ES2312179T3 - Terapia combinada que utiliza un inhibidor del il-1 para el tratamiento de enfermedades mediadas por el il-1. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO O LA PREVENCION DE LA ARTRITIS. EL PROCEDIMIENTO COMPRENDE LA ADMINISTRACION A PACIENTES EN NECESIDAD DE TERAPIA DE CANTIDADES TERAPEUTICAMENTE EFECTIVAS DE UN INHIBIDOR DE LA IL1 Y METOTREXATO. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, EL INHIBIDOR DE LA IL-1 ES IL-1RA RECOMBINANTE HUMANA Y EL METOTREXATO ES ACIDO N-[4-[(2,4-DIAMINO-6-PTERIDINIL)METILAMINO]BENZOILO]-LGLUTAMICO. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN UN INHIBIDOR DE LA IL-1 Y METOTREXATO UTILES EN LOS PROCEDIMIENTOS.

Description

Terapia combinada que utiliza un inhibidor del IL-1 para el tratamiento de enfermedades mediadas por el IL-1.

Campo de la invención

La presente invención se encuadra dentro del campo de las enfermedades mediadas por IL-1. Más específicamente, la presente invención se refiere a una terapia de combinación que tiene como fin de prevenir o tratar enfermedades mediadas por IL-1.

Antecedentes de la invención

La inflamación es la reacción de defensa del organismo ante los daños causados por ejemplo por una lesión mecánica, infección o estimulación antigénica. Una reacción inflamatoria se puede expresar patológicamente cuando la inflamación es inducida por un estímulo inapropiado, como por ejemplo un autoantígeno, se expresa de manera exagerada o persiste bastante después de que se eliminen los agentes culpables. Dicha reacción de inflamación pueden incluir la producción de determinadas citoquinas.

A pesar de que la etiología de la inflamación no se comprende sino escasamente, recientemente se ha adquirido una considerable información en lo que se refiere a los aspectos moleculares de la inflamación. Esta investigación ha llevado a la identificación de determinadas citoquinas que, según se cree, participan prominentemente en la mediación de la inflamación. Las citoquinas son proteínas extracelulares que modifican el comportamiento de las células, en particular las células que están en la zona inmediata de la síntesis y liberación de citoquina. Una de las citoquinas inflamatorias más potentes ya descubierta y una citoquina que según se piensa es una mediadora clave en muchas enfermedades y estados patológicos médicos es la interleuquina-1 (IL-1). IL-1, que es fabricada (aunque no exclusivamente) por las células del linaje macrófago/monocito, se puede producir en dos formas: IL-1 alfa (IL-1\alpha) e IL-1 beta (IL-1\beta).

Una enfermedad o estado patológico médico se considera como una "enfermedad mediada por interleuquina-1" cuando dicha enfermedad o estado patológico médico, ya sea espontáneo o experimental, está asociado con niveles elevados de IL-1 en los fluidos o tejidos de organismo, o cuando las células o tejidos extraídas desde el organismo producen niveles elevados de IL-1 en cultivo. En muchos casos, se reconocen las enfermedades mediadas por interleuquina-1 también porque se dan las dos condiciones adicionales que se indican a continuación: (1) las observaciones patológicas asociadas con la enfermedad o el estado patológico médico pueden imitarse experimentalmente en animales a través de la administración de IL-1; y (2) la patología inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad o el estado patológico médico puede inhibirse o eliminarse a través del tratamiento con agentes que inhiben la acción de IL-1. En la mayoría de las enfermedades mediadas por interleuquina-1 coinciden al menos dos de las tres condiciones, y en muchas de las enfermedades mediadas por interleuquina 1 se observan las tres condiciones.

Las enfermedades mediadas por IL-1 como artritis reumatoide y artritis psoriática, son enfermedades de las articulaciones crónicas que afligen o imposibilitan, en diversos grados, a millones de personas en todo el mundo. La artritis reumatoide es una enfermedad de las uniones articulares en la que se van erosionando lentamente el cartílago y el hueso a través de un tejido conectivo invasivo proliferativo denominado pannus, que se deriva de la membrana sinovial. La enfermedad puede implicar estructuras peri-articulares como bursas, envolturas de tendón y tendones, así como tejidos extra-articulares, como subcutis, sistema cardiovascular, pulmones, bazo, nódulos linfáticos, músculos esquele-
tales, sistema nervioso (central y periférico) y ojos (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissane (ed.), II: 1828).

Se cree que la artritis reumatoide es el resultado de la presentación de un antígeno relevante a un huésped susceptible inmunogenéticamente. Los antígenos que podrían iniciar potencialmente una respuesta inmune desembocando en artritis reumatoide podrían ser endógenos o exógenos. Entre los posibles antígenos endógenos se incluyen colágeno, mucopolisacáridos y factores reumatoides. Entre los antígenos exógenos se incluyen micoplasmas, micobacterias, espiroquetas y virus. Los productos secundarios de la reacción inmune inflaman la sinovia (es decir, las prostaglandinas y los radicales de oxígeno) e impulsan cambios en las articulaciones destructivos (es decir, colagenasa).

Existe un amplio espectro de gravedad dentro de la enfermedad, aunque muchos pacientes experimentan un ciclo de recaídas y remisiones intermitentes con un patrón general de lenta y progresiva destrucción y deformidad de las articulaciones. Entre las manifestaciones clínicas se pueden incluir poliartritis simétrica de las articulaciones periféricas, con dolor, irritabilidad, inflamación y pérdida de la función de las articulaciones afectadas; rigidez matutina; y pérdida de cartílago, erosión de la materia ósea y subluxación de las articulaciones tras una inflamación persistente. Entre las manifestaciones extra-articulares se incluyen nódulos reumatoides, vasculitis reumatoide, inflamaciones pleuro-pulmonares, escleritis, síndrome sicca, síndrome de Felty (esplenomegalia y neutropenia), osteoporosis y pérdida de peso (Katz (1985), Am. J. Med. 79: 24 y Krane and Simon (1986), Advances in Rheumatology, Synderman (ed.), 70(2): 263-284). Las manifestaciones clínicas tienen como resultado un alto grado de morbidad que tiene como resultado una vida cotidiana molesta para el paciente.

Una de las teorías aceptada de manera general a la que se recurre para explicar la relación causal entre IL-1 y la artritis es que la IL-1 estimula varios tipos de células, como fibroblastos y condrocitos, para producir y secretar compuestos proinflamatorios o degradativos, como prostaglandina E_{2} y metaloproteinasas. Se ha relacionado la participación de la interleuquina-1 en la artritis a través de dos líneas de evidencia.

En primer lugar, se ha observado un mayor nivel de interleuquina-1 y del ARNm que lo codifica, en el tejido y el líquido sinovial de las articulaciones artríticas. Ver por ejemplo, Buchan y cols., "Thrid Annual General Meeting of the British Society for Rheumatology" Londres, Inglaterra, noviembre 19-21, 1988, J. Rheumatol., 25(2); Fontana y cols. (1982), Rheumatology Int.: 2: 49-53; y Duff y cols. (1988); Monokines and Other Non-Lymphocytic Cytokines, M. Powanda y cols., (eds), pp. 387-392 (Alan R. Liss, Inc.).

En segundo lugar, se ha demostrado en numerosas ocasiones que la administración de interleuquina-1- al tejido de la articulación sano tiene como resultado la erosión del cartílago y el hueso. En un experimento, se demostró que las inyecciones intra-articulares de IL-1 a conejos causaban la destrucción del cartílago in vivo (Pettipher y cols., (1986), Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 83: 8749-8753). En otros estudios, se ha demostrado que IL-1 causa la degradación tanto del cartílago como del hueso en explantes de tejido (Saklatavala y cols., (1987), Development of Diseases of Cartilage and Bone Matrix, Sen and Thornhill (eds.), pp. 291-298 (Alan R. Liss, Inc.) and Stashenko y cols. (1987), The American Association of Immunologists, 183: 1464-1468). Por otra parte, se han obtenido unos resultados prometedores con con unas recientes pruebas clínicas preliminares con seres humanos en artritis reumatoide con un inhibidor de IL-1 (Bresnihan, y cols., (1996), Arthritis and Rheumatism, 39(9): S73: And Watt y cols., (1996), Arthritis and Rheumatism, 39(9): S123). Brody y cols., Eur. J. Clim. Chem. Clim.

En Biochem 31: 667-74 se describe el papel central de interleuquina-1 en los procesos inflamatorios y en la inducción de la respuesta inmune. Se describe también el papel de metotrexato en la terapia como inhibidor de IL-1.

Los autores han llevado a cabo experimentos con el empleo de IL-1\beta etiquetado con ficoeritrina y han llegado a la conclusión de que la presencia de MTX disminuía la unión de IL-1\beta al receptor IL-1. No obstante, no se llevaron a cabo experimentos en los que se demostrara que MTX se une normalmente al receptor IL-1; por ejemplo, los autores no realizaron ningún experimento en el que se utilizara MTX etiquetado. Brody y cols., por tanto, no han indicado nunca que MTX sea un antagonista de unión a receptor como IL-1ra. Por otra parte, IL-1ra también bloquea la unión de IL-\alpha con receptor de IL-1, y Brody y cols., nunca han alegado un efecto en IL-1\alpha. Hay que señalar sobre todo que la comunidad de reumatología no han adoptado la teoría de Brody y cols. como explicación de los beneficios clínicos de MTX, tal como se indica en los documentos de referencia que señalan a continuación.

Furst (1996) Journal of Rheumatology 23(44):86-90, enumera nueve mecanismos distintos de acción para MTX (Furst, página 87, tabla 2).

Crilly y cols. (1995) Journal of Rheumatology 22(2):224-226, observó que MTX reducía IL-6 y receptor de IL-2 soluble; sugieren que el efecto de IL-6 podía ser el resultado de una reducción en DL-1, lo que contradice directamente el presupuesto de Brody y cols. de que no tiene relación con una reducción de la producción de IL-1 (Cf. Crilly cols. en la página 225; Brody y cols., en la página 668).

Seitz y cols., (1995) British Society for Rheumatology. 34.602-609, han concluido tras sus experimentos que MTX estimula la producción de inhibidores de citoquina al mismo tiempo que también inhibe la producción y liberación de citoquinas inflamatorias, incluyendo IL-1 (Seitz y cols., en la página 602; ver también Cutolo y cols. (2001) Annual Rheumatology, 60:729-735; también en este caso en directa contradicción con el presupuesto de Brody y
cols.

Cronstein y cols. (1996) (copia adjunta) propone dos mecanismos bioquímicos de MTX que conducen a la liberación de adenosina; su teoría atribuye los efectos anti-reumáticos de MTX a la actividad anti-inflamatoria de la adenosina liberada, sin mencionar la inhibición de IL-1. En su artículo de revisión, Cronstein y cols. critican indirectamente las conclusiones de Brody y cols. (D2).

En suma, la acción de MTX no está clara dentro de la especialidad. Brody y cols. y otros han descubierto una gran diversidad de mecanismos y efectos de la acción de MTX en las enfermedades inflamatorias.

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar composiciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades inflamatorias de una articulación. Tanto éste como otros objetos de la presente invención se pondrán de manifiesto con la descripción que se expone a continuación.

Compendio de la invención

La presente invención se refiere a un medicamento de combinación para prevenir y tratar las enfermedades mediadas por IL-1 en un paciente. La presente invención se refiere específicamente a medicamentos de combinación en los que se utiliza un inhibidor de IL-1 para prevenir y tratar enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo enfermedades reumáticas, e inflamación sistémica y pérdida del peso corporal asociada con ella. El tipo de tratamiento que se describe en el presente documento va dirigido a mamíferos, incluyendo los seres humanos.

Breve descripción de las figuras

Varios de los aspectos y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto al repasar las figuras, en las que:

La figura 1 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO:1) que codifica Arg^{1}-Glu^{153}, IL-1ra humana recombinante madura (rhuIL-1ra). Asimismo, se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO:2) de rhuIL-1ra, siendo el aminoácido inicial M_{n}, siendo n equivalente a 0 ó 1.

En la figura 2 se representan los efectos de rhuIL-1ra en solitario, metotrexato en solitario y la combinación de rhuIL-1ra y metotrexato en el diámetro de la articulación en ratas artríticas adyuvantes, en el ejemplo 1.

La figura 3 representa los efectos de rhuIL-1ra en solitario, metotrexato en solitario y la combinación de rhuIL-1ra y metotrexato en los pesos finales de la pata (índice de artritis), la esplenomegalia (índice de inflamación sistémica) y el cambio de peso corporal en ratas artríticas adyuvantes, en el ejemplo 1.

En la figura 4 se representa el análisis final (inhibición en la terminación) de los efectos de rhuIL-1ra en solitario, metotrexato en solitario o de la combinación con rhuIL-1ra y metotrexato en el diámetro de la articulación en las ratas artríticas adyuvantes del ejemplo 2.

En la figura 5 se representan los efectos de rhuIL-1ra en solitario, metotrexato en solitario y la combinación de rhuIL-1ra y metotrexato en los pesos finales de la pata (índice de artritis), la esplenomegalia (índice de inflamación sistémica) y el cambio de peso corporal en ratas artríticas adyuvantes, en el ejemplo 2.

Descripción detallada de la invención

Las composiciones de la invención están destinadas a su administración a un animal que padece una enfermedad mediada por IL-1, en una cantidad efectiva, de inhibidor de IL-1 en combinación con metotrexato. El animal sujeto preferible es el ser humano.

