ES2288304T3 - Receptores tipo i del factor de necrosis tumoral truncados y solubles. - Google Patents

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Abstract

SE EXPONEN PROTEINAS, DENOMINADAS PROTEINAS DE FIJACION DEL FACTOR DE LA NECROSIS TUMORAL, QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE DICHO FACTOR. SE EXPONEN IGUALMENTE PROCESOS PARA OBTENER LAS PROTEINAS DE FIJACION DE LA NECROSIS TUMORAL POR TECNICAS DE INGENIERIA GENETICA DEL TIPO RECOMBINANTE.

Description

Receptores tipo I del factor de necrosis tumoral truncados y solubles.
Campo de la invención
La presente invención hace referencia al campo de la inflamación. Más específicamente, la presente invención hace referencia a receptores del factor de necrosis tumoral truncados (sTNFR).
Antecedentes de la invención
La inflamación es la reacción de defensa del organismo a lesiones tales como las causadas por daño mecánico, infección o estimulación antigénica. Se puede expresar una reacción inflamatoria patológicamente cuando la inflamación está inducida por un estímulo inapropiado tal como un auto-antígeno, está expresada de una manera exagerada o persiste bastante después de la eliminación de los agentes nocivos. Semejante reacción inflamatoria puede incluir la producción de ciertas citocinas.
Si bien la etiología de la inflamación es escasamente comprendida, recientemente se ha adquirido información considerable referente a los aspectos moleculares de la inflamación. Esta investigación ha conducido a la identificación de ciertas citocinas que se cree que figuran prominentemente en la mediación de la inflamación. Las citocinas son proteínas extracelulares que modifican el comportamiento de las células, concretamente aquellas células que están en la zona inmediata de la síntesis y liberación de las citocinas. Los factores de necrosis tumoral (TNF) son una clase de citocinas producidas por numerosos tipos de células, incluyendo monocitos y macrófagos.
Al menos dos TNF han sido descritos previamente, específicamente el TNF alfa (TNF-\alpha) y el TNF beta (TNF-\beta o linfotoxina), y cada uno es activo en forma de una molécula trimérica y se cree que inician la señalización celular por medio de receptores de entrecruzamiento (Engelmann et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:14497-14504).
Varias líneas de evidencia implican al TNF-\alpha y al TNF-\beta como citocinas inflamatorias principales. Estos TNF conocidos tienen importantes efectos fisiológicos sobre numerosas células diana que están implicadas en respuestas inflamatorias para una variedad de estímulos tales como la infección y la lesión.
Las proteínas hacen que tanto fibroblastos como células sinoviales secreten colagenasa y prostaglandina E_{2} latentes y hacen que los osteocitos estimulen la resorción ósea. Estas proteínas incrementan las propiedades adherentes de la superficie de las células endoteliales para los neutrófilos. Asimismo hacen que las células endoteliales secreten actividad coagulante y reduzcan su capacidad para lisar los coágulos. Además re-dirigen la actividad de los adipocitos lejos del almacenamiento de lípidos inhibiendo la expresión de la enzima lipoproteína lipasa. Los TNF también hacen que los hepatocitos sinteticen una clase de proteínas conocidas como "reaccionantes de fase aguda", que actúan sobre el hipotálamo en forma de pirógenos (Selby et al. (1988), Lancet, 1(8583):483; Starnes, Jr. et al. (1988), J. Clin. Invest., 82:1321; Oliff et al. (1987), Cell, 50:555; y Waage et al. (1987), Lancet, 1 (8529):355). Adicionalmente, los resultados preclínicos con diferentes modelos animales predictivos de inflamación, incluyendo artritis reumatoide, han sugerido que la inhibición del TNF puede tener un impacto directo sobre el progreso y la gravedad de la enfermedad (Dayer et al. (1994), European Cytokine Network, 5(6):563-571 y Feldmann et al. (1995), Annals Of The New York Academy Of Sciences, 66:272-278). Por otra parte, pruebas clínicas en humanos preliminares recientes en artritis reumatoide con inhibidores de TNF han demostrado resultados prometedores (Rankin et al. (1995), British Of Rheumatology, 3(4):4334-4342; Elliott et al. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1077-1081; y Paleolog et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1082-1091).
Las proteínas inhibidoras de TNF se describen en la técnica. En EP 308.378 se informa sobre una proteína derivada de la orina de pacientes con fiebre que tiene actividad inhibidora de TNF. El efecto de esta proteína se debe presumiblemente a un mecanismo competitivo a nivel de receptores. En EP 308.378 se describe una proteína suficientemente pura que va a ser caracterizada por su extremo N. La referencia, no obstante, no ilustra ninguna secuencia de ADN o inhibidor de TNF producido recombinantemente.
Los inhibidores de TNF producidos recombinantemente también han sido ilustrados en la técnica. Por ejemplo, en EP 393.438 y EP 422.339 se ilustran las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de un "inhibidor de TNF de 30 kDa" humano recombinante, maduro (también conocido como receptor p55 y como sTNFR-I) y un "inhibidor de 40 kDa" humano, recombinante, maduro (también conocido como receptor p75 y como sTNFR-II) así como formas modificadas de los mismos, p. ej., fragmentos, derivados funcionales y variantes. En EP 393.438 y EP 422.339 también se describen métodos para aislar los genes responsables de la codificación de los inhibidores, la clonación del gen en vectores adecuados y los tipos celulares, y expresar el gen para producir los inhibidores. Se ha demostrado que el inhibidor de TNF de 30 kDa humano recombinante maduro y el inhibidor de TNF de 40 kDa humano recombinante maduro son capaces de inhibir el TNF (EP 393.438, EP 422.339, Publicación PCT Núm. WO 92/16221 y Publicación PCT Núm. WO 95/34326).
El sTNFR-I y el sTNFR-II son miembros de la superfamilia de receptores del factor de crecimiento nervioso/TNF que incluye el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGF), el antígeno CD40 de las células B, 4-1BB, el antígeno MRC OX40 de células T de rata, el antígeno Fas, y los antígenos CD27 y CD30 (Smith et al. (1990), Science, 248:1019-1023). El rasgo más conservado entre este grupo de receptores de la superficie celular es el dominio de unión al ligando extracelular rico en cisteína, que se puede dividir en cuatro motivos repetitivos de aproximadamente cuarenta aminoácidos y que contiene 4-6 restos cisteína en posiciones que están bien conservadas (Smith et al. (1990),
supra).
En EP 393.438 se ilustra adicionalmente un inhibidor de TNF de 40 kDa \Delta51 y un inhibidor de TNF de 40 kDa \Delta53, que son versiones truncadas de la proteína inhibidora de TNF de 40 kDa recombinante completa donde 51 o 53 restos aminoácido, respectivamente, del extremo carboxilo de la proteína madura son eliminados. Por consiguiente, un artesano experto apreciaría que el cuarto dominio de cada uno de los inhibidores de TNF de 30 Kda e inhibidores de 40 kDa no es necesario para la inhibición del TNF. De hecho, diversos grupos han confirmado su conocimiento. Se han generado derivados por deleción de un dominio de los inhibidores de TNF de 30 kDa y de 40 kDa, y aquellos derivados sin el cuarto dominio conservan toda la actividad de unión al TNF mientras aquellos derivados sin el primer, segundo o tercer dominio, respectivamente, no conservan la actividad de unión al TNF (Corcoran et al. (1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840; Chih-Hsueh et al. (1995), The Journal of Biological Chemistry, 270(6):2874-2878; y Scallon et al. (1995), Cytokine, 7(8):759-770).
Debido a la inhibición de la citotoxicidad relativamente baja mostrada por el inhibidor de TNF de 30 kDa y el inhibidor de TNF de 40 kDa (Butler et al. (1994), Cytokine, 6(6):616-623), diversos grupos han generado dímeros de proteínas inhibidoras de TNF (Butler et al. (1994), supra; y Martin et al. (1995), Exp. Neurol., 131:221-228). No obstante, los dímeros pueden generar una respuesta de anticuerpos (Martin et al. (1995), supra; y Fisher et al. (1996), The New England Journal of Medicine, 334 (26):1697-1702).
Un objeto de la presente invención es proporcionar sTNFR truncados funcionalmente activos. Este y otros objetos de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción.
Compendio de la invención
La presente invención está dirigida a formas truncadas funcionalmente activas de sTNFR-I, referidas en la presente memoria como "sTNFR truncados". Los sTNFR truncados son formas modificadas de sTNFR-I que no contienen el cuarto dominio (restos aminoácido Thr^{127}-Asn^{161} de sTNFR-I; una porción del tercer dominio (restos aminoácido Asn^{111}-Cys^{126} de sTNFR-I; y, que opcionalmente no contienen una porción del primer dominio (restos aminoácido Asp^{1}-Cys^{19} de sTNFR-I. Estos nuevos inhibidores de TNF (p. ej., TNF-\alpha y/o TNF-\beta) tienen aplicabilidad
general.
Los sTNFR truncados de la presente invención incluyen las proteínas representadas por la fórmula R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}. Estas proteínas son formas truncadas de sTNFR-I.
Por "R_{i}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}" se quieren significar una o más proteínas en las que [Cys^{19}-Cys^{103}] representa los restos 19 a 103 de sTNFR-I, cuyo esquema de numeración de los restos aminoácido se proporciona en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) para facilitar la comparación; donde R_{1} representa un grupo amino metionilado o no metionilado de Cys^{19} o de uno o varios restos aminoácido seleccionados del grupo:
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1
y donde R_{2} representa un grupo carboxi de Cys^{103} o de los restos aminoácido carboxi terminales seleccionados del grupo:
2
donde dicho sTNFR tiene una antigenicidad reducida en comparación con el TNFR-I soluble que comprende los tres primero dominios; y las muteínas por deleción y/o sustitución de los mismos capaces de inhibir el TNF y tener una homología con la secuencia nativa de dicho sTNFR de más del 70%; y los productos conjugados de dicho TNFR con polímeros solubles en agua, donde los productos conjugados no contienen el cuarto dominio de TNFR.
Los sTNFR-I truncados ilustrativos de la presente invención incluyen las siguientes moléculas: NH_{2}-MDSVCPQG
KYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-Fc-COOH (también referida como sTNFR-I 2.6D/C105); NH_{2}-MDSVCPQGKYIHP
QNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referida como sTNFR-I 2.6D/C106); NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPO
NNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FN-COOH (también referida como sTNFR-I 2.6D/N105); NH_{2}-MYIHPQNNSIC-[Cys^{19}
-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referida como sTNFR-I 2.3D/d8); NH_{2}-M-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referida como sTNFR-I 2.3D/d18); y NH_{2}-MSIS-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referida como sTNFR-I 2.3D/d15), o bien metioniladas o no metioniladas, y las variantes y derivados de las mismas.
En un aspecto de la presente invención, los sTNFR truncados pueden ser elaborados en formas glicosiladas o no glicosiladas. Los sTNFR son producidos mediante técnicas de ingeniería genética recombinante. En una realización alternativa, los sTNFR truncados son sintetizados mediante técnicas químicas o una combinación de técnicas recombinantes y químicas.
En otro aspecto de la presente invención, los sTNFR truncados pueden ser transformados anclando los sTNFR truncados a un polímero soluble en agua. Por ejemplo, los sTNFR truncados pueden ser conjugados con una o más moléculas de polietilengicol con el fin de mejorar el funcionamiento farmacocinético incrementando el peso molecular aparente de la molécula.
Otro aspecto más de la presente invención incluye los diversos polinucleótidos que codifican los sTNFR truncados. Las secuencias de ácido nucleico adecuadas incluyen, por ejemplo, aquellas representadas específicamente en las Figuras así como las secuencias degeneradas y las variaciones alélicas de origen natural de las mismas. Tales secuencias de ácido nucleico se pueden utilizar en la expresión de los sTNFR truncados en las células anfitrionas eucarióticas o procarióticas, donde los productos de expresión o derivados de los mismos se caracterizan por la capacidad para modular la actividad del TNF.
Un aspecto adicional de la presente invención implica vectores que contienen los polinucleótidos que codifican los sTNFR truncados conectados operablemente a secuencias de control de la amplificación y/o la expresión. Tanto las células anfitrionas procarióticas como las eucarióticas pueden ser transformadas o transfectadas establemente con tales vectores para expresar los sTNFR truncados. La presente invención incluye adicionalmente la producción recombinante de sTNFR truncados donde las células anfitrionas que contienen tales polinucleótidos se desarrollan en un medio nutriente adecuado y los sTNFR truncados expresados por las células son aislados, opcionalmente, de las células anfitrionas y/o el medio nutriente.
Otro aspecto de la presente invención incluye composiciones farmacéuticas que contienen sTNFR truncados o derivados de los mismos. Típicamente, los sTNFR truncados o los derivados de los mismos pueden ser formulados asociados con vehículos farmacéuticamente aceptables. Se pueden utilizar una variedad de materiales de formulación distintos para facilitar la fabricación, el almacenamiento, la manipulación, la liberación y/o la eficacia de los sTNFR truncados o los derivados de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención hace referencia al uso de una cantidad terapéuticamente eficaz de sTNFR truncados para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF (p. ej., una enfermedad mediada por TNF-\alpha y/o TNF-\beta). En una realización, la enfermedad mediada por TNF es la artritis.
Los polinucleótidos que codifican los sTNFR truncados también pueden ser utilizados en aplicaciones de terapia celular o terapia génica.
Los sTNFR truncados de la presente invención son particularmente adecuados para la producción de cantidades a gran escala de proteína. Por ejemplo, el sTNFR-I tiene un sitio de desamidación en la secuencia de aminoácidos 111 a 126 (aminoácidos Asn^{111}-Gly^{126}). Se espera que la ausencia de este sitio intensifique la estabilidad bioquímica de la proteína purificada, disminuyendo los posibles productos de degradación y dando como resultado proteínas más estables durante el almacenamiento. Los sTNFR truncados tienen menos puentes disulfuro que otras proteínas inhibidoras de TNF descritas previamente. Por ejemplo, el sTNFR-I tiene dos puentes disulfuro en la secuencia de aminoácidos 111 a 126 y tres puentes disulfuro en la secuencia de aminoácidos 127 a 161; y el sTNFR-II tiene un puente disulfuro entre Cys^{121} y Cys^{139}, Cys^{142} y Cys^{157}, y Cys^{163} y Cys^{178}. El reducido número de puentes disulfuro es importante ya que números mayores de estos enlaces pueden complicar el proceso de replegamiento de la proteína. Sorprendentemente, los sTNFR truncados tienen menos sitios para epítopos antigénicos que otras proteínas inhibidoras de TNF descritas previamente (p. ej., una forma acortada de sTNFR-I que tiene los tres primeros dominios tiene neo-epítopos causados por la exposición a ciertos restos, véase el Ejemplo III), dando como resultado una antigenicidad comparativamente reducida y presentando una reducción significativa de la tasa de aclaramiento con la administración repetida. Se espera que la reducción de la inmunogenicidad de los sTNFR truncados sea adecuada para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, incluyendo concretamente enfermedades inflamatorias
crónicas.
Los aspectos y las ventajas adicionales de la invención se harán evidentes para los expertos en la técnica tras la consideración de la siguiente descripción, que detalla la práctica de la presente invención.
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Breve descripción de las figuras
Numerosos aspectos y ventajas de la presente invención se harán evidentes tras la revisión de las figuras, en las que:
La Figura 1 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) que codifica Asp^{1}-Asn^{161}, el sTNFR-I humano recombinante completo. También se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de Asp^{1}-Asn^{161}.
La Figura 2 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) que codifica NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQ
NNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FC-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C105). También representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FC-COOH.
La Figura 3 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 5) que codifica NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQ
NNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C106). Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH.
La Figura 4 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 7) que codifica NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQ
NNSIC-[Cys^{l9}-Cys^{103}]-FN-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/N105). Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FN-COOH.
La Figura 5 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 11) que codifica NH_{2}-MYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d8). Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH.
La Figura 6 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 9) que codifica NH_{2}-M-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d18). Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de NH_{2}-M-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH.
La Figura 7 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 13) que codifica NH_{2}-MSIS-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d15). Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de NH_{2}-MSIS-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH.
La Figura 8 representa una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 34) que codifica Leu^{1}-Thr^{179}, el sTNFR-II humano recombinante maduro. Asimismo se representa la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 35) de Leu^{1}-Thr^{179}.
La Figura 9 representa la cantidad de hinchazón inducida en un modelo de reactivación inducido por la pared celular Estreptocócica, como se describe en el Ejemplo II.
La Figura 10 representa los perfiles en plasma de sTNFR-I 4D/C105db en babuinos sanos siguientes a dos minutos de infusión intravenosa de 0,2 mg/kg, como se describe en el Ejemplo III.
La Figura 11 representa los perfiles en plasma de sTNFR-I 3D/C105db en babuinos sanos siguientes a dos minutos de infusión intravenosa de 0,2 mg/kg, como se describe en el Ejemplo III.
La Figura 12 representa los perfiles en plasma de sTNFR-I 2.6D/C105db en babuinos sanos siguientes a dos minutos de infusión intravenosa de 0,2 mg/kg, como se describe en el Ejemplo III.
La Figura 13 representa la relación entre la dosis y el aclaramiento de diferentes constructos sTNFR-I diméricos, como se describe en el Ejemplo III.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que el tamaño de sTNFR-I y sTNFR-II se puede reducir para excluir no solamente el cuarto dominio si no una porción del tercer dominio y, opcionalmente, una porción del primer dominio, y todavía conservar la actividad biológica y tener una antigenicidad reducida. Al menos por las siguientes razones, se considera ventajoso producir estos sTNFR truncados biológicamente activos o derivados de los mismos. Primero, estas moléculas pueden tener un sitio de desamidación potencialmente desestabilizante. Segundo, estas moléculas tienen menos puentes disulfuro, haciendo potencialmente más fácil el replegado y la purificación. Tercero, en estas moléculas se han reducido los sitios para los epítopos antigénicos potenciales.
Según se utiliza en la presente memoria, el término "sTNFR truncado" incluye una o más moléculas sintéticas o recombinantes biológicamente activas de fórmula R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, y las variantes (incluyendo las variantes por inserción, sustitución y deleción) de las mismas, como se describe más abajo.
