PT639079E

PT639079E - Composicao para tratamento de doencas mediadas por interleuquina-1 e factor de necrose tumoral

Info

Publication number: PT639079E
Application number: PT93910992T
Authority: PT
Inventors: Robert C Thompson; Deborah A Russell
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-28
Publication date: 2000-04-28
Also published as: CA2118119A1; DK0639079T3; JP2002220342A; EP0639079B1; AU672606B2; CA2118119C; DE69327582D1; EP0639079A1; DE69327582T2; AU4229493A; ES2142341T3; WO1993021946A1; ATE188610T1; GR3033144T3; JPH07509223A

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS MEDIADAS POR INTERLEUQUINA-1 E FACTOR DE NECROSE TUMORAL"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se de um modo geral a uma composição farmacêutica para prevenir e tratar doenças, e mais particularmente a uma composição farmacêutica para prevenir e tratar certas doenças mediadas pelo Factor de Necrose Tumoral (TNF) e doenças mediadas por Interleuquina-1 (IL-1). A inflamação é a reacção de defesa do corpo a lesões, tais como as causadas por danos mecânicos, infecção ou estimulação antigénica. Uma reacção inflamatória pode ser expressa patologicamente quando a' inflamação é induzida por um estimulo inapropriado tal como um autoantigénio expresso de uma maneira exagerada, ou persiste muito depois da remoção dos agentes da lesão. Nestas condições a inflamação pode expressar-se de uma forma crónica. A mediação de doenças inflamatórias agudas tais como choque séptico e doenças inflamatórias crónicas tais como artrite reumatóide e doença inflamatória do intestino, tem sido associada a actividades pró-inflamatórias de IL-1 e TNF. 0 TNF e a IL-1 são compostos que ocorrem naturalmente que são frequentemente referidos como citoquinas. As citoquinas são proteínas extracelulares que modificam o comportamento das células, particularmente daquelas células que estão na área imediata da síntese e libertação de citoquinas. ;.;?;.Uma das citoquinas inflamatórias mais potentes até agora descobertas e uma citoquina que se pensa ser um mediador chave em muitas doenças e condições médicas é a IL-1. A IL-1, que é produzida, embora não exclusivamente, por células da linhagem 1

V L-Cj ^ macrófago/monócito, pode ser produzida em duas formas, IL-1 alfa (IL-Ια) e IL-1 beta (IL-Ιβ).

Os Factores da Necrose Tumoral (TNFs) são uma classe de citoquinas produzidas por numerosos tipos de células, incluindo monócitos e macrófagos. Pelo menos dois TNFs foram previamente descritos, especificamente TNF alfa (TNFa) e TNF beta (TNFP ou linfotoxina). Estes TNFs conhecidos têm efeitos fisiológicos importantes num número de diferentes células alvo envolvidas na resposta inflamatória. As proteínas provocam em fibroblastos e em células sinoviais a secreção de colagenase latente e prostaglandina E2, e em células osteócito provocam a estimulação da reabsorção óssea. Estas proteínas aumentam as propriedades adesivas da superfície de células endoteliais em neutrófilos. Também provocam nas células endoteliais a secreção de actividade coagulante e a redução da sua capacidade de lisar coágulos. Adicionalmente, redireccionam a actividade dos adipócitos para fora do armazenamento de lípidos por inibição da expressão da enzima lipase de lipoproteína.

Os TNFs provocam em hepatócitos a síntese de uma classe de proteínas conhecidas como "reagentes de fase aguda" que actuam no hipotálamo como pirogénios. Através destas actividades, foi observado que os TNFs têm um papel importante na resposta de um organismo a uma variedade de indicações tais como infecção e lesão. Ver, p. ex., artigos por P.J. Selby et al., Lancet, 27 de Fevereiro, 1988, pg. 483; H.F. Starnes, Jr. et al., J. Clin. Invest., vol. 82, pg. 1321 (1988); A. Oliff et al., Cell, vol. 50, pg. 555 (1987) e A. Waage et al., Lancet, 14 de Fevereiro, 1987, pg. 355.

As actividades tanto de IL-1 como de TNF são detectadas no soro e em outros fluidos corporais amostrados em doenças inflamatórias humanas. Em sistemas experimentais, após um curto período de estímulos de lesões, a cinética da libertação de IL-1

e TNF na circulação segue um padrão bem caracterizado. A administração de uma pílula grande do produto bacteriano 2

lipopolissacárido (LPS) a babuínos provoca a síntese e a libertação de TNF e de IL-1 a picos sequenciais às 2 e 6 horas, respectivamente, após indução. A fonte celular de IL-1 e de TNF difere. Enquanto que o TNF é principalmente sintetizado apenas pelos monócitos, a IL-1 pode ser produzida por virtualmente todos os tipos de células nucleadas. Contudo, nos estágios primários de reacções inflamatórias, as células mais prováveis de estar envolvidas na produção de IL-1 são células epiteliais e endoteliais e células da linhagem monócito/macrófago. A síntese de IL-1 e de TNF é normalmente estimulada por produtos bacterianos, lectinas, complexos imunitários, e uma variedade de estímulos nocivos que produzem dano nos tecidos. A .IL-1 e o TNF partilham as seguintes actividades pró-inflamatórias: (1) aumenta a aderência dos neutrófilos ao endotélio vascular, (2) activam a explosão respiratória em neutrófilos e monócitos, (3) estimulam a reabsorção da matriz da cartilagem e do osso, (4) estimulam a libertação- de prostaglandina da proliferação de um número de tipos de células e (5) estimulam a febre, caquexia, anorexia e proteínas de fase aguda.

Adicionalmente às propriedades inflamatórias partilhadas, as observações que (1) IL-1 e TNF são sintetizados em resposta ao mesmo estímulo inflamatório e que (2) o próprio TNF induz a libertação de IL-1, indicam que existe uma relação estreita entre os dois sistemas de citoquinas. De facto, os efeitos sinergísticos de estimulação combinada com IL-1 e TNF têm sido observados em muitos sistemas experimentais de inflamação. Um efeito sinergístico é definido como aquele que ocorre quando o efeito de dois agentes em combinação é maior do que a soma algébrica dos seus efeitos individuais. Por exemplo, a injecção de doses sub-máximas de IL-1 e de TNF na articulação do joelho de coelho resulta numa sinergia marcada em relação à acumulação de neutrófilos polimorfonucleares (Henderson, B., Clin. Exp. Immunol. 75:306-310(1989)). Adicionalmente, a administração 3 U ΐ combinada de IL-1 e TNF a ratos em doses que são individualmente sub-letais causa a indução sinergistica de uma condição séptica semelhante ao choque, que é letal para 100% dos ratos (Everaerdt, B., Biochem.Biophys. Res. Commun., 163:378 (1989);

Waage et al., J. Exp. Med., 161: 1987-1992 (1988). Assim, se em estados de doença tanto IL-1 como TNF são necessários para desencadear uma resposta patológica completa por via de uma interacção sinergistica, então crê-se que a administração de um inibidor de IL-1 ou de um inibidor de TNF será suficiente para inibir maximamente uma resposta inflamatória. A EP-A-0422339 revela inibidores de TNF como terapêuticos úteis contra o choque séptico e caquexia. Este documento revela ainda que inibidores de TNF podem ser ainda mais eficazes quando administrados em conjunto com inibidores de interleuquina-1. Um inibidor de IL-1 especifico não é mencionado na EP-A-0422339. A EP-A-0418014 revela proteínas receptoras do factor de necrose de tumores para supressão de respostas inflamatórias dependentes de TNF. É ainda revelado que uma terapia de combinação utilizando ambos os receptores de IL-1 ou os receptores de IL-2 pode ser preferida no tratamento de indicações clínicas associadas a TNF.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A descoberta inesperada e surpreendente do resultado referente à presente invenção é a capacidade de um inibidor de IL-1 e um inibidor de TNF agirem não apenas aditivamente mas também sinergisticamente em alguns casos no tratamento de doenças mediadas por IL-1 e por TNF. Assim, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo o inibidor de IL-1, IL-lra, e um inibidor de TNF num transportador farmaceuticamente aceitável. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para o tratamento de certas doenças e condições médicas - muitas das quais podem ser caracterizadas como doenças inflamatórias - que 4 \

U são mediadas tanto por IL-1 como por TNF. De entre as indicações que podem ser tratadas com a composição da presente invenção estão o choque séptico, artrite, doença inflamatória do intestino, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, fibrose pulmonar, lesão isquémica e lesão reperfusora.