Los inhibidores de interleuquina pueden derivarse de cualquier proteína capaz de prevenir específicamente la activación de receptores celulares para IL-1. Entre las clases de inhibidores de interleuquina 1 se incluyen: antagonistas de receptor de interleuquina 1 como IL-1ra, tal como se describe más adelante; anticuerpos monoclonales de receptor anti-IL-1 (v.g., EP 623674), referencia; proteínas de unión a IL-1 como, por ejemplo, receptores de IL-1 solubles (v.g., U.S.P. 5.492.888; U.S.P. 5.488.032, y U.S.P. 5.464.937; U.S.P. 5.319.071; y U.S.P. 5.180.812; anticuerpos monoclonales anti-Il-1 (v.g. WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S.P. 4.935.343, EP 364.778; EP 276.611 y EP 220.063); proteínas accesorias de receptor de IL-1 (v.g., WO 96/23067)) y otros compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o la liberación extracelular de IL-1.

El antagonista de receptor de interleuquina-1 (IL-1ra) es una proteína humana que actúa como inhibidor natural de la interleuquina-1 y que es un miembro de la familia IL-1, incluyéndose entre dichos miembros IL-1\alpha e IL-1\beta. Entre los antagonistas de receptor preferibles, así como los métodos para su obtención preferibles se incluyen los descritos en la patente EE.UU. 5.075.222; WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626; WO 94/20517; WO 96/22973 y WO 97/28828. Entre las proteínas se incluyen antagonistas de receptor IL-1 tanto glucosilados como no glucosilados.

Específicamente, hay tres formas útiles de IL-1ra y variantes de las mismas, que se describen en la patente 5.075.222. La primera de ellas, IL-1ra\alpha, se caracteriza por estar formada por una molécula de 22-23 kD sobre SDS-PAGE con un punto isoeléctrico aproximado de 4,8, por elución desde una columna Mono Q FPLC a aproximadamente 52 mM de NaCl en tampón tris, pH 7,6. La segunda, IL-1ra\beta, se caracteriza por ser una proteína de 22-23 kD, por elución desde una columna Q a 48 mM de NaCl. Tanto IL-1ra\alpha como IL-1ra\beta están glucosiladas. La tercera, IL-1rax se caracteriza como una proteína de 20 kD, por elución desde una columna Mono Q a 48 mM de NaCl y no está glucosilada. En la patente 5.075.222 se describen también métodos para el aislamiento de genes responsables de la codificación de los inhibidores, la clonación del gen en vectores y tipos de células adecuados y la expresión del gen para producir los inhibidores.

Para los propósitos de la presente invención, IL-1ra y las formas modificadas de IL-1ra en las que los aminoácidos de IL-1ra han sido (1) suprimidos ("variantes de supresión"), (2) insertados ("variantes de adición") o (3) sustituidos ("variantes de sustitución") se denominan de forma colectiva "proteínas IL-1ra". [A no ser que se indique de otro modo, la numeración de aminoácidos para las moléculas que se describen en el presente documento deberá corresponder a la presentada para la forma madura de la molécula (es decir menos la secuencia de señal), tal como se describe con los aminoácidos Arg^{1}-Glu^{152} de la SEQ ID NO:2, siendo MET inicial en cada una de dichas secuencias el radical
número "0"].

Los especialistas en este campo podrán apreciar que se pueden realizar muchas combinaciones de supresiones, inserciones y sustituciones (individualmente o colectivamente "variantes") dentro de las secuencias de aminoácido de IL-1ra, siempre y cuando la molécula resultante sea biológicamente activa (v.g., que posea la capacidad de inhibir
IL-1).

Se puede realizar una rápida detección selectiva de una variante IL-ra para valorar sus propiedades físicas. Los especialistas en este campo podrán apreciar que dicha(s) variante(s) demostrará(n) propiedades de inhibición de IL-1 similares, pero no necesariamente todas las mismas propiedades y no necesariamente en el mismo grado que IL-1ra.

Existen dos variables principales en la construcción de la(s) variante(s) de secuencia de aminoácido: la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Al designar una(s) variante(s), la localización de cada sitio de mutación y la naturaleza de cada mutación dependerán de la(s) característica(s) bioquímica(s) que se vaya(n) a modificar. Cada sitio de mutación puede modificarse individualmente o en serie, v.g., (1) suprimiendo el radical de aminoácido diana, (2) insertando uno o más radicales de aminoácido adyacentes al sitio localizado o (3) sustituyendo primero con elecciones de aminoácido conservadoras y, dependiendo de los resultados conseguidos, a continuación, con seleccionas más radicales.

Las supresiones de la secuencia de aminoácido oscilan generalmente entre aproximadamente 1 y 30 radicales de aminoácido, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 20 radicales de aminoácido, más preferiblemente, entre aproximadamente 1 y 10 radicales de aminoácido, siendo sobre todo preferible entre aproximadamente 1 y 5 radicales contiguos. Se contemplan las supresiones dentro de la secuencia internas, carboxi-terminales y aminoterminales. Se pueden realizar supresiones dentro de la secuencia de aminoácido IL-1ra como, por ejemplo, en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1. Las supresiones dentro de la secuencia de aminoácido IL-1ra en áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1 tendrán más probabilidades de modificar significativamente la actividad biológica.

Una adición de secuencia de aminoácido puede incluir inserciones de fusión amino- y/o carboxi-terminal comprendidas en longitud entre un radical y cien o más radicales, así como inserciones dentro de la secuencia internas de un solo radical o varios radicales de aminoácido. Las adiciones internas pueden oscilar generalmente entre aproximadamente 1 y 20 radicales de aminoácido, preferiblemente entre aproximadamente 1 y 10 radicales de aminoácido, más preferiblemente entre aproximadamente 1 y 5 radicales de aminoácido, siendo sobre todo preferible entre aproximadamente 1 y 3 radicales de aminoácido. Las adiciones dentro de la secuencia de aminoácido de IL-1ra se pueden realizar en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1. Las adiciones dentro de la secuencia de aminoácido de IL-1ra en áreas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia IL-1 tendrán mayor probabilidad de modificar significativamente la actividad biológica. Las adiciones incluyen preferiblemente secuencias de aminoácido derivadas de las secuencias de los miembros de la familia IL-1.

Se contempla que la adición del termino amino incluya la adición de una metionina (por ejemplo, como elemento de la expresión directa en un cultivo de células recombinantes bacterianas). Otro ejemplo más de una adición amino-terminal incluye la fusión de una secuencia de señales con el término amino de Il-1ra con el fin de facilitar la secreción de proteínas desde células huésped recombinantes. Dichas secuencias de señal se obtendrán generalmente a partir especies de células huésped buscadas y por lo tanto serán homólogas a ellas. Para células huésped procarióticas que no reconocen la secuencia de señal nativa de IL-1ra, se puede sustituir la secuencia de señal por una secuencia de señal procariótica, como por ejemplo, a partir del grupo de secuencias líder de fosfatasa alcalina, penicilinasa o enterotoxina II termoestable. Para la expresión en células de levadura, cada polipéptido puede tener una secuencia de señal seleccionada por ejemplo del grupo de secuencias líder de invertasa de levadura, factor alfa o fosfatasa ácida. En la expresión de células de mamífero, la secuencia de señal nativa de IL-1ra (U.S. 5.075.222) es satisfactoria, si bien pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamífero, como por ejemplo secuencias derivadas de otros miembros de la familia IL-1.

Como ejemplo de la adición en el término amino- o carboxi se pueden mencionar proteínas quiméricas que comprenden la fusión amino-terminal o carboxi-terminal de una(s) proteína(s) IL-1ra con parte o todo el dominio constante de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana (individualmente o colectivamente, ("IL-1ra Fac(s"). Son preferibles dichos polipéptidos quiméricos, comprendiendo la porción de inmunoglobulina de cada uno todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobuilina humana, como IgG (v.g., IgG1 o IgG3), IgA, IgM o IgE. Las personas especializadas en este campo podrán apreciar que se puede suprimir o sustituir cualquier aminoácido de la porción inmunoglobulina con uno o más aminoácidos, se pueden añadir uno o más aminoácidos, siempre y cuando la porción de la(s) proteína(s) IL-Ira siga inhibiendo la IL-1 y la porción inmunoglobulina presente una o más de sus propiedades características.

Otro grupo de variante(s) es el de las variantes de sustitución de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de IL-1ra. Se trata de variantes en las que se elimina al menos un radical de aminoácido en IL-1ra y se inserta un radical diferente en su lugar. Entre las variantes de sustitución se incluyen variantes alélicas, que se caracterizan por cambios en la secuencia de nucleótido naturales en la población de especie que pueden tener o no como resultado un cambio de aminoácido. Las personas especializadas en este campo pueden utilizar la información con la que se cuenta sobre la unión o sitio activo del polipéptido para la selección de los posibles sitios de mutación. En WO 91/17184, WO 92/16221 y WO 96/09323 se instruye sobre ejemplos de variante(s) de sustitución.

Uno de los métodos para identificar radicales o regiones de aminoácido para mutagénesis de una proteína es la denominada "mutagénesis de exploración de alanina", tal como describe Cunningham and Wells (1989), Science, 244: 1081-1085. En este método, se identifica un radical de aminoácido o un grupo de radicales diana de una proteína (v.g., radicales cargados como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y se reemplaza por un aminoácido neutro o de carga negativa (siendo sobre todo preferible alanina o polialanina) para afectar a la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso circundante dentro o fuera de la célula. A continuación, se refinan los dominios/radicales que demuestran una sensibilidad funcional a las sustituciones por introducción de radicales adicionales o alternativos en los sitios de sustitución. Según esto, se determina previamente el sitio para introducir una modificación de la secuencia de aminoácido. Para optimizar el comportamiento de una mutación en un sitio determinado, se puede llevar a cabo la exploración de alanina o la mutagénesis aleatoria y se puede realizar la detección selectiva de la(s) variable(s) para obtener la combinación optima según la actividad y el grado de actividad deseados. Se ha trazado el mapa de los sitios de unión del receptor en IL-1ra por mutagénsis dirigida a sitio extensiva (Evans y cols., (1994), The Journal of Biological Chemistry, 270(19):11477-11483.

Los sitios de mayor interés para la mutagénsis de sustitución incluyen sitios en los que ciertos aminoácidos en particular, que se encuentran dentro de IL-ra, son sustancialmente diferentes de otras diversas especies u otros miembros de la familia IL-1 en lo que se refiere al volumen de cadenas laterales, la carga y/o la hidrofobiciodad. Otros sitios de interés incluyen aquellos en los que ciertos radicales en particular de IL-1ra son idénticos entre otras especies u otros miembros de la familia IL-1, dado que dichas posiciones son importantes por lo general para la actividad biológica de una proteína. Las personas especializadas en este campo podrán apreciar que inicialmente, estos sitios deberán modificarse por sustitución de una manera relativamente conservadora.

Dichas sustituciones conservadores se muestran en la tabla 1, bajo el encabezamiento "Sustituciones preferibles". Cuando dichas sustituciones tienen como resultado un cambio en la actividad biológica, más cambios sustanciales cambios se pueden introducir (ejemplos de sustituciones) y/o se pueden realizar otras adiciones/supresiones y realizar la detección selectiva de los polipéptidos resultantes.

TABLA 1 Sustituciones de aminoácido

1

Al realizar dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva a la proteína se comprende por lo general dentro de la especialidad (Kyte and Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157:105-131). Se sabe que determinados aminoácidos pueden estar sustituidos por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y siguen reteniendo una actividad biológica similar.

También se comprende dentro de la especialidad que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de manera efectiva en función de la hidrofobicidad, en particular, cuando se pretende utilizar la proteína o péptido de funcionalidad equivalente creada de este modo en modos de realización inmunológicos, como es el caso de la presente invención. En la patente EE.UU. 4.554.101, se señala que la mayor hidrofobicidad media local de una proteína, según se rige por la hidrofobicidad de sus aminoácidos adyacentes se corresponde con su inmunogenicidad y antigenicidad es decir con una propiedad biológica de la proteína.

En la patente EE.UU. 4.554.101 se instruye también sobre la identificación y preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácido primarias en función de la hidrofobicidad. A través de los métodos descritos en la patente EE.UU. 4.554.101, las personas especializadas en este campo podrán identificar epítopos, como por ejemplo, dentro de la secuencia de aminoácido de IL-1ra. Dichas regiones se denominan también "regiones de núcleo epitópico". Se han dedicado numerosas publicaciones científicas a la predicción de una estructura secundaria y a la identificación de epítopos, a partir de análisis de secuencias de aminoácido (Chou and Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 222-245; Chou and Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Chou and Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 211-222, Chou and Fasman (1978, Ann Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou and Fasman (1979), Biophys. J., 26:367-384. Por otra parte, actualmente se dispone de programas informáticos para ayudar a predecir las porciones antigénicas y las regiones de núcleo epitópico de proteínas. Entre los ejemplos se incluyen los programas basados en el análisis de Jameson-Wolf (Jameson and Wolf (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 y Wolf y cols., (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191, el programa PepPlot® (Brutlag y cols. (1990), CABS, 6:237-245 y Weinberger y cols. (1985), Science, 228: 740-742, y otros programas para predicción de estructura terciaria de proteína (Fetrow and Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11: 479-483).