El término "biológicamente activo" según se utiliza en la presente memoria significa que un sTNFR truncado demuestra propiedades de inhibición de TNF similares, pero no necesariamente todas las propiedades y no necesariamente en el mismo grado que sTNFR-I. En general, los sTNFR truncados y los derivados de los mismos tienen la capacidad de inhibir el TNF. Los bioanálisis de los sTNFR truncados se describen adicionalmente en el Ejemplo II más abajo. La selección de las propiedades inhibidoras de TNF concretas de interés depende del uso deseado del sTNFR truncado.
En un aspecto de la presente invención, los sTNFR truncados pueden ser producidos ventajosamente por medio de técnicas recombinantes en sistemas de células bacterianas, de mamífero o de insecto y pueden ser formas glicosiladas o no glicosiladas de la proteína. Alternativamente, los sTNFR truncados pueden ser sintetizados químicamente. Los métodos de producción preferidos actualmente se describen con más detalle más abajo.
Cada uno de los sTNFR truncados puede ser aislado y purificado típicamente para que esté sustancialmente libre de la presencia de otros materiales proteináceos (esto es, sTNFR no truncados). Preferiblemente, un sTNFR truncado está libre de otras proteínas aproximadamente en un 80% que pueden estar presentes debido a la técnica de producción utilizada en la fabricación del sTNFR truncado. Más preferiblemente un sTNFR truncado está libre de otras proteínas aproximadamente en un 90%, particularmente preferiblemente libre de otras proteínas aproximadamente en un 95%, y muy preferiblemente libre de otras proteínas aproximadamente en >98%. Se apreciará, no obstante, que la proteína deseada puede ser combinada con otros ingredientes activos, composiciones químicas y/o materiales de formulación farmacéutica adecuados antes de la administración, como se describe con más detalle más abajo.
sTNFR truncados
En una realización básica, los sTNFR truncados de la presente invención pueden ser una o más proteínas representadas por la siguiente fórmula:
R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}
donde [Cys^{19}-Cys^{103}] representa los restos 19 a 103 del sTNFR-I, el esquema de numeración de los restos aminoácido se proporciona en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) para facilitar la comparación; donde R_{1} representa un grupo amino metionilado o no metionilado de Cys^{19} o del resto o los restos aminoácido del extremo amino seleccionado del grupo:
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y donde R_{2} representa un grupo carboxi de Cys^{103} o de los restos aminoácido carboxi-terminales seleccionados del grupo:
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y las variantes de los mismos, no obstante siempre que, cuando R_{1} represente un grupo amino metionilado o no metionilado de la secuencia de aminoácidos VCPQGKYIHPQNNSIC o un truncamiento N-terminal del mismo de 1 a 15 restos, R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} no sea una variante de adición que tenga la fórmula R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSLCL-R_{3}, donde R_{3} representa un grupo carboxilo de la secuencia de aminoácidos de Asn^{111}-Asn^{161} de la Figura 1 o un truncamiento carboxi terminal de la misma.
Otro aspecto de la presente invención incluye una o más variantes de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, metionilada o no metionilada. El término "sTNFR truncados" incluye de este modo una o más variantes alélicas de origen natural de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, y una o más proteínas variantes en las que se han suprimido ("variantes por deleción"), insertado o ("variantes por adición"), o se han sustituido ("variantes por sustitución") restos aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}.
Las deleciones de la secuencia de aminoácidos generalmente oscilan entre aproximadamente 20 restos aminoácido, más típicamente de aproximadamente 1 a 10 restos, y muy típicamente de aproximadamente 1 a 5 restos, con tal que no interrumpan el plegamiento de la proteína. Se contemplan deleciones N-terminales, C-terminales e intrasecuencia interna. El número de deleciones totales y/o deleciones consecutivas se seleccionará con el fin de conservar la estructura terciaria de la proteína en el dominio afectado, p. ej., el entrecruzamiento de cisteína.
Las deleciones en la secuencia de aminoácidos de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} se pueden realizar en regiones de baja homología con las secuencias de otros miembros de la familia de receptores de NGF/TNF en el grupo de las proteínas de membrana de la superficie celular. Las deleciones en la secuencia de aminoácidos de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} se pueden realizar en zonas de homología sustancial con las secuencias de otros miembros de la familia de receptores de NGF/TNF y será más probable que modifiquen significativamente la actividad biológica. Específicamente, la similitud de secuencias entre los miembros de la familia de receptores de NGF/TNF es particularmente alta en la región correspondiente a los dos primeros bucles disulfuro del dominio 1, todo el dominio 2, y el primer bucle disulfuro del dominio 3 (Banner et al. (1993), Cell, 73:431-445). Por ejemplo, dos variantes por deleción ilustrativas de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} son R_{1}-[Cys^{19}(\DeltaThr^{20})-Cy^{103}]-R_{2} y R_{1}-[CyS^{19}(\DeltaCys^{19}-Lys^{21})-Cysl^{103}]-R_{2}, donde R_{1} y R_{2} se definen como antes.
Las adiciones a la secuencia de aminoácidos pueden incluir fusiones amino- y/o carboxi-terminales que tienen una longitud que oscila de un resto a cien o más restos, así como inserciones intrasecuencia interna de uno o múltiples restos aminoácido. Las adiciones internas pueden oscilar típicamente de aproximadamente a 10 restos aminoácido, más típicamente de aproximadamente 1 a 5 restos aminoácido y muy típicamente de aproximadamente 1 a 3 restos aminoácido.
Las variantes por adición en el extremo amino incluyen la adición de una metionina (por ejemplo como artefacto de la expresión directa de la proteína en cultivo de células recombinantes bacterianas) o un resto o secuencia de aminoácidos adicional. Un ejemplo adicional de una inserción amino-terminal incluye la fusión de una secuencia señal, así como con otras secuencias pre-pro, para facilitar la secreción de proteína a partir de células anfitrionas recombinantes. Para las células anfitrionas procarióticas que no reconocen ni procesan las secuencias señal de sTNFR-I o sTNFR-II nativas, la secuencia señal puede ser sustituida por una secuencia señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de los líderes de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa o la enterotoxina II térmicamente estable. Para las células de levadura, la secuencia señal se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo de las secuencias líder de la invertasa de levadura, el factor alfa o la fosfatasa ácida. En la expresión en células de mamífero las secuencias señal nativas de sTNFR-I o de sTNFR-II (EP 393.438 y EP 422.339) son satisfactorias, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias señal de mamífero (p. ej., secuencias derivadas de otros miembros de la familia de receptores de NGF/TNF).
Las variantes por adición en el extremo carboxi no implican la adición de uno o más restos aminoácido que producirían la reconstrucción del sTNFR-I. Se apreciará que una variante por adición en el extremo carboxi no incluirá la adición de uno o más restos ácido al carboxi que darían como resultado la reconstrucción del tercer dominio o el cuarto dominio de sTNFR-I. Un ejemplo de las variantes de adición al extremo carboxi incluye las proteínas quiméricas que comprende la fusión de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} con todo o con una parte de un dominio constante de una cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana. Se prefieren estas proteínas quiméricas en las que la porción de inmunoglobulina de cada una comprende todos los dominios excepto el primer dominio de la región constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humana, tal como IgG, IgA, IgM o IgE, especialmente IgG, p. ej., IgG1 o IgG3. Un artesano experto apreciará que cualquier aminoácido de cada porción de la inmunoglobulina puede ser suprimido o sustituido por uno o más aminoácidos, o se pueden añadir uno o más aminoácidos con tal que la porción de unión al TNF todavía se una al TNF y la porción de inmunoglobulina muestre una o más de sus propiedades
características.
Otro grupo de variantes son las variantes por sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen cada una al menos un resto aminoácido en R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} eliminado y un resto diferente insertado en su lugar. Las variantes por sustitución incluyen variantes alélicas, que se caracterizan por cambios en la secuencia de nucleótidos de origen natural en la población de las especies que pueden dar como resultado o no un cambio de aminoácido. Un experto en la técnica puede utilizar cualquier información conocida acerca del sitio de unión o activo del polipéptido en la selección de posibles sitios de mutación.
Un método para identificar restos aminoácido o regiones para la mutagénesis de una proteína se denomina "mutagénesis de barrido con alanina" (Cunningham y Wells (1989), Science, 244:1081-1085). En este método un resto aminoácido o grupo de restos diana de una proteína es identificado (p. ej., restos cargados tales como Arg, Asp, His, Lys y Glu) y remplazado por un aminoácido neutro o cargado negativamente (muy preferiblemente alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el entorno acuoso circundante dentro o fuera de la célula. Aquellos restos que demuestran sensibilidad funcional son refinados después introduciendo restos adicionales o alternativos en los sitios de la sustitución. De este modo, se pre-determina el sitio para introducir una modificación en una secuencia de aminoácidos y, para optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, se puede realizar la mutagénesis de barrido con alanina o al azar y el polipéptido resultante se puede escrutar en cuanto a la combinación óptima de actividad y el grado de actividad deseados.
Los sitios de interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen sitios en los que los aminoácidos encontrados en R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} son sustancialmente diferentes en términos de volumen, carga y/o carácter hidrófobo de la cadena lateral de las proteínas de tipo sTNFR tales como los sTNFR de otras especies diferentes o de otros miembros de la familia de receptores de NGF/TNF.
Otros sitios de interés incluyen aquellos en los que restos concretos son similares o idénticos a los de tales proteínas de tipo sTNFR-I y proteínas de tipo sTNFR-II. Tales posiciones son generalmente importantes para la actividad biológica de una proteína. Por ejemplo, un artesano experto comprendería que antes de la presente invención, los efectos del truncamiento de sTNFR-I y sTNFR-II sobre sus respectivas estructuras tridimensionales no hubieran sido predecibles. No obstante, dados los resultados descritos en la presente memoria, un artesano experto apreciaría que los primeros principios de desarrollo de una estrategia para elaborar variantes podrían contar en parte con la información elucidada previamente para sTNFR-I y sTNFR-II completas. Por consiguiente, se ha dilucidado la siguiente información concerniente a sTNFR-I (Banner et al. (1993), supra, y Fu et al. (1995), Protein Engineering, 8(12):1233-1241). Los restos Tyr^{9}, Thr^{39}, His^{55} del Dominio 1, los restos Phe^{49}, Ser^{63}, Asp^{82} del Dominio 2 y los restos Tyr^{92} y Ser^{107} del Dominio 3 han sido identificados por ser potencialmente importantes para la estabilización de la estructura de los Dominios 1, 2 y 3, respectivamente. Los restos Pro^{12} y His^{55} han sido identificados por interaccionar potencialmente con Ser^{86}-Tyr^{87} en la subunidad C del TNF\alpha. Los restos Glu^{45}-Phe^{49} han sido identificados por estar en un bucle que interacciona potencialmente con los restos Leu^{29}-Arg^{32} de la subunidad A del TNF\alpha. Los restos Gly^{48} han sido identificados por interaccionar potencialmente con Asn^{19}-Pro^{20} en la subunidad A del TNF\alpha. Los restos His^{58}-Leu^{60} han sido identificados por estar en conformación de hebra ampliada y las interacciones de la cadena lateral con los restos Arg^{31}-Ala^{33} de la subunidad A del TNF\alpha han sido identificados potencialmente con el resto His^{58} de sTNFR-I que interacciona específicamente con el resto Arg^{31}. Los restos Lys^{64}-Arg^{66} han sido identificados por estar en conformación de hebra ampliada y han sido identificados por tener interacciones de la cadena lateral y la cadena principal con los restos Ala^{145}-Glu^{146} y el resto Glu^{46} de la subunidad A del TNF\alpha. El resto Met^{69} ha sido identificado por interaccionar potencialmente con el resto Tyr^{115} de la subunidad A del TNF\alpha. Los restos His^{94}-Phe^{101} han sido identificados por formar un bucle que interacciona con los restos Thr^{72}-Leu^{75} y Asn^{137} de la subunidad C del TNF\alpha, con el resto Trp^{96} de sTNFR-I interaccionando específicamente con los restos Ser^{71}-Thr^{72} de la subunidad C del TNF\alpha, estando Leu^{100} de sTNFR-I en íntima proximidad con el resto Asn^{137} de la subunidad C del TNF\alpha e interaccionando el resto Gln^{102} de sTNFR-I específicamente con el resto Pro^{113} de la subunidad A del TNF\alpha. Por consiguiente, un artesano experto apreciaría que estos sitios iniciales sean modificados por sustitución de una manera relativamente
conservativa.
Semejantes sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "Sustituciones Preferidas". Si semejantes sustituciones dan como resultado un cambio en la actividad biológica, se pueden introducir más cambios sustanciales (Sustituciones Ilustrativas) y/o se pueden realizar otras adiciones/deleciones y escrutar los productos resultantes.
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TABLA 1 Sustituciones de Aminoácidos
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Al realizar semejantes cambios de una naturaleza equivalente, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparragina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del índice hidropático de los aminoácidos al conferir una función biológica interactiva a una proteína es generalmente comprendida en la técnica (Kyte y Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al realizar cambios basándose en el índice hidropático, se prefiere una sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están en \pm2, son particularmente preferidos aquellos que están en \pm1, y son incluso más concretamente preferidos aquellos en \pm0,5.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede realizar eficazmente basándose en el carácter hidrófilo, concretamente cuando la proteína o péptido con una funcionalidad biológica equivalente creado de ese modo está destinado al uso en realizaciones inmunológicas, como en el presente caso.
En la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, se establece que el mayor carácter hidrófilo medio local de una proteína, regido por el carácter hidrófilo de sus aminoácidos adyacentes, se corresponde con su inmunogenicidad y antigenicidad, esto es con una propiedad biológica de una proteína.
Como se detalla en la Patente de los Estados Unidos 4.554.101, se han asignado los siguientes valores de carácter hidrófilo a los restos aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 \pm1); glutamato (+3,0 \pm 1); serina (+0,3); asparragina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0) ; treonina (-0,4); prolina (-0,5 \pm 1); alanina (-0,5); histidina(-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4).
Al realizar cambios basándose en valores de carácter hidrófilo similares, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de carácter hidrófilo están en \pm2, son particularmente preferidos aquellos que están en \pm1, y son incluso más preferidos concretamente aquellos que están en \pm0,5.
En la Patente de los Estados Unidos 4.554.101 también se ilustra la identificación y preparación de epítopos de secuencias de aminoácidos primarias basándose en el carácter hidrófilo. Por medio de los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos 4.554.101 un experto en la técnica sería capaz de identificar epítopos de una secuencia de aminoácidos tal como las secuencias de los sTNFR descritas en la presente memoria. Estas regiones también son referidas como "regiones núcleo epitópicas".
Numerosas publicaciones han sido fieles a la predicción de la estructura secundaria, y a la identificación de epítopos, a partir de los análisis de las secuencias de aminoácidos (Chou y Fasman (1974), Biochemistry, 13(2):222-245; Chou y Fasman, Biochemistry, 113(2):211-222; Chou y Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Chou y Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou y Fasman (1979), Biophys. J., 26:367-384. Por otra parte, se encuentran disponibles programas computarizados para ayudar a pronosticar porciones antigénicas y regiones núcleo epitópicas de las proteínas. Los ejemplos incluyen aquellos programas basados en el análisis de Jameson-Wolf (Jameson y Wolf (1998), Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 y Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191, el programa PepPlot® (Brutlag et al. (1990) CABS, 6:237-245 y Weinberger et al. (1985), Science, 228: 740-742, y otros programas nuevos para la predicción de la estructura terciaria de las proteínas (Fetrow y Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11:479-483.
Se espera que las modificaciones conservativas de la secuencia de aminoácidos (y las correspondientes modificaciones de las secuencias de ácido nucleico codificantes) de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} produzcan proteínas que tengan características funcionales y químicas similares a las de la proteína modificada.
En contraste, las modificaciones sustanciales de las características funcionales y/o químicas de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} se pueden completar seleccionando sustituciones que difieran significativamente en su efecto sobre el mantenimiento (a) de la estructura del esqueleto polipeptídico en la zona de la sustitución, por ejemplo, en una conformación en lámina o hélice, (b) la carga o carácter hidrófobo de la proteína en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Los restos de origen natural se dividen en grupos basándose en las propiedades comunes de la cadena lateral:
1) hidrófobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr;
3) ácidos: Asp, Glu;
4) alcalinos: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y
6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de uno de estos grupos por otro. Tales restos sustituidos pueden ser introducidos en regiones de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} que son homólogas o no homólogas a otros miembros de la familia de receptores de NGF/TNF.
Las mutaciones específicas de la secuencia de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} pueden implicar la sustitución de un aminoácido no nativo en el extremo N, el extremo C o cualquier sitio de la proteína que esté modificado por la adición de un carbohidrato unido a N o unido a O. Tales modificaciones pueden ser de particular utilidad, por ejemplo en la adición de un aminoácido (p. ej., cisteína), que es ventajosa para la unión de un polímero soluble en agua para formar un derivado, como se describe más abajo. Véase, por ejemplo, la Figura 5 donde la Asn^{105} de origen natural del sTNFR-I se cambia por Cys para facilitar el anclaje de una molécula de polietilenglicol (Ejemplo I).
Adicionalmente, las secuencias de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2} pueden ser modificadas para añadir sitios de glicosilación o para suprimir sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O. Un sitio de reconocimiento de glicosilación unido a asparragina comprende una secuencia tripeptídica que es reconocida específicamente por enzimas de glicosilación celular apropiadas. Estas secuencias tripeptídicas son o bien Asn-Xaa-Thr o bien Asn-Xaa-Ser, donde Xaa puede ser cualquier aminoácido distinto de Pro. Existen restos asparragina de sTNFR-I probados o pronosticados en las posiciones 14, 105 y 111. Existen restos asparragina de sTNFR-II probados o pronosticados en las posiciones 149 y 171. Se pueden realizar una variedad de sustituciones o deleciones de aminoácidos para modificar o añadir sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O, dando como resultado una proteína con una glicosilación alterada.