Os inibidores de TNF que podem ser utilizados na presente invenção são proteínas que ocorrem naturalmente e formas truncadas de proteínas que ocorrem naturalmente. As proteínas que ocorrem naturalmente são úteis porque apresentam um risco relativamente baixo de produção de efeitos colaterais imprevistos em doentes com elas tratados. Noutras realizações desta invenção, muteínas de inibidores proteicos de TNF em que apenas uma pequena parte dos resíduos de aminoácidos diferem da sequência da proteína natural são também referidas como inibidores de TNF.

Os inibidores de TNF podem ser fragmentos solúveis de proteínas de receptor de TNF. Os inibidores de TNF que são úteis na presente invenção incluem proteínas de ligação da TNF humana (TNFbp), particularmente fragmentos solúveis de proteínas de receptor de TNF, incluindo, por exemplo, o inibidor de TNF de 30 kDa e o inibidor de TNF de 40 kDa. O inibidor de TNF de 4 0 kDa pode ser o inibidor de TNF de 4 0 kDa total ou .as formas truncadas do inibidor de TNF de 40 kDa Δ51 e o inibidor de TNF de 40 kDa Δ53. Também úteis são proteínas que tenham sido modificadas, por exemplo, através da adição de polietilenoglicol (PEG) ou qualquer outro polímero repetido para aumentar a sua semi-vida de circulação e/ou diminuir a imunogenicidade. Os inibidores de TNF que actuam como antagonistas receptores de TNF também estão incluídos no âmbito desta invenção.

Embora a produção de inibidores de TNF possa ser alcançada por extracção a partir de fontes disponíveis na Natureza tal como por isolamento a partir de urina humana, um método preferido de produção de inibidor de TNF é através de tecnologia do ADN recombinante. A tecnologia do ADN recombinante é 5 U/ ^ preferida em parte porque é capaz de produzir quantidades de inibidores de TNF comparativamente maiores em graus de pureza superiores.

Inibidores de TNF adicionais incluem muteinas de inibidor de TNF de 30 kDa em que aminoácidos seleccionados do inibidor de TNF de 30 kDa são substituídos por cisteína. Tais muteinas podem ser utilizadas como inibidores de TNF ou podem ser feitas reagir com polietilenoglicol (PEG) para formar compostos PEG de

inibidor de TNF contendo um ou dois inibidores de TNF por molécula. Numa realização preferida o inibidor de TNF é uma espécie bivalente formada numa reacção entre uma muteína inibidor de TNF de 30 kDa e um percursor de PEG bifuncionalizado. A muteína preferida é o inibidor de TNF de 30 kDa C105, em que o resíduo 105 do inibidor de TNF de 30 kDa é substituído por um resíduo de cisteína.

Os inibidores de IL-1 úteis na presente invenção são proteínas e, mais particularmente, são proteínas que ocorrem naturalmente. As proteínas que ocorrem naturalmente são particularmente úteis porque apresentam um risco relativamente baixo de produção de efeitos colaterais imprevistos em doentes com elas tratados.

Uma classe útil de inibidores de interleuquina-1 é uma proteína humana que actua como um antagonista natural do receptor da interleuquina-1 (IL-lra). Preferencialmente, o IL-lra que é preferido na prática da presente invenção é seleccionado a partir do grupo consistindo em IL-lraot, IL-lrap, IL-lrax, ou os derivados metionil N-terminal destes IL-lra. Também preferidas são proteínas que podem ser modificadas por exemplo através da adição de polietilenoglicol (PEG) ou qualquer outro polímero repetido para aumentar a sua semi-vida de circulação e/ou para diminuir a sua imunogenicidade.

Embora a produção de IL-lra possa ser alcançada por extracção a partir de fontes disponíveis na Natureza tal como por isolamento a partir de meio condicionado de monócitos 6

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u t humanos em cultura, um método preferido de produção de IL-lra é através de tecnologia do ADN recombinante. A tecnologia do ADN recombinante é preferida em parte porque é capaz de produzir quantidades de IL-lra comparativamente maiores em graus de pureza superiores.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta os aumentos máximos no diâmetro das articulações durante o período de 72 horas após reactivação induzida por LPS (* = a diferença significativa entre TNFbp + IL-lra vs. Veículo a p < 0,025; TNFbp + IL-lra vs. TNFbp a p < 0,025; e TNFbp + IL-lra vs. IL-lra a p < 0,010 pelo teste de t desemparelhado).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Como acima referido, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para prevenir e tratar doenças mediadas por IL-1 e TNF em doentes sofrendo dessas doenças. Uma utilização desta composição compreende o fabrico de um medicamento para administração de quantidades terapeuticamente eficazes de inibidor de TNF e de inibidor de IL-1 a um doente sofrendo de doença mediada por TNF ou IL-1. Embora não esteja provado teoricamente, a inter-relação que se sabe existir entre TNF e IL-1 sugere que a maioria, se não todas, as doenças mediadas por TNF deverão também ser doenças mediadas por IL-1 e vice-versa.

Como acima descrito, sabe-se que os inibidores de TNF podem ser empregues com sucesso para prevenir ou tratar doenças mediadas por IL-1, e que inibidores de IL-1 podem ser empregues com sucesso para prevenir ou tratar doenças mediadas por IL-1. O resultado inesperado e surpreendente verificado pelos inventores da presente invenção é a capacidade do inibidor de IL-1 e do inibidor de TNF actuarem sinergisticamente no tratamento de 7 r

doenças mediadas por IL-1 e por TNF. "Sinergisticamente" é aqui utilizado para referir uma situação em que o benefício provocado pela administração conjunta de inibidores é maior do que a soma algébrica dos efeitos resultantes da administração separada dos componentes da combinação.

Embora a presente invenção se refira a uma composição para prevenir e tratar doenças humanas, as utilizações veterinárias estão também incluídas dentro do âmbito desta invenção, dado que são fornecidas instruções para utilização fisiológica geral.

Uma doença ou condição médica é considerada "uma doença mediada por TNF" se a doença ou condição médica espontânea ou experimental estiver associada a níveis elevados de TNF nos fluidos corporais ou em tecidos adjacentes ao foco da doença ou indicação no corpo. As doenças mediadas por TNF podem também ser reconhecidas pelas duas condições seguintes: (1) descobertas patológicas associadas à doença ou condição médica poderem ser experimentalmente mimadas em animais pela administração de TNF; e (2) a patologia induzida em modelos animais experimentais da doença ou condição médica poder ser inibida ou abolida através do tratamento com agentes que inibem a acção de TNF. Muitas das doenças mediadas por TNF satisfazem duas destas três condições e outras satisfazem as três condições. Uma lista não exclusiva de doenças mediadas por TNF inclui o síndroma da dificuldade respiratória do adulto, fibrose pulmonar, artrite, doença inflamatória do intestino e choque séptico.

Uma doença ou condição médica é considerada "uma doença mediada por interleuquina-1" se a doença ou condição médica espontânea ou experimental estiver associada a níveis elevados de IL-1 nos fluidos corporais ou em tecidos ou se as células ou tecidos retirados do corpo produzirem níveis elevados de IL-1 em cultura. Em muitos casos essas doenças mediadas por interleuquina-1 são também reconhecidas pelas duas seguintes condições adicionais: (1) descobertas patológicas associadas à doença ou condição médica poderem ser experimentalmente mimadas 8 \ | em animais pela administração de IL-1; e (2) a patologia induzida em modelos animais experimentais da doença ou condição médica poder ser inibida ou abolida através do tratamento com agentes que inibem a acção de IL-1. Na maior parte das "doenças mediadas por interleuquina-1" estão reunidas pelo menos duas das três condições, e em muitas "doenças mediadas por interleuquina-1" estão reunidas todas as três condições. Uma lista de doenças ou condições médicas que são mediadas por interleuquina-1 inclui, mas não se limita a artrite, doença inflamatória do intestino, choque séptico, dano isquémico, dano de reperfusão, osteoporose, asma, diabetes insulinica, leucemia mielógena e outras, psoríase e caquexia/anorexia. São preferidas as proteínas inibidoras que ocorrem naturalmente em parte porque apresentam um risco comparativamente baixo de produzir efeitos colaterais imprevisíveis e indesejáveis em pacientes com elas tratados.

