções activas provenientes do parágrafo a) (volume total geralmente 40-50 litros, que pode ser reduzido por evaporação rotativa a pressão reduzida) é ajustada para pH 5,0 cora hidróxido de aménio IM num recipiente com dimensão adequada. Adicionam-se aproximadamente 750 mililitros de resina Sefarose Fenilo CL 4B, conforme preparada acima, ao recipiente, e o conteúdo é mantido em agitação lenta toda a noite a 4°C. A agitação é detida, deixa-se a resina assentar e decanta-se cuidadosamente o material sobrenadante e deita-se fora. A resina é depois transferida para um funil grande de vidro concrecionado e lavada cuidadosamente com uma quantidade de uma solução tampão, constituida por acetato de aménio O,ÓM, neces sária para que o eluente deixe de ser opaco. A resina é depois transferida para uma coluna de cromatografia com dimensão apropriada e a coluna é depois lavada com 2 volumes adicionais de acetato de aménio 0,6l-í, pH 5,0, seguindo-se fases a etanol 28^ e 40^ em acetato de aménio 0,2M, pH 5,0 que é suficiente para eluir a actividade desejada. A fase 28^o pode ser omitida para diminuir o volume. A Figura 2 representa a absorvência a 280 nm durante a fase eluição, juntamente com a actividade de migração das fracções recolhidas. As fracções activas (Nos. 113-180) são reunidas e armazenadas a 4°C até serem necessárias.

c) Cromatografia de Interacção Hidrófoba II (CLGP)

A reunião das fracções activas provenientes do parágrafo b) (volume total geralmente 2-2,5 litros) ó liofilizada ate secagem e redissolvida para um volume pequeno, geralmente 50 mililitros, de uma mistura constituida por 7 partes de etanol a 60$ para 3 partes de acetato de amónio 2M com pH 5,0, ou então concentrada 3 a 10 vezes por meio de evaporação em vácuo, Adicionam-se-lhe mais 1-2 volumes de um tampão constituido por acetato de amónio 2M com pH 5,5 e a solução ó transferida por bombagem para uma coluna de cromatografia de intercação hidrófoba Butil Poliol Si500 (dimensão de poro pm), à temperatura ambiente, com um debito de 1 mililitro por minuto. A coluna ó depois lavada com a mesma solução tampão seguida por eluição com utilização de um gradiente linear com uma quantidade crescente de etanol, neste exemplo 21-24$ acima da parte horizontal do gradiente, que foi suficiente para eluir a actividade desejada. Finalmente, separa-se o conteúdo da coluna por meio de repetições de um gradiente etanol linear de 0-100$. A Figura 3 representa a absorvência a 280 nm durante a fase eluição, juntamente com a actividade de migração das fracções recolhidas. As fracções activas (Nos. 31-4o) são reunidas e armazenadas a -209C num recipiente fechado para evitar evaporação até utilização ulterior.

d) Cromatografia de Interacção Hidrófoba III (CLGP)

A reunião das fracções activas proveniente do parágrafo c) (volume total geralmente 20-40 mililitros) é misturada com um volume igual de um tampão consttiuido por acetato de amónio 2M com pH 5,5 ® a solução é transferida por bombagem para uma coluna de cromatografia de interacção hidrófoba Octil Poliol Si500 (dimensão de poro 10 φα) à temperatura ambiente, com um debito de 1 mililitro por minuto. A coluna é depois lavada com o mesmo tampão, seguindo -se eluição cora o emprego de um gradiente linear com uma quantidade de etanol crescente, neste exemplo 40-42$ durante a parte plana do gradiente, que foi suficiente para eluir a actividade desejada. Por fim, a coluna é separada com repetições de um gradiente etanol linear 0-100$,

A Figura 4 representa a absorvência a 280 nm durante a fase eluição, juntamente com a actividade de migração das fracções recolhidas. As fracções activas (Mos. 39-42) são reunidas e armazenadas a -20²C ate serem necessárias.

e) Cromatografia de Exclusão de Dimensão (CLGP)

A reunião das fracções activas proveniente do parágrafo d) (volume total geralmente 2-10 mililitros) é liofilisada ató secagem e redissolvida em 100 microlitros de uma solução tampão constituída por 7 partes de etanol a óo$ para 3 partes de acetato de amónio 2M com pH 5,5. A reunião redissolvida é depois injectada sobre uma coluna de exclusão de dimensão TSK G2000 e efectua-se uma eluição isocrática, utilizando a mesma solução tampão, à temperatura ambiente, com um débito de 0,2 mililitros por minuto. A Pigura 3 representa a absorvência a 280 nm durante toda a fase de eluição isocrática, juntamente com a actividade de migração das fracções recolhidas. As fracções activas (Nos. 86-91) são liofilizadas e armazenadas separadamente a -20SC até serem necessárias,

FCL está presente nas fracções activas provenientes do parágrafo e) numa forma que pode chegar até 100$ pura, inclusive, e tem um peso molecular de aproximadamente 25-26.000. Sendo estes critérios estimados a partir de geles EGPA-SDS manchados com prata (com um conteúdo de 15$ de acrilamida), fez-se a prescrutação na espessura de 1,5 milímetros em 530 nm contra padrões Οζ-quimotripsinogéneo, num densímetro de prescrutação de comprimento de onda dual Shimadzu CS-93⁰· A aplicação de mancha de prata é efectuada de acordo cora Burk, R.E.. et al. ,

Methods in Enzymology. 91. 2^7-25^ (1983).