En una realización específica, las variantes son sustancialmente homólogas al aminoácido de R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}. El término "sustancialmente homólogas" según se utiliza en la presente memoria representa un grado de homología que es preferiblemente mayor del 70%, más preferiblemente mayor del 80%, incluso más preferiblemente más del 90% o muy preferiblemente incluso el 95%. El porcentaje de homología descrito en la presente memoria se calcula como el porcentaje de restos aminoácido encontrados en la más pequeña de las dos secuencias que se alinean con restos aminoácido idénticos de la secuencia que está siendo comparada cuando se pueden introducir cuatro espacios en una longitud de 100 aminoácidos para ayudar a ese alineamiento, como expone Dayhoff (1972), en Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. También se incluyen como sustancialmente homólogos los sTNFR truncados que pueden ser aislados en virtud de la reactividad cruzada con anticuerpos para la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 35, respectivamente, o cuyos genes pueden ser aislados mediante hibridación con el ADN del SEQ ID NO: 1 o el SEQ ID NO: 34 o con segmentos de los mismos.
Los sTNFR ilustrativos de la presente invención incluyen las siguientes moléculas: NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQN
NSIC -[Cys^{19}-Cys^{103}]-FC-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C105); NH_{2}-MDSVCPQGKYINPONNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C106); NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FN-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/N105); NH_{2}-MYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FN
CSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d8); NH_{2}-M-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d18); y NH_{2}-MSIS-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d15), ya sea metioniladas o no metioniladas, y las variantes y derivados de las mismas.
La producción de sTNFR truncados variantes se describe con más detalle más abajo. Tales variantes se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ADN que codifica los sTNFR truncados o mediante síntesis química in vitro de los sTNFR truncados deseados. Los expertos en la técnica apreciarán que se pueden realizar muchas combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones, siempre que los sTNFR truncados finales sean biológicamente activos.
Las técnicas de mutagénesis para la reposición, la inserción o la deleción de uno o más restos aminoácido seleccionados son bien conocidas por los expertos en la técnica (p. ej., Patente de los Estados Unidos Núm. 4.518.584). Existen dos variables principales en la construcción de cada variante de secuencia de aminoácidos, la localización del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación. Al diseñar cada variante, la localización de cada sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de las características bioquímicas que se vayan a modificar. Cada sitio de mutación puede ser modificado individualmente o en serie, p. ej., (1) sustituyendo primero con selecciones de aminoácidos conservativas y después con selecciones más radicales, dependiendo de los resultados obtenidos, (2) suprimiendo el resto aminoácido diana o (3) insertando los restos aminoácido adyacentes al sitio localizado.
Los derivados químicamente modificados de sTNFR truncados pueden ser preparados por un experto en la técnica, dadas las descripciones de la presente memoria. Los productos conjugados pueden ser preparados utilizando sTNFR truncados glicosilados, no glicosilados o des-glicosilados. Típicamente, se utilizarán los sTNFR truncados no glicosilados. Los radicales químicos adecuados para la transformación de sTNFR truncados incluyen polímeros solubles en agua.
Son deseables los polímeros solubles en agua debido a que la proteína a la cual está anclado cada uno no precipitará en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. Preferiblemente, el polímero será farmacéuticamente aceptable para la preparación de un producto o composición terapéuticos. Un experto en la técnica podrá seleccionar el polímero deseado basándose en consideraciones tales como si el producto conjugado de polímero/proteína será utilizado terapéuticamente y, si es así, de la dosificación deseada, del tiempo de circulación y de la resistencia a la proteolisis.
Los polímeros solubles en agua, clínicamente aceptables, adecuados incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG), propionaldehído de polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/-propilenglicol, polietilenglicol monometoxilado, carboximetilcelulosa, dextrano, poli(alcohol vinílico) (PVA), polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poli(\beta-aminoácidos) (ya sean homopolímeros o copolímeros al azar), poli(n-vinil-pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol (PPG) y otros óxidos de polialquileno, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (POG) (p. ej., glicerol) y otros polioles polietoxilados, sorbitol polioxietilado, o glucosa polioxietilada, ácidos colónicos u otros polímeros de carbohidratos, Ficoll o dextrano y mezclas de los mismos.
Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que polietilenglicol abarque cualquiera de las formas que han sido utilizadas para transformar otras proteína, tales como mono-alcoxi(C_{1}-C_{10})- o ariloxi-polietilenglicol. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua.
Los polímeros solubles en agua pueden ser de cualquier peso molecular y pueden ser ramificados o no ramificados. Los polímeros solubles en agua tienen cada uno típicamente un peso molecular medio entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 100 kDa (indicando el término "aproximadamente" que en las preparaciones de un polímero soluble en agua, algunas moléculas pesarán más, algunas menos, que el peso molecular establecido). El peso molecular medio de cada polímero soluble en agua está preferiblemente entre aproximadamente 5 kDa y aproximadamente 50 kDa, más preferiblemente entre aproximadamente 12 kDa y aproximadamente 40 kDa y muy preferiblemente entre aproximadamente 20 kDa y aproximadamente 35 kDa.
Generalmente, a mayor peso molecular o a más ramificaciones, mayor proporción polímero:proteína. Se pueden utilizar otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (p. ej., la duración de la liberación sostenida; los efectos, si los hubiera, sobre la actividad biológica; la facilidad de manipulación; el grado o carencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de un polímero soluble en agua sobre una proteína terapéutica).
Los polímeros solubles en agua deben ser anclados cada uno a la proteína teniendo en cuenta los efectos sobre los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. En general, la transformación química se puede realizar en cualquier condición adecuada utilizada para hacer reaccionar una proteína con una molécula de polímero activada. Los grupos activadores que se pueden utilizar para unir el polímero soluble en agua con una o más proteínas incluyen los siguientes: sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo. Los polímeros solubles en agua están anclados cada uno a la proteína generalmente en los grupos \alpha- o \varepsilon-amino de los aminoácidos o un grupo tiol reactivo, pero normalmente también se contempla que un grupo soluble en agua pueda estar anclado a cualquier grupo reactivo de la proteína que sea suficientemente reactivo para quedar anclado a un grupo soluble en agua en condiciones de reacción adecuadas. De este modo, un polímero soluble en agua puede estar unido covalentemente a una proteína vía un grupo reactivo, tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los restos aminoácido que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos lisina y el resto aminoácido N-terminal. Los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir restos ácido aspártico, restos ácido glutámico y el resto aminoácido C-terminal. Los que tienen un grupo tiol reactivo incluyen restos cisteína.
Los métodos para preparar proteínas conjugadas con polímeros solubles en agua comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar una proteína con un polímero soluble en agua en condiciones en las que la proteína se quede anclada a uno o más polímeros solubles en agua y (b) obtener el producto de reacción. Las condiciones de reacción para cada conjugación se pueden seleccionar entre cualquiera de las conocidas en la técnica o las desarrolladas posteriormente, pero deben ser seleccionadas para evitar o limitar la exposición a condiciones de reacción tales como temperaturas, disolventes y niveles de pH que inactiven la proteína que se vaya a modificar. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones serán determinadas caso por caso basándose en parámetros conocidos y en el resultado deseado. Por ejemplo, a mayor proporción de polímero soluble en agua:producto conjugado de proteína, mayor porcentaje de producto conjugado. La proporción óptima (en términos de eficacia de la reacción ya que no hay proteína o polímero en exceso que no hayan reaccionado) puede ser determinada por factores tales como el grado de transformación deseado (p. ej., mono-, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero seleccionado, de si el polímero es ramificado o no ramificado y de las condiciones de reacción utilizadas. La proporción de polímero soluble en agua (p. ej., PEG) con respecto a proteína estará generalmente en el intervalo de 1:1 a 100:1. Se pueden preparar uno o más productos conjugados purificados a partir de cada mezcla mediante mecanismos de purificación normalizados, incluyendo entre otros, diálisis, precipitación por adición de sal, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y electroforesis.
Se puede desear específicamente una proteína modificada químicamente en el extremo N. Se puede seleccionar un polímero soluble en agua por el peso molecular, la ramificación, etc., la proporción de las moléculas de polímero soluble en agua con respecto a proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción que se vaya a realizar, y el método de obtención de la proteína modificada químicamente en el extremo N seleccionada. El método de obtención de la preparación de proteína químicamente modificada en el extremo N (esto es, la separación de este radical de otros radicales monotransformados si fuera necesario) puede ser mediante purificación del material proteico químicamente modificado en el extremo N de una población de moléculas de proteína químicamente modificadas. La modificación química en el extremo N selectiva se puede completar mediante alquilación reductiva que explota la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina versus extremo N) disponibles para la transformación en una proteína concreta. En las condiciones de reacción apropiadas, se logra la transformación sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N con un polímero que contiene grupos carbonilo. Por ejemplo, se puede anclar selectivamente un polímero soluble en agua al extremo N de la proteína llevando a cabo la reacción a un pH que permita sacar ventaja de las diferencias de pKa entre el grupo \varepsilon-amino de los restos lisina y el del grupo \alpha-amino del resto del extremo N de la proteína. Por medio de semejante transformación selectiva, se controla el anclaje de un polímero soluble en agua a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína y no se produce una modificación significativa de los otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. Utilizando la alquilación reductiva, el polímero soluble en agua puede ser del tipo descrito antes y debe tener un único aldehído reactivo para el acoplamiento a la proteína. Se puede utilizar propionaldehído de polietilenglicol, que contiene un único aldehído reactivo.
La presente invención contempla específicamente que la proteína transformada químicamente incluya radicales mono- o poli- (p. ej., 2-4) PEG. La pegilación se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica. Los métodos para preparar un producto de proteína pegilada comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar un producto proteico con polietilenglicol (tal como un derivado éster o aldehído reactivo de PEG) en condiciones en las que la proteína se quede anclada a uno o más grupos PEG y (b) obtener el producto o los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones se determinarán caso por caso basándose en parámetros conocidos y en el resultado deseado.
Existen numerosos métodos de anclaje disponibles para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, EP
0.401.384; véase también, Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(7):4-10, (publicado por Mediscript, Mountain Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK); EP 0.154.316; EP 0.401.384; WO 92/16221; WO 95/34326; y otras publicaciones citadas en ellas que se refieren a la pegilación.
La pegilación se puede llevar a cabo específicamente vía reacción de acilación o reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva. De este modo, los productos proteicos según la presente invención incluyen proteínas pegiladas en las que el grupo o los grupos PEG está o están anclados vía grupos acilo o alquilo. Tales productos pueden ser mono-pegilados o poli-pegilados (p. ej., conteniendo 2-6, y preferiblemente 2-5, grupos PEG). Los grupos PEG están anclados generalmente a la proteína en los grupos \alpha- o \varepsilon-amino de los aminoácidos, pero también se contempla que los grupos PEG puedan estar anclados a cualquier grupo amino anclado a la proteína que sea suficientemente reactivo para quedar anclado a un grupo PEG en condiciones de reacción adecuadas.
La pegilación mediante acilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado éster activo de polietilenglicol (PEG) con la proteína. Para las reacciones de acilación, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un único grupo éster reactivo. Se puede utilizar cualquier molécula de PEG reactiva conocida o descubierta con posterioridad para llevar a cabo la reacción de pegilación. Un éster de PEG activado preferido es esterificado con PEG a hidroxisuccinimida (NHS). Según se utiliza en la presente memoria, se contempla que la "acilación" incluya, sin limitación, los siguientes tipos de conexiones entre la proteína terapéutica y un polímero soluble en agua tal como PEG: amida, carbamato, uretano, y similares (véase Chamow (1994), Bioconjugate Chem., 5(2):133-140). Las condiciones de reacción se pueden seleccionar entre cualquiera de las conocidas en la técnica de la pegilación o aquellas desarrolladas con posterioridad, pero se deben evitar las condiciones tales como temperaturas, disolventes y pH que inactiven la proteína que se vaya a modificar.
La pegilación mediante acilación dará como resultado generalmente una proteína poli-pegilada. Preferiblemente, la unión conectora será una amida. También preferiblemente, el producto resultante estará sustancialmente solo (p. ej., > 95%) mono, di- o tri-pegilada. No obstante, se pueden formar algunas especies con grados más altos de pegilación en cantidades que dependen de las condiciones de reacción específicas utilizadas. Si se desea, se pueden separar las especies pegiladas más purificadas de la mezcla (concretamente las especies que no han reaccionado) mediante técnicas de purificación normalizadas, incluyendo entre otras, diálisis, precipitación por adición de sal, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel y electroforesis.
La pegilación mediante alquilación implica generalmente hacer reaccionar un derivado aldehído terminal de PEG con la proteína en presencia de un agente reductor. Para la reacción de alquilación reductiva, el polímero o los polímeros seleccionados deben tener un único grupo aldehído reactivo. Un aldehído de PEG ilustrativo es el propionaldehído de polietilenglicol, que es estable en agua, o los derivados alcoxi C_{1}-C_{10} o ariloxi de los mismos (véase, la Patente de los Estados Unidos 5.252.714).
La pegilación mediante alquilación también puede dar como resultado una proteína poli-pegilada. Además, se pueden manipular las condiciones de reacción para favorecer sustancialmente la pegilación solamente en el grupo \alpha-amino del extremo N de la proteína (esto es, una proteína mono-pegilada). En cualquier caso de monopegilación o polipegilación, los grupos PEG están anclados preferiblemente a la proteína vía grupo -CH_{2}-NH-. Con una referencia concreta al grupo -CH_{2}-, este tipo de conexión es referida en la presente memoria como conexión "alquílica".
La alquilación reductiva para producir una población sustancialmente homogénea de producto mono-polímero/proteína comprenderá generalmente las etapas de: (a) hacer reaccionar una proteína con una molécula de PEG reactiva en condiciones de alquilación reductiva, a un pH adecuado para permitir la modificación selectiva del grupo \alpha-amino en el extremo amino de dicha proteína y (b) obtener el producto o los productos de reacción. La transformación vía alquilación reductiva para producir un producto monopegilado explota las diferencias de pKa entre los grupos amino de la lisina y el grupo \alpha-amino del extremo N (siendo la pKa el pH al cual el 50% de los grupos amino están protonados y el 50% no).
La reacción se realiza a un pH que permite sacar partido de las diferencias de pKa entre los grupos \varepsilon-amino de los restos lisina y el del grupo \alpha-amino del resto N-terminal de la proteína. En general, si el pH es más bajo, se deseará un exceso mayor de polímero con respecto a la proteína (esto es, cuanto menos reactivo sea el grupo \alpha-amino N-terminal, más polímero será necesario para alcanzar unas condiciones óptimas). Si el pH es más alto, la razón de polímero:proteína no necesita ser tan grande (esto es, se encuentran disponibles más grupos reactivos, de modo que son necesarias menos moléculas de polímero). Para los fines de la presente invención, el pH se corresponde con el intervalo de 3-9, preferiblemente 3-6. Para la alquilación reductiva, el agente reductor debe ser estable en solución acuosa y preferiblemente ser capaz de reducir solamente la base de Schiff formada en el procedimiento inicial de la alquilación reductiva. Los agentes reductores adecuados pueden ser seleccionados entre borohidruro de sodio, cianoborohidruro de sodio, dimetilaminoborano, trimetilaminoborano y piridinoborano. Un agente reductor particularmente adecuado es el cianoborohidruro de sodio. Otros parámetros de reacción tales como el disolvente, los tiempos de reacción, las temperaturas y los medios de purificación de los productos se pueden determinar caso por caso, basándose en la información publicada referente a la transformación de proteínas de polímeros solubles en agua.
Mediante semejante transformación selectiva, se controla el anclaje de un polímero soluble en agua (que contiene un grupo reactivo tal como un aldehído) a una proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N de la proteína y no se produce la modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral de la lisina. La preparación será típicamente mayor del 90% de producto conjugado de monopolímero/proteína, y más típicamente mayor del 95% de producto conjugado de monopolímero/proteína, siendo el resto de las moléculas observables las que no han reaccionado (esto es, proteína que carece del radical polimérico).
Una realización específica de la presente invención es una molécula de aldehído de polietilenglicol monometoxilada no ramificada que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 33 kDa (p. ej., entre 30 kDa y 35 kDa), o un aldehído de polietilenglicol t-butilado que tiene un peso molecular medio de aproximadamente 33 kDa (p. ej., entre 30 kDa y 35 kDa) conjugado vía alquilación reductiva con sTNFR-I 2.6D/N105.
La pegilación también se puede llevar a cabo específicamente vía polímeros solubles en agua que tienen al menos un grupo hidroxi reactivo (p. ej. polietilenglicol) que puede reaccionar con un reactivo que tiene un grupo carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo para convertir el grupo hidroxilo en un aceptor de Michael reactivo, formando de ese modo un "conector activado" útil en la modificación de diversas proteínas para proporcionar productos conjugados biológicamente activos mejorados. "Carbonilo, nitrilo o sulfona reactivo" representa un grupo carbonilo, nitrilo o sulfona al que se une un grupo de dos carbonos que tiene un sitio reactivo para el acoplamiento específico del tiol en el segundo carbono del grupo carbonilo, nitrilo o sulfona (WO 92/16221).
Los conectores activados pueden ser monofuncionales, bifuncionales, o multifuncionales. Los reactivos útiles que tienen un grupo sulfona reactivo que puede ser utilizado en los métodos incluyen, sin limitación, clorosulfona, vinilsulfona y divinilsulfona.
En una realización específica, el polímero soluble en agua es activado con un aceptor de Michael. En WO 95/13312 se describen, entre otros, PEG activados con sulfona solubles en agua que son muy selectivos para el acoplamiento con radicales tiol en lugar de radicales amino en moléculas y superficies. Estos derivados de PEG son estables frente a la hidrólisis durante períodos prolongados en entornos acuosos a pH de aproximadamente 11 o menos, y pueden formar conexiones con moléculas para formar productos conjugados que también son hidrolíticamente estables. La conexión por medio de la cual los PEG y la molécula biológicamente activa se acoplan incluye un radical sulfona acoplado con un radical tiol y tiene la estructura PEG-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2}-S-W, donde W representa la molécula biológicamente activa, y donde el radical sulfona es una vinilsulfona o una etilsulfona activa. Dos derivados homobifuncionales particularmente útiles son PEG-bis-clorosulfona y PEG-bis-vinilsulfona.