Para efeitos da especificação e reivindicações, uma proteína é considerada como "ocorrendo naturalmente" se ela ou uma proteína substancialmente equivalente existir normalmente em humanos saudáveis. As proteínas que "ocorrem naturalmente" incluem especificamente formas de proteínas que existem em humanos saudáveis que estão parcialmente truncadas nas extremidades carboxilo de tais proteínas, bem como formas não glicosiladas de proteínas que existem em formas glicosiladas em humanos saudáveis. As proteínas que "ocorrem naturalmente" podem ser obtidas através de métodos de ADN recombinante bem como por isolamento a partir das células que ordinariamente as produzem. Que "ocorrem naturalmente" também compreende proteínas que contenham um grupo metionilo no N-terminal como consequência da expressão em E. coli. "Substancialmente equivalente", como utilizado ao longo da especificação e das reivindicações, é definido como significando possuir um grau muito elevado de homologia de resíduos de aminoácidos (Ver na generalidade M. Dayhoff, Atlas of Protein 9 p U, ^

Sequence and Structure, vol. 5, p. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., especificamente aqui incorporado por referência) bem como possuir actividade biológica comparável.

Entre os inibidores de TNF úteis na presente invenção estão as proteínas que ocorrem naturalmente que existem in vivo como proteínas de ligação de TNF que estão descritas no Pedido de EP N° 90 113 673.9 entitulada "Inibidor do Factor de Necrose Tumoral (TNF) e Método para Obter o Mesmo", depositado em 17 de Julho de 1990.

Existem duas formas distintas de inibidores de TNF preferidos, cada um revelado e descrito no Pedido de EP N° 90 113 67 3.9. 0 primeiro destes é o inibidor de TNF de 30 kDa, que foi identificado e isolado a partir de meio condicionado por células humanas U937 e a partir de urina humana. O inibidor de TNF de 30 kDa tem aproximadamente 30 kDa em SDS-PAGE e elui de uma coluna de DEAE CL6B com NaCl a cerca de 80 milimolar em tampão Tris, pH 7,5. O inibidor de TNF de 30 kDa mostrou inibir a actividade de TNF alfa e tem pouco efeito sobre a actividade de TNF beta. A proteína que ocorre naturalmente é glicosilada. O inibidor de TNF de 30 kDa não glicosilado também exibe actividade inibitória de TNF. A segunda forna de inibidores de TNF é o inibidor de TNF de 40 kDa, que também foi identificado e isolado a partir de pelo menos um meio condicionado por células humanas U937 e de urina humana. O inibidor de TNF de 40 kDa total é uma glicoproteína que migra a aproximadamente 40 kDa em SDS-PAGE e elui de uma coluna de DEAE com NaCl a cerca de 100 milimolar em tampão Tris, pH 7,5. Este inibidor de TNF de 40 kDa mostrou inibir a actividade de TNF alfa e de TNF beta. A proteína glicosilada exibe actividade inibidora de TNF.

Foram produzidas de forma recombinante três formas de inibidor de TNF de 4 0 kDa, produzidas por expressão em E. coli. Cada uma destas formas, referidas como inibidor de TNF de 40 kDa 10 V Γ u

total, inibidor de TNF de 40 kDa Δ51 e inibidor de TNF de 40 kDa Δ53 (juntamente com o inibidor ' de TNF de 4 0 kDa total glicosilado, como isolado a partir de meio condicionado por células humanas U937 e de urina humana, nas formas glicosilada e não glicosilada, todos eles colectivamente referidos como inibidor de TNF de 40 kDa) são descritos no Pedido de EP N° 90 113 673.9. A proteína Δ51 é uma versão truncada da proteína nativa em que 51 resíduos de aminoácidos no terminal carboxilo da proteína matura são removidos. A proteína Δ53 é uma versão truncada da proteína matura em que 53 resíduos de aminoácidos no. terminal carboxilo da proteína nativa são removidos. 0 inibidor de TNF de 4 0 kDa que ocorre naturalmente (glicosilado) e os inibidores não glicosilados (Δ51 e Δ53 nativos de comprimento total) possuem substancialmente a mesma actividade de inibição de TNF.

As sequências de ácido nucleico dos genes que codificam o inibidor de TNF de 30 kDa e os inibidores de TNF de 40 kDa e as sequências de aminoácidos destas proteínas são apresentadas no Pedido de EP N° 90 113 673.9. A presente invenção compreende formas não glicosiladas dos inibidores de TNF bem como certas formas truncadas das proteínas que ocorrem naturalmente como acima descrito. Noutra realização, os inibidores de TNF são modificados por ligação de um ou mais meios poliméricos repetidos de polietilenoglicol (PEG) ou outros, como acima descrito. São também revelados no Pedido de EP N° 90 113 673.9 métodos para produzir os inibidores de TNF. Um método revelado envolve isolar os inibidores de várias fontes, tais como urina humana e meio condicionado por células humanas U937. Um segundo método revelado envolve isolar os genes responsáveis por'

codificar os inibidores, clonar o gene em vectores adequados e tipos de células e expressar o gene para produzir os inibidores. 0 último método, que é exemplificativo de métodos de ADN 11 p recombinante em geral, é um método preferido da presente invenção. Os métodos de ADN recombinante são preferidos em parte porque são capazes de atingir quantidades comparativamente mais elevadas em graus de pureza superiores.

Preferencialmente, os inibidores de TNF acima descritos são produzidos pelo método acima mencionado numa forma "substancialmente pura". Por "substancialmente pura" entende-se que o inibidor, numa forma não modificada, possui uma actividade especifica comparativamente elevada. Contudo, deve ser reconhecido que derivados de inibidores de TNF podem possuir actividades especificas diferentes.

Inibidores de TNF adicionais incluem compostos capazes de competir com TNF para os sítios receptores de TNF. Tais compostos incluem antagonistas de receptores. Outros inibidores de TNF incluem compostos e proteínas que bloqueiam a síntese in vivo ou a libertação extracelular de TNF. Tais compostos incluem agentes que afectam a transcrição ou tradução de genes de TNF ou o processamento de pré-proteínas de TNF. IL-lras particularmente preferidos da presente invenção são as proteínas que ocorrem naturalmente que existem in vivo como reguladores de interleuquina-1 que foram previamente descritas na Patente U.S N° 5,075,222 de Hannum et al., que se intitula "Inibidores de Interleuquina-1". Esta Patente U.S. é aqui referida como a patente '222.

Três formas preferidas de IL-lra, cada uma sendo derivada da mesma sequência codificante de ADN, são reveladas e descritas na patente '222. A primeira destas, IL-lraa, é uma molécula de 22-23 kDa em SDS-PAGE com um ponto isoeléctrico aproximado de 4,8, eluindo de uma coluna Mono Q de FPLC com NaCl a cerca de 52 mM em tampão Tris, pH 7,6. A segunda, IL-lraP, é uma proteína de 22-23 kDa, p.I=4,8, eluindo de uma coluna Mono Q com NaCl a cerca de 60 mM. A terceira, IL-lrax, é uma proteína de 20 kDa, eluindo de uma coluna Mono Q com NaCl a cerca de 48 mM. Todos os três destes inibidores de interleuquina-1 possuem actividades 12 V L·

funcionais e imunológicas semelhantes. A presente invenção também inclui IL-lras modificados. Numa realização, o IL-lra contém um grupo metionilo no N-terminal como consequência da sua expressão em E. coli. Métodos para produzir estes inibidores de IL-1, particularmente de IL-lras, são também revelados na patente '222. Um método revelado envolve o isolamento de inibidores a partir de monócitos humanos (que são naturalmente produzidos). Um segundo método revelado envolve isolar o gene responsável por codificar os inibidores, clonar o gene em vectores adequados e tipos celulares, expressar o gene para produzir os inibidores e recolher os inibidores. 0 último método, que é exemplificativo de métodos de ADN recombinante em geral, é um método preferido da presente invenção. Os métodos de ADN recombinante são preferidos em parte porque são capazes de atingir quantidades comparativamente mais elevadas em graus de pureza superiores.

Inibidores de interleuquina-1 adicionais incluem compostos capazes de prevenir especificamente a activação de receptores celulares para IL-1. Tais compostos incluem proteínas de ligação a IL-1 tais como receptores solúveis e anticorpos monoclonais. Tais compostos também incluem antagonistas do receptor e anticorpos monoclonais para os receptores.