Em condições de concentração isoeléctrica em leito plano, a actividade foi recuperada de fracções com pH 9,0 a 10,5.

EXEMPLO 2

Isolamento de FOL a partir de outra fonte de leite fresco

Uma quantidade apropriada de leite fresco proveniente de outra fonte mamífera, por exemplo humana, de ovelha ou cabra, é primeiramente diluída como na cromatografia de permuta de catiões fase la), cromatografia de interacção hidréfoba e cromatografia de exclusão de dimensão, que são la) a le), após o de Leite (FCL).

efectuadas sm analogia com os Exemplos que se obtém um Factor de Crescimento

EXEMPLO 3

Isolamento do FCL proveniente de leite em pó de bovino desnatado seco

Lava-se leite em pó de bovino desnatado seco à venda no mercado (25-50 quilogramas), pondo-o em suspensão em 50-100 litros de acetona, mantendo em agitação durante uma hora a 2O5C e secando o pó lavado toda a noite à temperatura ambiente numa câmara de vácuo grande. Menos de 100 gramas de material seco perdem-se na acetona e são deitados fora. 0 pó lavado com acetona pode ser manti do à temperatura ambiente até ser utilizado. 0 leite em pó lavado com acetona (25-50 quilogramas) é adicionado a 250-500 litros de água destilada a 4°C, mantido em agitação lenta para evitar a formação de espuma durante 1 hora, θ a mistura ó ajustada desde aproximadamente pH 6,7 ató pH 7,0 com hidróxido de sódio IN. Diluição adicional do leite em pó lavado e reconstituído, cromatografia de permuta de catiões, cromatografia de interacção hidrófoba e cromatografi de exclusão de dimensão são efectuadas em analogia com os Exemplos la) a le), após o que se obtém um Factor de Cresci mento de Leite bovino.

À actividade cicatrizante de ferimentos e demonstrada com a execução de dois protocolos diferentes de cura de ferimentos de roedores experimentais

EXEMPLO 4

Creme (Tipo O/lí)

Ingredientes:
Monoestearato de sorbitano	2,0
Monoestearato de polioxietileno sorbitano	3,0
Álcool cetílico	5,0
Parafina líquida leve	8,0
Miristato de isopropilo	2,0
Substância activa, ECL	1,0
Propileno glicol	2,0
Glicerina	2,0
Ãgua desionizada	76,0

Preservantes e outros estabilizadores

q. s

Aquece-se a fase aquosa até 55-60^0, dissolve-se a substância activa naquela fase e dispersa-se nela a fase lípido fundido por meio de forte agitação. Arrefece-se até à temperatura ambiente e homogeniza-se.

De maneira análoga, pode produ zir-se um creme que compreende 0,4, 4 ou 20 yg/ml, respect vamente.

Aplicam-se 100 μΐ/cm^ deste creme no ferimento.

EXEMPLO 5
Unguento (Tipo 0/U
Ingredientes:	$
Trioleato de sorbitano	5,0
Cera microcristalina	3,0
Parafina líquida leve	9,0
Miristato de isopropilo	10,0
Álcoois de lanolina	3,0
Substância, activa, EGL	1,0
Propileno glicol	2,0
Glicerina	2 y Q
Sulfato de magnésio, hidratado	0,7
Água desionizada	65,3
Preservantes	q.s.

-lí-6Dissolve-se a substância activa na fase aquosa, com aquecimento lento, e dispersa-se a solução na fase lípido fundido. Arrefece-se até à temperatura ambiente e homogeniza-se.

De maneira análoga, pode ser produzido um unguento que compreende 0,4, 4 ou 20 pg/ml, 2 respectivamente. Deste unguento aplicam-se 100 μΐ/cm de ferimento.

EXEMPLO 6

Elixir dentifrico

Ingredientes: $

Λ -3

Substancia activa, FCL 1,0. 10 ^J

Cocoato de polietilenoglicol(7)-glicerilo 4,0

Água desionizada 13,0

Glicerina 86$ 18,0 õleo de hortelã-pimenta 10,0

Etanol 55,0

Dissolve-se a substancia activa em água desionizada. Adiciona-se e dissolve-se cocoato de PEG(7)-Slicerilo e glicerina na solução. Dissolve-se óleo de hortelã-pimenta e raisturam-se as duas soluções mantendo em agitação.

A solução ê dissolvida até

1:10 antes de usar.

EXEMPLO 7

Solução Parentérica

Ingredientes;

Substância activa, EGL

- Albumina de Soro Humano

Arginina ou Glicina x

- Hidrato de Carbono

PH mg/ml 1 mg/ml mg/ml 5-20 mg/ml hidrato de carbono é glucose, manose, dextrano, amido hidroxietilo ou uma mistura destes.

pH é ajustado com fosfato, succinato, amino ácidos ou com uma mistura destes,

Preparam-se e liofilizam-se frasquinhos com 0,5 mg de PCL/0,5 ml.

protocolo que se segue demonstra que as composições de acordo com a presente invenção são efectivas in vivo e que se pode empregar FCL em espéciesi cruzadas.

EXEMPLO 8

Pasta dentxfrica

Substância activa (FCL)	1,0.1,0
Metil celulose	0,8 g
Carbonato de cálcio	30,0 g
Sílica coloidal	3,0 g
Parafina liquida leve	2,0 g
Glicerina	20,0 g

Agente edulcorante

Agente aromatizante

Preservantes

Água desdonizada para 100,0 g

Os pós são molhados com a mistura da substância activa e metil celulose em uma parte de água desionizada, parafina e glicerina. Os aditivos são juntos em solução. Depois de reconstituição com a água restante, a pasta ó homogeneizada.