En la Solicitud Internacional PCT Núm. US96/19459, se ilustran métodos de elaboración de conectores activados con sulfona mediante la obtención de un compuesto que tiene un grupo hidroxilo reactivo y la conversión del grupo hidroxilo en un aceptor de Michael reactivo para formar un conector activado, con el uso de tetrahidrofurano (THF) como disolvente para la conversión. En la Solicitud Internacional PCT Núm. US96/19459 se ilustra un procedimiento para purificar conectores activados que utiliza la cromatografía de interacción hidrófoba para separar los conectores basándose en el tamaño y la funcionalidad del grupo terminal.
Específicamente, la presente invención contempla las siguientes moléculas expresadas en procariotas transformadas químicamente para que incluyan radicales mono- o poli- (p. ej., 2-4) PEG: sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 y sTNFR-I 2.3D/d15, ya sean metionilados o no metionilados, y variantes y derivados de los mismos.
Formas Polivalentes
Se pueden construir formas polivalentes, esto es, moléculas que comprenden más de un radical activo. En una realización, la molécula puede poseer múltiples sitios de unión al factor de necrosis tumoral para el ligando de TNF (p. ej., una combinación de un producto de sTNFR truncado). Adicionalmente, la molécula puede poseer al menos un sitio de unión al factor de necrosis tumoral y, dependiendo de la característica deseada de la forma polivalente, al menos un sitio de unión de otra molécula (p. ej., una combinación de al menos un producto de sTNFR truncado y al menos un antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1ra''), como se describe más abajo).
En una realización, la forma polivalente puede ser construida, por ejemplo, acoplando químicamente al menos un producto de sTNFR truncado y otro radical, preferiblemente otro producto de sTNFR truncado, con cualquier conector clínicamente aceptable (p. ej., un polímero soluble en agua como se ha descrito antes). En principio el conector no debe conferir nueva inmunogenicidad ni, en virtud de los nuevos restos aminoácido, alterar el carácter hidrófobo y el equilibrio de cargas de la estructura para afectar perjudicialmente a su biodistribución y aclaramiento.
Tales polímeros cuando se utilizan como conectores pueden ser homopolímeros, copolímeros al azar o de bloques y terpolímeros basándose en los monómeros enumerados antes, con cadena lineal o ramificada, sustituidos o no sustituidos. El polímero puede tener cualquier longitud o peso molecular, pero estas características pueden afectar a las propiedades biológicas. Los pesos moleculares promedio del polímero particularmente útiles para disminuir las tasas de aclaramiento en las aplicaciones farmacéuticas están en el intervalo de 2.000 a 35.000 dalton. Además, la longitud del polímero se puede variar para optimizar o conferir la actividad biológica deseada.
Los grupos activadores que se pueden utilizar para conectar el polímero soluble en agua a dos o más proteínas incluyen los siguientes: sulfona, maleimida, sulfhidrilo, tiol, triflato, tresilato, azidirina, oxirano y 5-piridilo.
En una realización específica, se puede purificar un conector activado bifuncional o multifuncional que tenga al menos un aceptor de Michael reactivo según la Patente de los Estados Unidos 5747639.
Los radicales activos se pueden conectar utilizando técnicas de acoplamiento convencionales (véase la Publicación PCT Núm. WO 92/16221 y la Publicación PCT Núm. WO 95/34326. Además, en la Publicación PCT Núm. 92/16221 se describe la preparación de diversas moléculas inhibidoras de sTNFR-I dimerizadas, p. ej., sTNFR-I c105 dimerizado. Un factor de necrosis tumoral polivalente ilustrativo que se une a proteínas que tienen la fórmula (sTNFR-I 2.6D/C106)_{2}-(20 kDa PEG), se describe en el Ejemplo I.
Alternativamente, una molécula bivalente puede consistir en dos repeticiones en tándem de productos de sTNFR truncados separadas por una región conectora polipeptídica. El diseño de los conectores polipeptídicos es similar en diseño a la inserción de secuencias bucle cortas entre los dominios del diseño de proteínas de novo (Mutter (1988), TIBS, 13:260-265 y Regan y DeGrado (1988), Science, 241:976-978. Se ha demostrado que un conector adecuado para anticuerpos de cadena sencilla es eficaz para producir una forma dimérica del sTNFR-II humano recombinante (Neve et al. (1996), Cytokine, 8(5):365-370).
Se han ensamblado diversos constructos conectores diferentes y se ha demostrado que son útiles para anticuerpos; los conectores más funcionales varían de tamaño entre 12 y 25 aminoácidos (aminoácidos que tienen grupos laterales no reactivos, p. ej., alanina, serina y glicina) que constituyen juntos una secuencia hidrófila, tienen unos pocos restos cargados opuestamente para intensificar la solubilidad y son flexibles (Whitlow y Filpula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105 y Brigido et al. (1993), J. Immunol., 150:469-479).
En otra realización, los sTNFR truncados pueden ser acoplados químicamente a biotina, y después se deja que la biotina/sTNFR truncado que están conjugados se unan a avidina, dando como resultado moléculas de sTNFR avidina/biotina/sTNFR truncado tetravalentes. Los sTNFR truncados también se pueden acoplar covalentemente a dinitrofenol (DNP) o trinitrofenol (TNP) y los productos conjugados resultantes precipitar con IgM anti-DNP o anti-TP para formar productos conjugados decaméricos con una valencia de 10 para los sitios de unión a TNF.
En otra realización más, también se pueden producir proteínas de fusión recombinantes que tienen un sTNFR truncado donde cada molécula quimérica recombinante tiene una secuencia de sTNFR, como se ha descrito antes, sustituida para los dominios variables de cualquiera o de ambas cadenas pesada y ligera de la molécula de inmunoglobulina y que tiene todos o parte de los dominios constantes, pero al menos un dominio constante, de la cadena pesada o ligera de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, cada una de tales proteínas de fusión sTNFR truncado/IgG1 quimérica puede ser producida a partir de dos genes quiméricos: una quimera de sTNFR truncado/cadena ligera kapa humana (sTNFR truncado/Ck) y una quimera de sTNFR truncado/cadena pesada gamma-1 humana (sTNFR truncado/Cg-1). Después de la transcripción y traducción de los dos genes quiméricos, como se describe más abajo, los productos génicos pueden ser ensamblados en una molécula quimérica que tenga un sTNFR truncado individual presentado bivalentemente. Los detalles adicionales referentes a la construcción de tales moléculas quiméricas se describen en la Patente de los Estados Unidos 5.116.964, Publicación PCT Núm. WO 89/09622, Publicación PCT Núm. WO 91/16437 y EP 315062.
En otra realización adicional más, también se pueden producir proteínas de fusión recombinantes que tengan un sTNFR truncado donde cada molécula quimérica recombinante tiene una secuencia de sTNFR, como se ha descrito antes, y al menos una porción de la región 186-401 de la osteoprotegerina (OPG), como se describe en la Solicitud de Patente Europea Núm. 96309363.8.
Polinucleótidos
La presente invención proporciona adicionalmente polinucleótidos que codifican los sTNFR truncados. Basándose en la presente descripción y utilizando la tabla de codones universal, un experto en la técnica puede determinar fácilmente todas las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos de los sTNFR truncados. Las secuencias de ácido nucleico preferidas en la actualidad incluyen aquellos polinucleótidos que codifican sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 y sTNFR-I 2.3D/d15. Los ejemplos de una variedad de polinucleótidos se representan en las Figuras 2, 3, 4, 5, 6 y 7.
Se pueden seguir las técnicas de expresión recombinante realizadas según las descripciones mostradas más abajo para producir estos polinucleótidos y para expresar las proteínas codificadas. Por ejemplo, insertando una secuencia de ácido nucleico que codifica un sTNFR truncado en un vector apropiado, un experto en la técnica puede producir fácilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleótidos deseada. Las secuencias se pueden utilizar después para generar sondas de detección o cebadores de amplificación. Alternativamente, un polinucleótido que codifica un sTNFR truncado puede ser insertado en un vector de expresión. Introduciendo el vector de expresión en un anfitrión apropiado, se puede producir el sTNFR truncado deseado en grandes cantidades.
Como se describe adicionalmente en la presente memoria, existen numerosos sistemas anfitrión/vector disponibles para la propagación de las secuencias de ácido nucleico deseadas y/o la producción de los sTNFR truncados. Estos incluyen pero no están limitados a vectores plasmídicos, virales y de inserción, y anfitriones procarióticos y eucarióticos. Un experto en la técnica puede adaptar un sistema anfitrión/vector que sea capaz de propagar o expresar ADN heterólogo para producir o expresar las secuencias de la presente invención.
Además, los expertos en la técnica apreciarán que, a la vista de la presente descripción, las secuencias de ácido nucleico novedosas incluyen secuencias de ácido nucleico degeneradas que codifican los sTNFR truncados que tienen las secuencias mostradas en las Figuras, y aquellas secuencias de ácido nucleico que hibridan (preferiblemente en condiciones de hibridación restrictivas) con los complementos de estas secuencias de ácido nucleico (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, páginas 387 a 389). Las condiciones de hibridación restrictivas ilustrativas son hibridación en 4 x SSC a 62-67ºC, seguido de lavado en 0,1 x SSC a 62-67ºC durante aproximadamente una hora. Alternativamente, las condiciones de hibridación restrictivas ilustrativas son hibridación en 45-55% de formamida, 4 x SSC a 40-45ºC. También están incluidas las secuencias de ADN que hibridan con las secuencias de ácido nucleico mostradas en las Figuras 1 y 9 en condiciones de hibridación relajadas y que codifican los sTNFR truncados. Los ejemplos de tales condiciones de hibridación relajadas son 4 x SSC a 45-55ºC o hibridación con 30-40% de formamida a 40-45ºC.
Asimismo la presente invención proporciona constructos de ADN recombinantes que implican un vector de ADN junto con las secuencias de ADN que codifican los sTNFR truncados. En cada uno de tales constructos de ADN, la secuencia de ácido nucleico que codifica el sTNFR truncado (con o sin péptidos señal) está asociado operativamente con una secuencia de control de la expresión o reguladora adecuada capaz de dirigir la replicación y/o la expresión del sTNFR truncado en un anfitrión seleccionado.
Expresión Recombinante Preparación de Polinucleótidos
Las secuencias de ácido nucleico que codifican los sTNFR truncados se pueden obtener fácilmente en una variedad de formas incluyendo, sin limitación, la síntesis química, el escrutinio de genotecas de ADNc o genómicas, el escrutinio de genotecas de expresión y/o la amplificación mediante PCR de ADNc. Estos métodos y otros que son útiles para aislar tales secuencias de ácido nucleico son expuestos por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); por Ausubel et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, (1994); y por Berger y Kimmel, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, (1987).
La síntesis química de las secuencias de ácido nucleico que codifican los sTNFR truncados se puede completar utilizando métodos bien conocidos en la técnica, tales como los mostrados por Engels et al. (1989), Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 y Wells et al. (1985), Gene, 34:315.
Estos métodos incluyen, inter alia, los métodos de síntesis de secuencias de ácido nucleico del fosfotriéster, la fosforamidita y el H-fosfonato. Las secuencias de ácido nucleico grandes, por ejemplo aquellas mayores de aproximadamente 100 nucleótidos de longitud, pueden ser sintetizadas en forma de numerosos fragmentos. Los fragmentos se pueden ligar entre sí para formar secuencias de ácido nucleico que codifican los sTNFR truncados. Un método preferido es la síntesis soportada en polímero utilizando la química de la fosforamidita normalizada.
Alternativamente, se puede obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada escrutando una genoteca de ADNc apropiada (esto es, una genoteca preparada a partir de una o más fuentes de tejido que se cree que expresan la proteína) o una genoteca genómica (una genoteca preparada a partir de ADN genómico total). La fuente de la genoteca de ADNc es típicamente un tejido de cualquier especie que se crea que expresa una proteína deseada en cantidades razonables. La fuente de la genoteca genómica puede ser cualquier tejido o tejidos de cualquier mamífero u otra especie que se crea que codifica un sTNFR truncado.
Los medios de hibridación pueden ser escrutados en cuanto a la presencia de un ADN que codifique un sTNFR truncado utilizando una o más sondas de ácido nucleico (oligonucleótidos, ADNc o fragmentos de ADN genómico que poseen un nivel aceptable de homología con el ADNc o el gen o genes presentes en la genoteca. Las sondas utilizadas típicamente para semejante rastreo codifican una pequeña región de secuencia de ADN de la misma especie o una similar a la especie de la cual se prepara la genoteca. Alternativamente, las sondas pueden ser degeneradas, como se comenta en la presente memoria.
La hibridación se obtiene típicamente recociendo la sonda oligonucleotídica o el ADNc con los clones en condiciones restrictivas que eviten la unión no específica pero permitan la unión de aquellos clones que tienen un nivel significativo de homología con la sonda o cebador. Las condiciones restrictivas de hibridación y lavado típicas dependen en parte del tamaño (esto es, el número de nucleótidos de longitud) del ADNc o de la sonda de oligonucleótidos y de si la sonda es degenerada. La probabilidad de identificar un clon también se toma en consideración al diseñar el medio de hibridación (p. ej., si se está escrutando una genoteca de ADNc o genómica).
Cuando se utiliza un fragmento de ADN (tal como ADNc) como sonda, las condiciones de hibridación típicas incluyen aquellas mostradas por Ausubel et al. (1994), eds., supra. Tras la hibridación, el medio de hibridación se lava con una restricción adecuada dependiendo de numerosos factores tales como el tamaño de la sonda, la homología esperada de la sonda con el clon, el medio de hibridación que se está escrutando, el número de clones que se están escrutando y similares. Los ejemplos de las soluciones de lavado restrictivas, que tienen normalmente poca fuerza iónica y se utilizan a una temperatura relativamente elevada, son las siguientes: uno de tales lavados restrictivos es NaCl 0,015 M, Na Citrato 0,005 M y 0,1% de SDS a 55-65ºC; otro de tales lavados restrictivos es Na_{2}EDTA 1 mM, NaHPO_{4} 40 mM, pH 7,2, y 1% de SDS a aproximadamente 40-50ºC: y otro de tales lavados restrictivos es 0,2 X SSC y 0,1% SDS a aproximadamente 50-65ºC.
También existen protocolos ilustrativos para las condiciones de lavado restrictivas cuando se utilizan sondas de oligonucleótidos para escrutar los medios de hibridación. Por ejemplo, en un primer protocolo se utiliza 6 X SSC con 0,05 por ciento de pirofosfato de sodio a una temperatura entre aproximadamente 35ºC y 63ºC, dependiendo de la longitud de la sonda. Por ejemplo, las sondas de 14 bases se lavan a 35-40ºC, las sondas de 17 bases a 45-50ºC, las sondas de 20 bases a 52-57ºC, y las sondas de 23 bases a 57-63ºC. La temperatura se puede incrementar 2-3ºC cuando el fondo de unión no específica aparece alto. En un segundo protocolo se utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para el lavado. Una de tales soluciones de lavado restrictivas es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y 0,2% SDS.
Otro método adecuado para obtener una secuencia de ácido nucleico adecuada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En este método, se prepara ADNc a partir de ARN poli(A)+ o ARN total utilizando la enzima transcriptasa inversa. Dos cebadores, típicamente complementarios a dos regiones separadas de ADNc (oligonucleótidos) que codifican un sTNFR truncado, se añaden después al ADNc junto con una polimerasa tal como la polimerasa Taq, y la polimerasa amplifica la región de ADNc entre los dos cebadores.
Las secuencias de oligonucleótidos seleccionadas como sondas o cebadores deben tener la longitud adecuada y ser suficientemente inequívocas con el fin de minimizar la cantidad de unión no específica que se puede producir durante el escrutinio o la amplificación mediante PCR. La secuencia real de las sondas o cebadores se basa normalmente en secuencias o regiones conservadas o altamente homólogas. Opcionalmente, las sondas o cebadores pueden ser totalmente o parcialmente degeneradas, esto es, pueden contener una mezcla de sondas/cebadores, codificando todos la misma secuencia de aminoácidos pero utilizando diferentes codones para hacerlo. Una alternativa para preparar sondas degeneradas es colocar una inosina en algunas o en todas las posiciones de codones que varían por especies. Las sondas oligonucleotídicas o los cebadores se pueden preparar mediante métodos de síntesis química para el ADN, como se ha descrito antes.
Como se ha descrito antes, una secuencia variante es una secuencia natural (p. ej., una variación alélica) o sintética que contiene una o más sustituciones, deleciones, y/o inserciones de nucleótidos, en comparación con la secuencia de las Figuras 2, 3, 4, 5, 6 y 7 y que da como resultado la expresión de variaciones de la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje. La preparación de secuencias variantes sintéticas también es bien conocida en la técnica, y la describen, por ejemplo Sambrook et al. (1989), supra y Wells et al. (1985), Gene, 34:315.
Vectores
Los ADN que codifican los sTNFR truncados pueden ser insertados en vectores para la clonación adicional (amplificación del ADN) o para su expresión. Los vectores adecuados están disponibles en el mercado, o se puede construir un vector específicamente. La selección o construcción de un vector apropiado dependerá de (1) si se va a utilizar para la amplificación del ADN o la expresión del ADN, (2) el tamaño del ADN que se va a insertar en el vector, y (3) la célula anfitriona pretendida que se va a transformar con el vector.
Los vectores implican cada uno una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína deseada conectada operativamente a una o más de las siguientes secuencias de control de la expresión o reguladoras capaces de dirigir, controlar o efectuar de otro modo la expresión de una proteína deseada por una célula anfitriona seleccionada. Cada vector contiene diversos componentes, dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y de su compatibilidad con la célula anfitriona pretendida. Los componentes del vector incluyen generalmente pero no están limitados a uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores de selección, promotores, elementos intensificadores, una secuencia de terminación de la transcripción y similares. Estos componentes pueden ser obtenidos a partir de fuentes naturales o pueden ser sintetizados mediante procedimientos conocidos.