Uma segunda classe de IL-lras inclui os compostos e proteínas que bloqueiam a síntese in vivo e/ou a libertação extracelular de IL-1. Tais compostos incluem agentes que afectam a transcrição de genes de IL-1 ou o processamento de pré-proteínas de IL-1. Em certas condições o IL-lra bloqueará a produção de IL-1 induzida por IL-1.

Preferencialmente, os acima descritos IL-lra são produzidos pelo acima mencionado método numa forma ''substancialmente pura". Por ''substancialmente pura", entende-se que o inibidor, numa forma não modificada , possui comparavelmente uma elevada actividade específica, preferencialmente no intervalo de aproximadamente 150 000-500 000 unidades de receptor/mg, como 13

Γ definido por Hannum et al., in Nature 343:336-340 (1990) e Eisenberg et al., in Nature 343:341-346 (1990). Deve ser reconhecido, no entanto, que os derivados de IL-lra podem ter diferentes actividades específicas.

Também incluídos no âmbito desta invenção estão inibidores de TNF e IL-1 modificados. Os inibidores modificados incluem, por exemplo, muteínas destes inibidores nos quais um resíduo de cisteína é substituído por um aminoácido em um ou mais sítios na sequência de aminoácidos de um inibidor que ocorra naturalmente. Tais muteínas podem então ser feitas reagir selectivamente no sítio com unidades de polietilenoglicol funcionalizado ou outros poliéteres contendo sulfidrilo, para criar uma espécie PEG inibidora de TNF ou uma espécie PEG inibidora de IL-1. A publicação PCT N° WO 92/16221 revela um número de espécies de inibidores de TNF e IL-1 modificados e métodos para preparar tais inibidores PEG modificados. Uma muteína inibidora de TNF de 30 kDa, no qual a asparagina na posição 105 do inibidor de TNF de 30 kDa é substituída por cisteína (aqui referida como "muteína 105" ou "C105"), é particularmente útil. Numa realização adicional, as proteínas muteínas podem reagir com unidades de PEG bifuncionalizadas para formar espécies "haltere" bivalentes em que duas espécies de citoquina são acopladas via uma única cadeia de PEG, por exemplo, em que duas muteínas C105 são acopladas a uma parte de polietilenoglicol (PEG), particularmente PEG possuindo um peso molecular de cerca de 20 000.

Porque é possível que a função inibitória dos inibidores preferidos seja comunicada por uma ou mais porções discretas e separáveis, é também visado que a composição terapêutica possua como ingrediente activo uma porção ou porções do inibidor TNF ou inibidor de IL-1 que controla a inibição de interleuquina-1 ou TNF. A composição terapêutica da presente invenção pode ser administrada parentalmente por injecção, embora outras formas 14 p L·, ^ eficazes de administração, como injecção intra-articular, vapores inalantes, formulações oralmente activas, iontoforeses transdérmicas ou supositórios, são também visados. Um veículo preferido é uma solução fisiologicamente salina, mas está contemplado que outros veículos farmaceuticamente aceitáveis possam também ser utilizados.

Numa realização, é visado que o transportador e o inibidor de TNF e o inibidor de IL-1 constitui uma formulação de libertação lenta fisiologicamente compatível. 0 solvente primário em tal transportador pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Adicionalmente, o transportador pode conter outros excipientes farmacologicamente aceitáveis para modificar ou manter o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução, ou odor da formulação. Do mesmo modo, o transportador pode ainda conter outros excipientes farmacologicamente aceitáveis para modificação ou manutenção da estabilidade, taxa de dissolução, libertação ou absorção do inibidor de TNF e/ou inibidor de IL-1. Tais excipientes são aquelas substâncias usualmente e normalmente empregues para formular dosagens para administração parental na forma de dose unitária ou multi-dose.

Uma vez formulada a composição terapêutica, pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas numa forma pronta a usar ou que requer a reconstituição imediata antes da administração. 0 armazenamento preferido de tais formulações é a temperaturas pelo menos tão baixas quanto 4°C e preferencialmente a - 70°C. É também preferido que tais formulações contendo o inibidor de TNF e o inibidor de IL-1 sejam armazenadas e administradas a pH fisiológico ou próximo deste. Crê-se presentemente que é indesejável a administração numa formulação a elevado pH (isto é, maior do que 8) ou a baixo pH (isto é, menor do que 5). 15 Γ

Preferencialmente, a forma de administração das formulações contendo inibidor de TNF e inibidor de IL-1 para distribuição sistémica é a via subcutânea, intramuscular, intravenosa, intranasal ou supositório vaginal ou rectal. Preferencialmente, a forma de administração das formulações contendo inibidor de TNF e inibidor de IL-1 para distribuição local é por via intra-articular, intratraqueal, ou instilação ou inalações para o trato respiratório. Adicionalmente, pode ser desejável administrar o inibidor de TNF e o inibidor de IL-1 a porções especificadas do canal alimentar quer por administração oral do inibidor de TNF e do inibidor de IL-1 numa formulação apropriada ou dispositivo ou por supositório ou enema.

Num modo preferido adicional para o tratamento de doenças mediadas por TNF e IL-1, uma injecção inicial de uma grande quantidade intravenosa de inibidor de TNF e inibidor de IL-1 é administrada seguida por uma infusão intravenosa continua de inibidor de TNF e inibidor de IL-1. A iniciação de tratamento para choque séptico deve começar o mais cedo possível após ser diagnosticada septicemia ou hipótese de septicemia. Por exemplo, o tratamento pode ser iniciado imediatamente após cirurgia ou um acidente ou qualquer outro evento que possa apresentar risco de iniciação de choque séptico.

Modos preferidos para o tratamento de doenças mediadas por TNF ou IL-1 e mais particularmente para o tratamento de artrite incluem: (1) uma única . injecção intra-articular de inibidor de TNF e inibidor de IL-1 administrada periodicamente como necessário para prevenir ou remediar o irromper de artrite; e (2) injecções subcutâneas periódicas de inibidor de TNF e inibidor de IL-1.

Modos preferidos para o tratamento de doenças mediadas por TNF ou IL-1 e mais particularmente para o tratamento de síndroma da dificuldade respiratória do adulto incluem: 1) administrações intratraqueais únicas ou múltiplas de inibidor de TNF e inibidor 16

de IL-1; e 2) uma pílula grande ou infusão intravenosa contínua de inibidor de TNF e inibidor de IL-1.

Está também contemplado que certas formulações contendo inibidor de TNF e inibidor de IL-1 devem ser administradas oralmente. Preferencialmente, o inibidor de TNF e o inibidor de IL-1 que são administrados desta forma devem ser encapsulados. 0 inibidor de TNF e inibidor de IL-1 encapsulados podem ser formulados com ou sem aqueles transportadores normalmente utilizados na composição de formas de dosagem sólida. Preferencialmente, a cápsula é construída de modo a que a porção activa da formulação seja libertada nesse ponto no trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistémica é minimizada. Podem ser incluídos excipientes adicionais para facilitar a absorção do inibidor de TNF e inibidor de IL-1. Podem também ser empregues diluentes aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e agentes de ligação.

Independentemente da forma de administração a dose específica é calculada de acordo com o peso corporal aproximado do doente. Em certas realizações, a administração é preparada para criar um intervalo de concentração pré-seleccionado de inibidor de TNF e inibidor de IL-1 na corrente sanguínea do doente. Crê-se que a manutenção de concentrações de inibidor de TNF e inibidor de IL-1 em circulação de menos do que 0,01 ng por ml de plasma pode não ser uma composição eficaz, enquanto que a manutenção prolongada de níveis de circulação em excesso de 10 μg por ml pode possuir efeitos colaterais indesejáveis.

Refinamentos posteriores dos cálculos necessários para determinar a dosagem apropriada para tratamento envolvendo cada uma das formulações acima mencionadas é rotineiramente realizado por técnicos da especialidade normais e está dentro do âmbito de tarefas realizadas de rotina por aqueles sem formação específica, especialmente à luz da informação de dosagem e 17 L· ι ensaios aqui revelados. Estas dosagens podem ser acertadas através da utilização dos ensaios estabelecidos para determinar dosagens utilizadas em conjugação com resultados apropriados de dose-resposta.