En contraste, se pueden realizar sustanciales modificaciones en las características funcionales y/o químicas de IL-1ra seleccionando las sustituciones que difieren significativamente en su efecto en mantener (a) la estructura de la cadena principal de polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como lámina o una conformación helicoidal, (b) la carga relativa o hidrofobicidad de la proteína en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los radicales naturales se dividen en grupos en función de las propiedades de la cadena lateral comunes:

1)

hidrofóbico: norleucina, Met, Ala, Val, Leu; Ile;

2)

hidrófílico neutro: Cys, Ser, Thr;

3)

ácido: Asp; Glu

4)

básico: Asn, Gln; His, Lys, Arg;

5)

aromático: Trp, Tyr, Phe; y

6)

radicales que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro.

Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de uno de estos grupos por otro. Dichos radicales sustituidos pueden introducirse en regiones de IL-1ra que son por ejemplo homólogas a las de otros miembros de la familia IL-1 o en regiones no homólogas de la proteína.

Se puede obtener una variedad de sustituciones o supresiones de aminoácido para modificar o añadir sitios de glucosilación unidos en N- o unidos en O-, con el resultado de una proteína con la glucosilación alterada. Se puede modificar la secuencia para añadir sitios de glucosilación o suprimir sitios de glucosilación unidos en N- o unidos en O- desde IL-1ra. Un sitio de reconocimiento de glucosilación unido a asparagina comprende una secuencia de tripéptido que es reconocida específicamente por enzimas de glucosilación celulares apropiadas. Dichas secuencias de tripoéptido son o bien Asn-Xaa-Thr o bien Asn-Xaa-Ser, pudiendo ser Xaa cualquier aminoácido distinto a Pro.

Las mutaciones específicas de la secuencia de IL-1ra pueden implicar sustitución de un aminoácido no nativo en el término amino, el término carboxi o cualquier otro sitio de la proteína que está modificado por la adición de un carbohidrato unido en N- o unido en O-. Dichas modificaciones pueden resultar de particular utilidad en la adición de un aminoácido (v.g., cisteína), lo que es ventajoso para la unión de un polímero hidrosoluble para formar un derivado. Por ejemplo, WO 92/16221 describe la preparación de IL-1ra muteínas, v.g., en las que se cambian los radicales nativos por cisteína.

En un modo de realización específico, el polipéptido variante será preferiblemente sustancialmente homólogo al aminoácido de IL-1ra (SEQ ID NO:2). El término "susancialmente homólogo" tal como se utiliza aquí se refiere a un grado de homología que excede un 80%, preferiblemente, que excede un 90%, más preferiblemente, que excede 95%, siendo sobre todo preferible incluso 99%. El porcentaje de homología, tal como se describe aquí se calcula como el porcentaje de radicales aminoácido que se encuentran en la más pequeña de las dos secuencias que se alinéan con radicales de aminoácido idénticos en la secuencia que se está comparando cuando se pueden introducir dos espacios en una longitud de 100 aminoácidos para ayudar a dicho alineamiento, tal como describe Dayhoff en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. También se incluyen dentro del término "sustancialmente homólogo" variante(s)de IL-1ra que se pueden aislar en virtud de la reactividad cruzada con anticuerpos para la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 o cuyos genes se pueden aislar a través de hibridación con el ADN de la SEQ ID NO:1 o con segmentos de la misma.

Derivados de polipéptido

Los derivados químicamente modificados de la(s) proteína(s) IL-1ra en los que la proteína está unida a un polímero con el fin de modificar las propiedades de la proteína (denominados en el presente documento "derivados") son útiles para la puesta en práctica de la presente invención. Dichos derivados pueden ser preparados por las personas especializadas en este campo en función de la descripción aquí expuesta. Se pueden preparar conjugados utilizando proteína(s) IL-1ra glucosiladas, no glucosiladas o desglucosiladas y fracciones químicas adecuadas. Típicamente, se utilizarán proteínas no glucosiladas y polímeros hidrosolubles.

Los polímeros hidrosolubles son deseables ya que la proteína a la que se une cada uno de ellos no precipitará en un entorno acuoso, como es el entorno fisiológico. Preferiblemente, el polímero será farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o composición tarapéutico. Las personas especializadas en este campo podrán seleccionar el polímero deseado en función de consideraciones de si el conjugado polímero /proteína se utilizará terapéuticamente y, si es así, el perfil terapéutico de la proteína (v.g., la duración de la liberación sostenida; la resistencia a la proteolisis; los efectos, si los hay en la dosis; la actividad biológica; la facilidad de manejo; el grado o falta de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero hidrosoluble en una proteína terapéutica).

Entre los polímeros hidrosolubles clínicamente aceptables adecuados se incluyen, sin limitarse sólo a ellos, polietilen glicol (PEG), propionaldehído de polietilen glicol, copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, monometoxi-polietilen glicol, carboximetil celulosa, dextrano, polialcohol vinílico (PVA), polivinil pirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolimero de etileno/anhídrido maleico, poli(\beta-aminoácidos (ya sean homopolímeros o copolímeros aleatorios), poli(n-vinil pirrolidona)polietilen glicol, homopolímeros de polipropilen glicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polialcoholes polioxietilados (POG) (v.g., glicerol) y otros polialcoholes polioxietilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada, ácidos colónicos u otros polímeros de hidrato de carbono, Ficoll o dextrano y mezclas de ellos. Tal como se utiliza aquí, se pretende que polietilen glicol abarque cualquier forma que se haya utilizado para derivar otras proteínas, como mono-(C1-C10) alcoxi o ariloxi-polietilen glicol. El propionaldehido de polietilen glicol puede presentar ventajas en la fabricación gracias a su estabilidad en agua.

Los polímeros hidrosolubles pueden presentar cualquier peso molecular y pueden estar ramificados o sin ramificar. Por lo general, cuanto mayor es el peso molecular o cuanto más ramificaciones tiene, mayor es la relación polímero:proteína. Los polímeros hidrosolubles tienen típicamente un peso molecular medio comprendido entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que, en las preparaciones de un polímero hidrosoluble, algunas moléculas pesarán más y algunas menos que el peso molecular señalado). El peso molecular medio de cada uno de los polímeros hidrosolubles está comprendido preferiblemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 40 kDa, más preferiblemente entre aproximadamente 10 kDa y aproximadamente 35 kDa siendo sobre todo preferible entre aproximadamente 15 kDa y aproximadamente 30 kDa.

Existe una serie de métodos de unión disponibles para las personas especializadas en este campo, entre los que se incluyen reacciones de acilación o reacciones de alquilación (preferiblemente para generar una proteína químicamente modificada amino-terminal) con una molécula hidrosoluble reactiva. Ver por ejemplo, EP 0.401.384; Malik y cols. (1992), Exp. Hematol., 20: 1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2): 4-10, publicado por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, RU; EP 0.154.316; EP 0.401.384; WO 92/16221; WO 95/34326; WO 95/13312; WO 96/11953; WO 96/19459 y WO 96/19459; y las otras publicaciones aquí citadas que se refieren a la pegilación.

Un modo de realización específico para la puesta en práctica de la presente invención consiste en una molécula de aldehído de monometoxi-polietilen glicol que tiene un peso molecular medio de o bien aproximadamente 20 kDa o bien aproximadamente 33 kDa (v.g., entre 30 kDa y 35 kDa), o un aldehído de terc-butil polietilen glicol que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 33 kDa (v.g. entre 30 kDa y 35 kDa) conjugado a través de la alquilación reductora con la(s) proteína(s) IL-1ra.

La pegilación también se puede llevar a cabo específicamente utilizando polímeros hidrosolubles que tienen al menos un grupo hidroxi reactivo (v.g., polietilen glicol). Se puede hacer reaccionar el polímero hidrosoluble con un grupo activador, formando así un "ligador activado" útil en la modificación de diversas proteínas. Los ligadores activados pueden ser monofuncionales, bifuncionales o multifuncionales.

Entre los grupos activadores que se pueden utilizar para unir el polímero hidrosoluble con dos o más proteínas se incluyen los siguientes: sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Entre los reactivos útiles que tienen un grupo sulfona reactivo que se pueden utilizar en los métodos se incluyen, sin limitación, clorosulfona, vinilsulfona y divinilsulfona. Estos derivados PEG son estables frente a la hidrólisis durante extensos períodos de tiempo en entornos acuosos, a pHs de aproximadamente 11 o menos, y pueden formar uniones con moléculas para formar conjugados que también son hidrolíticamente estables. Dos derivados homobifuncionales particularmente útiles son PEG-bis-clorosulfona y PEG-bis-vinilsulfona (WO 95/13312).

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Formas polivalentes

Se pueden construir formas polivalentes, es decir, moléculas que comprenden más de una fracción activa. En un modo de realización, la molécula puede poseer varios sitios antagonistas de receptor de interleuquina-1. Adicionalmente, la molécula puede poseer al menos un sitio antagonista de receptor de interleuquina-1 y, dependiendo de las características deseadas de la forma polivalente, al menos un sitio de otra molécula (v.g., una(s) proteína(s) IL-1ra, y un producto TNFbp, tal como se describe más adelante).

En un modo de realización, se puede construir la forma polivalente, por ejemplo, por acoplamiento químico en al menos una proteína(s) IL-1ra y otra fracción con cualquier ligador clínicamente aceptado (v.g., un polímero hidrosoluble). En principio, el ligador no debe impartir una nueva inmunogenicidad ni tampoco, en virtud de los nuevos radicales de aminoácido, alterar la hidrofobicidad ni cargar el resto de la estructura que afecte a su distribución y eliminación.

Los polímeros hidrosolubles pueden ser, en función de los monómeros aquí enumerados, homopolímeros, copolímeros aleatorios o de bloque, terc-polímeros de cadena lineal o ramificada, sustituidos o sin sustituir. El polímero puede ser de cualquier longitud o peso molecular, si bien estas características pueden afectar a las propiedades biológicas. Los pesos moleculares medios de polímero particularmente útiles para disminuir los índices de eliminación en aplicaciones farmacéuticas se encuentran en el intervalo de 2.000 a 35.000 daltons. Por otra parte, la longitud del polímero puede variar para optimizar o conferir la actividad biológica deseada.

Las fracciones activas pueden unirse utilizando técnicas de copulación convencionales (ver WO 92/16221, WO 95/13312 y WO 95/34326. Por ejemplo, en WO 92/16221 y WO 95/34326 se describe la preparación de diversas moléculas IL-1ra dimerizadas.

Alternativamente, una molécula bivalente puede consistir en dos repeticiones en tandem de proteína(s) IL-1ra separadas por una región de ligador de polipéptido. El diseño de los ligadores de polipéptido es similar al diseño a la inserción de secuencias de bucle cortas entre dominios en el nuevo diseño de proteínas (Mutter (1988), TIBS, 13: 260-265 y Regan and Degrado (1988), Science, 241: 976-978. Se han ensamblado varios constructos de ligador diferentes y se ha demostrado que son útiles para formar anticuerpos de cadena simple; los ligadores más funcionales varían en tamaño entre 12 y 25 aminoácidos (aminoácidos que tienen grupos laterales no reactivos, v.g., alanina, serina y glicina) que constituyen juntos una secuencia hidrófila, tienen radicales de carga opuesta para potenciar la solubilidad y son flexibles (Whitlow and Filpula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2: 97-105; y Brigido y cols., (1993), J. Immunol., 150: 469-479.

Adicionalmente, se puede(n) acoplar químicamente la(s) proteína(s) IL-1raa biotina y, a continuación, puede dejarse unir el conjugado resultante a avidina, con el resultado de una molécula de proteína(s) avidina/biotina/IL-1ra tetravalente. La(s) proteína(s) IL-1ra puede(n) acoplarse covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y hacerse precipitar el conjugado resultante con anti-DNP o anti-TNP-IgM para formar conjugados decaméri-
cos.

En otro modo de realización más, se pueden producir también las proteínas de fusión recombinantes en las que cada molécula quimérica recombinante tiene una secuencia de proteína(s) IL-1ra fusionada amino-terminalmente o carboxi-terminalmente con todos o parte de los dominios constantes, pero a al menos un dominio constante, de la cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se puede producir una proteína de fusión quimérica de proteína(s) IL-1ra/IgG1 (o proteína(s) IgGl/IL-1ra) a partir de un gen químerico con contenido en cadena ligera: una quimera de proteína(s) IL-1ra/kappa humana de cadena ligera (proteína(s) IL-1ra/Ck) o quimera de cadena ligera de kappa humana /proteína(s) IL-1ra (Ck/proteína(s) IL-1ra); o gen químerico con contenido en cadena pesada: una quimera de proteína(s) IL-1ra/cadena pesada de gamma-1 humana (proteína(s) IL-1ra /Cg-1) o quimera de gamma-1 humana de cadena pesada/proteína IL-1ra) (Cg-1/proteína(s) IL-1ra). Tras la transcripción y traducción de un gen quimérico de cadena pesada, o de un gen con contenido en cadena ligera y un gen químerico de cadena pesada, se pueden ensamblar los productos genéticos en una sola molécula químerica que tiene una proteína(s) IL-1ra desplegada bivalentemente. Otros detalles que se refieren a la construcción de dichas moléculas químericas se describen en la patente estadounidense 5.116.964; WO 89/09622, WO 91/16437 y EP 315062.