Los ejemplos de vectores de clonación procarióticos adecuados incluyen bacteriófagos tales como derivados de lambda, o plásmidos de E. coli (p. ej. pBR322, col E1, pUC, el factor F y los derivados del plásmido Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Otros vectores de expresión apropiados, de los que se conocen numerosos tipos en la técnica para las células anfitrionas descritas más abajo, también se pueden utilizar para este fin.
Secuencia Señal
El ácido nucleico que codifica una secuencia señal puede ser insertado 5' de la secuencia que codifica un sTNFR truncado, p. ej., puede ser un componente de un vector, o puede ser una parte de un ácido nucleico que codifica un sTNFR truncado. El ácido nucleico que codifica las secuencias señal nativas de sTNFR-I y sTNFR-II son conocidas (EP 393 438 y EP 422 339).
Origen de Replicación
Los vectores de expresión y clonación incluyen cada uno generalmente una secuencia de ácido nucleico que permite al vector replicar en una o más células anfitrionas seleccionadas. En un vector de clonación, esta secuencia es típicamente una que permite que el vector replique independientemente del ADN cromosómico del anfitrión, e incluye orígenes de replicación o secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son bien conocidas. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, y diversos orígenes (p. ej., SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no es necesario para los vectores de expresión en mamíferos (por ejemplo, a menudo se utiliza solamente el origen de SV40 porque contiene el promotor temprano).
Gen de Selección
Los vectores de expresión y clonación contienen cada uno típicamente un gen de selección. Este gen codifica una proteína "marcadora" necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células anfitrionas transformadas cuando se desarrollan en un medio de cultivo selectivo. Las células anfitrionas que no están transformadas con el vector no contendrán el gen de selección y, por lo tanto, no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, p. ej., ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxótrofas o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles en el medio de cultivo.
Se pueden utilizar otros genes de selección para amplificar los genes que se van a expresar. La amplificación es el proceso en el que los genes que tienen una mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento están reiteradamente en tándem dentro de los cromosomas de sucesivas generaciones de células recombinantes. Los ejemplos de los marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y la timidina cinasa. Los transformantes celulares se colocan bajo una presión de selección a la que solamente los transformantes que están adaptados de forma única sobreviven en virtud de los marcadores presentes en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación tanto de los genes de selección como del ADN que codifica los sTNFR truncados. Como resultado, se sintetizan cantidades mayores de sTNFR truncados a partir del ADN amplificado.
Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato, un antagonista competitivo de DHFR. Una célula anfitriona apropiada cuando se utiliza DHFR de tipo salvaje es la línea células de ovario de hámster Chino deficiente en actividad DHFR (Urlaub y Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(7): 4216-4220. Las células transformadas se exponen después a niveles más altos de metotrexato. Esto conduce a la síntesis de múltiples copias del gen DHFR y, concomitantemente, múltiples copias de otro ADN presente en el vector de expresión, tal como el ADN que codifica un sTNFR truncado.
Promotor
Los vectores de expresión y clonación contendrán cada uno típicamente un promotor que es reconocido por el organismo anfitrión y está conectado operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un sTNFR truncado. Un promotor es una secuencia no traducida localizada aguas arriba (5') del codón de iniciación de un gen estructural (generalmente en aproximadamente 100 a 1000 pb) que controla la transcripción y la traducción de una secuencia de ácido nucleico concreta, tal como la que codifica un sTNFR truncado. Un promotor puede estar agrupado convencionalmente en una de dos clases, los promotores inducibles y los promotores constitutivos. Un promotor inducible origina un aumento de los niveles de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Son bien conocidos un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células anfitrionas potenciales. Un promotor puede estar conectado operablemente a un ADN que codifica un sTNFR truncado separando el promotor del ADN fuente mediante digestión con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora deseada. La secuencia promotora de sTNFR-I o la secuencia promotora de sTNFR-II nativas se pueden utilizar para la amplificación directa y/o la expresión del ADN que codifica un sTNFR truncado. No obstante, se prefiere un promotor heterólogo si éste permite una mayor transcripción y rendimientos superiores de la proteína expresada en comparación con el promotor nativo y si es compatible con el sistema de la célula anfitriona que se ha seleccionado para su uso. Por ejemplo, se puede utilizar cualquiera de las secuencias promotoras nativas de los miembros de otra familia de NGF/TNF para dirigir la amplificación y/o expresión del ADN que codifica un sTNFR truncado.
Los promotores adecuados para su uso con los anfitriones procarióticos incluyen los sistemas promotores de la beta-lactamasa y la lactosa; el sistema promotor de la fosfatasa alcalina, del triptófano (trp); un sistema del gen de la luminiscencia bacteriana (luxR) y promotores híbridos tales como el promotor tac. También son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos han sido publicadas, permitiendo de ese modo al experto en la técnica ligarlas a las secuencias de ADN deseadas utilizando conectores y adaptadores según sea necesario para suministrar cualquier sitio de restricción requerido.
Las secuencias promotoras adecuadas para su uso con anfitriones de levadura son bien conocidas en la técnica. Los promotores adecuados para su uso con células anfitrionas de mamífero son bien conocidas e incluyen aquellas obtenidas de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, el citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y, muy preferiblemente, el Virus de Simios 40 (SV40). Otros promotores de mamíferos adecuados incluyen promotores de mamíferos heterólogos, p. ej., promotores del choque térmico y el promotor de la actina.
Elemento Intensificador
Los vectores de expresión y clonación contendrán cada uno típicamente una secuencia intensificadora para incrementar la transcripción por eucariotas superiores de una secuencia de ADN que codifica un sTNFR truncado. Los intensificadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para incrementar su transcripción. Los intensificadores son relativamente independientes de la orientación y la posición. Se han encontrado en 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripción. Los intensificadores de levadura se utilizan ventajosamente con promotores de levadura. Se conoce numerosas secuencias intensificadoras asequibles de genes de mamíferos (p. ej., globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Adicionalmente, los intensificadores virales tales como el intensificador de SV40, el intensificador del promotor temprano de citomegalovirus, el intensificador del polioma y los intensificadores de adenovirus son elementos intensificadores ilustrativos para la activación de promotores eucarióticos. Si bien se puede empalmar un intensificador en un vector en una posición 5' o 3' con respecto a un ADN que codifica un sTNFR truncado, típicamente está localizado en un sitio 5' del promotor.
Terminación de la Transcripción
Los vectores de expresión utilizados en las células anfitrionas eucarióticas contendrán cada uno típicamente una secuencia necesaria para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Tales secuencias son asequibles comúnmente de las regiones 5' y ocasionalmente 3' no traducidas de los ADN o ADNc eucarióticos. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos en forma de fragmentos poliadenilados en una porción no traducida del ARNm que codifica un sTNFR truncado.
Construcción del Vector
La construcción de un vector adecuado que contiene uno o más de los componentes enumerados antes (junto con la secuencia codificadora que codifica un sTNFR truncado) se completa mediante técnicas de ligación normalizadas. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN son escindidos, ajustados y religados en el orden deseado para generar el vector requerido. Para confirmar que se ha construido la secuencia correcta, se puede utilizar la mezcla de ligación para transformar E. coli, y los transformantes acertados se pueden seleccionar mediante técnicas conocidas como las descritas antes. Después se preparan cantidades del vector de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasas de restricción y/o se secuencian para confirmar la presencia del constructo deseado.
También se puede utilizar un vector que proporciona la expresión transitoria del ADN que codifica un sTNFR truncado en células de mamífero. En general, la expresión transitoria implica el uso de un vector de expresión que es capaz de replicar eficazmente en una célula anfitriona, de manera que la célula anfitriona acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de la proteína deseada codificada por el vector de expresión. Cada sistema de expresión transitoria, que comprende un vector de expresión adecuado y una célula anfitriona, permite la identificación positiva conveniente de las proteínas codificadas por los ADN clonados, así como el rápido escrutinio de tales proteínas en cuanto a las propiedades biológicas o fisiológicas, esto es, la identificación de un sTNFR truncado biológicamente activo.
Células Anfitrionas
La presente invención también proporciona cualquiera de una variedad de células anfitrionas recombinantes, cada una de las cuales contiene una secuencia de ácido nucleico para su uso en la expresión de una proteína deseada. Las células anfitrionas procarióticas y eucarióticas ilustrativas incluyen células bacterianas, de mamífero, fúngicas, de insecto, de levadura o vegetales.
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Las células anfitrionas procarióticas incluyen pero no están limitadas a eubacterias tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos (p. ej., E. coli (HB101, DH5a, DH10 y MC1061); Bacillos tales como B. subtilis; Pseudomonas sp., tales como P. aeruginosa; Streptomyces sp.; Salmonella typhimurium; o Serratia marcescens. Como realización específica, se puede expresar una proteína deseada en E. coli.
Además de las células anfitrionas procarióticas, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos y levaduras pueden ser anfitriones adecuados para la expresión de sTNFR truncados. Saccharomyces cerevisiae, o levadura panadera común, es el más comúnmente utilizando entre los microorganismos anfitriones eucarióticos inferiores, pero también son bien conocidos otros numerosos géneros, especies y cepas y están disponibles comúnmente.
Un sTNFR truncado puede ser expresado en forma glicosilada por cualquiera de las numerosas células anfitrionas adecuadas derivadas de organismos multicelulares. Tales células anfitrionas son capaces de actividades de procesamiento y glicosilación complejas. En principio, se podría utilizar cualquier cultivo de células eucarióticas superiores, ya implique dicho cultivo células de vertebrados o de invertebrados, incluyendo células de plantas e insectos. Como realización específica, se puede expresar una proteína deseada en células de baculovirus.
Se pueden utilizar células de vertebrados, ya que la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejidos) es un procedimiento bien conocido. Los ejemplos de líneas celulares anfitrionas de mamífero útiles incluyen pero no están limitadas a línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7), línea de riñón embriónico humano (células 293 o células 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión), células de riñón de cría de hámster y células de ovario de hámster Chino. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen pero no están limitadas a HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, y líneas celulares de hámster BHK o HaK. Como realización específica, una proteína deseada puede ser expresada en células COS.
Una célula anfitriona puede ser transfectada y preferiblemente transformada con un ácido nucleico deseado en condiciones apropiadas que permitan la expresión del ácido nucleico. La selección de las células anfitrionas adecuadas y de los métodos de transformación, cultivo, amplificación, escrutinio y producción del producto son bien conocidos en la técnica (Gething y Sambrook (1981), Nature, 293:620-625 o, alternativamente, Kaufman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759, o Patente de los Estados Unidos Núm. 4.419.446). Por ejemplo, para las células de mamífero sin paredes celulares, se puede utilizar el método de precipitación con fosfato de calcio. Asimismo se pueden utilizar la electroporación, la microinyección y otras técnicas conocidas.
También es posible que los sTNFR truncados se puedan producir mediante recombinación homóloga o con métodos de producción recombinantes utilizando elementos de control introducidos en las células que ya contenían ADN que codificaba sTNFR truncados. La recombinación homóloga es una técnica desarrollada originalmente para dirigir genes para inducir o corregir mutaciones en genes transcripcionalmente activos (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. y Mol. Biol., 36:301). La técnica básica fue desarrollada como método para introducir mutaciones específicas en regiones específicas del genoma de mamíferos (Thomas et al. (1986), Cell, 44:419-428; Thomas y Capecchi (1987), Cell, 51:503-512 y Doetschman et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587) o para corregir mutaciones en genes defectuosos (Doetschman et al. (1987), Nature, 330:576-578). Las técnicas ilustrativas se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.272.071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 y WO 94/31560.
Por medio de la recombinación homóloga, la secuencia de ADN que se va a insertar en el genoma puede ser dirigida a una región específica del gen de interés anclándola al ADN de redireccionamiento. El ADN de redireccionamiento es el ADN que es complementario (homólogo) a una región del ADN genómico. Se ponen en contacto pequeñas porciones de ADN de redireccionamiento que son complementarias a una región específica del genoma con la hebra parental durante el procedimiento de replicación del ADN. Una propiedad general del ADN que ha sido insertado en una célula es que híbrida y por lo tanto se recombina con otras porciones del ADN endógeno por medio de regiones homólogas compartidas. Si esta hebra complementaria es anclada a un oligonucleótido que contiene una mutación de una secuencia de ADN diferente, éste también es incorporado a la hebra recién sintetizada como resultado de la recombinación. Como resultado de la función de corrección, es posible que la nueva secuencia de ADN sirva como molde. De este modo, el ADN transferido es incorporado al genoma.
Si se conoce la secuencia de un gen concreto, tal como la secuencia de ácido nucleico de un sTNFR truncado, se puede sintetizar la secuencia de control de la expresión (una porción de ADN que es complementaria a una región seleccionada del gen) o se puede obtener de otro modo, por ejemplo mediante restricción apropiada del ADN nativo en sitios de reconocimiento específicos que se unen a la región de interés. Esta porción sirve como secuencia de redireccionamiento tras la inserción en la célula e hibridará con su región homóloga dentro del genoma. Si se produce esta hibridación durante la replicación del ADN, esta porción de ADN, y cualquier secuencia adicional anclada a esta, actuará como fragmento de Okazaki y será pespunteada en la hebra hija de ADN recién sintetizada.
Ancladas a estas porciones de ADN de redireccionamiento están las regiones de ADN que pueden interaccionar con la expresión de un sTNFR truncado. Por ejemplo, se inserta un elemento promotor/intensificador, un supresor o un elemento modulador de la transcripción exógeno en el genoma de la célula anfitriona pretendida con una proximidad y orientación suficientes para influir en la transcripción del ADN que codifica el sTNFR truncado deseado. El elemento de control no codifica el sTNFR truncado, pero en lugar de eso controla una porción del ADN presente en el genoma de la célula anfitriona. De este modo, se puede lograr la expresión de un sTNFR truncado no mediante la transfección de un ADN que codifica un sTNFR truncado, sino mediante el uso de un ADN de redireccionamiento (que contiene regiones de homología con el gen endógeno de interés) acoplado con segmentos reguladores del ADN que proporcionan la secuencia endógena con señales reconocibles para la transcripción de un sTNFR truncado.
Cultivo de Células Anfitrionas
El método para cultivar cada una de las una o más células anfitrionas recombinantes para la producción de una proteína deseada variará dependiendo de muchos factores y consideraciones; el procedimiento de producción óptimo para una situación dada será evidente para los expertos en la técnica por medio de la experimentación mínima. Tales células anfitrionas recombinantes se cultivan en medio adecuado y el sTNFR truncado expresado se recupera después opcionalmente, se aísla y se purifica del medio de cultivo (o de la célula, si es expresado intracelularmente) mediante métodos apropiados conocidos por los expertos en la técnica.
Específicamente, cada una de las células recombinantes utilizadas para producir un sTNFR truncado deseado puede ser cultivada en medios adecuados para inducir promotores, seleccionar células anfitrionas adecuadas recombinantes o amplificar el gen que codifica el sTNFR truncado deseado. Los medios pueden tener un suplemento según sea necesario de hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleósidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como gentamicina), elementos vestigiales (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar), y glucosa u otra fuente de energía. También se pueden incluir otros suplementos, a concentraciones apropiadas, como apreciarán los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo adecuadas, tales como la temperatura, el pH y similares, también son bien conocidas por los expertos en la técnica para su uso con las células anfitrionas seleccionadas.
El producto de expresión resultante puede ser purificado después casi hasta la homogeneidad utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Los mecanismos de purificación ilustrativos se ilustran en EP 393.438 y EP 422.339.
Composiciones Farmacéuticas
Cada una de las composiciones farmacéuticas incluirán generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de sTNFR truncados y derivados químicamente modificados de los sTNFR truncados (en conjunto, "productos de sTNFR truncados") mezclados con un vehículo. El vehículo incluye preferiblemente uno o más materiales de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables mezclados con los productos de sTNFR truncados y material de liberación controlada.
El disolvente primario en un vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH preferiblemente entre 5-6,5, y más preferiblemente entre 5,5-6,0 (p. ej., tampones tales como citratos, fosfatos y aminoácidos tales como glicina); agentes para conferir volumen a la formulación liofilizada (p. ej., manitol y glicina); osmolaridad (p. ej., manitol y cloruro de sodio); tensioactivos (p. ej., Polisorbate 20, Polisorbate 80, Triton, y Pluronics); viscosidad; claridad; color; esterilidad; estabilidad (p. ej., sacarosa y sorbitol); antioxidantes (p. ej., sulfito de sodio e hidrogenosulfito de sodio); conservantes (p. ej., ácido benzoico y ácido salicílico); olor de la formulación; agentes aromatizantes y diluyentes; velocidad de disolución (p. ej., solubilizadores o agentes solubilizantes tales como alcoholes, polietilenglicoles y cloruro de sodio); velocidad de liberación; agentes emulsionantes; agentes suspensores; disolventes; cargas; vehículos de liberación; diluyentes; excipientes y/o coadyuvantes farmacéuticos. También se pueden prever otras formas de administración eficaces tales como formulaciones de liberación lenta parenteral, neblinas para inhalación, formulaciones oralmente activas, o supositorios. La composición también puede implicar preparaciones particuladas de compuestos poliméricos tales como polímeros de erosión en masa (p. ej., copolímeros de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), combinaciones poliméricas de PLGA, copolímeros de bloques de PEG, y ácido láctico y glicólico, poli(cianoacrilatos)); polímeros de erosión superficial (p. ej., poli(anhídridos) y poli(ortoésteres)); ésteres de hidrogeles (p. ej., polioles Pluronic, poli(alcohol vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-éter alquilvinílico, celulosa, derivados de ácido hialurónico, alginato, colágeno, gelatina, albúmina, y almidones y dextranos) y sistemas de composición de los mismos; o preparaciones de liposomas o microesferas. Tales composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo, y la velocidad de aclaramiento in vivo de las proteínas y los derivados de la presente invención. La formulación farmacéutica óptima para una proteína deseada será determinada por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseadas. Las composiciones farmacéuticas ilustrativas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; Leone-Bay, et al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haas, et al. (1995), Clinical Immunology y Immunopathology, 76(1):93; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 y WO 94/21235.