Deve ser notado que as formulações de inibidor de TNF e inibidor de IL-1 aqui descritas podem ser utilizadas para aplicações veterinárias bem como humanas e que o termo "doente" não deve ser entendido de um modo limitativo. No caso de aplicações veterinárias os intervalos de dosagens devem ser os mesmos como acima especificado.

Foram desenvolvidos um antagonista de receptor de interleuquina-1 (IL-lra) e uma proteína de ligação do factor da necrose tumoral (TNFbp) para o tratamento de doenças inflamatórias que são mediadas por IL-1 e TNF. Em dois sistemas experimentais, artrite reumatóide em ratos e choque séptico em babuínos, o bloqueamento da acção quer de IL-1 quer de TNF isoladamente foi suficiente para inibir significativamente a resposta inflamatória. Na artrite de roedores, o inchaço da articulação apresentou um máximo de inibição com a administração de IL-lra ou TNFbp isoladamente em ratos que estavam a sofrer uma artrite reactivada induzida por peptidoglicano-polissacárido (PG/PS). No choque séptico, babuínos que foram confrontados com Escherichia coli foram protegidos até um grau semelhante contra alterações letais e hemodinâmicas pela administração de IL-lra ou TNFbp isoladamente.

Estes resultados em sistemas experimentais que apresentam os efeitos benéficos da administração de qualquer dos inibidores isolados sugerem que é desejável uma interacção sinergística entre IL-1 e TNF para promover uma resposta patogénica completa e que a inibição da acção de um destes mediadores chave é suficiente para reduzir ao máximo a magnitude do processo inflamatório. Acreditava-se que a administração única quer de IL-lra quer de TNFbp seria suficiente para reduzir ao máximo os efeitos inflamatórios noutros modelos animais de doenças 18

mediadas por IL-1 e TNF e que a administração combinada dos inibidores forneceria uma vantagem especial. Contudo, inesperadamente, o tratamento de ratos que sofriam uma artrite reactivada por LPS, uma alveolite estimulada por LPS e uma resposta inflamatória sistémica estimulada por LPS, com uma combinação de IL-lra e TNFbp causou efeitos inibitórios sinergisticos em inchaço da articulação, exsudação neutrofilica broncoalveolar e letalidade, respectivamente. Os exemplos abaixo descrevem métodos para tratar doenças inflamatórias mediadas por IL-1 e TNF, tais como artrite 1 reumatóide, síndroma da dificuldade respiratória do adulto (ARDS) e sépsia, por terapia de combinação com IL-lra e TNFbp.

Os exemplos seguintes pretendem ilustrar a presente invenção.

EXEMPLO I

Este exemplo demonstra os efeitos sinergisticos da terapia de combinação com IL-lra e TNFbp em reactivação induzida por LPS de artrite induzida por SCW.

As teorias correntes da patogénese da artrite reumatóide e artrites relacionadas colocam como hipótese dois possíveis mecanismos de inflamação articular imunologicamente mediada: (a) um componente microbiano que se localiza nas articulações, ou (b) um autoantigénio articular. Wilder, Experimental Animal Models of Chronic Arthritis. Um modelo animal de artrite reumatóide induzida por dois componentes microbianos (lipopolissacárido (LPS) e peptidoglicano-polissacárido (PG/PS) foi utilizado para investigar a utilização de terapia combinada com o inibidor de TNF de 30 kDa humano recombinante (hrTNF/inh30) e IL-1 humano recombinante e o antagonista do receptor de IL-1 humano recombinante (hrIL-lra) para o tratamento de artrite. De acordo com R. L. Wilder em Iiamunopathogenetic Mechanisms of Arthritis, cap. 9 intitulado "Experimental Animal Models of Chronic Arthritis" em relação a artrite induzida pela parede celular de estreptococus, "as 19 r

U. >L características clínicas, histológicas e radiológicas da doença articular experimental parecem-se muito de perto com as observadas na artrite adulta e juvenil".

Nas seguintes experiências, o modelo animal descrito em Schwab, Experimental Medicine, 1688-1702, (1987), foi utilizado para induzir artrite nas articulações do tarso de ratos normais. Em resumo, a artrite foi induzida pela administração sequencial de dois componentes microbianos: (1) em primeiro lugar produtos da parede celular de estreptococus (SCW) contendo peptidoglicano-polissacárido (PG/PS) foram injectados intra-articularmente, e (2) vinte e um dias depois foi injectado intravenosamente lipopolissacárido (LPS) de Salmonella typhimurium. A. Experiência 1

Ratos de Lewis, pesando cada um 140 a 160 g, foram injectados intra-articularmente, (Charles River) na articulação do tornozelo com SCW a uma dose de 3 μg de ramnose por articulação. Foi injectado salino na articulação contra-lateral para servir de controlo. A injecção intra-articular de SCW causou uma artrite aguda de duração relativamente curta com inchaço da articulação com um pico aos dias um a dois após a injecção. Após um período de vinte dias durante o qual a reacção de inflamação aguda ocorreu, foi administrado lipopolissacárido (LPS) por injecção intravenosa a uma dose de 45 μg por rato. Tal dose de LPS foi suficiente para reactivar a inflamação na articulação do tornozelo previamente injectada com SCW e teve pouco efeito no tornozelo injectado com salino. Para verificar a extensão da inflamação durante o período de 72 horas após a injecção intravenosa de LPS, as dimensões da articulação do tornozelo foram medidas a 0, 24, 36, 48 e 72 horas após a reactivação da artrite.

Os efeitos de IL-lra e TNFbp quando administrados isoladamente e em combinação foram testados no desenvolvimento de inchaço da articulação durante a reactivação da artrite. Os 20 11

V

inibidores e veículos foram administrados sub-cutaneamente na base da nuca nos tempos 0, 2, 6, 12, 18, 24, 30, 36 e 42 horas relativamente à injecção intravenosa de LPS. Na primeira experiência, os ratos foram tratados como se segue:

Grupo I - veículo (citrato de sódio, NaCl e EDTA) Grupo II - IL-lra (2 mg/kg)

Grupo III - TNFbp (1 mg/kg)

Grupo IV - IL-lra (2 mg/kg) + TNFbp (1 mg/kg)

Os aumentos máximos do diâmetro da articulação durante o período de 72 horas após reactivação são apresentados na Tabela 1. Os resultados mostram que a terapia de combinação com IL-lra e TNFbp causaram um efeito inibitório aditivo em artrite reactivada com LPS. O IL-lra e o TNFbp isoladamente inibiram o inchaço da articulação em 31% e 16% respectivamente, enquanto que a terapia de combinação inibiu o inchaço em 41%. TABELA 1

Grupos de Tratamento Alteração Máxima no Diâmetro da Articulação* (mm) Percentagem de Redução Veículo 1,08 + 0,07 IL-lra (2 mg/kg) 0,74 + 0,08** 16% TNFbp (1 mg/kg) 0,91 + 0,04 16% IL-lra (2 mg/kg) + TNFbp (1 mg/kg) 0,59 + 0,11** 41% * Os valores são médias + erro padrão para 8 a 9 ratos por grupo. Os aumentos no diâmetro das articulações foram calculados a partir do inchaço máximo durante o período de 72 horas após a reactivação da artrite pela administração intravenosa de LPS. ** Significativamente diferente do grupo do veículo a p<0,01 para o grupo tratado com IL-lra e p < 0,005 para o grupo tratado com IL-lra + TNFbp. B. Experiência 2

Na segunda experiência os inibidores foram administrados novamente isolados e em combinação, por injecção sub-cutânea a 21 p U, ^^ Ο, 2, 6, 12, 18, 24, 30, 36 e 42 horas após reactivação induzida por LPS. A dose de IL-lra foi reduzida em comparação com a utilizada na experiência 1, enquanto que a dose de TNFbp não foi alterada. Os ratos foram tratados como se segue:

Grupo 1 - veiculo

Grupo II - IL-lra (0,1 mg/kg)

Grupo III - TNFbp (1 mg/kg)