Cura de Ferimento em Ratos com a Idade de 10 Meses, Protocolo I:

Determinou-se a actividade in vivo de FCL bovino por um método baseado no protocolo descrito por Zimmerli et al.(1982) J, Infect. Dis. 146: 487 e Sporn, M.B. et al.. (1983) Science 1329.

Tubos vazios de polimetilacrila to ou politetrafluoroetileno rígidos (diâmetros interior e exterior, 10 e 12 milímetros, respectivamente; comprimento 32 milímetros), cada um perfurado por aproximadamente 250 furos espaçados de maneira regular (diâmetro 1 milímetro) e vedados em cada uma das extremidades com uma tampa de material igual, foram esterilizados com gás e inseridos subcutanearaente por meio de cirurgia, de maneira simétrica, no flanco dorsal de Ratos Vistar (com a idade aproximada de 10 meses) completamente anestesiados. Implantou-se uma gaiola de tecido esterilizada com gás no interior de cada flanco e fechou-se a incisão com grampos de metal que foram retirados 5 dias depois da cirurgia. Depois da inserção cirúrgica, as câmaras ficara envolvidas por tecido conjuntivo fibroso, embora haja uma ausência relativa de células dentro das próprias câmaras. Este modelo proporciona-nos, portanto, um espaço esterilizado, definido e fechado (no interior da câmara implantada) onde se pode quantificar uma resposta de cura de ferimento. Os ratos foram utilizados para experimentação, duas semanas depois da implantação das gaiolas de tecido, depois de cura completa da incisão. Neste momento, iniciaram-se injecções diárias de FCL (0,1 mililitros, em solução saturada de cloreto de sódio com tampão histidina esterilizada (STR/0,5$ de veiculo tampão θ

Klucel ) directamente no interior da câmara do lado esquerdo (câmara A). As doses diárias foram de 1000, 100 ou nanogramas de FCL por câmara. A actividade especifica 7 do FCL foi aproximadamente de 10 unidades por miligrama

conforme determinado por uma experiência de resposta a dose com o emprego de fibroblastos Balb/C 3T3·

Para activar a actividade do FCL, incluiu-se una pequena quantidade (20 nanogramas) de FCL' murídeo em todas as injecções de FCL, salvo indicação em contrário. Utilizaram-se câmaras contralaterais do lado direito (câmara B) como controlos de placebo, sendo estas câmaras injectadas com veiculo tampão isolado ou com veiculo tampão que continha uma quantidade de albumina de soro bovino (ASB) suficiente para que a proteína total fosse equivalente à quantidade de FCL injectada no interior da câmara do lado esquerdo. Aplicaram-se injecções diariamente uma vez por dia durante 5 dias e todos os produtos injectados foram esterilizados, isentos de endotoxina e isentos de pirogéneo, Todos os ratos foram engaiolados individualmente durante o tempo da experiência. Os ratos foram sacrificados 6 horas depois da última série de injecções e todas as câmaras foram depois retiradas dos animais, empregando técnica asséptica. 0 material fibrótico que estava nas câmaras foi pesado molhado” e mediu-se a proteína total no fluido de câmara seroso pelo método de Lowry et al., J. Bio. Chem. 193, 265 (1951). Verificou-se a esterilidade do conteúdo da câmara por meio da incubação de amostras sobre placas de Infusão Cerebro/Coração durante 72 horas a 37°C. A análise estatística dos dados foi feita por comparação de pares opostos das câmaras (à v B).

Quadro 1 indica as injecções diárias de FCL, durante 5 dias, a acumulação significativamente aumentada (até 3 vezes) de material fibroso total, numa maneira dependente de dose, em câmaras do lado esquerdo em comparação com as câmaras contralerais do lado direito que receberam apenas tratamentos com placebo (Exp. 1-3).

PCE, embora actue como agent activante, não teve efeito significativo quando isolado, sobre o nivel de material fibroso total encontrado nas câmaras relevantes (Exp. 4). 0 PCL também aumentou significa tivamente a quantidade de proteina de fluido seroso total nas câmaras do lado esquerdo, em comparação com as câmaras do lado direito contralaterais que receberam apenas tratamentos com placebo (Sxp. 1-3). 0 PCE isolado também teve pouco efeito sobre os niveis de proteina de fluido seroso total nas câmaras relevantes (Exp. 4).

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No fim das experiencias 1-3 obser vou-se constantemente, em biópsia post-mortem, que a câmara do lado esquerdo tratada com FCL estava mais firmemente fixada aos tecidos conjuntivos circundantes da parede do corpo, do que as câmaras de controlo emparelhadas respectivas, e que a espessura do material fibrótico que circundava imediatamente as câmaras tratadas com FCL era acentuadamente maior do que aquela que circunadva as câmaras de controlo emparelhadas respectivas. Esta observação conduz a pensar que os efeitos de FCL são também manifestos na área imediatamente circundante das câmaras respectivas. Não se observaram diferenças aparentes na espessura de material fibrótico circundante das câmaras na Exp. 4. As câmaras contralaterais apresentam também um pequeno aumento depende te da dose era relação ao controlo, o qual pode ser explicado por transmissão através da circulação de FCL para esta câmara.