En otro modo de realización más, se pueden producir también proteínas de fusión recombinantes teniendo cada molécula quimérica recombinante al menos una proteína(s) IL-1ra, tal como se ha descrito en el presente documento, y al menos una porción de la región 186-401 de osteoprotogerina, tal como se describe en la solicitud de patente europea Nº 96309363.8. O bien la(s) proteína(s) IL-1ra o bien la porción de osteoprotogerina pueden estar en el término amino o en el término carboxi de la molécula quimérica.

Síntesis de proteína(s) IL-1ra

A continuación, se describe con mayor detalle la producción de la proteína IL-1ra. Dichas proteínas pueden prepararse, por ejemplo, a través de técnicas recombinantes o a través de una proteína de síntesis química in vitro.

Polinucleótidos

Basándose en la presente descripción y utilizando la tabla de codones universal, las personas especializadas en este campo podrán determinar fácilmente todas las secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácido de la(s) proteína(s) IL-1ra.

Se pueden seguir las técnicas de expresión recombinantes aplicadas de acuerdo con las descripciones que se exponen a continuación para producir cada uno de dichos polinucleótidos y para expresar la proteína codificada. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína(s) IL-1ra en un vector apropiado, las personas especializadas en este campo podrán producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleótido deseada. Las secuencias se pueden utilizar después para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, se puede insertar un polinucleótido que codidifica una proteína(s) IL-1ra en un vector de expresión. Al introducir el vector de expresión en un huésped apropiado, se puede producir la proteína deseada en grandes cantidades.

Tal como se describirá también en el presente documento, se dispone de numerosos sistemas huésped/vector para la propagación de las secuencias de ácido nucleico deseadas y/o la producción de las proteínas deseadas. Entre ellos se incluyen, sin limitarse sólo a ellos plásmido, vectores viral e insercional y húéspedes procarióticos y eucarióticos. Las personas especializadas en este campo podrán adaptar un sistema húésped/vector con el que se pueda propagar o expresar ADN heterólogo para producir o expresar las secuencias de la presente invención.

Por otra parte, las personas especializadas en este campo podrán apreciar, a la vista de la presente descripción, que las secuencias de ácido nucleico incluyen la secuencia de ácido nucleico de la figura 1, así como las secuencias de ácido nucleico degeneradas de la misma, secuencias de ácido nucleico que codifican variante(s) de IL-1ra y secuencias de ácido nucleico que se hibridan (en las condiciones de hibridación que se describen más adelante en la sección detetección selectiva de biblioteca de ADNc, o condiciones equivalentes o condiciones más rígidas) con complementos de la secuencia de ácido nucleico de la figura 1.

Expresión recombinante Preparación de polinucleótidos

Se puede obtener fácilmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína(s) IL-1ra de varias maneras entre las que se incluyen, sin limitarse sólo a ellas, síntesis química, detección selectiva de biblioteca de ADNc o genómica, detección selectiva de biblioteca de expresión y/o amplificación por PCR de ADNc. Estos métodos y otros, que son útiles para aislar dichas secuencias de ácido nucleico, se describen en Sambrook y cols. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; de Ausubel y cols. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; y por Berger adn Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, vol. 152, Academic Press, Inc. San Diego Ca.

La síntesis química de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada puede llevarse a cabo utilizando métodos muy conocidos en la especialidad, como por ejemplo los que describe Engels y cols. (1989), Angew. Chem. Intl. Ed. 28: 716-734 y Wells y cols. (1985), Gene, 34: 315. Estos métodos incluyen, entre otros, los métodos de síntesis de secuencia de ácido nucleico de fosfotriéster, fosforoamidita, y H-fosfonato. Se pueden sintetizar secuencias de ácido nucleico grandes, como por ejemplo, las que son más grandes de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, como varios fragmentos. A continuación, se pueden ligar los fragmentos entre sí para formar una secuencia de ácido nucleico adecuada. Un método preferible es la síntesis soportada por polímero aplicando la química de fosforamidita normal.

Alternativamente, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada por detección selectiva de una biblioteca de ADNc apropiada (es decir, una biblioteca preparada a partir de una o más fuentes de tejido que presuntamente expresa la proteína) o una biblioteca genómica (una biblioteca preparada a partir de un ADN genómico total). La fuente de la biblioteca de ADNc es típicamente una fuente de tejido o celular de cualquier especie que exprese presuntamente una proteína deseada en cantidades razonables. La fuente de la biblioteca genómica puede consistir en cualquier tejido o tejidos de un mamífero u otra especie que se crea que hospeda un gen que codifica la proteína deseada.

Se puede realizar la detección selectiva de los medios de hibridación para determinar la presencia de un ADN que codifica una proteína deseada utilizando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, fragmentos de ADN genómico o ADNc que poseen un nivel aceptable de homología con el ADNc o gen que se va a clonar) que se hibriden selectivamente con los ADNc o gene(s) presentes en la biblioteca. Las sondas utilizadas típicamente para dicha detección selectiva codifican una región reducida de la secuencia de ADN desde la misma especie o especie similar a la especie desde la que se prepara la biblioteca. Alternativamente, las sondas se pueden degenerar, tal como se explica en el presente documento.

Típicamente, se lleva a cabo la hibridación por apareamiento de una sonda de oligonucleótido o ADNc con los clones en condiciones de severidad para prevenir una unión no específica a la vez que se permite la unión de los clones que tienen un nivel significativo de homología con la sonda o cebador. Las condiciones de severidad de lavado e hibridación típicas dependen en parte del tamaño (es decir el número de nucleótidos en longitud) del ADNc o la sonda de oligonucleótido o de si se genera o no la sonda. La probabilidad de identificación de un clon también se considera a la hora de diseñar el medio de hibridación (v.g., si se está detectando selectivamente una biblioteca genómica o de ADNc o no).

Cuando se utiliza un fragmento de ADN (como por ejemplo un ADNc) como sonda, entre las condiciones de hibridación típicas se incluyen las que se exponen en Ausubel y cols. (1994), supra. Tras la hibridación, se lava el medio de hibridación en condiciones de severidad adecuadas, dependiendo de varios factores como el tamaño de la sonda, la homología de la sonda con el clon esperada, el medio de hibridación que se esté detectando selectivamente, el número de clones que se estén detectando selectivamente y similares.

Como ejemplo de condiciones de hibridación severas se puede mencionar una hibridación en 6 x SSC a 62-67ºC, seguido del lavado en 0,1 x SSC a 62-67ºC durante aproximadamente una hora. Alternativamente, otro ejemplo de condiciones de hibridación severas puede consistir en una hibridación a 45-55% de formamida, 6 x SSC a 40-45ºC, seguido del lavado en 0,1 x SSC a 62-67ºC durante aproximadamente una hora. Asismismo, se incluyen secuencias de ADN que se hibridan con las secuencias de ácido nucleico que se indican en la figura 1 en condiciones de hibridación relajadas y que codifican una proteína(s) IL-1ra. Como ejemplo de condiciones de hibridación severas relajadas se puede mencionar 6 x SSC a 45-55ºC o la hibridación con 30-40% de formamida a 40-45ºC, seguido del lavado en 1-2 x SSC a 55ºC durante aproximadamente 30 minutos. Ver Maniatis y cols. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a 389.

Existen también ejemplos de protocolos para las condiciones de lavado severas, según los cuales se utilizan sondas de oligonucleótido para detectar selectivamente los medios de hibridación. Por ejemplo, en un primer protocolo se utilizan 6 x SSC con 0,05 por ciento de pirofosfato sódico a una temperatura comprendida entre aproximadamente 35ºC y 63ºC, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, se lavan 14 sondas de base a 35-40ºC, 17 sondas de base a 45-50ºC, 20 sondas de base a 52-57ºC, y 23 sondas de base a 57-63ºC. Se puede aumentar la temperatura 2-3ºC cuando la unión no específica de fondo resulta alta. En un segundo protocolo se utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para el lavado. Una solución de lavado severa consiste en TMAC 3M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y 0,2% SDS.

Otro método para obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada que codifica una(s) proteína(s) IL-1ra es la reacción en cadena de polimerasa (PCR). En este método, se prepara ADNc a partir de poli(A)+ARN o ARN total utilizando la transcriptasa inversa de enzima. A continuación, se añaden dos cebadores, típicamente complementarios de las dos regiones de ADN por separado (oligonucleótidos) que codifican la proteína desdada, al ADNc junto con una polimerasa, como por ejemplo Taq polimerasa, y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.

Las secuencias de oligonucleótido seleccionadas como sondas o cebadores deberá ser de la longitud adecuada y suficientemente no ambigua como para reducir al minímo la cantidad de unión no específica que pueda darse durante la detección selectiva o la amplificación por PCR. La secuencia real de las sondas o cebadores se basa normalmente en las secuencias o regiones altamente homólogas o conservadas. Opcionalmente, se pueden degenerar total o parcialmente las sondas o cebadores, es decir, pueden contener una mezcla de sondas/cebadores, que codifican todos ellos la misma secuencia de aminoácido, pero que utilizan diferentes codones para hacerlo. Una alternativa a la preparación de sondas degeneradas consiste en colocar una inosina en alguna o en todas las posiciones de codón que varían según la especie. Las sondas o cebadores de oligonucleótido se pueden preparar a través de métodos de síntesis química para ADN tal como se describe en el presente documento.

Vectores

Se puede insertar ADN que codifica las proteínas deseadas en vectores para posterior clonación (amplificación de ADN) o para expresión. Los vectores adecuados están disponibles en el comercio o se pueden construir de manera específica. La selección o construcción de un vector apropiado dependerá de (1) si se va a utilizar o no para amplificación de ADN o para expresión de ADN, (2) el tamaño del ADN que se va a insertar en el vector y (3) la célula húesped pretendida que se va a transformar con el vector.

Los vectores implican típicamente cada uno de ellos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada unida operativamente a una o más de las siguientes secuencias reguladoras o de control de la expresión capaces de dirigir, controlar o afectar de otro modo a la expresión de una proteína deseada a través de una célula húesped seleccionada. Cada vector contiene varios componentes, dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y su compatibilidad con la célula huésped pretendida. Los componentes de vector incluyen generalmente, sin limitarse sólo a ellos, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores o de selección, un promotor, un elemento potenciador, una secuencia de terminación de transcripción y similares. Estos componentes se puede obtener a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar a través de procedimientos conocidos.

Entre los ejemplos de vectores de clonación procarióticos adecuados se incluyen bacteriofagos como derivados lambda, o plasmidios de E. coli (v.g., derivados de plasmidio pBR322, col E1, pUC, el factor F y Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Se pueden utilizar también para este propósito otros vectores de expresión apropiados de los que se conocen numerosos tipos dentro de la especialidad para las células húesped que se describen a continua-
ción.

Secuencia de señal

Se puede insertar el ácido nucleico que codifica una secuencia de señal en 5' de la secuencia que codifica una proteína deseada, v.g., puede ser un componente de un vector o puede formar parte de un ácido nucleico que codifica la proteína deseada. El ácido nucleico que codifica la secuencia de señal nativa de IL-1ra es conocida (patente EE.UU. Nº 5.075.222).

Origen de replicación

Los vectores de expresión y clonación incluyen de manera general cada uno de ellos una secuencia de ácido nucleico que da cabida a la replicación del vector en una o más células huésped seleccionadas. En un vector de clonación, esta secuencia es típicamente aquella que da cabida a que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped e incluye un origen de replicación o una secuencia de replicación autonómicamente. Dichas secuencias son muy conocidas. El origen de la replicación a partir del plasmidio pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, y diversos orígenes (v.g., virus de simio 40 (SV40), polimoa, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de la replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 se utiliza frecuentemente solamente porque contiene el promotor temprano).

Gen de selección

Los vectores de expresión y clonación contienen cada uno de ellos típicamente un gen de selección. Dicho gen codifica una proteína "marcadora" necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células huésped transformadas cuando crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped que no se transforman con el vector no contendrán el gen de selección y por lo tanto, no sobrevirán en los medios de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, v.g., ampicilina, neomicina, metotrexano o tetraciclina; (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles desde los medios de cultivo.

Se pueden utilizar otros genes de selección para amplificar los genes que se van a expresar. La amplificación es el proceso en el que los genes que son más demandados para la producción de una proteína crítica para el crecimiento se reiteran en tandem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Entre los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero se incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. Los transformantes de célula quedan bajo la presión de selección de manera que solamente los transformantes se adaptan de manera única para sobrevivir en virtud del marcador que está presente en los vectores. La presión de selección se impone al cultivar las células trnasformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio logra cambiarse, lo que lleva a la amplificación tanto del gen de selección como el ADN que codifica la proteína deseada. Como resultado, se sintetizan mayores cantidades de la proteína deseada desde el ADN amplificado.

Por ejemplo, en primer lugar se identifican las células transformadas con el gen de selección DHFR cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo silvestre es la línea de células de ovario de hámster chino deficientes en actividad DHFR (Urlaub and Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 77(7): 4216-4220. A continuación, se exponen las células transformadas a mayores niveles de metotrexato. Esto lleva a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR y, de manera concomitante, a múltiples copias de otro ADN presente en el vector de expresión, como el ADN que codifica una proteína deseada.