Grupo IV - IL-lra (0,1 mg/kg) + TNFbp (1 mg/kg) A Tabela 2 apresenta o curso de tempo das alterações no diâmetro da articulação de ratos dos grupos I, II, III e IV. O inchaço dos ratos foi reduzido por terapia de combinação com IL-lra e TNFbp quando comparado com a ausência de efeito no inchaço da articulação no tratamento com IL-lra ou TNFbp isoladamente. Os efeitos inibitórios sinergisticos da terapia de combinação são apresentados claramente na Figura 1 e Tabela 3. Na Figura 1 são apresentados os aumentos máximos do diâmetro da articulação durante o período de 72 horas após a reactivação induzida por LPS. A terapia de combinação com IL-lra e TNFbp causou uma depressão significativa do inchaço da articulação (35%), enquanto que o tratamento com qualquer um dos agentes isolado não causou redução significativa. Na Tabela 3 é apresentada a área abaixo da curva {alteração no diâmetro (mm) versus tempo (hr).} para os valores listados na Tabela 2. Durante o período de reactivação de 72 horas, a terapia de combinação com IL-lra e TNFbp causou uma redução significativa no inchaço total da articulação (53%) enquanto que o tratamento com qualquer dos agentes isolado não causou redução significativa. 22

t TABELA 2 DIÂMETRO DA ARTICULAÇÃO (mm) 1 (média ± EP) TEMPO APÓS A REACTIVAÇÃO (HORAS) Veículo TNFbp 1 mg/kg IL-lra 0,1 mg/kg TNFbp 1 mg/kg + IL-lra 0,1 mg/kg 0 6,03 ± 0,03 6,39 ± 0,20 6,07 ± 0,03 6,20 ± 0,09 24 6,61 ± 0,06 6,70 ± 0,12 6,64 ± 0,08 6,49 ± 0,11 36 6,89 ± 0,10 7,03 ± 0,15 6,83 ± 0,10 6,62 ± 0,11 48 6,91 ± 0,09 6,91 ± 0,25 6,79 + 0,03 6,76 ± 0,11 60 6,93 + 0,10 7,14 ± 0,17 6,78 ± 0,05 6,67 ± 0,12 72 6,75 + 0,13 6,88 ± 0,14 6,72 ± 0,08 6, 65 ± 0,10 n = 14 a 16 ratos por grupo TABELA 3 AREA ABAIXO DA CURVA Alteração no diâmetro da articulação vs. Tempo Após Reactivação mm vs. Tempo (Unidades arbitrárias) I Veiculo 27,9 ± 3,0 II TNFbp (1 mg/kg) 27,8 ± 2,6 III IL-lra (0,1 mg/kg) 28,4 ± 2,0 IV TNFbp (1 mg/kg) + IL-lra (0,1 mg/kg) 16,4 ± 2,2a,b'c IV vs I + = 3,05, p<0,005 IV vs II + = 3,34, p<0,005 IV vs III + = 3,98, p<0,001

As percentagens reflectindo a redução do inchaço com terapia de combinação foram semelhantes nas experiências 1 e 2 (41% e 35 a 53% respectivamente). Tirando vantagem do sinergismo 23 nas acções inibitórias de IL-lra e de TNFbp no inchaço da articulação, foi alcançado um nível semelhante de benefício terapêutico na experiência 2 apesar da redução em dez vezes na dose de IL-lra.

EXEMPLO II

Este exemplo demonstra os efeitos sinergísticos da terapia de combinação com IL-lra e TNFbp em alvéolite neutrofílica estimulada por LPS como um método para tratamento do Síndroma da Dificuldade Respiratória do Adulto (ARDS). A experiência empregou um estímulo séptico, endotoxina, para induzir lesão pulmonar aguda mediada por neutrófilo- de acordo com o modelo revelado em Ullich et al., American Journal of Pathology 138:1485-1496 (1991). Este modelo é resumido como se segue: a endotoxina é injectada intratraquealmente na porção médiocervical da traqueia de ratos anestesiados. Após um período de latência de seis horas, é efectuada lavagem broncoalveolar dos pulmões (BAL) como procedimento terminal. Contagens totais e diferenciais de células brancas do sangue são realizadas no fluido de BAL. A injecção intratraqueal de salino livre de pirogénio produz fluido de BAL com uma predominância de macrófagos alvéolares (cerca de 99%) em números baixos. A injecção intratraqueal de endotoxina causa um aumento grande no número de células de BAL e uma predominância de neutrófilos. 0 influxo neutrofílico agudo no espaço alveolar tem um pico de 6 a 12 horas e é acompanhado pela acumulação de fluido edematoso contendo proteína nos espaços alveolares. IL-1 e TNF estão presentes no fluido BAL após estimulação com endotoxina. Crê-se que o macrófago alveolar é a fonte de síntese de citoquina. Além disso, a injecção intratraqueal de IL-1 e de TNF exógenos induz um exsudado neutrofílico intra-alveolar agudo que é qualitativamente semelhante ao induzido pela endotoxina. São utilizados muitos modelos animais que aproximam o edema pulmonar alterado, o sequestro de leucócitos e hipoxemia durante 24

V

U a fase aguda de lesão do parênquima do pulmão durante ARDS de acordo com Murray et al., American Review of Respiratory Disease 138: 720-723 (1991). As formas agudas de ARDS ocorrem na presença de certos factores de risco identificáveis tais como sépsia, aspiração ou transfusões múltiplas de sangue. As investigações correntes enfatizam o papel central da lesão mediada neutrofilicamente na patofisiologia de ARDS [Tate, Am. Rev. Res. Dis. 128: 552-559 (1983)]. Crê-se que os produtos tóxicos libertados pelos neutrófilos activados causam dano na membrana capilar alvéolar. A permeabilidade da membrana lesionada é bastante aumentada estimulando o movimento das proteínas do plasma e células inflamatórias nos espaços alvéolares. Num modelo experimental bovino de ARDS de origem séptica, a deplecção neutrófila protegeu contra o desenvolvimento de lesões pulmonares [Heflin, J. Clin. Invest. 68:1253-1260 (1981)]. É descrito um método para tratar alvéolite neutrofílica em ratos através da administração intratraqueal de terapia de combinação com TNFbp (inibidor de TNF humana recombinante de 30 kDa) e IL-lra (IL-lra humana recombinante). A lesão do pulmão foi induzida pela administração de endotoxina, lipossacárido (LPS), de Salmonella typhimurium a uma dose de 5 μg por rato num volume total de 0,5 ml de PBS estéril através de uma agulha de calibre 27 de H polegada inserida entre os anéis da traqueia na região médiocervical da traqueia exposta cirurgicamente. O inóculo foi administrado lentamente na traqueia, enquanto se monitorizava a taxa e a profundidade de respiração do rato. Seis horas depois, os ratos foram anestesiados com isofluorano de modo a que a laparotomia pudesse ser realizada por forma a facilitar a lavagem dos pulmões. O caudal da veia cava foi restringido para diminuir o conteúdo de sangue nos pulmões. O diafragma foi aberto para permitir a expansão dos pulmões durante a lavagem. A BAL foi realizada injectando 40 ml de solução salina equilibrada de Hank nos espaços broncoalvéolares 25 t através de um catéter angiocat, que foi inserido e fixo no local de incisão da traqueia médio-cervical. 0 influxo celular inflamatório foi recolhido a partir do sedimento obtido pela centrifugação do fluído de BAL a 1500 rpm durante 15 minutos. O número total de leucócitos foi contado num contador Coulter. A percentagem de neutrófilos polimorfonucleares foi determinada realizando uma contagem de células diferencial manualmente, numa lâmina de células fixadas.

Os efeitos de IL-lra e de TNFbp, num influxo estimulado por LPS nos espaços broncoalvéolares foram determinados pela administração de inibidores intratraquealmente em simultâneo com a instilação intratraqueal de LPS. O TNF/inh foi administrado isoladamente em doses variando entre 0,1 e 10 μg por rato. Os resultados estão sumarizados na Tabela 4. O TNFbp a uma dose de 0,1 μg por rato não reduziu o influxo de neutrófilos nos espaços alvéolares. Contudo, a administração intratraqueal de TNF/inh a doses entre 2,5 μg e 10 μg por rato, provocou uma reacção máxima no influxo de neutrófilos nos espaços alvéolares no intervalo de 30 a 40%. O IL-lra foi administrado em doses variando entre 0,75 e 10 μg por rato (Tabela 5). O IL-lra a doses entre 0,75 e 2,5 μg por rato não reduziu o influxo de neutrófilos nos espaços alvéolares. Contudo, a administração intratraqueal de IL-lra a doses de 5 e 10 μg por rato provocou percentagens significativas de inibição de 57% e 47%, respectivamente. 26 V.