Preparações histológicas mostraram a medida da espessura de tecido aumentada em volta das câmaras laterais esquerdas tratadas com FCL nas Exp. 1-3, e também a ocorrência de proliferação fibroblasto no interior do conteúdo do tecido de granulação fibrosa dentre da cada câmara. Encontrou-se um infiltrado esterilizado de células inflamatórias no fluido seroso tanto nas câmaras tratadas como nas de controlo, embora contagens diferenciais mostrassem uma pequena predominância de leucócitos polimorfonucleares nas câmaras de controlo do lado direito sob predominância de populações macrófagas nas câmaras do lado direito que tinham recebido FCL nas Exp. 1-3. Os conteúdos de todas as 4o câmaras nas Exp. 1-4 mostraram ser estereis depois da incubação de amostras dos conteúdos em cada câmara sobre infusão de cérebro coração durante 72 horas a 37°C.

Cura de Ferimento em Ratinhos com mais de 480 Dias de Idade, Protocolo II:

Há muito tempo que se observou mas só recentemente se fez a experimentação, que o processo de cura de ferimento se torna mais difícil à medida que a idade aumenta (Greve, G.L, (1982) Arch. Dermatol. Res. 272; 38l), o que, nestas condições, constitui um problema importante em medicina geriátrica. Decidiu-se portanto, investigar os efeitos de FCL bovino numa resposta de cura de ferimento, empregando um ferimento de espessura parcial (por queimadura do segundo grau) numa situação de cura de ferimento parcialmente deficiente ou enfraquecida, designa damente em animais idosos, utilizando um protocolo análogo descrito por Schultz, G.S. et al.,(1987) Science 235: 350.

Fizeram-se ferimentos térmicos meio dermicos singulares no tórax dorsal de ratinhos 057/ /BLé idossos (480 a 600 dias) anestesiados, cujas costas tinham sido anteriormente raspadas e depiladas com um depilatório de tipo creme à venda no mercado, por meio de uma só aplicação, durante 10 segundos, de um escantilhão de latão (l χ 1 cm, 8 g) que tinha sido equilibrada a 80°C num banho de água. A empola resultante foi retirada cirurgicamente e as queimaduras foram tratadas diariamente, durante 5 dias, com uma aplicação tópica de 25 tjl de veiculo tampão esterilizado que continha diversas quantidades de

FCL (500 nanogramas, 100 nanogramas e 10 nanogramas; acti7 vidade especifica do FCL era de aproximadamente 10 unidades por miligrama, determinada por uma experiência de resposta a dose utilizando fibroplastos Balb/C 3T3) na presen ça de uma quantidade pequena constante (20 nanogramas) de FC3 murxdeo, ou ficaram sem tratamento. Todos os materiais para aplicação tópica foram esterilizados, livres de endotoxina e livres de pirogeneo, s? todos os ratinhos foram

engaiolados individualmente durante as experiências.

Depois de 5 dias de tratamento com FCL, os ratinhos foram anestasiados, as ampolas (quando presentes) foram retiradas cirurgicamente das queimaduras, e as queimaduras foram fotografadas. Zonas de queimaduras que tinham epitélio regenerado foram delineadas sobre película plástica transparente com espessura uniforme (pelicula de projector aéreo Scotch ) e mediu-se por meio de planimetria a percentagem da zona de queimadura original que se tinha curado. Os valores indicados no Quadro 2 são as médias e gamas de avaliações de grupo. Os resultados foram também comparados com o processo de regeneração epitelial em ratinhos C57/BLÓ novos (56-84 dias de idade) com queimaduras meio dérmicas iguais mas que não foram tratadas durante a experiência. Todos os ratinhos foram engaiolados individualmente e os grupos experimentais eram constituídos por 5 ratinhos por grupo.

Quadro 2 (Ratinhos, com mais de 480 dias de idade)

Exp. Animais Tratamento Gp, Percentagem de área de queimadura original

Velho	500ng +20ng	FCL FCS	A	45
Velho	lOOng +20ng	FCL FCE	B	51
Ve lho	lOng +20ng	FCL FCS	C	54
Velho	20ng	FCS	D	78
Velho	Veiculo	S	91
Velho	N.T.		F	90
Novo	N.T.		G	36

Quadro 2 indica os resultados das análises planimétrioas e demonstra que a aplicação tópica de FCL, diariamente durante 5 dias, num veiculo portador apropriado e na presença de uma pequena quantidade de FCE murxdeo, estimulou e acelerou a regeneração epitelial em ratinhos idosos numa maneira dependente de dose (Exp.

1-3) quando comparados com FCE apenas, veiculo apenas ou ferimentos não tratados (Exp. 4-6 respectivamente). Os ratinhos novos parece terem sido suficientemente capazes de re-epitealizar com âxito os seus ferimentos na ausência de qualquer FCL aplicado topicamente (Exp. 7).

As análises histológicas dos ferimentos induzidos experimentalmente nesta série de experiências mostraram as suas extensões para (e possivelmente incluindo) a camada basal (germinativa) da epiderme. Esses ferimentos cicatrizam em primeiro lugar num processo que inclui a divisão e migração de células nos planos vertical e lateral, e num processo que dá origem não sé à re-epitelização e novo fecho do ferimento, mas produz mais tarde um engrossamento ou hiper-ceratose da epiderme regenerada. As análises histológicas mostraram também a medida do aumento (ou aceleração) deste processo de re-epitelização em animais que tinham sido tratados com FCL (Exp. 1-3) e uma ausência relativa de novos epitélios em qualquer dos grupos de controlo (Exp. 4-6). Os animais novos mostraram também uma re-epiteliazlização acentuada dos seus ferimentos (Exp. 7).