Las composiciones de liberación sostenida específicas son asequibles de los siguientes proveedores: Depotech (Depofoam®, un liposoma multivesicular); Alkermes (ProLease®, una microesfera de PLGA). Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el hialuronano incluya hialuronano, ácido hialurónico, sales de los mismos (tal como hialuronato de sodio), ésteres, éteres, derivados enzimáticos y geles entrecruzados de ácido hialurónico, y derivados químicamente modificados de ácido hialurónico (tales como Hylan). Las formas ilustrativas de hialuronano se describen en Peyron y Balazs (1974), Path. Biol., 22(8):731-736; Isdale et al. (1991), J. Drug Dev., 4(2):93-99; Larsen et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129-1134; Namiki, et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11):501-507; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Release, 35:67-72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis y Cartilage, 4:99-110; Sakakibara et al. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299:282-292; Meyers y Brandt (1995), 22(9):1732-1739; Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand, 66(266):116-120; Cascone et al. (1995), Biomaterials, 16(7):569-574; Yerashalmi et al. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2):267-273; Bernatchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5):677-681; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(11):38-43; Gombotz y Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.582.865, 4.605.691, 4.636.524, 4.713.448, 4.716.154, 4.716.224, 4.772.419, 4.851.521, 4.957.774, 9.863.907, 5.128.326, 5.202.431, 5.336.767, 5.356.883; Solicitudes de Patente Europeas Núms. 0.507.604 A2 y 0.718.312 A2; y WO 96/05845. Las composiciones de hialuronano específicas son asequibles de los siguientes proveedores: BioMatrix , Inc. Ridgefield, NJ (Synvisc®, una mezcla 90:10 de fluido de Hylan y gel de Hylan); Fidia S.p.A., Abano Terme, Italia (Hyalgan®, la sal de sodio de un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo (PM \sim500.000 a \sim700.000); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan (Artz®, una solución al 1% de ácido hialurónico derivado de cresta de gallo, PM \sim700.000); Pharmacia AB, Stockholm, Sweden (Healon®, un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo, PM \sim4 x 10^{4}); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgieoat®, un ácido hialurónico recombinante); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Hyaluronic Acid FCH, un ácido hialurónico de elevado peso molecular (p. ej., PM \sim1,5-2,2 x 10^{6}) preparado a partir de cultivos de Streptococcus zooepidemicus; Hialuronato de Sodio MV, PM \sim1,0-1,6 x 10^{6} y Hialuronato de Sodio LV, PM \sim1,5-2,2 x 10^{6}); Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Switzerland (Acido hialurónico, sal de sodio (1997 número de catálogo de la compañía 385908) preparado a partir de Streptococcus sp.); Intergen Company, Purchase, NY (un ácido hialurónico derivado de cresta de gallo, PM >1 x 10^{6}); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ and Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japón.
Una vez que la composición farmacéutica ha sido formulada, se puede almacenar en viales estériles en forma de solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden ser almacenadas o bien en una forma lista para el uso o bien en una forma que requiera reconstitución (p. ej., liofilizada) antes de la administración.
En una realización específica, la presente invención está dirigida a kits para producir una unidad de administración de dosis única. Cada uno de los kits puede contener un primer recipiente que tiene una proteína seca y un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. Los kits incluidos en el alcance de esta invención son jeringas pre-cargadas de una o múltiples cámaras; las jeringas pre-cargadas ilustrativas (p. ej., jeringas para líquido, y liojeringas tales como Lyo-Ject®, una liojeringa pre-cargada de cámara dual) son asequibles de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.
Usos
Los productos de sTNFR truncados pueden ser útiles como reactivos de investigación y como agentes terapéuticos y de diagnóstico. De este modo los sTNFR truncados pueden ser utilizados en análisis de diagnóstico in vitro y/o in vivo para cuantificar la cantidad de sTNFR-I o sTNFR-II nativo en una muestra de tejido u órgano o para determinar y/o aislar células que expresan el TNF (Scallon et al. (1995), supra). En los análisis de tejidos u órganos habrá menos radiactividad de sTNFR-I^{125} truncados que se unen a TNF, en comparación con una curva de unión normalizada de sTNFR-I^{125} truncados, debido al sTNFR-I o sTNFR-II nativo no marcado que se une a TNF. De un modo similar, el uso de sTNFR-I^{125} truncados se puede utilizar para detectar la presencia de TNF en diversos tipos de células.
Esta invención también contempla el uso de productos de sTNFR truncados en la generación de anticuerpos y los anticuerpos resultantes (incluyendo específicamente aquellos que también se unen a sTNFR-I nativo). Se pueden desarrollar anticuerpos que se unen a sTNFR truncados, tales como epítopos de la secuencia de aminoácidos R_{1}-[Cys^{19}-CYS^{103}]-R_{2}. Un experto normal en la técnica puede utilizar procedimientos publicados bien conocidos para obtener anticuerpos monoclonales y policlonales, o anticuerpos recombinantes, que reconocen y se unen específicamente a las diversas proteínas codificadas por la secuencia de aminoácidos de la presente invención. Tales anticuerpos se pueden utilizar después para purificar y caracterizar el inhibidor de TNF de 30 kDa maduro, completo.
La presente invención también hace referencia al uso de sTNFR truncados para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de ciertas enfermedades y afecciones médicas (muchas de las cuales pueden ser caracterizadas como enfermedades inflamatorias) que están mediadas por el TNF. Se considera que una enfermedad o afección médica es una "enfermedad mediada por TNF" si la enfermedad espontánea o experimental está asociada con niveles elevados de TNF en los fluidos corporales o en tejidos adyacentes al foco de la enfermedad o indicación en el organismo. Las enfermedades asociadas con TNF también pueden ser reconocidas por las siguientes dos condiciones: (1) los descrubrimientos patológicos asociados con una enfermedad pueden ser emulados experimentalmente en animales mediante la administración de TNF y (2) la patología inducida en modelos animales experimentales de la enfermedad puede ser inhibida o abolida mediante tratamiento con agentes que inhiben la acción del TNF. Muchas enfermedades mediadas por TNF cumplen dos de estas tres condiciones, y otras cumplirán las tres condiciones. Una lista no exclusiva de enfermedades mediadas por TNF, así como de las secuelas y los síntomas asociados con ellas, que pueden ser tratadas según los métodos de la presente invención son el síndrome de fatiga respiratoria en adultos; la caquexia/anorexia; el cáncer (p. ej., leucemias); el síndrome de fatiga crónica; el rechazo injerto versus anfitrión; la hiperalgesia; la enfermedad inflamatoria del intestino; las enfermedades neuroinflamatoria; la lesión por isquemia-reperfusión, incluyendo la isquemia cerebral (lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneración); la diabetes (p. ej., diabetes melitus de Tipo 1 de inicio juvenil); esclerosis múltiple; enfermedades oculares; dolor; pancreatitis; fibrosis pulmonar; enfermedades reumáticas (p. ej., artritis reumatoide, osteoartritis, artritis (reumatoide) juvenil, poliartritis seronegativa, espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, artritis psoriásica, artritis enteropática, polimiositis, dermatomiositis, esclerodermia, esclerosis generalizada, vasculitis, vasculitis cerebral, síndrome de Sjögren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y arteritis de células gigantes); choque séptico; efectos secundarios de la terapia con radiación; lupus eritematoso generalizado; enfermedad de la articulación mandibular temporal; tiroiditis y transplante de tejidos.
Los productos de sTNFR truncados pueden ser administrados cada uno a un paciente en cantidades terapéuticamente eficaces para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, como se ha definido antes, incluyendo por ejemplo enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos). Se pretende que el término "paciente" abarque animales (p. ej., gatos, perros y caballos) así como seres humanos.
Un producto de sTNFR truncado puede ser administrado vía administración tópica, entérica o parenteral incluyendo, sin limitación la inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intraventricular e intrasternal injection. Un producto de sTNFR truncado también puede ser administrado vía administración oral o puede ser administrado a través de membranas mucosas, esto es, intranasalmente, sublingualmente, bucalmente o rectalmente para la liberación generalizada.
Se prefiere que los productos de sTNFR truncados sean administrados vía inyección intra-articular, subcutánea, intramuscular o intravenosa. Adicionalmente, el producto de sTNFR truncado puede ser administrado mediante infusión continua (p. ej., dispositivos moduladores del flujo de infusión implantados o externos constantes o intermitentes) con el fin de proporcionar continuamente el nivel deseado de producto de sTNFR truncado en la sangre durante la duración de la administración. Esto se logra preferiblemente por medio de la infusión continua vía, por ejemplo, minibombas tales como las minibombas osmóticas. De esta manera, se puede asegurar que la cantidad de fármaco se mantiene al nivel deseado y se pueden tomar muestras de sangre y controlar la cantidad de fármaco de la corriente sanguínea. Diversas bombas están disponibles en el mercado, de proveedores tales como MiniMed Inc, Sylmar, CA (p. ej., MT507) y Alza Corp., Palo Alto, CA (p. ej., bomba osmótica, modelo 2MLI).
Asimismo se contempla que se puedan poner en práctica otros modos de dosificación continua o casi continua. Por ejemplo, la transformación química puede dar como resultado formas de liberación sostenida que tienen el efecto de una presencia continua en la corriente sanguínea, en cantidades predecibles basándose en un régimen de dosificación determinado.
Los modos de utilización de los productos de sTNFR truncados para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, incluyendo afecciones inflamatorias de una articulación (p. ej., osteoartritis, artritis psoriásica y artritis reumatoide), se muestran en la Solicitud de Patente Europea 5675661. A modo de ejemplo pero no de limitación, en una realización específica se pueden administrar productos de sTNFR truncados intraarticularmente para el tratamiento de la artritis reumatoide y la osteoartritis. A modo de ejemplo pero no de limitación, en otra realización específica se pueden administrar productos de sTNFR truncados subcutáneamente o intramuscularmente para el tratamiento de la artritis reumatoide, la enfermedad inflamatoria del intestino, la caquexia/anorexia o la esclerosis múltiple. A modo de ejemplo pero no de limitación, en una realización específica adicional se pueden administrar productos de sTNFR truncados intravenosamente para el tratamiento de la lesión cerebral como resultado de un trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía; o se pueden administrar intra-ventricularmente para el tratamiento de la lesión cerebral como resultado de un trauma. Un modo preferido para el tratamiento de la artritis incluye: (1) una única inyección intra-articular de un producto de sTNFR truncado administrada periódicamente según sea necesario para evitar o remediar el brote de artritis y (2) inyecciones subcutáneas periódicas de un producto de sTNFR truncado. El inicio del tratamiento para el choque séptico debe ser tan pronto como sea posible después del diagnóstico de la septicemia o la ocasión de septicemia. Por ejemplo, el tratamiento debe ser iniciado inmediatamente después de la cirugía o accidente o cualquier otro evento que pueda acarrear el riesgo de iniciar un choque séptico. Los modos preferidos para el tratamiento del síndrome de fatiga respiratoria en adultos incluyen: (1) administraciones intratraqueales únicas o múltiples de un producto de sTNFR truncado y (2) bolo o infusión intravenosa continua de un producto de sTNFR truncado.
En otra realización, también se contempla la terapia celular, p. ej., la implantación de células productoras de sTNFR truncados. Esta realización de la presente invención pueden incluir la implantación en paciente de células que son capaces de sintetizar y secretar una forma biológicamente activa de un sTNFR truncado. Tales células que producen un sTNFR truncado pueden ser células que normalmente no producen un sTNFR truncado pero que han sido modificadas para producir un sTNFR truncado, o que pueden ser células cuya capacidad para producir un sTNFR truncado ha aumentado por transformación con un polinucleótido adecuado para la expresión y secreción de un sTNFR truncado. Con el fin de minimizar una reacción inmunológica potencial en pacientes mediante la administración de un sTNFR truncado de una especie foránea, se prefiere que las células sean de la misma especie que el paciente (p. ej., humana) o que las células sean encapsuladas con material que proporcione una barrera contra el reconocimiento inmunitario, o que las células sean situadas en una localización anatómica inmunológicamente privilegiada, tal como el testículo, el ojo o el sistema nervioso central.
Se pueden implantar células animales humanas o no humanas en compartimentos poliméricos o membranas biocompatibles, semipermeables para permitir la liberación de un sTNFR truncado, pero para evitar la destrucción de las células por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales del tejido circundante. Alternativamente, las propias células del paciente, transformadas ex vivo para producir un sTNFR truncado, pueden ser implantadas directamente en el paciente sin semejante encapsulación. La metodología para la encapsulación en membranas de células vivas es familiar para los expertos normales en la técnica, y se pueden lograr la preparación de las células encapsuladas y su implantación en pacientes.
En otra realización más, también se prevé la terapia génica in vivo, donde una secuencia de ácido nucleico que codifica un sTNFR truncado puede ser introducida directamente en un paciente. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica un sTNFR truncado puede ser introducida en células diana vía inyección local de un constructo de ácido nucleico, con o sin un vector de liberación apropiado, tal como un vector de virus adeno-asociado. Los vectores virales alternativos incluyen pero no están limitados a vectores de retrovirus, adenovirus, virus herpes simplex y virus papiloma. La transferencia física se puede lograr in vivo mediante inyección local del constructo de ácido nucleico deseado u otro vector de liberación apropiado que contiene la secuencia de ácido nucleico deseada, transferencia mediada por liposomas, inyección directa (ADN desnudo), transferencia mediada por receptores (complejo ligando-ADN) o bombardeo con micropartículas (pistola génica).
Las técnicas de terapia celular y génica ilustrativas se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.892.538; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.011.472; Patente de los Estados Unidos Núm. 5.106.627; DE 4219626, WO 94/20517 y 96/22793.
Con independencia de la manera de administración, el tratamiento de una enfermedad mediada por TNF requiere una dosis o un régimen de dosificación total de un sTNFR truncado eficaz para reducir o aliviar los síntomas de la enfermedad. Otros factores para la determinación de la dosificación apropiada pueden incluir la enfermedad o afección que se vaya a tratar o prevenir, la gravedad de las enfermedad, la ruta de administración, y la edad, el sexo y la condición médica del paciente. El perfeccionamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento es realizado rutinariamente por los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la información sobre la dosificación y los análisis descritos en la presente memoria. La dosificación también se puede determinar por medio del uso de análisis conocidos para determinar las dosificaciones utilizadas junto con los datos de dosis-respuesta apropiados. La dosis específica se calcula según el peso corporal aproximado o el área de superficie corporal del paciente.
La frecuencia de dosificación depende de los parámetros farmacocinéticos del sTNFR truncado de la formulación utilizada. El sTNFR truncado puede ser administrado una vez, o en casos de alteraciones graves y prologadas, administrado diariamente a dosis menos frecuentes o administrado con una dosis de bolo inicial seguida de una dosis continua o una liberación sostenida. Cuando se administra parenteralmente, las dosis unitarias parenterales, por ejemplo, pueden ser de hasta 10 mg, generalmente hasta 15 mg y más generalmente hasta 20 mg. Cuando se administra en una cavidad articular, la composición farmacéutica se administra preferiblemente en forma de una única inyección, por ejemplo, con una jeringa de 3 a 10 ml conteniendo, por ejemplo, una dosis entre aproximadamente 5 mg/ml y 10 mg/ml de sTNFR truncado disuelto en solución salina tamponada con fosfato isotónico. La preparación puede ser administrada en la cavidad articular a una frecuencia, por ejemplo, de una vez cada 7 a 10 días. De esta manera, la administración se realiza continuamente, por ejemplo, 4 a 5 veces mientras se varía la dosis si fuera necesario.
En algunos casos, los productos de sTNFR truncados pueden ser administrados como un accesorio de otra terapia y también con otras formulaciones farmacéuticas adecuadas para la indicación que esté siendo tratada. El producto de sTNFR truncado y uno o más cualquiera de los fármacos anti-inflamatorios tradicionales o nuevos se pueden administrar por separado o combinados.
Los productos de sTNFR truncados (p. ej., las proteínas R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) y uno o más cualesquiera de los fármacos anti-inflamatorios adicionales pueden ser administrados por separado o combinados. Se puede encontrar información referente a los siguientes compuestos en The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Decimosexta Edition, Merck, Sharp & Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) y en Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
El presente tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda tal como en las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoríasica, artritis reumatoide y artritis inducida por estafilococos ("séptica")) incluye fármacos de primera línea para el control del dolor y la inflamación clasificados como fármacos anti-inflamatorios, no esteroideos (AINE). Los tratamientos secundarios incluyen corticoesteroides, fármacos anti-reumáticos de acción lenta (ARAL) o fármacos modificadores de la enfermedad (ME).
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado con uno o más cualquiera de los AINE para el tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica tal como en las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoríasica, artritis reumatoide y artritis inducida por estafilococos ("séptica")); la enfermedad de rechazo injerto versus anfitrión. Los AINE deben su acción anti-inflamatoria, al menos en parte, a la inhibición de la síntesis de prostaglandinas (Goodman y Gilman en "The Pharmacological Basis of Therapeutics," MacMillan, 7ª Edicion (1985)). Los AINE se pueden caracterizar en nueve grupos: (1) derivados de ácido salicílico; (2) derivados de ácido propiónico; (3) derivados de ácido acético; (4) derivados de ácido fenámico; (5) derivados de ácido carboxílico; (6) derivados de ácido butírico; (7) oxicams; (8) pirazoles y (9) pirazolonas.