ΐ TABELA 4

Percentagem de Inibição de Influxo Neutrofilico em Fluido de BAL

Dose Intratraqueal de TNFbp % de Inibição (μ5) 0 0 0,1 10 + 4 1,0 20 ± 7 2,5 35 ± 6 5 28 ± 8 7,5 33 ± 7 10 39 ± 7 n = 4 a 8 por grupo. TABELA 5

Percentagem de Inibição de Influxo Neutrofilico em Fluido de BAL

Dose Intratraqueal de IL-lra (μσ) % de Inibição 0 0 0, 75 0,1 ± 8 1 2 ± 9 2,5 1 ± 8 5 57 ± 16 10 40 ± 5 n = 4 a 8 por grupo. 27 p ^^

Numa experiência preliminar, foi determinado que a terapia de combinação com doses inibitórias máximas de IL-lra (100 μς/rato) e de TNF/inh (10 \x.q por rato) causou um efeito inibitório no influxo neutrofílico que não foi significativamente diferente do efeito de qualquer dos agentes isolados.

Nas experiências 1 e 2, os efeitos da terapia de combinação foram testados utilizando doses sub-máximas ou sub-limiares de IL-lra e de TNF/inh no influxo neutrofílico nos espaços broncoalvéolares. Na experiência 1, IL-lra e TNF/inh foram dados intratraquealmente em simultâneo com LPS na seguintes doses:

Grupo I - Veículo

Grupo II - TNF/inh (0,1 μς por rato)

Grupo III - IL-lra (2,5 μg por rato)

Grupo IV - TNF/inh (0,1 pg por rato) + IL-lra (2,5 μg por rato) 0 número de neutrófilos que migraram dos espaços broncoalvéolares é apresentado na Tabela 6. Os resultados demonstraram que a terapia de combinação com IL-lra e TNF/inh causou um efeito inibitório aditivo em alvéolite neutrofílica estimulada por LPS. TNF/inh e IL-lra inibiram o influxo neutrofílico em 19 e 29%, respectivamente, enquanto a terapia de combinação inibiu o inchaço em 47%. TABELA 6

Grupos de tratamento % de Neutrófilos em fluido de BAL (X10)* Percentagem de redução Veículo 5, 45 + 0,6 TNF/inh (0,1 μg/rato) 4,43 + 0,9 19% IL-lra (2,5 μg/rato) 3,89 + 0,3** 29% TNF/inh (0,1 μς/Γ8ΐο)+ 2,88 + 0,5** 47% IL-lra (2,5 μς/Γ3ίο) * Os valores são médias + erro padrão para 6 ratos por grupo 28

V Γ ** significativamente diferentes do grupo do veiculo a p< 0,05 para o grupo tratado com IL-lra e p< 0,01 para o grupo tratado com IL-lra e TNF/inh.

Na experiência 2, os inibidores (isolados e em combinação) foram administrados ‘ como na experiência 1 por uma via intratraqueal em simultâneo com a lesão por LPS. Um vez que IL-lra na experiência anterior a 2,5 μυ por rato provocou um efeito inibitório sub-máximo no influxo neutrofílico, a dose de IL-lra foi reduzida para uma que possa induzir um efeito inibitório sub-limiar. O objectivo foi o de manipular as doses para um nivel no qual os inibidores isoladamente possam não induzir redução significativa, contudo possam actuar sinergisticamente quando administrados em combinação. A dose de TNF/inh não foi alterada.

Grupo I - Veiculo

Grupo II - TNF/inh (0,1 μρ por rato)

Grupo III - IL-lra (0,75 μg por rato)

Grupo IV - TNF/inh (0,1 μg por rato)

Grupo IV - TNF/inh (0,1 μg por rato) + IL-lra (0,75 μg por rato) A Tabela 7 apresenta os números de neutrófilos que migram para os espaços broncoalveolares de ratos nos grupos I, II, III e IV. O influxo neutrofilico foi reduzido por terapia de combinação com TNF/inh e IL-lra em comparação com a ausência de efeito no influxo neutrofilico dos tratamentos com TNF/inh e IL-lra isolados. Os efeitos inibitórios aditivos e sinergisticos da terapia de combinação são claramente evidentes em lesão pulmonar aguda. A terapia de combinação com IL-lra e TNF/inh causaram uma redução significativa no influxo neutrofilico de 40% enquanto que o tratamento com TNF/inh e IL-lra isoladamente provocou 29 p L-i ^ reduções insignificantes do influxo neutrofilico de 12% e 7%, respectivamente. TABELA 7

Componentes Neutrófilos (106/pulmão) I LPS + veiculo 5,10 ± 0,80 (n = 8) II LPS + 0,1 pg de TNFbp 4,44 ± 0,40 (n = 9) III LPS + 0,75 pg de IL-lra 4,81 ± 0,70 (n = 9) IV LPS + 0,1 pg de TNFbp + 0,75 pg de IL-lraa'b,c 3,02 ± 0, 30a,b,c (n = 9) a IV vs I + = 2,50, p < 0,025 b IV vs II + = 2,82, p < 0,025 c IV vs III + = 2,23, p < 0,05

EXEMPLO III

Foram testados IL-lra e TNFbp, individualmente e em combinação, para determinar os seus efeitos no aumento do tempo de sobrevivência de animais confrontados com uma dose elevada de endotoxina para induzir sépsia. Neste conjunto de experiências foram injectados ratos (n = 6 por grupo) com 25 mg/kg de LPS de acordo com o procedimento do Exemplo II. TNFbp peguilado (a muteina C105 do inibidor de TNF de 30 kDa peguilada com polietileno-20 K) ou veiculo isolado foi injectado intravenosamente e em simultâneo com LPS, enquanto que o IL-lra foi injectado sub-cutaneamente a 0, 4, 8, 12 e 18 horas a doses identificadas na Tabela 8. As determinações de sobrevivência final foram realizadas a 96 horas após a administração da endotoxina.

As percentagens de sobrevivência para cada grupo de teste são também fornecidas na Tabela 8. Os resultados demonstram que a combinação de IL-lra e TNFbp produziu um aumento sinergistico de sobrevivência, enquanto que IL-lra e TNFbp isoladamente não foram totalmente protectores. 30 Γ

TABELA. 8 SOBREVIVÊNCIA

Percentagem de Sobrevivência a Endotoxemia em Ratos

25 mg/kg de LPS 1 IL-lra T N 0 mg/kg 1 mg/kg 10 mg/kg 100 mg/kg 0 mg/kg 0% 0% . 0% 0% F / b 1,5 mg/kg 33% 17% 83% 100% 3 mg 17% 0% 67% 100% P 4,5 mg/kg 17% 83% 100% 83%

EXEMPLO IV

Crê-se que niveis elevados de corticosterona associados a certas condições, tais como sépsia e doentes com queimaduras, por exemplo, contribuem significativamente para a imunosupressão e efeito caquéctico observados nestas condições. Os efeitos de IL-lra e de TNFbp, individualmente e em combinação, em niveis de costicosterona no soro foram determinados em sépsia induzida por endotoxina em ratos.

Ratos de Lewis foram confrontados com 10 mg/kg de LPS de acordo com o procedimento do Exemplo II. 0 TNFbp peguilado do Exemplo III (1,5 mg/kg) foi injectado intravenosamente e em simultâneo com LPS, enquanto que hrIL-lra (100 mg/kg) foi injectado sub-cutaneamente a 0, 4, 8, 12 e 18 horas após a administração de endotoxina.

Os niveis de costicosterona do soro foram testados às 24 horas por radioimunoensaio utilizando o kit de corticosterona-3H (ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, Califórnia) de acordo com as 31

instruções do fabricante. A Tabela 9 sumariza os resultados dos ensaios. TABELA 9 Número de Animais Componentes Níveis de Costicosterona do soro (ng/ml) + E.P, 4 Veículo (sem LPS) 164 ± 62 4 Veículo + LPS 750 ± 49 8 IL-lra + LPS 279 ± 54 8 TNFbp + LPS 489 ± 43 8 IL-lra + TNFbp + LPS 103 ± 25a'b,c a t = 2,95, p < 0,025 (combinação vs. IL-lra + LPS) bt=7,85, p< 0,001 (combinação vs. TNFbp + LPS) c t = 13,30, p < 0,001 (combinação vs. veiculo + LPS)

Como apresentado na Tabela 9, o nível de cosrticosterona foi significativamente reduzido em animais recebendo a combinação de IL-lra e de TNFbp em comparação com aqueles recebendo IL-lra ou TNFbp isoladamente. A terapia de combinação demonstrou que em conjunto IL-lra e TNFbp provocam um efeito aditivo na redução do nível de costicosterona no soro. Estes resultados sugerem que a terapia de combinação pode ter efeitos anti-imunosupressores e anti-caquécticos resultando num método com benefício terapêutico para o tratamento de sépsia e doentes com queimaduras.