Os resultados de uma experiência análoga cora 100 ng de FCL, uma mistura de 100 ng de FCL e 100 ng de FCE, 100 ng de FCE isolado, veículo isolado, ratinhos idosos nao tratados e ratinhos novos não tratados estão compilado^ no Quadro 3.

Quadro 3

Grupo	Animal	Tratamento	Percentagem de área queimadura original remanescente no dia
1	Velho	lOOng FCL	46 í 9
O	Velho	lOOng FCL +lOOng FCE	4i i 5
3	Velho	lOOng FCE	76 í 9
lt	Velho	sé veiculo	78 í 5
5	Velho	não tratado	81-9
6	Novo	não tratado	3¾ * 5

Quadro 3 indica a regeneração epitelial de queimaduras de espessura paicial em grupos de ratinhos C57BL/6J idosos que foram tratados diariamente, durante 5 dias, com um veiculo tampão viscoso que continha FCL na presença ou ausência de FCE. Cada grupo era constituído por 5 animais. Os valores indicados são as médias gamas de 3 avaliações individuais para cada ferimento.

Cura de Ferimento em Porcos Idosos, Protocolo III:

Duas porcas idosas grandes sandáveis (com a idade de 7-8 anos; peso 25O~3QQkg) juntamente com duas porcas novas saudáveis (com a idade de 2-3 meses) da mesma raça, foram seleccionadas e confinadas separadamente em caixas de reienção apertadas durante a experiên cia, para impedir que os animais lambessem as suas feridas ou se deitassem sobre estas. Visto que os porcos são geralmente abatidos antes do fim do sou tempo de vida normal (sendo as porcas raramente mantidas em condições de criação durante mais de 4 anos), desconhece-se a duração média de vida, tanto da espécie como da casta, embora se saiba que porcas velhas produziram ninhadas aos 10 anos o chagaram aos 15-20 anos de idade. Escolheram-se porcos como modelo apropriado para ferimentos de espessura parcial no homem por causa das semelhanças de estrutura epidérmica, morfologia e velocidade de renovação de células.

Todos os animais foram raspados e depilados com a utilização de um depilatório comercia] antes do ferimento.

As porcas foram sujeitas a anejs tesia cirúrgica completa antes de sofrerem ferimentos múltiplos. Como sedativo, administrou-se Azaperone (STRESNYL , Janssen, Beerse, Bélgica; 1 mg.kg” ) intravenosamente a cade porca através da veia auricular central, seguindo-se 20 minutos depois a aplicação de Cloridrato de Metomidato (lIYPNODIL⁰, Janssen; Beers, Bélgica; 4 mg.kg”^) pela mesma via.

Equilibrou-se um escantilhão de latão (3x3 cm; 78 g) a 90°C num banho de água, colocou-se em contacto firme com a superfície dorsal depilada da pele durante exactamente 10 segundos para produzir queima duras múltiplas de espessura parcial de cada animal e retirou-se a empola resultante.

As queimaduras múltiplas de espessura parcial produzidas no tórax dorsal de porcas velhas foram tratadas diariamente durante 9 dias com 225 yl de veiculo tampão que ©ntinha FCL (4,5 yg_t 0,9 yg ou 0,45 yg), FCE (4,5 yg, 0,9 yg ou 0,45 yg) ou combinações iguais de ambos os factores (4,5 yg FCL + 4,5 yg FCE, 0,9 yg FCL + + 0,9 yg FCE, 0,45 yg FCL + 0,45 yg FCE). Estas doses foram escolhidas para que as porcas recebessem a mesma quantidade de material, por centímetro quadrado de área de superficie de ferimento, conforme se fez com os ratinhos numa experiência anterior. As queimaduras de controlo em cada animal receberam veículo apenas ou ficaram sem tratamento. Como conti lo adicional, duas porcas novas sofreram cada uaa queimaduras de espessura parcial únicas iguais que também ficaram sem tratamento durante a experiência. 0 grau de re-epitelialização para cada queimadura foi avaliado no 109 dia por planimetria e por meio de exame histológico de uma quantidade limitada de material de biópsia.

Quadro 4 indica os resultados das análises planimótricas. A re-epitelialização normal de ferimentos não tratados foi acentuadamente melhor nas porcas novas (Tratamento 12) do que nas mais idosas (Tratamento 11) durante o periodo de experiência de 10 dias. Conforme sucedeu nas experiências anteriores, uma aplicação tópica diária de FCL, quer na presença quer na ausência de FCE, melhorou acentuadamente este processo de regeneração no animal mais velho (Tratamentos 1-6) em medida suficiente para que os niveis de re-epitelialisaçao também se assemelhassem aos observados em animais novos com feridas não tratadas (Tratamento 12). A aplicação diária de Veiculo Tampão (Tratamento 10 ou FCE numa gama de concentrações de 100-500 ng cm” de área de queimadura (Tratamentos 7-9) teve pouco efeito no processo de re-epitelialização em porcas velhas,

Microscopia luminosa de materi de biópsia confirmou os resultados da análise planimétrica e revelou uma epiderme delgada, constituida, apenas por duas camadas de células epiteliais distintas, na zona Intacta em volta de cada ferimento e também a acentuação do processo de re-epitelialização em ferimentos que tinham sidc tratados com FCL (quer na presença quer na ausência de FCE). Embora não houvesse indícios visiveis de qualquer metaplasia nos epitélios acabados de regenerar, era evidente uma hiperceratose leve mas distinta em todos os grupos de ratinhos no perímetro de cada ferimento. Outra observação geral foi que ferimentos tratados com PGL (quer na presença quer na ausência de FCE) mostravam conter mais tecido de granulação, na maior parte subjacente à epiderme acabada de regenerar, do que ferimentos que tinham ficado sem tratamento ou tinham recebido tratamentos com FCE apenas ou veiculo apenas. Em geral, fizeram-se observações análogas na quantidade limitada de material de biópsia disponível a partir do ss tudo do porco, embora o aspecto estrutural da epiderme intacta em volta dos ferimentos em animais idosos se assemelhasse mais de perto à disposição bem definida em camadas múltiplas que ó característica do animal mais novo.