Promotor

Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente cada uno de ellos un promotor que es reconocido por el organismo huésped y que está unido operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína deseada. Un promotor es una secuencia sin traducir localizada corriente arriba (5') del codón de partida de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 bp) que controla la transcripción y la traducción de una secuencia de ácido nucleico en particular. Un promotor puede agruparse convencionalmente en una de las dos clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Un promotor inducible inicia mayores niveles de transcripción desde ADN bajo su control como respuesta a ciertos cambios en las condiciones de cultivo, como por ejemplo la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Se conoce un gran número de promotores, reconocidos a través de una serie de células huésped potenciales. Se puede unir operativamente un promotor a ADN que codifica una proteína deseada separando el promotor del ADN fuente por digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia de promotor deseada. La secuencia de promotor IL-1ra nativa puede utilizarse para la amplificación y/o la expresión directa del ADN que codifica una proteína deseada. Es preferible un promotor heterólogo, sin embargo, si permite una mayor transcripción y mayores rendimientos de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo y si es compatible con el sistema de célula huésped que ha sido seleccionado para su uso. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de las secuencias de promotor nativas de otros miembros de la familia IL-1 para la amplificación directa y/o expresión del ADN que codifica una proteína deseada.

Entre los promotores adecuados para su uso con huéspedes procarióticos se incluyen sistemas de promotor de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptofano (trp); un sistema de gen de luminiscencia bacteriano (luxR) y promotores híbridos, como por ejemplo promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótido han sido publicadas, lo que permite a las personas especializadas en este campo ligarlos con las secuencias de ADN deseadas empleando ligadores o adaptadores según sea necesario para suministrar los sitios de restricción necesarios.

Las secuencias de promotor adecuadas para su uso con huéspedes de levadura también son conocidas dentro de la especialidad. Los promotores adecuados para su uso con células huésped de mamífero son conocidos y entre ellos se incluyen los obtenidos a partir de genomas de virus como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (como Adenovirus 2), virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y, más preferiblemente, SV40. Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, v.g., promotores de impacto por calor y promotor de actina.

Elemento potenciador

Los vectores de expresión y clonación contendrán típicamente cada uno de ellos una secuencia potenciadora para aumentar la transcripción mediante eucoriotas superiores de una secuencia de ADN que codifica una proteína deseada. Los potenciadores son elementos de actuación cis de ADN, normalmente de aproximadamente 10-300 bp de longitud, que actúan en el promotor aumentando su transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes en orientación y posición. Se han encontrado en 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción. Ventajosamente, se utilizan potenciadores de levadura con promotores de levadura. Se conocen varias secuencias de potenciador disponibles a partir de genes de mamífero (v.g., globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Adicionalmente, otros ejemplos de elementos potenciadores para la activación de promotores eucarióticos son potenciadores virales como el potenciador SV40, el potenciador de promotor de citomegalovirus temprano, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus. Si bien se puede dividir un potenciador en un vector en la posición 5' ó 3' para un ADN que codifica una proteína deseada, típicamente está localizado en un sitio 5' desde el promotor.

Terminación de transcripción

Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucarióticas contendrán cada uno de ellos típicamente una secuencia necesaria para la terminación de la transcripción y para la estabilización de ARNm. Dichas secuencias están disponibles comúnmente desde las regiones sin traducir 5' y ocasionalmente 3' de los ADNs eucarióticos o los ADNc. Dichas regiones contienen segmentos de nucleótido transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción sin traducir del ARNm que codifica una proteína deseada.

Construcción de vector

La construcción de un vector adecuado que contiene uno o más de los componentes que se han enumerado (junto con la secuencia de codificación deseada) puede llevarse a cabo a través de técnicas de ligadura normales. Se segmentan plasmidios aislados o fragmentos de ADN, se adaptan y se religan en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la secuencia correcta, se puede utilizar la mezcla de ligadura para transformar E. coli, y se pueden seleccionar los transformantes con éxito a través de técnicas conocidas, tal como se ha descrito. A continuación, se preparan cantidades del vector desde los transformantes, se analizan por digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian para confirmar la presencia del constructo deseado.

Se puede utilizar también un vector que proporciona la expresión transitoria del ADN que codifica una proteína deseada en células de mamífero. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicarse eficientemente en una célula huésped, de manera que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de la proteína deseada codificada por el vector de expresión. Cada uno de los sistemas de expresión transitorios, que comprende un vector de expresión adecuado y una célula huésped, permite la identificación positiva conveniente de las proteínas que codifican los ADNs clonados, así como la rápida detección selectiva de dichas proteínas para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas.

Células huésped

La presente invención proporciona también cualquiera de las variedades de células huésped recombinantes, que contiene cada una de ellas una secuencia de ácido nucleico para su uso en la expresión de una proteína deseada. Entre los ejemplos de células huésped procarióticas y eucarióticas se incluyen células de bacteria, de mamífero, de hongos, de insectos, de levadura o vegetales.

Entre las células huésped procarióticas se incluyen, sin limitarse sólo a ellas, eubacterias como organismos Gram-negativos o Gram-positivos (v.g., E. coli (HB101, DH5a, DH10, y MC1061); Bacilli spp. como B. subtilis; Pseudomonas spp. como P. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella spp. como S. typhimurium; o Serratia spp. como S. marcescans. En un modo de realización específico, la proteína deseada puede expresarse en E. coli.

Además de las células huésped procarióticas, la(s) proteína(s) IL-1ra pueden expresarse en la forma glucosilada a través de cualquiera entre una serie de células huésped adecuadas derivadas de organismos multicelulares. Dichas células huésped son capaces de un procesado complejo y actividad de glucosilación. En principio, podría utilizarse cualquier cultivo de células eucarióticas superiores, pudiendo implicar dicho cultivo tanto células de vertebrado como de invertebrado, incluyendo células vegetales y de insecto. Pueden ser huéspedes adecuados para la expresión de una proteína deseada microbios eucarióticos como hongos filamentosos o levaduras. Saccaromyces cerevisiae, o levadura de panadero común, es la que se utiliza más comúnmente dentro de los microorganismos huésped eucarióticos inferiores, si bien se conoce una serie de otros géneros, especies y cepas diversos y se dispone de ellos comúnmente.

Se pueden utilizar células de vertebrado, ya que la propagación de las células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) es un procedimiento muy conocido. Entre los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles se incluyen, sin limitarse sólo a ellas, línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), línea de riñón embriónico humano (células 293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión), células de riñón de hámster bebé y células de ovario de hámster chino. Otras líneas de célula de mamífero adecuadas incluyen, sin limitarse sólo a ellas, HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadadas de ratones suizos, Balb-c o NIH, y líneas de células de hámster BHK o HaK. En un modo de realización específico, se puede expresar una proteína deseada en células COS o en células de baculovirus.

Se puede transfectar una célula huésped y transformar preferiblemente con un ácido nucleico deseado en condiciones apropiadas que permitan la expresión del ácido nucleico. La selección de las células huésped adecuadas y los métodos de transformación, cultivo, amplificación, detección selectiva y producción y purificación de producto son muy conocidas dentro de la especialidad (Gething and Sambrook (1981), Nature, 293: 620-625 o alternativamente, Kaufman y cols. (1985), Mol. Cell. Biol. 5(7): 1750-1759 o patente EE.UU. Nº 4.419.446. Por ejemplo, se puede utilizar para células de mamífero sin paredes celular, la precipitación con fosfato de calcio. Asimismo, se pueden utilizar también técnicas como electroporación, micro-inyección y otras técnicas conocidas.

Por otra parte, es posible también que la proteína deseada se obtenga por recombinación homóloga o a través de métodos de producción recombinantes utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contienen ADN que codifica la proteína deseada. La recombinación homóloga es una técnica desarrollada originalmente para genes diana para inducir o corregir mutaciones en genes activos transcripcionalmente (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol. 36: 301). La técnica básica fue desarrollada como un método para introducir mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de mamífero (Thomas y cols., (1986), Cell, 44:419-428; Thomas and Capecchi (1987), Cell 51: 503-512 and Doetschman y cols. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8583-8587) o para corregir mutaciones específicas dentro de genes defectuosos (Doetschman y cols. (1987), Nature, 330: 576-578). En la patente EE.UU. Nº 5.272.071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 y WO 94/31560 se describen ejemplos de técnicas.

Cultivo de células huésped

El método para cultivar cada una de las una o más células huésped recombinantes para la producción variarán dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento de producción óptimo para una situación dada será evidente para las personas especializadas en la técnica a través de una experimentación mínima. Dichas células huésped recombinantes se cultivan en un medio adecuado y a continuación, opcionalmente, se recupera, aísla y purifica la proteína expresada desde el medio de cultivo (o desde la célula, si se expresa intracelularmente) a través de medios adecuados conocidos entre los especialistas en este campo.

Específicamente, se puede cultivar cada una de las células recombinantes utilizadas para producir una proteína deseada en un medio adecuado para inducir promotores, seleccionar células huésped recombinantes adecuadas o amplificar el gen que codifica la proteína deseada. El medio puede estar suplementado según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato), tampones (como HEPES), nucleósidos (como adenosina y timidina), antibióticos (como gentamicina), elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos normalmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa y otras fuentes de energía. Se pueden incluir también otros suplementos en condiciones adecuadas, tal como podrán apreciar las personas especializadas en este campo. Asimismo, las personas especializadas en este campo conocerán las condiciones de cultivo adecuadas, tales como la temperatura, el pH y similares, para su uso con las células huésped seleccionadas.

A continuación, puede purificarse el producto de expresión resultante próximo a la homogeneidad aplicando procedimientos conocidos en la técnica. En la patente EE.UU. Nº 5.075.222 y WO 91/08285 se instruye sobre ejemplos de técnicas de purificación. Preferiblemente, se obtiene el producto de expresión en una forma sustancialmente pura. "Sustancialmente pura" significa que IL-1ra, en una forma sin modificar, tiene una actividad específica comparativamente alta, preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 150.000 a 500.00 unidades de receptor/mg tal como se define en Hannum y cols. (1990), Nature, 343: 341-340 y Eisenberg y cols. (1990), Nature, 343: 341-346.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención abarca el uso de preparaciones farmacéuticas que contienen cada una de ellas cantidades efectivas terapéutica o profilácticamente de una proteína(s) IL-1ra o un derivado químico de las mismas (denominado de forma colectiva "producto(s) de proteína IL-1ra") en combinación con metotrexato y un vehículo. Entre los vehículos se incluyen preferiblemente uno o más materiales de formulación farmacéutica o fisiológicamente aceptables en combinación con el (los) producto(s) de proteína IL-1ra.

El disolvente primario en el vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por otra parte, el vehículo puede contener excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, preferiblemente entre 6,0 y 7,0, más preferiblemente 6,5 (v.g., tampones como citratos o fosfatos y aminoácidos como glicina); viscosidad; transparencia; color; esterilidad; estabilidad (v.g., sacarosa y sorbitol); olor; velocidad de disolución (v.g., solubilizantes o agentes de solubilizacion como alcoholes; polietilen glicoles y cloruro sódico), velocidad de liberación; así como agentes de volumen para formulaciones liofilizadas (v.g., manitol y glicina), agentes tensioactivos (v.g., polisorbato 20, polisorbato 80, tritón y pluronics); antioxidantes (v.g., sulfito sódico e hidrogen sulfito sódico); conservantes (v.g., ácido benzoico y ácido salicílico); agentes aromatizantes y de dilución; agentes emulsionantes; agentes de suspensión; disolventes; cargas; vehículos de administración y otros adyuvantes y/o excipientes farmacéuticos. Se prevén también otras formas de administración efectivas, como por ejemplo formulaciones parenterales de liberación lenta, nebulizadores de inhalación, formulaciones oralmente activas, o supositorios. La composición puede presentarse también en forma de preparación en partículas de compuestos poliméricos como polímeros de erosión en volumen (v.g., copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), mezclas de polímero PLGA, copolímeros de bloque de PEG, y ácido láctico y glicólico, poli(cianoacrilatos)); polímeros de erosión superficial (v.g., poli(anhídridos) y poli(orto ésteres)); ésteres de hidrogel (v.g., polialcoholes plurónicos, poli(alcohol vinílico), poli(vinil pirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-éter alquil vinílico, celulosa, derivados de ácido hialurónico, alginato, colágeno, gelatina, albúmina y almidones y dextranos) y sistemas de composición de los mismos; o preparaciones de liposomas o macroesferas. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de las proteínas y derivados de la presente invención. La formulación farmacéutica óptima para la proteína deseada será determinada por las personas especializadas en este campo dependiendo de la ruta de administración y la dosis deseada. En Remiginton's Pharmaceutical Sciences, 18ª ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem. 6: 332-351; WO 94/06457; Leone-Bay y cols. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38: 4263-4269; Haas, y cols. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1): 93; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235 y WO 97/28828 se describen ejemplos de composiciones farmacéuticas.