EXEMPLO V

Contagens de plaquetas foram também testadas em ratos injectados com endotoxina para induzir endotoxemia. É conhecido 32 Γ i—1 que as plaquetas são consumidas durante a endotoxemia resultando num decréscimo significativo das plaquetas.

Ratos de Lewis foram confrontados com 10 mg/kg de LPS de acordo com o procedimento do Exemplo II. O TNFbp peguilado do Exemplo III (1,5 mg/kg) foi injectado intravenosamente em cada rato e em simultâneo com LPS, enquanto que hrIL-lra (100 mg/kg) foi injectado sub-cutaneamente a 0, 4, 8, 12 e 18 horas após a administração de endotoxina.

As contagens de plaquetas foram realizadas às 24 horas de acordo com procedimentos padrão conhecidos na arte (contagem automatizada baseada no tamanho das partículas). A Tabela 10 sumariza os resultados dos ensaios. TABELA 10 EXPERIÊNCIA N° 1 EXPERIÊNCIA N° 2 Níveis de Número de Níveis de Número de Componente(s) Plaquetas Animais Plaquetas Animais Veículo(sem LPS) 825 ± 23 5 762 ± 14 4 Veículo + LPS 31 + 5 13 19 ± 4 4 IL-lra + LPS 20 ± 1 10 29 ± 3 8 TNFbp + LPS 28 ± 6 12 23 ± 3 8 IL-lra + TNFbp + LPS 64 ± 8a,b,c 11 44 ± 4d,e,f 8 Níveis de plaquetas = 103/μ1 ± E.P. t = 5,10, P < 0,001 t = 2,67, P < 0,005 t = 3,67, P < 0, 005 t = 2,94, P < 0,025 t = 4,25, P < 0,001 t = 3,87, P < 0, 005 (combinação vs. (combinação vs. (combinação vs. (combinação vs. (combinação vs. (combinação vs. IL-lra + LPS) TNFbp + LPS) veiculo + LPS) IL-lra + LPS) TNFbp + LPS) veículo + LPS) 33

Em ambas as experiências o valor do tratamento de combinação é significativamente diferente dos valores para o tratamento com IL-lra ou TNFbp isolados. Estes resultados sugerem que a terapia de combinação reduz o consumo de plaquetas durante a endotoxemia.

Lisboa, 31 de Janeiro de 2000 agente oficial da propriedade industrial.

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Claims

Γ u REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica compreendendo o inibidor de IL-1, IL-lra, ou uma porção ou muteina deste, inibidora de IL-1 e um inibidor de TNF, num transportador farmaceuticamente aceitável.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido IL-lra compreende pelo menos um composto do grupo consistindo em: IL-lraa, IL-lra3 e IL-lrax ou uma porção ou muteina destes, inibidora de IL-1.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido inibidor de TNF compreende pelo menos um composto seleccionado do grupo consistindo em: inibidor de TNF de 30 kDa ou um fragmento ou muteina deste inibidora de TNF; inibidor de TNF de 40 kDa ou um fragmento ou muteina deste inibidora de TNF; inibidor de TNF de 40 kDa Δ51 e inibidor de TNF de 40 kDa Δ53.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o referido inibidor de IL-1 é IL-lra humano recombinante e o referido inibidor de TNF é inibidor de TNF de 30 kDa humano recombinante.
5. Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1-4, em que o referido transportador farmaceuticamente aceitável compreende uma formulação fisiologicamente compatível de libertação lenta.
6. Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1-5, em que o referido IL-lra está ligado a 1 p Lz ^ uma ou mais partes poliméricas repetidas, incluindo polietilenoglicol (PEG).
7. Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1-6, em quê o referido inibidor de TNF é o inibidor de TNF de 30 kDa e possui uma cisteina na posição 105.
8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido inibidor de TNF está ligado a uma ou mais partes poliméricas repetidas, incluindo polietilenoglicol (PEG).
9. Composição farmacêutica compreendendo o inibidor de IL-1, IL-lra, ou uma porção ou muteina deste, inibidora de IL-1 e um inibidor de TNF como uma preparação combinada para utilização em simultâneo, separada ou sequencial no tratamento e prevenção de doenças mediadas por TNF ou doenças mediadas por IL-1.
10. Utilização do inibidor de IL-1, IL-lra, ou uma porção ou muteina deste, inibidora de IL-1 e um inibidor de TNF para a preparação de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de doenças mediadas por TNF ou doenças mediadas por IL-1, em que o inibidor de IL-1, IL-lra, ou uma porção ou muteina deste inibidora de IL-1 e o inibidor de TNF possam ser administrados em simultâneo, em separado ou sequencialmente.
11. Utilização de acordo com a reivindicação 10', em que o referido IL-lra compreende pelo menos um composto do grupo consistindo em: IL-lraa, IL-lraP e IL-lrax ou uma porção ou muteina deste, inibidora de IL-1. 2 t Γ
12. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido inibidor de TNF compreende pelo menos um composto seleccionado do grupo consistindo em: inibidor de TNF de 30 kDa ou um fragmento ou muteina deste, inibidor de TNF; inibidor de TNF de 40 kDa ou um fragmento ou muteina deste, inibidor de TNF; inibidor de TNF de 40 kDa Δ51 e inibidor de TNF de 40 kDa Δ53.
13. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido inibidor de TNF é inibidor de TNF de 30 kDa humano recombinante.
14. Utilização de acordo com a reivindicação 10, em que o referido inibidor de IL-1 é IL-lra humano recombinante.
15. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10 a 14, em que a referida doença é seleccionada de um grupo compreendendo: artrite, doença inflamatória do intestino, sépsia, choque séptico, lesão isquémica, lesão de reperfusão, osteoporose, asma, diabetes insulínica, leucemia mielógena e outras, psoríase, síndroma da dificuldade respiratória do adulto, caquéxia/anorexia e fibrose pulmonar.
16. Utilização de qualquer das reivindicações 10-15, em que os referidos IL-lra e inibidor de TNF estão num transportador farmaceuticamente aceitável para administração.
17. Utilização de acordo com a reivindicação 16, em que o referido transportador farmaceuticamente aceitável compreende uma formulação de libertação lenta fisiologicamente compatível. 3 p U, ^—ç*
18. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-17, em que os referidos IL-lra e inibidor de TNF se destinam a administração por infusão intravenosa continua.
19. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-18, em que o referido IL-lra está substancialmente puro.
20. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-19, em que o referido IL-lra está glicosilado ou em que o referido IL-lra não está glicosilado.
21. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-20, em que o referido IL-lra possui um resíduo de metionina no terminal N.
22. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-21, em que o referido IL-lra está ligado a uma ou mais partes poliméricas repetidas, incluindo polietilenoglicol.
23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que a parte polimérica repetida é polietilenoglicol.
24. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-23, em que o IL-lra se destina a administração intra-articular, sub-cutânea, intramuscular, intravenosa, intranasal ou oral.
25. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-24, em que o referido inibidor de TNF é o inibidor de TNF de 30 kDa que possui uma cisteína na posição 105.
26. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-25, em que o referido inibidor de TNF está substancialmente puro. 4
27. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-26, em que o referido inibidor de TNF está glicosilado ou em que o referido inibidor de TNF não está glicosilado.
28. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-27, em que o referido inibidor de TNF possui um resíduo de metionina no terminal N.
29. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-28, em que o referido inibidor de TNF e inibidor de IL-1 estão ligados a uma ou mais partes poliméricas repetidas, incluindo polietilenoglicol.
30. Utilização da reivindicação 29, em que a parte polimérica repetida é polietilenoglicol.
31. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 10-30, em que o referido inibidor de TNF se destina a administração intra-articular, sub-cutânea, intramuscular, intravenosa, intranasal ou oral. Lisboa, 31 de Janeiro de 2000 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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