Quadro 4;

(Porcas Idosas)

Q Quadro 4 indica a Regeneração Epitelial de queimaduras de espessura parcial em duas porcas brancas grandes e idosas tratadas diariamente durante 3 dias com um veiculo tampão viscoso que continha PCL na presença ou na ausência de PCE. Os valores indicados são as medias e gamas de 3 avaliações individuais para cada animal.

Animal		Tratamento	Percentagem de	' área	de
		+ Número		queimadura, ori remanescente n	g^íà	10
				Animal 1	Animal	2
Velho	1.	4.5 pg	FCL	7 + 4	10 +	2
Velho	2.	0.9 pg	FCL	10 + 2	12 +	4
Velho	3.	0.45 pg FCL	15 + 6	15 +	5
Velho	4.	4.5 pg	FCL +	9 + 2	18 +	4
		4.5 pg	FCE
Velho	5.	0.9 pg	FCL	18 + 2	20 +	2
		0.9 pg	FCE
Velho	6.	0.45 pg 0.45 pg	FCL FCE	17 + 4	21 +	5
Velho	7.	4.5 pg	FCE	26 + 4	29 ±	2
Velho	8.	0.9 pg	FCE	28 + 3	36 +	3
Velho	9.	0.45 pg	FCE	29 + 2	37 +	4
Velho	10.	só veiculo	31 + 6	37 +	5
Velho	11.	não-tratado	42 + 6	40 ±	6
Velho	12.	não-tratado	8 + 2	7 +	3

Os resultados nos Protocolos

I a III indicam que o FCL pode acelerar e aumentar significativamente a cura de ferimentos, como primeiro e segundo objectivos, in vivo, ao passo que em ambos os exemplos, tra tamentos só com placebo ou só com agente activante não produziram uma resposta análoga.

Resposta Imune Celular, Protocolo IV

Reacção de leucócito misturado numa dix-ecção (RLM):

Misturaram-se linfócitos de duas estirpes diferentes de ratinhos (CBA e Balb/c) uns com os outros in vitro em poços de placa TC 96 (2 xlCr células, provenientes de cada estirpe por poço; os linfócitos CBA foram respondedores e os linfécitos 3alb/c irradiados foram estimuladores) e a resposta de proliferação foi medida depois de 72 horas por meio de incorporação de H-timidina.

~ -1

Resultado : -1000 pg.ml de FCL causaram 5θ/β de inibição de proliferação.

Experiência de célula T cIonada (ratinho):

Incubou-se um clone célula T de longo prazo de ratinho especifico para um antigénio solúvel (arsenato-tirosina) in vitro em poços de placa TC 96 (l<r células por poço) com macrofagos peritoneais de ratinho (2 x lCr células por poço) vibrados anteriormente com antigénio. Mediram-se a proliferação e a produção de células T de interferon-7 depois de decorridas 72 horas.

Resultado: -~500 pg.ml de FCL provocaram 5θ$ de inibição de proliferação e de libertação de IPN-Y.

Experiência de linfocito murídeo:

Linfócitos murídeo não prepara dos foram estimulados in vitro em poços de placa TC 9Ó (lO’ cólulas por poço) com lipopolissacarídeo (LPS, 2,5 yg por poço) e mediu-se a resposta proliferante depois de de3 corridas 72 horas por meio de ^H-Timidina.

Resultado: - 1000 pg.ml de FCL causaram 5 o/ de inibição de proliferação nesta experiência.

Experiência de linfócito T humano;

Linfócitos T humanos foram K estimulados in vitro em poços de placa TC 96 (lCr células por poço) com a) fitohemaglutinina A (EHA, 0,5$) ou b) anticorpo Anti-T3 mais Éster Phorbol (pDBu, 1 ng ml , ou c) inomicina (0,25 VS ml ^) mais PDBu (10 ng ml ^). Mediram-se as respostas proliferantes depois de decorridas 72 horas, por meio da incorporação de H-timidina.

Resultado: a) -~pg ml de ECL causaram 50$ de inibição de proliferação

b) -~1 pg ml’*' de ECL causaram 50$ de Inibição de proliferação

c) -~1O pg al^ de FCL causaram 50$ de inibição de proliferação.

Experiência de linfócito T humano especifico antigéneo:

Linfócitos T humanos acabados de isolar foram estimulados in vitro em poços de placa TC

9é (ICr células por poço) com um antigéneo especifico, toxóide de tétano, e mediu-se a resposta proliferante por meio 3 da incorporação de Ií-timidina.

~ -1

Resultado: -50 pg ml de FCL causaram 50$ de inibição de proliferação.