En una realización específica, la presente invención está dirigida al uso de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) que puede ser utilizado combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los derivados de ácido salicílico, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Tales derivados de ácido salicílico, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acetaminosalol, aloxiprina, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de sodio, trisalicilato de colina y magnesio diflusinal, etersalato, fendosal, ácido gentísico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, ácido O-acético de salicilamida, salsalato y sulfasalazina. También se pretende que los derivados de ácido salicílico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) puede ser utilizado combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los derivados de ácido propiónico, ésteres pro-fármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido propiónico, ésteres pro-fármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: aminoprofeno, benoxaprofeno, ácido buclóxico, carprofeno, dexindoprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, furcloprofeno, ibuprofeno, ibuprofeno aluminio, ibuproxam, indoprofeno, isoprofeno, cetoprofeno, loxoprofeno, miroprofeno, naproxeno, oxaprozin, piquetoprofeno, pimeprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, ácido protizínico, piridoxiprofeno, suprofeno, ácido tiaprofénico y tioxaprofeno. También se pretende que los derivados de ácido propiónico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los derivados de ácido acético, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido acético, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: acemetacina, alclofenaco, amfenaco, bufexamac, cinmetacina, clopirac, delmetacina, diclofenaco sódico, etodolac, felbinac, fenclofenaco, fenclorac, ácido fenclózico, fentiazac, furofenaco, glucametacina, ibufenaco, indometacina, isofezolac, isoxepac, lonazolac, ácido metiazínico, oxametacina, oxpinac, pimetacina, proglumetacina, sulindac, talmetacina, tiaramida, tiopinac, tolmetin, zidometacina y zomepirac. También se pretende que los derivados de ácido acético estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los derivados de ácido fenámico, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido fenámico, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: ácido enfenámico, etofenamato, ácido flufenámico, isonixina, ácido meclofenámico, meclofenamato sódico, ácido medofenámico, ácido mefánamico, ácido niflúmico, talniflumato, terofenamato, ácido tolfenámico y ufenamato. También se pretende que los derivados de ácido fenámico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{203}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los derivados de ácido carboxílico, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido carboxílico, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden utilizar comprenden: clidanaco, diflunisal, flufenisal, inoridina, cetorolac y tinoridina. También se pretende que los derivados de ácido carboxílico relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los derivados de ácido butírico, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de ácido butírico, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizon, butibufeno, fenbufeno y xenbucina. También se pretende que los derivados de ácido butírico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los oxicams, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los oxicams, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicam, enolicam, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam y 4-hidroxil-1,2-benzotiazina 1,1-dioxido 4-(N-fenil)carboxamida. También se pretende que los oxicams relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquier de los pirazoles, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los pirazoles, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden utilizar comprenden: difenamizol y epirizol. También se pretende que los pirazoles relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de las pirazolonas, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las pirazolonas, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que se pueden utilizar comprenden: apazona, azapropazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propilfenazona, ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona. También se pretende que las pirazolonas relacionadas estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares están abarcadas por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los siguientes AINE: ácido \varepsilon-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, ácido 3-amino-4-hidroxibutírico, amixetrina, anitrazafeno, antrafenina, bendazaco, bendazaco lisinato, benzidamina, beprozina, broperamol, bucoloma, bufezolaco, ciprocuazona, cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidina, difenpiramida, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, fanetizol mesilato, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixina, fluprocuazona, fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guaiazoleno, isonixirn, lefetamina HCl, leflunomida, lofemizol, lotifazol, lisina clonixinato, meseclazona, nabumetona, nictindol, nimesulida, orgoteina, orpanoxina, oxaceprolm, oxapadol, paranilina, perisoxal, perisoxal citrato, pifoxima, piproxeno, pirazolac, pirfenidona, procuazone, proxazol, tielavin B, tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamid y aquellos designados por el número de código de la compañía tal como 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (ácido 4-benzoil-1-indanocarboxílico), TVX2706, U60257, UR2301 y WY41770. También se pretende que los AINE estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares a las de los AINE anteriores están abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-CyS^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los corticoesteroides, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica tal como las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos); y esclerosis múltiple. Los corticoesteroides, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen hidrocosticoesterona y compuestos que derivan de la hidrocortisona, tales como 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, betametasona valerato, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, clobetasol propionato, clobetasona, clobetasona butirato, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacon, desonida, desoximerasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, flunisolida, acetónido de flucinolona, fluocinonida, acetónido de fluorocinolona, fluocortin butilo, fluocortolona, hexanoato de fluorocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, 21-succinato sódico de hidrocortisona, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednicolona, mometasona furoato, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato sódico de prednisolona, succinato sódico de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato sódico de prednisolona, 21-etearoglicolatosódico de prednisolona, tebutato de prednisolona, 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, prednilideno 21-dietilaminoacetato, tixocortol, triamcinolona, triamcinolona acetonida, triamcinolona benetonida y triamcinolona hexacetonida. También se pretende que los corticosteroides relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los fármacos anti-reumáticos de acción lenta (ARAL) o fármacos anti-reumáticos modificadores de la enfermedad (ARME), ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica tal como las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos); y esclerosis múltiple. ARAL o ARME, ésteres profármaco y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos comprende: alocupreido sódico, auranofin, aurotioglucosa, aurotioglicanida, azatioprina, brequinar sódico, bucilamina, 3-aurotio-2-propanol-1-sulfonato cálcico, clorambucil, cloroquina, clobuzarit, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosporinaa, dapsona, 15-deoxispergualina, diacereina, glucosamina, sales de oro (p. ej., sal de oro de cicloquina, tiomalato de sodio y oro, tiosulfato de sodio y oro), hidroxicloroquina, hidroxiurea, cebuzona, levamisol, lobenzarit, melitina, 6-mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, micofenolato mofetil, mioral, mostaza nitrogenada, D-penicilamina, piridinol imidazoles tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoyetina y vincristina. También se pretende que los ARAL o ARME relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcadas por este grupo.
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En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o mas cualquiera de los inhibidores de COX2, sus ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica. Los ejemplos de los inhibidores de COX2, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, celecoxib. También se pretende que los inhibidores de COX2 relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares están abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los antimicrobianos, ésteres profármaco o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica. Los antimicrobianos incluyen, por ejemplo, ampicilina, amoxicilina, aureomicina, bacitracina, ceftazidima, ceftriaxona, cefotaxima, cefaclor, cefalexin, cefradina, ciprofloxacina, ácido clavulánico, cloxacilina, dicloxacilan, eritromicina, flucloxacilan, gentamicina, gramicidina, meticilan, neomicina, oxacilan, penicilina y vancomicina. También se pretende que los antimicrobianos relacionados estructuralmente que tienen propiedades analgésicas y anti-inflamatorias similares estén abarcados por este grupo.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-(Cys^{19}-Cys^{103})-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los siguientes compuestos para el tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica: factor estimulador de las colonias de granulocitos; talidomida; BN 50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401; péptido T; MDL 201,449A; Hidrocloruro de (1R,3S)-cis-1-[9-(2,6-diaminopurinil)]-3-hidroxi-4-ciclopenteno; (1R,3R)-trans-1-[9-(2,6-diamino)purino]-3-acetoxiciclopentano; hidrocloruro de (1R,3R)-trans-1-(9-adenil)-3-azidociclopentano y (1R,3R)-trans-1-(6-hidroxi-purin-9-il)-3-azidociclopentano.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más inhibidores de TNF adicionales para el tratamiento de las enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica. Los inhibidores de TNF incluyen compuestos y proteínas que bloquean la síntesis in vivo o la liberación extracelular del TNF, incluyendo los siguientes compuestos.
Los inhibidores de TNF adicionales incluyen anticuerpos anti-TNF (p. ej., el anticuerpo MAK 195F Fab (Holler et al. (1993), 1^{er} Simposio Internacional sobre Citocinas en el Transplante de Médula Osea, 147; el anticuerpo monoclonal anti-TNF CDP 571 (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342); el anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral murino BAY X 1351 (Kieft et al. (1995), 7º Congreso Europeo de Microbiología Clínica y Enfermeddes Infecciosas, 9, cuya descripción se incorpora en la presente como referencia); el anticuerpo monoclonal anti-TNF CenTNF cA2 (Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1125-1127 y Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1105-1110).
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103})-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con el antígeno Fas humano recombinante soluble o versiones recombinantes del mismo (WO 96/20206 y Mountz et al., J. Immunology, 155:4829-4837; y EP 510 691). En WO 96/20206 se describen el antígeno Fas humano secretado (nativo y recombinante, incluyendo una proteína de fusión de Ig), los métodos para aislar los genes responsables de la codificación del antígeno Fas humano recombinante soluble, los métodos para clonar el gen en vectores y tipos de células adecuados, y los métodos para expresar el gen para producir los inhibidores. En EP 510 691 se ilustran los ADN que codifican el antígeno Fas soluble, los vectores que expresan dichos ADN y los transformantes transfectados con el vector. Cuando se administra parenteralmente, las dosis de una proteína de fusión de antígeno Fas son generalmente de 1 microgramo/kg a 100 microgramos/kg, cada una.
En una realización específica, se puede utilizar un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más cualquiera de los inhibidores de interleucina-1 para el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF, definidas antes, incluyendo la inflamación aguda y crónica tal como las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos); lesión cerebral como resultado de un trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía; y esclerosis múltiple. Las clases de inhibidores de interleucina-1 incluyen los antagonistas del receptor de interleucina-1 (cualquier compuesto capaz de evitar específicamente la activación de los receptores celulares para IL-1) tales como IL-1ra, como se describe más abajo; los anticuerpos monoclonales anti-receptor de IL-1 (p. ej., EP 623674); las proteínas de unión a IL-1 tales como los receptores de IL-1 solubles (p. ej., U.S.P. 5.492.888, U.S.P. 5.488.032, U.S.P. 5.464.937, U.S.P. 5.319.071 y U.S.P. 5.180.812,); anticuerpos monoclonales anti-IL-1 (p. ej., WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S.P. 4935343, EP 364778, EP 267611 y EP 220063); proteínas accesorias del receptor de IL-1, p. ej., WO 96/23067 y otros compuestos y proteína que bloquean la síntesis o la liberación extracelular in vivo IL-1.
El antagonista del receptor de interleucina-1 (IL-1ra) es una proteína humana que actúa como inhibidor natural de la interleucina-1. Los antagonistas del receptor preferidos, así como los métodos de elaboración y los métodos de uso de los mismos, se describen en la Patente de los Estados Unidos 5.075.222 (referida en la presente memoria como patente 222); WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO93/21946; Solicitud Internacional PCT Núm. US97/02131, que ilustra una composición farmacéutica que comprende (a) una cantidad eficaz de un polímero de liberación controlada (p. ej., ácido hialurónico) y (b) una cantidad eficaz de un IL-1ra; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; y WO 96/22793. Las proteínas incluyen los antagonistas del receptor de IL-1 glicosilados así como los no glicosilados.
Específicamente, se revelan y describen tres formas preferidas de IL-lra (IL-1ra\alpha, IL-1ra\beta y IL-lrax), estando derivada cada una de la misma secuencia codificadora de ADN, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.075.222 de Hannum et al., titulada "Interleukin-1 Inhibitors." Estos tres inhibidores de interleucina-1 poseen actividades funcionales e inmunológicas similares. Los métodos para producir los inhibidores de IL-1, concretamente IL-lras, también se describen en la patente 222. Un método descrito implica el aislamiento de los inhibidores de los monocitos humanos (donde son producidos naturalmente). Un segundo método descrito implica el aislamiento del gen responsable de la codificación de IL-1ras, la clonación del gen en vectores y tipos celulares adecuados, la expresión del gen para producir el IL-lras y la cosecha del IL-lras. El último método, que es ilustrativo de los métodos de ADN recombinante en general, es el método preferido. En una realización específica, un IL-1ra contiene un grupo metionilo N-terminal como consecuencia de la expresión en E. coli. Se pueden utilizar IL-lras modificados. Los IL-lras modificados incluyen, por ejemplo, muteínas de tales inhibidores en las que un resto cisteína es sustituido por un aminoácido en uno o más sitios de la secuencia de aminoácidos de un inhibidor de origen natural. Tales muteínas se pueden hacer reaccionar de una manera selectiva del sitio con unidades de polietilenglicol (PEG) funcionalizadas u otros poliéteres que contienen sulfhidrilo para crear especies de PEG IL-lra. En la Publicación PCT Núm. WO 92/16221 se describen numerosas especies de IL-1ra modificadas y los métodos para elaborar tales inhibidores modificados de PEG.
Una clase adicional de inhibidores de interleucina-1 incluye los compuestos capaces de evitar específicamente la activación de receptores celulares de IL-1. Tales compuestos incluyen proteínas de unión a IL-1, tales como receptores solubles y anticuerpos monoclonales. Tales compuestos también incluyen anticuerpos monoclonales para los receptores.
Una clase adicional de inhibidores de interleucina-1 incluye compuestos y proteínas que bloquean la síntesis y/o la liberación extracelular in vivo de IL-1. Tales compuestos incluyen agentes que afectan a la transcripción de los genes de IL-1 y al procesamiento de las preproteínas de IL-1.
Lo anterior sirve como ejemplo y no excluye otros tratamientos que se pueden utilizar simultáneamente con estos compuestos anti-inflamatorios que son conocidos por los expertos en la técnica o a los que podrían llegar los expertos en la técnica utilizando las pautas mostradas en esta memoria.
Es especialmente ventajoso formular las composiciones de los compuestos anti-inflamatorios adicionales en una forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Según se utiliza en la presente memoria "forma unitaria de dosificación" hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuestos anti-inflamatorios adicionales calculada para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. Según se utiliza en la presente memoria, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y para retardar la absorción y similares que son compatibles con el ingrediente activo y con el modo de administración y otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor. El uso de tales medios y agentes es bien conocido en la técnica (véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, páginas 1435-1712). También se pueden incorporar a las composiciones ingredientes activos suplementarios.
Para la administración terapéutica oral, el compuesto anti-inflamatorio adicional puede ser incorporado a excipientes puede ser incorporado y utilizado en forma de comprimidos, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares, o puede ser incorporado directamente al alimento de la dieta. Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener lo siguiente: un aglutinante tal como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregantes tal como almidón de maíz, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, aceite de Gaultheria o aroma de cereza o naranja. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, ésta puede contener, además de las sustancias del tipo anterior, un portador líquido. Otros diversos materiales pueden estar presentes como recubrimiento o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, los comprimidos, píldoras o cápsulas pueden estar recubiertos con goma laca, azúcar o ambos. Por supuesto, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma de dosificación unitaria debe ser farmacéuticamente pura y sustancialmente no tóxica en las cantidades empleadas. Además, el compuesto anti-inflamatorio adicional puede ser incorporado a una preparación y formulación de liberación sostenida. La cantidad de compuesto anti-inflamatorio adicional de semejante composición terapéuticamente útil es tal que se obtiene una dosificación adecuada.
Para la administración terapéutica parenteral, cada compuesto anti-inflamatorio adicional puede ser incorporado a una solución inyectable estéril. La solución inyectable estéril puede ser preparada incorporando el compuesto anti-inflamatorio adicional en la cantidad requerida a un portador farmacéuticamente apropiado, con otros diversos ingredientes enumerados más abajo (requeridos), seguido de esterilización por filtración. En el caso de las dispersiones, cada una puede ser preparada incorporando el compuesto anti-inflamatorio adicional a un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados antes. En el caso de las soluciones inyectables estériles, cada una puede ser preparada incorporando un polvo del compuesto anti-inflamatorio adicional y, opcionalmente, cualquier ingrediente deseado adicional de una solución esterilizada por filtración previamente del mismo, donde el polvo se prepara mediante cualquier técnica adecuada (p. ej., secado a vacío, y liofilización).
La dosis específica del compuesto anti-inflamatorio adicional se calcula según el peso corporal aproximado o el área de superficie del paciente. Otros factores en la determinación de la dosificación apropiada pueden incluir la enfermedad o afección inflamatoria aguda o crónica que se vaya a tratar o prevenir, la gravedad de la enfermedad, la ruta de administración, y de la edad, el sexo y la condición médica del paciente. El perfeccionamiento adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento que implica cada una de las formulaciones anteriormente mencionadas es realizado rutinariamente por los expertos en la técnica. Las dosificaciones también se pueden determinar por medio del uso de análisis conocidos para determinar dosificaciones utilizados junto con los datos dosis-respuesta apropiados.
De este modo, por ejemplo, las dosis de los compuestos anti-inflamatorios adicionales seleccionados para tratar una enfermedad inflamatoria aguda o crónica concreta tal como las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos) se puede variar para lograr un efecto terapéutico deseado. Cuando uno de los compuestos anti-inflamatorios adicionales tiene efectos secundarios, puede ser administrado a los pacientes durante períodos de tratamiento alternos de terapia combinada. Por ejemplo, el tratamiento crónico con metotrexato está asociado con toxicidad gastrointestinal, hepática, de la médula ósea y pulmonar (Sandoval et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:49-56).
Los ensayos para controlar la mejoría de una enfermedad pueden incluir ensayos específicos dirigidos, por ejemplo, a la determinación de la respuesta generalizada a la inflamación, lo que incluye la velocidad de sedimentación de los eritrocitos (ESR) y los reaccionantes de la fase aguda (APR). Se realizan observaciones de la hinchazón, etc. de las partes del cuerpo afectadas. También se observa mejoría en la rigidez, y la empuñadura (cuando sea aplicable), y la reducción del dolor del paciente. Si la condición del paciente es estable, se vuelve a tratar semanalmente con la misma dosis y se evalúa semanalmente. Siempre que la condición del paciente sea estable, se puede continuar el tratamiento. Después de seis meses de tratamiento, se determinan los cambios anatómicos del esqueleto mediante imágenes radiológicas, por ejemplo, radiografía con rayos X.
Al final de cada período, el paciente es evaluado de nuevo. La comparación de la evaluación radiológica pre-tratamiento y post-tratamiento, ESR y APR indica la eficacia de los tratamientos. Según la eficacia de los tratamientos y la condición del paciente, se puede incrementar la dosis o mantenerla constante a lo largo de la duración del tratamiento.