Las composiciones de liberación sostenida específicas están disponibles por los siguientes proveedores: Depotech (Depofoam^{TM}, un liposoma multivesicular) y Alkermes (ProLease^{TM}, una microesfera PLGA). En Peyron y Balazs (1974), Path. Biol., 22(8): 731-736; Isdale y cols. (1991), J. Drug. Dev., 4(2): 93-99; Larsen y cols. (1993), Journal of Biomedical Materials Research 27: 1129-1134; Namiki, y cols. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11): 501-507; Meyer y cols. (1995), Journal o Controlled Release, 35: 67-72; Kikuchi y cols. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4:99-110; Sakakibara y cols. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299:282-292; Meyers and Brandt (1995), 22(9): 1732-1739; Laurent y cols., (1995), Acta Orthop Scand, 66(266): 116-120; Cascone y cols.(1995), Biomaterials, 16(7): 569-574; Yerashalmi y cols. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2): 267-273; Bernatchez y cols., (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5): 677-681; Tan y cols. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1): 38-43; Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332-351; patentes EE.UU. Nº 4.582.865; 4.605.691; 4.636.524; 4.713.448; 4.716.154; 4.716.224; 4.772.419; 4.851.521; 4.957:774; 4.863:907; 5.128:326; 5.202.431; 5.336.767; 5.356.883; las solicitudes de patente europeas Nº 0.507.604 A2 y 0.718.312 A2; y WO 96/05845 se describen ejemplos de rormas de hialurano. Las composiciones de hialurano específicas están disponibles por los siguientes proveedores: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (Synvisc^{TM}, una mezcla 90:10 de un fluido hilano y un gel hilano); Fidia S.p.A.; Abano Terme, Italia (Hyalgan^{TM}, la sal sódica de un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo(\sim500.000 a \sim700.000 MW)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Tokio, Japón (Artz^{TM}, una solución al 1% de un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo, \sim700.000 MW); Pharmacia AB, Estocolmo, Suecia (Healon^{TM}, un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo, \sim4 x 10^{6} MW); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoat^{TM}, un ácido hialurónico recombinante); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Acido hailurónico FCH, un alto peso molecular (v.g., \sim1,5-2,2x10^{6} MW) ácido hialurónico preparado a partir de cultivos de Streptococcus zooepidemicus; Hialuronato sódico MW, \sim1,0-1,6 x10^{6} PM y hialuronato sódico LV, \sim1,5-2,2 x 10^{6} MW); Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Suiza (ácido hialurónico, sal sódica (número de catálogo de la empresa 1997, 385908) preparado partir de Streptococcus sp.); Intergen Company, Purchase, NY (un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo, >1 x 10^{6} MW); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp. Edison, NJ and Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Tokio, Japón.

Otra formulación farmacéutica específica consiste en citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1% (p/p) en agua, pH 6,5 ("formulación de tampón citrato"). Otra formulación específica consiste en fosfato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, entre 0,1% (p/p) y polisorbato al 0,01% (p/p) en agua y opcionalmente, EDTA 0,5 milimolar, pH 6,5 ("formulación de tampón fosfato"). Otra formulación específica más consiste en fluido hilano H-10^{TM}, un ácido hialurónico reticulado (Biomatrix, Inc., Ridgefield, Inc.) para conseguir 100 mg/ml de IL-1ra y ácido hialurónico al 2% (Mr^{3} 4 x 10^{6}).

Una vez formulada la composición farmacéutica para su uso en la presente invención, se puede almacenar en viales esterilizados en forma de solución, suspensión, gel, emulsión, sólido o en un polvo liofilizado o deshidratado. Dichas composiciones se pueden almacenar o bien en una forma lista para su uso o bien en una forma que requiera la reconstitución antes de su administración (liofilizada).

En un modo de realización específico, la presente invención puede emplear equipos para producir una unidad de administración de una sola dosis. Los equipos pueden contener cada uno de ellos tanto un primer contenedor que tiene una proteína deshidratada como un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. Los equipos consiste en jeringuillas de una sola cámara o de varias cámaras previamente cargadas; como ejemplos de jeringuillas precargadas (v.g., jeringuillas líquidas y lio-jeringuillas como Lyo-Ject®, una liojeringuilla precargada de cámara dual) se pueden mencionar las que están disponibles por Vetter GmbH, Ravensburgo, Alemania.

Usos

La presente invención se refiere al uso de metotrexato y un inhibidor de IL-1 para la preparación de medicamentos para el tratamiento de determinadas enfermedades y estados patológicos médicos (que se pueden caracterizar como enfermedades inflamatorias) que son mediadas por IL-1, así como a las secuelas y síntomas relacionados que están asociados con ellas. Una lista no exhaustiva de las enfermedades mediadas por interleuquina-1 (IL-1) agudas o crónicas incluye las siguientes, aunque no se limita sólo a ellas: ALS, enfermedad de Alzheimer, asma, aterosclerosis, caquexia/anorexia; síndrome de fatiga crónica, depresión, diabetes (v.g., diabetes de tipo I de inicio en la juventud y diabetes melitus); fiebre, fibromialgia o analgesia; glomerulonefritis; rechazo de huésped frente a injerto; shock hemorrágico; hiperalgesia, enfermedad intestinal inflamatoria; lesión isquémica, incluyendo isquemia cerebral (v.g., lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o accidente crebrovascular, que pueden conducir a neurodegeneración); enfermedades del pulmón (v.g., ARDS y fibrosis pulmonar); mieloma múltiple; esclerosis múltiple; leucemia mielogenosa (v.g., AML y CML) y otras leucemias; miopatías (v.g., metabolismo de proteína muscular, esp., en spesis), enfermedades oculares, osteoporosis; enfermedad de Parkinson; dolor, pancreatitis, parto prematuro; psoriasis; lesión por reperfusión; enfermedades reumáticas (v.g., artirits reumatoide; osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis, vasculitis cerebral, enfermedad de Lime, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), Síndrome de Sjögren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y artritis de célula gigante); shock séptico; efectos colaterales de terapia de radiación; enfermedad de articulación mandibular temporal; metástasis de tumor; o estado inflamatorio como resultado de una torcedura, tensión, daño de cartílago, trauma, cirugía ortopédica, infección y otros procesos patológicos.

Los medicamentos de combinación de metotrexato y inhibidores IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) pueden administrarse a un paciente en una cantidad terapéuticamente efectiva para prevenir o tratar una enfermedad mediada por IL-1 incluyendo enfermedades reumáticas. Se pretende que el término paciente incluya animales (v.g., gatos, perros y caballos) así como seres humanos.

Asimismo, los medicamentos de combinación de metotrexato y inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteínade IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) pueden administrarse por vía tópica, entérica o parenteral incluyendo sin limitarse sólo a ellas, por infusión, intraarterial, intraarticular, intracapsular, intracardiáca, intradérmica, intramuscular, intraorbital, intratecal, intravenosa, intraperitoneal, intraespinal, inyección intrasternal, intraventricular, subcutánea, subcuticular, subcapsular, subaraquinoide y transtraqueal. Los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) pueden administrarse también por administración oral o se pueden administrar a través de membranas mucosas es decir, por vía bucal, intranasal, rectal o sublingual para administración sistémica.

Es preferible que los medicamentos de combinación de metotrexato y los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) se administren por vía intraarticular, subcutánea, intramuscular o inyección intravenosa. Adicionalmente, los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) pueden administrase por infusión continua (v.g., dispositivos de modulación de flujo por infusión externa o implantados de forma constante o intermitente) de manera que proporcionen continuamente el nivel deseado de inhibidores de IL_1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) en la sangre durante el tiempo que dure la administración. Esto se puede llevar a cabo por medio de una mini-bomba, como por ejemplo una mini-bomba osmótica. De esta forma, es posible asegurar que se mantiene la cantidad de los fármacos en el nivel deseado y es posible tomar muestras de sangre y llevar un control de la cantidad de fármaco en la corriente sanguínea. En el comercio se dispone de varias bombas, como por ejemplo de proveedores como MiniMed Inc., Sylmar, CA (v.g., MT507) y Alza Corp., Palo Alto CA (v.g., bomba osmótica Alzet, modelo 2ML1).

También se contempla la puesta en práctica de otros modos de dosificación continua o próxima a la continua. Por ejemplo, la formación de derivados químicos puede tener como resultado formas de liberación sostenida de la proteína que tienen el efecto de mantener una presencia continua en la corriente sanguínea, en cantidades predecibles en función de un régimen de dosis determinado.

Los modos de utilización de inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo enfermedades reumáticas (v.g., osteoartritis, artritis psoriática y artritis reumatoide) se exponen en la solicitud de patente australiana AU 9173636. En un modo de realización específico se pueden administrar los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) intra-articularmente para el tratamiento de artritis reumatoide y osteoartritis. En otro modo de realización específico, se pueden administrar los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) subcutáneamente o intramsulcularmente para el tratamiento de artritis reumatoide, enfermedad intestinal inflamatoria, esclerosis múltiple, mieloma múltiple o leucemias mielogenosa (v.g., AML y CML) y otras leucemias. En otro modo de realización específico más se pueden administrar los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) por vía intravenosa para el tratamiento de lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, o para el tratamiento de enfermedad de huésped frente a injerto; o se pueden administrar por vía intraventricular para el tratamiento de lesión cerebral como resultado de trauma.

Independientemente de la manera de administración, el tratamiento de una enfermedad mediada por IL-1 requiere una dosis o un régimen de dosis total de un inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) efectiva para reducir o aliviar los síntomas de la enfermedad. Los factores que determinan la dosis apropiada o el régimen de dosis total pueden incluir la enfermedad o estado patológico que se vaya a tratar o prevenir, la severidad de la enfermedad y la ruta de administración, así como la edad, el sexo y el estado médico del paciente.

El especialista en este campo podrá afinar mejor los cálculos necesarios para determinar la dosis apropiada para el tratamiento de manera rutinaria, especialmente a la luz de la información sobre la dosis y los ensayos que se describen en el presente documento. La frecuencia de la dosis dependerá de los parámetros farmacocinéticos del inhibidor IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) en la formulación utilizada. Los inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) puede administrarse de una vez, o en los casos de trastornos graves o prolongados, se puede administrar de forma diaria en dosis menos frecuentes o se puede administrar con una dosis de bolo inicial seguido de una dosis continua o una administración sostenida. También se contempla la puesta en práctica de otros modos de dosificación continua o próxima a la continua. Por ejemplo, la formación de un derivado químico puede tener como resultado una forma de liberación sostenida que tiene el efecto de mantener una presencia continua en la corriente sanguínea, en cantidades predecibles en función de una dosis o un régimen de dosis total determinado. La dosis o régimen de dosis total se podrá determinar también a través del uso de ensayos conocidos para determinar las dosis utilizadas en combinación con los datos de respuesta a dosis apropiados.

Cuando se administra por vía parenteral, cada dosis unitaria, por ejemplo, puede consistir en hasta 200 mg, generalmente hasta 150 mg y más generalmente hasta 100 mg. Cuando se administra en una cavidad articular, la composición farmacéutica se administra preferiblemente en una sola inyección desde una jeringuilla de 3 a 10 ml que contiene una dosis, por ejemplo, de hasta 200 mg/ml, generalmente de hasta 150 mg y más generalmente de hasta 100 mg de producto IL-1 disuelto en solución salina isotónica tamponada con fosfato. La preparación se puede administrar en una cavidad articular a una frecuencia por ejemplo de una vez cada 7 a 10 días. Según dicho modo, se lleva a cabo la administración de modo continuo, por ejemplo de 4 a 5 veces, al mismo tiempo que se varía la dosis, si es necesario.

Tal como se contempla según la presente invención, se puede administrar un producto(s) inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) como adjunto de otra terapia y también con otras formulaciones farmacéuticas adecuadas para la indicación que se esté tratando. Se puede administrar un producto inhibidor de IL-1 (v.g. preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) y metotrexato por separado o en combinación.

En un modo de realización específico, la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) en combinación (tratamiento previo, post-tratamiento y tratamiento concurrente) con metotrexato para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamación aguda y crónica como caquexia/anorexia; síndrome de fatiga crónica; depresión, diabetes (v.g., diabetes de tipo I de inicio en la juventud y diabetes melitus); fibromialgia o analgesia; rechazo de huésped frente a injerto; hiperalgesia, enfermedad intestinal inflamatoria; lesión isquémica, incluyendo isquemia cerebral (v.g., lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o accidente crebrovascular, que pueden conducir a neurodegeneración); enfermedades del pulmón (v.g., ARDS y fibrosis pulmonar); esclerosis múltiple; enfermedades oculares; dolor, pancreatitis; lesión por reperfusión; enfermedades reumáticas (v.g., artirits reumatoide; osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis, vasculitis cerebral, enfermedad de Lime, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), síndrome de Sjögren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y artritis de célula gigante); shock séptico; efectos colaterales de terapia de radiación; enfermedad de articulación mandibular temporal; metástasis de tumor; o estado inflamatorio como resultado de una torcedura, tensión, daño de cartílago, trauma, cirugía ortopédica, infección y otros procesos patológicos.

El tratamiento de la presente invención de enfermedades mediadas por IL-1 incluyendo inflamación crónica y aguda como por ejemplo enfermedades reumáticas, incluye el uso de fármacos de primera línea para controlar el dolor y la inflamación clasificados como fármacos anti-inflamatorios no esteroides (NSAIDs). Los tratamientos secundarios incluyen corticoesteroides, fármacos antireumáticos de lenta actuación (SAARDs) y fármacos de modificación de la enfermedad (DM). La información referente a estos compuestos se puede encontrar en el Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16ª edición, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) y en Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.

En un modo de realización específico, la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) y metotrexato para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo inflamación crónica y aguda, como enfermedades reumáticas; y enfermedad de huésped frente a injerto.

En un modo de realización más específico, la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) en combinación (tratamiento previo, post-tratamiento y tratamiento concurrente) con metotrexato.