Experiência de célula T clonada (Humana)

Um clone de célula T de longo prazo humana (h?4 ⁺/ TS ) especifico para um antigénio especifico, derivado de proteína purificada a partir de microbactérias (DPP), foi incubado in vitro em poços de placa TC 96 (2x10** células por poço) com:

a) monócitos humanos isélogos (IO³ células por poço) que tinham sido vibrados anteriormente com antigénio ou

b) células isólogas provenientes de um Virus Epstein Barr (VSB) - linha de célula B transformada (8x10^ células por poço).

Mediram-se as respostas de proliferação depois de decorridas 72 horas por meio de 3 incorporação de H-timidina.

Resultados: a) -500 pg ml de PCL causaram 50$ de inibição de proliferação

b) -10 pg ml de PCL causaram 50$ de inibição de proliferação.

Proliferação accionada por 11-2 de linfoblastos ConA humanos

Incubaram-se linfoblastos con canavalin A (ConA) humanos in vitro em poços de placa TC (10 células por poço) na presença de interleucina 2 recombinante (rIl-2, 2 ou 9 ⁿS ml^-’*') e mediu-se a resposta de proliferação depois de decorridas 96 horas por meio de 3 incorporação de I-I-timidina.

W X

Resultado: fQ,l pg ml de FCL causaram 50$ de inibição de proliferação.

Proliferação accionada por 11-4 de linfocitos T humanos

Incubaram-se linfócitos T humanos não preparados (\ 95$ T3⁺) in vitro em poços de plac Tc 96 (l<r células por poço) na presença de PDBu (10 ng ml mais interleucina 4 recombinante (rIl-4, 10 ng ml ) e mediu-se a resposta proliferante depois de decorridas 72 3 horas por meio de incorporação de H-timidina.

Resultado: - 500 pg ml^-’*' de FCL causaram 50$ de inibição de proliferação.

Resposta lraun.e I-Iumoral, Protocolo V;

Prepararam-se ratinhos in vivo com um conjugado hapton-portador (Dinitrofenil-globulina gama de frango; DKP-CGG, 200 yg por ratinho). Dois meses depois, provocaram-se células de baço in vitro em poços, de placa TC 96 (3x10''’ células por poço) com DNP-GGG (10 ng-10 ng por poço) e o número de células formadores de anticorpo anti-hapton (DHP) foi determinado 4 dias depois por meio de uma experiência de placa Jerne.

Resultado: -50 pg.ml’’¹· de PCL causaram 50$ de inibição de células B formadoras de anticorpo.

-1000 pg-ml de POL causaram também 5θ$ de inibição de proliferação.

Lise de Célula de Tumor, Protocolo VI

Experiência MAP:

Estimularam-se monécitos humanos aderentes em placas TC 96 durante 24 horas com diferentes concentrações de PCL. Depois de lavar os monécitos uma vez, juntaram-se células alvo Melanoma A375. 0s controlos incluíram macrófagos e células de tumor isolados, uma mistura de macrófagos não estimulados com células alvo, o dissolvente Klucel (cf. Protocolo l) e padrões MAP.

Depois de decorridas 72 horas de incubação, as monocamadas de células foram lavadas uma vez, fixadas e manchadas com violeta cristal durante 15 minutos. Lavou-se energicamente a mancha não ligada. As células manchadas restantes foram ligadas com ácido acético e mediu-se D.O. a 590 nm com um Fotémetro Canal Multiskan-8 equipado com um CP M24 Olivetti para calcular a activL dade dos compostos em experiência. Os dados estão expressos em ΒΕ^θ.

Resultados: tratamento com FCL estimulou os monécitos para actividade citolítica de tumor. Encontrou-se a ΕΕ^θ na concentração 0,17 - 0,l4 ng.ml·⁵· (n = 4 experiências).

Os controlos Klucel estiveram inactivos.

Citotoxidade para proliferação de células Melanoma A375?

Diluiu-se FCL em meio C-RPKE + + FCS a 5$ ®m placas Tc 96. Os controlos foram meio isolado e Klucel. (lOO ng de FCL foram dissolvidos em 50 ç.1 de

Klucel e depois diluidos com meio C-RPMC + FCS a 5$), Adi4 z cionaram-se 1,2 x 10 células alvo A375 em cada poço. Depois de decorridas 72 horas de incubação a 37°C em CO^ a 5$, as monocamadas de células de tumor A375 foram manchadas e calculou-se a actividade citotéxica pelo processo descrito para a experiência MAF.

Resultados: 0 FCL foi citotéxico para proliferação de células de tumor À375 melanoma. Encontrou-se a EE_ na con« * jL centração 0,18 - 0,12 ng. ml (n = 4 experiencias).

Estas experiências indicara que as concentrações de FCL que estimulam monécitos para

70citólise de tumor e a actividade citotéxica de tumor directa estão muito próximas (0,17 - 0,14 contra 0,18 0,12).

Inibição de Crescimento de linhas de célula de cancro do seio dependente de Estradiol e independente de Estradiol. Protocolo VIIi

Duas linhas de célula de carcinoma mamário humano com receptores estradiol, HCF-7 e ZR-75-1, e uma linha de célula de carcinoma mamário humano sem receptores estradiol mensuráveis, MDA-MB-231, foram semeadas separadamente em placas TC 96 com uma densidade de 3-6x10^ células por poço e estimuladas com diferentes concentrações de FCL em dissolvente Klucel (cf. Protocolo i). 0s controlos incluiram células de carcinoma isoladas e células de carcinoma cultivadas na presença de dissolvente Klucel isolado. Depois de 8-10 dias de incubação em condições isentas de soro definidas, as monocamadas de células foram lavadas e depois fixadas e manchadas com violeta cristal durante 15 minutos. Uma mancha não ligada foi lavada intensamente, e, visto que a mancha ligada estava confinada ao núcleo, esta técnica proporcionou uma experiência colorimétrica para medição do crescimento e proliferação de células. Mediu-se a D.O. a 59θ mu com um Fotómetro Canal Multislcan-8 equipado com um CP M24 Olivetti para calcular a actividade dos compostos em experiência sobre o crescimento de células de carcinoma durante o tempo da experiência.

tf

Resultados: Tratamento com FCL, numa gama de concentração - 9 -13 de 10 a 10 M, inibiu o crescimento das linhas de celu las dependentes de estradiol MCF-7 e ZR-75-1, e da linha de células independentes de estradiol MDA-MB-231, em comparação com células de controlo não tratadas. 0 dissolvent Iilucel não tem efeito era qualquer das linhas de célula nes ta experiência.

Claims (17)

1&. - Processo para a preparação de um Factor de Crescimento de Leite (FCL), tendo um peso molecular de aproximadamente 25 kd como determinado por SDS-PAGE e um ponto isoelectrico entre pi 9,0 e 10,5, ou de um seu sal, caracterizado por o FCL ser recuperado a par tir do leite ou de qualquer produto lácteo que o contenha e, quando requerido, se transformar um FCL livre obtido num sal ou um sal obtido no FCL livre.

2&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o Factor de Crescimento de Leite ser obtido a partir de leite em forma enri3 7 quecida 10 a 10 vezes.

3&, - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o Factor de Crescimento' de Leite, ou um seu sal, ser essencialmente livre de outros factores de crescimento que se encontram no leite que têm peso molecular menor ou maior e um pi diferente.

4-2·. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se preparar o Factor de Crescimento de Leite essencialmente puro.

5&. _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o Factor de Crescimento de Leite, ou um seu sal, ser obtido a partir de leite de bovino na sua forma essencialmente purificada tendo a seguinte composição em amino-ácidos

-73Amino-ác ido

Amino-ác ido s/Mole

a) b) ASP + ASN 21,10 20 GLU + GLN 24,68 24 SER 19,00 18 THR 10,02 10 GLI 10,62 10 ALA 14,64 14 ARG 9,50 10 PRO 12,92 12 VAL 10,68 10 MET 0,16 2 ILE 11,04 10 LEU 22,40 22 TRP não determinado FEN 7,78 8 Cis 11,16 12 L.]S 16,14 16 HIS 5,84 6 TIR 13,38 14

/a): moles de amino-ácido por mole de peptideo;

b): arredondado para dar resíduos de amino ácido por mole de peptideo7 e a seguinte sequência de amino-ácidos N-terminais

15 10

Ala-Leu-Asp-Ála-Ala-Tir-Cis-Fen-Arg-Asn-Val-Gln-Asp-Asn-Cis-Cis-X^{15 * 17}-X¹⁸-^X9Pro,

17 18 z na qual X e X são amino ácidos não determinados.

Sc

6^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se recuperar FCL a partir de leite de vaca fresco.

7^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se recuperar FCL a partir de leite de vaca em pó desnatado seco.

8^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fonte do FCL ser submetida a um ou mais processos cromatográficos.

9^a. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a fonte do FCL ser submetida a cromatografia de permuta de catiões, cromatografia de interacção hidrófoba, cromatografia de exclusão de dimensões, e/ou, se for necessário, outros processos de purificação.

10^a. - Processo para a preparação de uma combinação sinérgica, caracterizado por se incluir na referida combinação FCL e qualquer polipeptídeo, que exerce um efeito agonista por ligação a receptores de Factor de Crescimento Epidérmico (FCE).

11^a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz de um Factor de Crescimento de Leite, de acordo com a reivindicação 1, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável em forma de dosagem unitária.

12 â. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz de uma combinação de FCL, de acordo com a reivindicação 1, e qualquer polipeptideo que exerce um efeito agonistico por meio de ligação a receptores de FCE.

13®. - Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por se obter uma composição farmacêutica que é uma pasta dentifrica ou um elixir dentifrico.

l4a. - Processo para a preparação de uma composição cosmética, caracterizada por se incluir na referida composição uma quantidade eficaz de Factor de Crescimento de Leite de acordo com a reivindicação 1, ou um seu sal.

15~- - Processo para a preparação de uma composição alimentar, caracterizada por se incluir na referida composição uma quantidade promotora de crescimento de FCL ou de um seu sal.

l6a. - Método para a prevenção ou tratamento de traumas em mamíferos, caracterizado por compreender a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,1 a 1000 ^.g.

17®. - Método para a supressão de respostas imunológicas, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade imunosupressivamente eficaz de FCL, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,1 a 1000 qg.

7618-. - Método para o tratamento de cancro, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade antiproliferativamente eficaz de FCL, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,1 a 1000 pg.

19-· - Método para estimulo de crescimento de um mamifero, caracterizado por compreender a administração ao referido animal de uma quantidade estimulante de crescimento de uma composição alimentar de acordo com a reivindicação l4, sendo a gama de dosagem de composto activo de 0,1 a 1000 pg.

20S. - Meio de crescimento celular, caracterizado por compreender uma quantidade estimulante promotora de crescimento de um FCL de acordo com a reivindicação 1 ou de um seu sal.

2is. - Processo para o estimulo de crescimento celular in vitro num meio caracterizado por compreender a adição ao referido meio de uma quantidade estimulante de crescimento de um FCL de acordo com a reivindicação 1 ou de um seu sal.