En un modo de realización específico preferible, el método comprende la administración (v.g., por vía intraarticular, subcutánea o intramuscular) de un inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra o IL-1ra Fc) formulado opcionalmente con un polímero de liberación controlada (v.g., un dextrano o hialuronano), formulación de tampón citrato o formulación de tampón fosfato) en combinación (tratamiento previo, postratamiento, tratamiento concurrente) con metotrexato para el tratamiento de enfermedades mediadas por IL-1 incluyendo inflamación crónica y aguda como caquexia/anorexia; síndrome de fatiga crónica; depresión, diabetes (v.g., diabetes de tipo I de inicio en la juventud y diabetes melitus); fibromialgia o analgesia; rechazo de huésped frente a injerto; hiperalgesia, enfermedad intestinal inflamatoria; lesión isquémica, incluyendo isquemia cerebral (v.g., lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o accidente crebrovascular, que pueden conducir a neurodegeneración); enfermedades del pulmón (v.g., ARDS y fibrosis pulmonar); esclerosis múltiple; enfermedades oculares, dolor, pancreatitis; lesión por reperfusión; enfermedades reumáticas (v.g., artirits reumatoide; osteoartritis, artritis juvenil (reumatoide), poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriática, artritis enteropática, polimiositis, dermatomiositis, escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis, vasculitis cerebral, enfermedad de Lime, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), Síndrome de Sjögren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y artritis de célula gigante); shock séptico; efectos colaterales de terapia de radiación; enfermedad de articulación mandibular temporal; metástasis de tumor; o estado inflamatorio como resultado de una torcedura, tensión, daño de cartílago, trauma, cirugía ortopédica, infección y otros procesos patológicos.

En un modo de realización preferible específico, el método comprende la administración (v.g., intraarticular, subcutánea o intramuscular) de inhibidores de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra o IL-1ra Fc, opcionalmente formulado con un polímero de liberación controlada (v.g., un dextrano o hialuronano), la formulación de tampón citrato o la formulación de tampón fosfato) en combinación (tratamiento previo, postratamiento y tratamiento concurrente) con metotrexato para tratar artritis (v.g. osteoartritis, artritis psoriásica y/o artritis reumatoide) y los síntomas asociados con ellos.

El resultado sorprendente e inesperado que se ha expuesto en el presente documento es la capacidad de IL-1ra y metotrexato para actuar sinérgicamente en el tratamiento de diversos síntomas asociados con enfermedades mediadas por IL-1, incluyendo estados inflamatorios agudos y crónicos. El término "sinérgicamente" tal como se utiliza aquí se refiere a una situación en la que el beneficio transmitido por la administración conjunta de un inhibidor de IL-1 (v.g., preferiblemente un producto(s) de proteína de IL-1ra y más preferiblemente IL-1ra) y metotrexato es superior a la suma algebraica de los efectos que resultan de la administración por separado de los componentes de la combinación. Tal como se demuestra en el experimento que se expone más adelante, en un modelo de artritis adyuvante, la combinación de tratamiento de rhuIL-1ra y metotrexato es sinérgica en lo que se refiere al tratamiento de inflamación sistémica (v.g., esplenomegalia) y la pérdida de peso asociada con artritis reumatoide. Por lo tanto, el tratamiento de rhuIl-1ra y metotrexato combinado tiene la ventaja de conseguir el mismo resultado con una dosis más baja o una administración menos frecuente de metotrexato, reduciendo así el efecto tóxico y, potencialmente, con la ventaja de una actividad persistente incluso después de que haya terminado el tratamiento.

El metotrexato es un anti-metabolito y un fármaco inmunosupresor. Metotrexato es un agente anti-inflamatorio eficaz que tiene utilidad en el tratamiento de psoriasis discapacitante y severa y artritis reumatoide (Hoffmeister (1983), The Americal Journal of Medicine, 30: 69-73 y Jaffe (1988), Arthritis and Rheumatism, 31: 299). Metotrexato es ácido N-[4-[(2,4-diamino-6-pteridinil)metilamino]benzoíl]-L-glutámico y tiene la fórmula estructural:

2

En los documentos de referencia que se citan a continuación se describe la preparación de metotrexato (Seeger y cols. (1949), J. Am. Chem. Soc., 71: 1753; el metabolismo de metotrexato (Freeman (1958), J. Pharmacol. Exp. Ther. 122: 154 and Henderson y cols., (1965), Cancer Res. 25: 1008); la toxicidad de metotrexato (Condit y cols., (1960), Cancer, 13: 222-249; los modelos farmacocinéticos de metotrexato (Bischoff y cols., (1970), J. Pharm. Sci. 59: 149); el metabolismo y farmacocinética de metotrexato (Evans (1980), Appl. Pharmacokinet. Williams y cols. [eds], pp. 518-548 (Appl. Ther. Inc.); la farmacología clínica de metotrexato (Bertino (1981), Cancer Chemother., 3: 359-375 y Jolivet y cols. (1983), N. Engl. J. Med. 309: 1094-1104); y la experiencia clínica de metotrexato en artritis reumatoide (Weinblatt y cols. (1985), N. Eng. J. Med., 312: 818-822; Furst (1985), J. Rheumatol., 12(12): 1-14; Williams y cols. (1985), Arthritis Rheum., 28: 721-730 y Seitz y cols. (1995), British Journal of Rheumatology, 34 602-609). Adicionalmente, se han publicado numerosas patentes en las que se describe el agente activo metotrexato y métodos para la síntesis de metotrexato o productos intermedios potenciales en la síntesis de metotrexato: patentes EE.UU. Nº 2.512.572; 3.892.801; 3.989.703; 4.057.549; 4.067.867; 4.079.056; 4.080.325; 4.136.101; 4.224.446; 4.306.064; 4.374.987; 4.421.913 y 4.767.859.

El mecanismo de acción de metotrexato apenas se comprende, aunque se han demostrado varias de las actividades de este fármaco que, probablemente, contribuyan a su eficacia (Segal y cols., (1990), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 20 190-198). Se han postulado los siguiente mecanismos de acción para metotrexato: inhibición de las rutas dependientes de foliato y metabolismo de proteína (Morgan y cols., (1987); Arthritis and Rheumatism, 30: 1348-1356); inhibición de desplazamiento de neutrófilos en articulaciones artríticas (Van de Kerkhof y cols., (1985), British Journal of Dermatology, 113: 251-255; Ternowitz y cols., (1987), Journal of Investigative Dermatology, 89: 192-196 and Sperling (1992), Arthritis and Rheumatism, 35: 376-384); actividad inhibidora de IL-6 (Segal (1991), Arthritis and Rheumatism, 34(2): 146-152) y el efecto anti-proliferativo específico local en células implicadas en artritis (Rodenhuis y cols. (1987), Arthritis and Rheumatism, 30: 369-374). Se ha demostrado que metotrexato bloquea la ruta de interleuquina-1 beta/receptor de interleuquina (Brody y cols., (1993), European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, 31(10): 667-674); no obstante, aunque metotrexato pueda inhibir los efectos proliferativos de IL-1 y disminuir la producción de IL-1 de monocito a corto plazo en determinados pacientes, su efecto no es sostenido y no es probable que explique la eficacia a largo plazo de metotrexato (Barrera y cols., (1996), Seminars in Arthritis and Rheumatism, 25(4): 234-253).

El metotrexato se puede administrar por vía oral, intraperitoneal, subcutánea o intravenosa. Es preferible la administración oral. A continuación, se expóne un ejemplo sobre el procedimiento para la administración combinada de un producto(s) de proteína IL-1ra (v.g., IL-1ra) y tratamiento con metotrexato para tratar a un paciente humano. El paciente ingiere una pastilla o cápsula de metotrexato tres veces a la semana, una dosis semanal total de 5 a 50 mg/paciente/semana. Asimismo, se inyecta al paciente por vía intravenosa un producto(s) de proteína IL-1ra (v.g., IL-1ra) a una dosis diaria de 50 a 150 mg. Las personas especializadas en este campo apreciarán que las dosis aquí presentadas son dosis preferibles. La dosis de partida del compuesto que se utilice en particular se reduce cuando el paciente presente una reacción adversa, o se puede cambiar o reducir el fármaco utilizado en combinación con el compuesto(s), v.g., dependiendo de las diferentes formulaciones, rutas, planes de dosis y/o otras variables conocidas entre las personas especializadas en este campo, como puedan ser la tolerancia al fármaco por parte del paciente, su eficacia y su toxicidad.

Preferiblemente, se trata al paciente con una dosis de partida semanal de metotrexato comprendida entre 5 mg y 7,5 mg (oral o intramuscular) y una dosis diaria de producto(s) de proteína IL-1ra (v.g., IL-1ra) a una dosis comprendida entre 50 mg y 150 mg (por vía intravenosa). Se aumenta la dosis de metotrexato en 5 mg cada 2 a 3 semanas. Se determina el nivel de dosis máxima a un punto en el que el paciente presente una mejora, que consiste preferiblemente por lo general en menos de aproximadamente 25 mg de metotrexato por semana, más preferiblemente entre 5 y 25 mg de metotrexato por semana. A continuación, se puede evaluar al paciente con un examen físico y un extenso análisis de laboratorio. El análisis incluye la evaluación para determinar la toxicidad. Otro control de laboratorio adicional en el caso de metotrexato incluye también preferiblemente un recuento de células de la sangre completo cada 2 semanas durante los primeros 3 meses y mensualmente después. Entre las precauciones adicionales se incluyen preferiblemente valoraciones mensuales de los niveles en suero de albúmina, alanina amino transferasa, bilirrubina, creatinina y nitrógeno en la urea de la sengre. También es preferible un análisis de orina
mensual.

Todo esto se cita como ejemplo y no excluye otros tratamientos que se puedan utilizar concurrentemente con estos compuestos anti-inflamatorios que sean conocidos entre las personas especializadas en este campo o a las que puedan llevar las personas especializadas en este campo aplicando las directrices que se exponen en la presente memoria descriptiva.

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Ejemplos

Los métodos patrón para muchos de los procedimientos que se describen en los siguientes ejemplos, o procedimientos alternativos, se encuentran en manuales muy conocidos sobre biología molecular como por ejemplo Sambrook y cols., Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) y Ausabel y cols., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, Nueva York (1990). Todas las sustancias químicas fueron de calidad analítica o calidad USP.

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Ejemplo 1

Se utilizó un modelo animal de artritis reumatoide inducido por un adyuvante para investigar la terapia de combinación de un inhibidor de IL-1 y metotrexato. Se canularon ratas de Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5 por grupo) que pesaban al menos 200 g con catéteres yugulares y se les dejó que se recuperarn durante varios días. A continuación, se las colocó en jaulas para infusión y se las aclimató durante una semana antes de iniciar las inyecciones adyuvantes.

El día 0, se inyectaron a todas las ratas tratadas 100 \mul de adyuvante Completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a la que se añadió adyuvante sintético, N,N-dioctildecildecil-N'-, N-bis(2-hidroxi-etil)-propanodiamina, 75 mg/ml. En los días 0 a 14 se comenzó el tratamiento con metotrexato en carboximetil celulosa al 1% (Sigma) y se administró oralmente (0,06 mg/kg). El día 8, se administró el tratamiento con antagonista de receptor de IL-1 recombinante humano derivado de E. coli (preparado de manera general de acuerdo con las directrices de la patente EE.UU. Nº 5.075.222, rhuIL-1ra) formulado en una composición farmacéutica (citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1% (p/p) en agua, pH 6,5) por infusión IV continua (5 mg/kg/hora) a cada uno de los grupos de ratas que se estaba tratando tanto con adyuvante completo de Freunds como metotrexato y a otro grupo de ratas que se estaba tratando solamente con adyuvante completo de Freunds.

Se tomaron los pesos corporales el día 0 y cada día a partir del 8 día hasta la terminación el día 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuación cínica el día 8 y cada día hasta la terminación. En este momento, se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

Tal como se puede observar en las figuras 2 y 3, las ratas tratadas con rhuIL-1ra en solitario presentaron un 57% de inhibición de la artritis (inflamación de la pata), no presentaron ningún beneficio significativo en esplenomegalia y presentaron un 25% de inhibición del cambio de peso corporal. Las ratas tratadas con metotrexato tenían un 55% de inhibición de inflamación e la pata, y no presentaron inhibición del peso del bazo y un 23% de inhibición del cambio de peso corporal. La terapia de combinación presentó un 100% de inhibición de la inflamación de la pata, un 49% de inhibición de la esplenomegalia y 106% de inhibición del cambio de peso corporal.

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Ejemplo 2

Se canularon ratas de Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5-7/grupo) que pesaban al menos 200 g con catéteres yugulares y se les dejó que se recuperaran durante varios días. A continuación, se les colocó en jaulas para infusión y se les aclimató durante al menos una semana antes de inhiciar las inyecciones de adyuvante.

El día 0, se les inyectaron a las ratas 100 \mul de adyuvante completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se añadió adyuvante sintético, N,N-dioctildecildecil-N',N-bis(2-hidroxi-etil)-propanodiamina, 75 mg/ml. En los días 0 a 14, se comenzó el tratamiento con metotrexato en carboximetil celulosa al 1% (Sigma) y se administró por vía oral ((0,06 mg/kg). El día 8, se administró el tratamiento con rhuIL-1ra formulado en una composición farmacéutica (citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1% (p/p) en agua, pH 6,5) por infusión IV continua (5 mg/kg/hora). Se tomaron los pesos corporales el día 0 y cada día desde el día 8 hasta la terminación el día 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuación clínica el día 8 y cada día hasta el día de la terminación. En este tiempo, se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

Tal como se puede observar en las figuras 4 y 5, las ratas tratadas con rhu IL-1ra en solitario presentaron un 22% de inhibición de la inflamación de la pata, un 24% de inhibición de la esplenomegalia y ninguna inhibición del cambio de peso corporal. Las ratas tratadas con metotrexato presentaron un 57% de inhibición en la inflamación de la pata, un 22% de inhibición de la esplenomegalia y un 59% de inhibición del cambio de peso corporal. La combinación de rhuIL -1ra y metotrexato tuvo como resultado un 90% de inhibición de la inflamación de la pata, un 77% de inhibición de esplenomegalia y un 65% de inhibición del cambio de peso corporal asociado con artritis/inflamación sistémica.

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Ejemplo 3

Se canuló a las ratas Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5-7/grupo) que pesaban al menos 150 -300 g en el subcutis la parte dorsal y se les dejó que se recuperaran durante varios días. A continuación, se las colocó en jaulas para infusión y se les aclimató durante al menos 4 días antes de iniciar las inyecciones adyuvantes.

El día 0, se les inyectaron 100 \mul de adyuvante completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se añadió adyuvante sintético N,N-dioctildecildecil-N',N-bis(2-hidroxi-etil)-propanodiamina, 75 mg/ml. En los días 0-14 se inició el tratamiento con metotrexato en carboximetil celulosa al 1% (Sigma) y se administró por vía oral (0,048, 0,06 ó 0,075 mg/kg). El día 8, se comenzó el tratamiento con rhuIL-1ra formulado en una composición farmacéutica (citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1% (p/p) en agua, pH 6,5) por infusión subcutánea continua (5 mg/ml/hora; 0,1 ml/hora). Se tomaron los pesos corporales el día 0 y cada día a partir del día 8 hasta la terminación el día 15. Se realizaron las medidas con calibrador y la puntuación clínica el día 8 y cada día hasta la terminación. En este tiempo se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

La infusión subcutánea continua de rhuIL-1ra a una velocidad de 5 mg/ml/hora, días 8-15 en ratas artríticas adyuvantes tuvo como resultado un 6% de inhibición del peso de la pata final. El tratamiento de ratas artríticas adyuvantes con una dosis oral diaria de metotrexato (0,075, 0,060 o 0,048 mg/kg) en los días 0-14, tuvo como resultado 47, 27 o 0% (respectivamente) de inhibición del peso de la pata final. El tratamiento concurrente de rhuIL-1ra y metotrexato a las mismas dosis aumentó la inhibición a un peso de la pata final de 84, 44 ó 21%. Por lo tanto, se observaron ventajas clínicas estadísticamente significativas cuando las dosis de metotrexato fueron 0,075 o 0,06 mg/kg. En el caso de una terapia de combinación, la inhibición de la inflamación de la pata fue significativamente mayor que la que se dió con rhuIL-1ra o metotrexato en solitario cuando la dosis de metotrexato fue 0,075 mg/kg. El análisis de la inflamación de la pata según las medidas con calibrador secuenciales de las articulaciones del tobillo revelaron una inhibición de la artritis cuando se analizaron los datos del área bajo la curva. Las ratas tratadas con rhuIL-1ra en solitario presentaron un 6% de inhibición de la inflamación, mientras que aquellas a las que se administró 0,075 mg/kg de metotrexato presentaron un 45% de disminución del diámetro de la articulación del tobillo a lo largo del tiempo. Como contraste, las ratas a las que se les administró una terapia de combinación presentaron un 78% de inhibición de la artritis. Estadísticamente, se observó un beneficio de combinación estadísticamente significativo en el área bajo la curva del diámetro del tobillo en las ratas a las que se les administró 0,048 pero no 0,06 mg/kg de metotrexato.

La evaluación histológica de las articulaciones del tobillo de las ratas tratadas con rhuIL-1ra demostró un 8% de inhibición de la inflamacion y un 53% de inhibición de la resorción ósea. El tratamiento con metotrexato tuvo como resultado una inhibición significativa de respuesta a dosis de estos parámetros a 0,075 (44% de inhibición de la inflamación y 58% de inhibición de la resorción ósea) o 0,06 (26% de inhibición de la inflamación y 55% de inhibición de la resorción ósea) pero no 0,048 mg/kg (8% de inhibición de la inflamación y 11% de inhibición de la resorción ósea). El beneficio de la combinación fue sobre todo espectacular en las ratas a las que se les administró 0,075 mg/kg de dosis de metotrexato en combinación con rhuIL-1ra. En estas ratas, se inhibió la inflamación en un 85% y disminuyó la resorción ósea en un 97%. Estas diferencias aumentaron significativamente con respecto a las observadas en cada uno de los tratamientos en solitario para ambos parámetros. Se observaron también beneficios de la combinación similares a 0,06 mg/kg de dosis de metotrexato en combinación con rhuIL-1ra (44% de inhibición de la inflamación y 84% de inhibición de la resorción ósea) y con 0,048 mg/kg de dosis de metotrexato en combinación con rhuIL-1ra (23% de inhibición de la inflamación y 68% de inhibición de la resorción ósea).

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Ejemplo 4

Se canularon ratas Lewis macho (Charles River, Portage, MI) (5-7 /grupo) que pesaban al menos 250 -300 g en el subcutis de la parte dorsal y se les dejó que se recuperaran durante varios días. A continuación, se las colocó en jaulas para infusión y se las aclimató durante al menos 4 días antes de iniciar las inyecciones adyuvantes.

El día 0, se inyectaron a las ratas 100 \mul de adyuvante completo de Freunds (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se añadió un adyuvante sintético, N,N-dioctildecildecil-N',N-bis(2-hidroxi-etil) propanadiamina, 75 mg/ml. En los días 0 a 14, se comenzó el tratamiento de metotrexato en carboximetil celulosa al 1% (Sigma) y se administró por vía oral (0,048, 0,06 o 0,075 mg/kg). El día 8, se inició el tratamiento con rhuIL-1ra formulado en una composición farmacéutica (citrato sódico 10 milimolar, cloruro sódico 140 milimolar, EDTA 0,5 milimolar, polisorbato al 0,1% (p/p) en agua, pH 6,5) por infusión IV continua (5 mg/kg/hora). Se tomaron los pesos del cuerpo el día 0 y cada día desde el día 8 hasta la terminación el día 15. Se realizaron las medicas con calibrador y la puntuación clínica el día 8 y cada día después hata la terminación. En este tiempo se determinaron los pesos del cuerpo del animal, la pata y el bazo.

La infusión subcutánea continua de rhuIL-1ra a una velocidad de 5 mg/kg/hora, días 8-15 en ratas artríticas adyuvantes tuvo como resultado un 6% de inhibición del peso de la pata final. El tratamiento de ratas artríticas adyuvantes con dosis orales diarias de metotrexato (0,075, 0,060 o 0,048 mg/kg) los días 0-14, tuvo como resultado un 47, 27 o 0% (respectivamente) de inhibición del peso de la pata final. El tratamiento concurrente con rhuIL-1ra y metotrexato a estas mismas dosis aumentó la inhibición del peso de la pata final a 84, 44 ó 21%. Por lo tanto, se observó un beneficio clínico estadísticamente significativo cuando las dosis de metotrexato fueron 0,075 o 0,06 mg/kg. En el caso de una terapia de combinación, la inhibición de la inflamación de la pata fue significativamente mayor que la que se produjo con rhuIL-1ra o con metotrexato en solitario cuando la dosis de metotrexato fue 0,075 mg/kg. El análisis de la inflamación de la pata según las medidas con calibrador secuenciales de las articulaciones del tobillo revelaron una inhibición de la artritis cuando se analizaron los datos como el área bajo la curva. Las ratas tratadas con rhuIL-1ra en solitario presentaron un 6% de inhibición de la inflamación, mientras que las ratas a las que se administró 0,075 mg/kg de metotrexato presentaron un 45% de disminución del diámetro de la articulación del tobillo a lo largo del tiempo. En contraste, las ratas a las que se les administró una terapia de combinación presentaron un 78% de inhibición de la artritis. Se observó un beneficio de la combinación estadísticamente significativo en el área bajo la curva de inhibición del diámetro del tobillo en las ratas a las que se les había administrado 0,048, pero no 0,06 mg/kg, de metotrexato.

La evaluación histológica de las artículaciones del tobillo a partir de las ratas tratadas con rhuIL-1ra demostró un 8% de la inhibición y un 53% de la inhibición de la resorción ósea. El tratamiento con metotrexato tuvo como resultado una significativa inhibición como respuesta a dosis de estos parámetros a 0,075 (44% de inhibición de la inflamación y 58% de inhibición de la resorción ósea) o 0,06 (26% de inhibición de la inflamación y 55% de inhibición de la resorción ósea) pero no 0,048 mg/kg (8% de inhibición de la inflamación y 11% de la inhibición de la resorción ósea). El beneficio de la combinación fue sobre todo sorprendente en las ratas a las que se les administró 0,075 mg/kg de dosis de metotrexato en combinación con rhuIL-1ra. En estas ratas, se inhibió la inflamación en un 85% y la resorción ósea disminuyó en un 97%. Estas diferencias aumentaron significativamente con respecto a las observadas con cada uno de los tratamientos por separado para ambos parámetros. Se observó un benefició de la combinación similar a una dosis de 0,06 mg/kg de metotrexato en combinación con rhuIL-1ra (44% de inhibición de la inflamación y 84% de inhibición de la resorción ósea) y con 0,048 mg/kg de dosis de metotrexato en combinación con rhuIl-1ra (23% de inhibición de la inflamación y 68% de inhibición de la resorción ósea).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

AUTOR DE LA SOLICITUD: Amgen Inc..

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: TERAPIA DE COMBINACIÓN EN LA QUE SE EMPLEA UN INHIBIDOR DE IL-1 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES MEDIADAS POR IL-1.

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Amgen Inc.

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(B)

CALLE: 1840 DeHavilland Drive

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(C)

CIUDAD: Thoushand Oaks

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(D)

ESTADO: CA

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(E)

PAÍS: EE.UU.

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(F)

CODIGO POSTAL: 91320-1789

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(v)

FORMA INTERPRETABLE POR ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIO: Floppy disk

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(B)

ORDENADOR: PC compatible de IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Versión #1,0, versión #1,30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: AÚN DESCONOCIDO

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 08-DICIEMBRE-1997

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(C)

CLASIFICACIÓN

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/032.790

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 06 DE DICIEMBRE DE 1996

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/036.353

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 23 DE ENERO DE 1997

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/039.311

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 7 DE FEBRERO DE 1997

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(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIORES:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 60/052.025

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(B)

FECHA DE REGISTRO: 09 DE JULIO DE 1997

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(viii)

INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Zindrick, Thomas D.

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(C)

NÚMERO DE REGISTRO /REFERENCIA: A-398D

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID NO:1

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 462 pares de base

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

HEBRA: desconocida

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(D)

TOPOLOGÍA: desconocida

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix)

RASGO:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 1..462

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 154 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

5

Claims (23)

1. Uso de metotrexato en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda o crónica en un paciente que lo necesita en combinación con la administración anterior, concurrente o posterior de un inhibidor de interleuquina-1 (IL-1).

2. Uso de un inhibidor de interleuquina-1 (IL-1) en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria aguda o crónica en un paciente que lo necesita en combinación con la administración anterior, concurrente o posterior de metotrexato.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 administrándose dicho metotrexato por vía oral.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 siendo dicho inhibidor de IL-1 un antagonista de receptor de IL-1 (IL-1ra).

5. Uso según la reivindicación 4, fusionándose dicho IL-1ra con todo o parte de un dominio constante de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina humana en el término amino de la misma.

6. Uso según la reivindicación 5, fusionándose dicho IL-1ra con todo o parte del dominio constante de una cadena pesada de IgG1 en el término amino de la misma.

7. Uso según la reivindicación 5, comprendiendo dicho dominio constante todos los dominios a excepción del primer dominio de la región constante de dicha cadena pesada.

8. Uso según la reivindicación 7, seleccionándose la cadena pesada del grupo que consiste en cadena pesada de IgG, IgA, IgM o IgE.

9. Uso según la reivindicación 8, siendo dicho IgG, IgG1.

10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo dicho IL-1ra una secuencia que es homóloga en al menos un 80% con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo dicho IL-1ra una secuencia que es homóloga en al menos aproximadamente un 90% con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo dicho IL-1ra una secuencia que es homóloga en al menos aproximadamente un 95% con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo dicho IL-1ra una secuencia que es homóloga en al menos aproximadamente un 99% con la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO:2.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo IL-1ra la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 2 o una variante de supersión biológicamente activa de la misma.

15. Uso según la reivindicación 14, comprendiendo dicho IL-1ra una supresión N-terminal o C-terminal de SEQ ID NO:2.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, comprendiendo dicho IL-1ra un aminoácido que tiene una secuencia de SEQ ID NO:2.

17. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, consistiendo dicho IL-1ra en un aminoácido que tiene una secuencia de SEQ ID NO: 2.

18. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, siendo el aminoácido inicial en la SEQ ID NO:2 Mn, equivaliendo n a 1.

19. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18, siendo dicho IL-1ra no glucosilado.

20. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 18, en la que dicho IL-1ra está glucosilado.

21. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 20, en el que dicho IL-1ra se produce a través de métodos de ADN recombinante.

22. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, siendo dicha enfermedad inflamatoria un estado patológico inflamatorio de una articulación.

23. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, siendo dicha enfermedad inflamatoria artritis reumatoide.