Preferiblemente, se puede utilizar una de las siguientes combinaciones en un método para tratar o prevenir una enfermedad y afección inflamatoria aguda o crónica, definida antes, tales como las enfermedades reumáticas (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos): un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) y metotrexato; un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}), metotrexato y un inhibidor de IL-1, preferiblemente IL-1ra; un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) y uno o más cualesquiera de metotrexato, un inmunosupresor (p. ej., ciclosporina), ciprofloxacina, el antígeno Fas y un inhibidor de IL-1, preferiblemente IL-1ra; un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cysl^{103}]-R_{2}) y metotrexato y un inmunosupresor (p. ej., ciclosporina); un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) y metotrexato y ciprofloxacina; y un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) y metotrexato y un inhibidor de IL-1, preferiblemente IL-1ra; un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}) y uno o más cualesquiera de metotrexato, sulfasazina e hidroxicloroquina; un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}), metotrexato e hidroxicloroquina; y un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}), metotrexato y sulfasazina.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., intra-articular, subcutánea o intramuscular) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, opcionalmente formulada en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con metotrexato y/o un inhibidor de IL-1 (p. ej., IL-1ra) y/o el antígeno Fas humano recombinante soluble para tratar las enfermedades reumáticas, definidas antes, (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos) y los síntomas asociados a ellas.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., intravenosa o intraventricular) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, formulada opcionalmente en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con activador de plasminógeno de los tejidos y/o un inhibidor de IL-1 (p. ej., IL-1ra) para tratar la lesión cerebral como resultado de un trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía, cada una de las cuales puede conducir a neurodegeneración.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., subcutánea o intramuscular) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, opcionalmente formulada en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con uno o más de un corticoesteroide, ciclosporina, FK-506, o un interferón (p. ej., interferón alfa, interferón beta, interferón gamma o interferón consenso) y/o IL-1ra para tratar la esclerosis múltiple.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., subcutánea o intramuscular) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, opcionalmente formulada en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con G-CSF y/o IL-lra para tratar la enfermedad inflamatoria del intestino.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., subcutánea o intramuscular) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, opcionalmente formulada en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con leptina, Marinol® o Megace® para tratar la caquexia/anorexia.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., subcutánea, intraventricular o intratecal) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, opcionalmente formulada en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con un AINE (p. ej., indometacina) y/o un inhibidor de IL-1 (p. ej. IL-1ra) para tratar la enfermedad de Alzheimer.
En una realización preferida específica, el método comprende la administración (p. ej., subcutánea, intraventricular o intratecal) de un producto de sTNFR truncado (p. ej., proteína R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}, opcionalmente formulada en una formulación de liberación sostenida (p. ej., hialuronano)) opcionalmente combinado (pre-tratamiento, post-tratamiento o tratamiento simultáneo) con un antígeno Fas humano recombinante soluble para tratar el cáncer (p. ej., leucemias); la diabetes (p. ej., diabetes melitus de tipo 1 de comienzo juvenil); el rechazo de injerto versus anfitrión; la hepatitis; la lesión por isquemia/reperfusión, incluyendo la isquemia cerebral (lesión cerebral como resultado de un trauma, epilepsia, hemorragia o apoplejía, cada una de las cuales puede conducir a neurodegeneración); enfermedades neuroinflamatorias; enfermedades reumáticas, definidas antes (p. ej., enfermedad de Lyme, artritis (reumatoide) juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis reumatoide y artritis ("séptica") inducida por estafilococos y transplante de tejidos.
Otros aspectos y ventajas de la presente invención serán comprendidos tras la consideración de los siguientes ejemplos ilustrativos.
Ejemplos
Los métodos normalizados para muchos de los procedimientos descritos en los siguientes ejemplos, o los procedimientos alternativos adecuados, se proporcionan en manuales ampliamente reconocidos de la biología molecular tales como, por ejemplo Sambrook et al. (1989), supra y Ausubel et al. (1990), supra. Por conveniencia para el lector, "mL" hace referencia a mililitros, "L" hace referencia a litros.
Ejemplo I
El siguiente ejemplo ilustra la producción de diversas formas de TNFR-I soluble recombinante, truncado: NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FC-COOH (sTNFR-I 2.6D/C105); NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQ
NNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.6D/C106); NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FN-COOH (sTNFR-I 2.6D/N105); NH_{2}-MYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d8); NH_{2}-M-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d18) y NH_{2}-MSIS-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (sTNFR-I
2.3D/d15).
A. Preparación de ADN 1. sTNFR-I 2.6D/C106
Se lleva a cabo la amplificación mediante PCR de sTNFR-I 2.6D/C106 utilizando como molde un ADNc clonado derivado del clon lambda-gt 107ctnfbp (EP 422339) y los siguientes cebadores de PCR:
5' OLIGO núm. 1: (SEQ ID NO:68)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO núm. 2: (SEQ ID NO:69)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3' 
\newpage
Los OLIGO núm. 1 y OLIGO núm. 2 codifican NdeI y HindIII e hibridan con el extremo 5' y 3' del gen truncado, respectivamente. La amplificación mediante PCR se realiza durante 25 ciclos; constando cada ciclo de 30 segundos a 94ºC para la desnaturalización, 15 segundos a 55ºC para la hibridación, y 1 minuto a 72ºC para la elongación [Termociclador Modelo 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. El producto de la PCR se purifica utilizando un QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR purificado se corta con NdeI y HindIII después se purifica en gel utilizando el QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR aislado en gel es ligado en pAMG11 (WO 95/26746) y transformado en células E. coli FM15 (ATCC 55765).
\vskip1.000000\baselineskip
2. sTNFR-I 2.6D/C105
Se lleva a cabo la amplificación mediante PCR de sTNFR-I 2.6D/C105 utilizando el ADN plasmídico de sTNFR-I 2.6D/C106 como molde y los siguientes cebadores de PCR:
OLIGO núm. 3: (SEQ ID NO:70)
5'-ACTCGA GGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA-3'
OLIGO núm. 4: (SEQ ID NO:71)
5'-CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3'
Los OLIGO núm. 3 y OLIGO núm. 4 codifican BamHI y la mutación N(105)C seguida de un codón de terminación. Los OLIGOS se diseñan para que se extienda completamente entorno al molde para la incorporación del nuevo sitio BamHI para la ligación. La amplificación mediante PCR se realiza durante 35 ciclos; 10 ciclos, constando cada ciclo de 10 segundos a 92ºC para la desnaturalización, 30 segundos a 55ºC para la hibridación, y 4 minutos a 68ºC para la elongación seguido de 25 ciclos, constando cada ciclo de 10 segundos a 92ºC para la desnaturalización, 30 segundos a 55ºC para la hibridación, y 4 minutos + 20 segundos a 68ºC para la elongación [termociclador Modelo 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. El producto de la PCR es purificado en gel utilizando el QIAquick^{^{TM}} Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA) según las instrucciones del fabricante, cortado con BamHI, extraído con fenol/cloroformo y precipitado con etanol. Después se resuspende, se liga en pAMG11, y se transforma en células E. coli
FM15.
\vskip1.000000\baselineskip
3. sTNFR-I 2.6D/N105
La amplificación por PCR de sTNFR-I 2.6D/N105 se lleva a cabo utilizando el ADN plasmídico de sTNFR-I 2.6D/C106 como molde y los siguientes cebadores de PCR:
5' OLIGO núm. 5: (SEQ ID NO:72)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO núm. 6: (SEQ ID NO:73)
5'-CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-3'
Los OLIGO núm. 5 y OLIGO núm. 6 codifican NdeI y BamHI e hibridan con el extremo 5' y 3' del gen truncado, respectivamente. La amplificación por PCR se realiza durante 30 ciclos; constando cada ciclo de 45 segundos a 95ºC para la desnaturalización, un minuto a 65ºC para la hibridación, y dos minutos a 72ºC para la elongación [Termociclador Modelo 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)].
El producto de la PCR se purifica utilizando el Wizard® DNA Clean-Up System (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. El producto de la PCR purificado es cortado con NdeI y BamHI, extraído con fenol/cloroformo y precipitado con etanol. Este se resuspende después, se liga en pAMG11 y se transforma en células de E. coli FM15.
Basándose en la descripción de la presente invención, los expertos normales en la técnica apreciarán que se pueden utilizar fácilmente una variedad de materiales y métodos o se pueden adaptar para la expresión adecuada en una célula anfitriona (p. ej., E. coli y otras bacterias).
\newpage
4. sTNFR 2.3D/d18: sTNFR-I 2.3D/d8 y sTNFR-I 2.3D/d15
Las amplificaciones por PCR de sTNFR-I 2.3D/d18; sTNFR-I 2.3D/d8 y sTNFR-I 2.3D/d15 se llevan a cabo cada una utilizando ADN plasmídico de 2.6D/C106 como molde y los siguientes cebadores de PCR:
Cebadores de PCR de sTNFR-I 2.3D/d8:
5' OLIGO núm. 7: (SEQ ID NO:74)
5'-CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3'
3' OLIGO núm. 8: (SEQ ID NO:75)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3' 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores de PCR de sTNFR-I 2.3D/d15:
5' OLIGO núm. 9: (SEQ ID NO:76)
5'-CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3'
3' OLIGO núm. 10: (SEQ ID NO:77)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3' 
\vskip1.000000\baselineskip
Cebadores de PCR de sTNFR-I 2.3D/d18:
5' OLIGO núm. 11: (SEQ ID NO:78)
5'-CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3'
3' OLIGO núm. 12: (SEQ ID NO:79)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
Los OLIGO núm. 7, OLIGO núm. 9 y OLIGO núm. 11 codifican cada uno NdeI y los OLIGO num. 8, OLIGO núm. 10 y OLIGO núm. 12 codifican cada uno HindIII. Las amplificaciones mediante PCR se realizan durante 245 ciclos; constando cada ciclo de 45 segundos a 95ºC para la desnaturalización, 1 minuto a 65ºC para la hibridación, y 2 minutos a 72ºC para la elongación [termociclador Modelo 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. Los productos de la PCR se purifican utilizando el Wizard® DNA Clean-Up System (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante. Los productos de la PCR purificados se cortan con NdeI y HindIII, se extraen con fenol/cloroformo y se precipitan con etanol. Estos se resuspenden, se ligan en pAMG11, y se transforman en células E. coli FM15.
B. Producción en E. coli
Inicialmente, un pequeño inóculo recién cultivado del clon de E. coli recombinante deseado que alberga el constructo deseado para sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.6D/C105 sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR 2.3D/d18, sTNFR-I 2.3D/d8 y sTNFR-I 2.3D/d15 es iniciado transfiriendo todo el contenido de una ampolla de siembra de provisión de glicerol congelada (aprox. 1,5 mL) en un matraz que contiene 500 mL de caldo Luria. El cultivo se incuba a un sacudidor giratorio a 37ºC que funciona a 350 rpm. La densidad del cultivo se determina midiendo la absorbancia a 660 nm (DO_{660}). El cultivo de siembra se hace crecer hasta una densidad \geq DO_{660} 2,0, en cuyo momento se transfieren asépticamente 125 mL al fermentador de producción de 15 L contiene 10 L de medio de crecimiento estéril.
El medio del lote y las condiciones de fermentación para la fermentación de producción son las condiciones de fermentación del medio complejo descritas por Sniff (1993), en la tesis "A Chemically-Defined Medium for the Overproduction of a Recombinant Protein in E. coli", Colorado State University. Generalmente, la referencia ilustra el uso de un medio complejo que contiene producto hidrolizado de caseína, sales, glicerina y antiespumante, que son esterilizados en el fermentador. Una vez que el tanque se ha enfriado por debajo de 40ºC, se añaden minerales vestigiales esterilizados por filtración e hidrocloruro de tiamina.
Cuando la temperatura del medio es estable a 37ºC, se inocula el medio con el cultivo de siembra. El crecimiento del cultivo se vigila midiendo la DO_{660}. El cultivo e mantiene a un pH de 6,0 mediante la adición automática de hidróxido de sodio 5M y ácido clorhídrico 5 M. Cuando la DO_{660} está entre 9,5 y 10,5, el cultivo es inducido mediante la adición aséptica de isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) a una concentración final de 0,50 mM. El cultivo se cosecha tras detenerse el crecimiento.
El medio de cultivo y las condiciones de crecimiento son los descritos por Sniff (1993), supra, con las siguientes excepciones: se añaden al medio sulfato de amonio (2,0 g/L) e hidrocloruro de L-cisteína monohidratado (1,0 g/L); se omite el hidrocloruro de tetraciclina del medio; el pH se mantiene a 6,0 con hidróxido de sodio y ácido clorhídrico, en vez de a 7,0 solamente con hidróxido de sodio; la temperatura de crecimiento se incrementa a 37ºC; la concentración de inductor se ha incrementado de IPTG 0,15 mM a 0,50 mM; y el criterio de la cosecha se basa en el cese del crecimiento en lugar de en el tiempo después de la inducción.
Una vez completada la fermentación, las células se cosechan con centrifugación en botellas de 500 mL. Las células se sedimentan mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos. La pasta celular recuperada se diluye a un 15% de sólido en tampón de rotura compuesto por Tris 50 mM Tris y EDTA 5 mM a pH 8,0. Las células suspendidas se someten a lisis después haciendo pasar la solución a través de un homogeneizador (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) que funciona a una presión de 562,588 kg/cm^{2} tres veces. El producto homogeneizado se centrifuga después a 10.000 rpm durante 30 minutos para recuperar los cuerpos de inclusión (IB). Los IB se lavan resuspendiendo en tampón de rotura y centrifugando la solución una tercera vez a 10.000 rpm durante 30 minutos. Los IBs se resuspenden en agua desionizada (razón 1:1) y se centrifugan una última vez a 10.000 rpm durante 30 minutos para el segundo lavado. Los cuerpos de inclusión recuperados, lavados para cada proteína están listos para la solubilización, el replegameinto y la purificación. Cada ronda rinde aproximadamente 200-250 g de IB.
En una realización alternativa, el sTNFR-1 truncado puede ser fermentado como sigue:
Inicialmente, un pequeño inóculo recién cultivado del clon de E. coli recombinante deseado que alberga el constructo deseado para sTNFR-I 2.6D/N105 o sTNFR-I 2.6D/C106 es iniciado transfiriendo todo el contenido de una ampolla de siembra de provisión de glicerol congelado (aprox. 1,5 mL) a un matraz de 2 L que contiene 500 mL de extracto de levadura BBL 10 g/L, pH 7,0. El cultivo se incuba en un sacudidor giratorio a 33ºC funcionando a 300 rpm. La densidad del cultivo se determina midiendo la absorbancia a 600 nm (DO_{600})\cdot El cultivo de siembra se hace crecer hasta una densidad \geq DO_{660} 2,0, en cuyo momento es transferido asépticamente (80 mL) al fermentador de producción de 15 L que contiene 7 L de medio de crecimiento estéril.
La fermentación de producción emplea un procedimiento de alimentación por lotes. El medio del lote es un medio complejo que contiene extracto de levadura, sales, y antiespumante, que son esterilizados en el fermentador. Una vez que el tanque se ha enfriado por debajo de 40ºC, se añaden minerales vestigiales esterilizados por filtración, glucosa, sulfato de magnesio, y hexametafosfato. Se emplean dos alimentaciones, siendo la primera una alimentación de contiene carbono (glucosa/sulfato de magnesio) y la segunda una alimentación nitrogenada que contiene extracto de levadura.
Cuando la temperatura del medio del lote es estable a 33ºC, el medio es inoculado con el cultivo de siembra. El crecimiento del cultivo es vigilado midiendo la DO_{600}. El cultivo se mantiene a un pH de 7,0 mediante la adición automática de hidróxido de amonio y ácido cítrico al 48,7%. Cuando la DO_{600} está entre 8,0 y 12,0, se inicia la alimentación I utilizando una velocidad de alimentación exponencial. Cuando la DO_{600} está entre 30 y 40, se inicia la alimentación 2 utilizando una velocidad de alimentación constante. Cuando la DO_{600} alcanza 67-83, el cultivo the culture es inducido mediante la adición aséptica de un autoinductor estéril (homoserina lactona) a una concentración final de 0,6 mg/L. Ambas velocidades de alimentación I y II se cambian a una velocidad constante en la inducción. El cultivo se cosecha a las 16 \pm 2 horas después de la inducción.
Una vez completada la fermentación, las células se cosechan con centrifugación en botellas de 500 mL. Las células se sedimentan mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 30 minutos. La pasta celular recuperada se diluye a un 15% de sólidos en tampón de rotura compuesto por Tris 50 mM y EDTA 5 mM a pH 8,0. Las células suspendidas se someten a lisis después haciendo pasar la solución a través de un homogeneizador (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) que funciona a una presión de 562,588 kg/cm^{2} tres veces. El producto homogeneizado se centrifuga después a 10.000 rpm durante 30 minutos para recuperar los cuerpos de inclusión (IB). Los IB se lavan resuspendiendo en tampón de rotura y centrifugando la solución una tercera vez a 10.000 rpm durante 30 minutos. Los IB se resuspenden en agua desionizada (razón 1:1) y se centrifugan una última vez a 10.000 rpm durante 30 minutos para el segundo lavado. Los cuerpos de inclusión recuperados, lavados están listos para la solubilización, el replegamiento y la purificación.
C. Solubilización/Replegamiento
Los IB lavados de los 10 L completos de la fermentación se solubilizan en 800 mL de tampón de solubilización (Tris 50 mM, Urea 8M, cisteína 160 mM pH 9,5). El pH de la mezcla de solubilización se ajusta a 9,5 con NaOH 10 N y se agita a la temperatura ambiente durante 2-3 horas. Cada ronda rindió aproximadamente 200-250 g de IB.
Cada mezcla de solubilización se diluye 1:20 en Tampón de Renaturalización frío (Tris 50 mM, Urea 1,1 M). Cada volumen final es de aproximadamente 16 L. Después de eso cada mezcla se ajusta a pH 9,7 con HCl 6 N, y se agita lentamente a 4ºC durante 2-3 días.
El pH de cada mezcla se ajusta después a 5,0 con ácido acético glacial y HCl 6 N. En cada mezcla se forma un producto precipitado que se separa mediante centrifugación a 10.000 X g en una centrífuga Modelo J2-HS Beckman. Cada material se filtra después a través de un filtro de 5 \mum y 0,22 \mum.
D. Purificación
Los materiales del replegamiento están listos para la purificación en columna en una columna IX-1 SP-Sepharose Big Bead® (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
9
Se equilibra una columna con 4-5 volúmenes de Tampón A antes de separar las cargas de cada material de replegamiento. Los materiales de replegamiento se cargan por separado en una columna para su purificación. Para cada carga, la columna se carga con no más de doce gramos de proteína por litro de resina. Para cada carga, la columna se lava después con 3-4 volúmenes de la columna de Tampón A (hasta que U.V. retornaba a la línea base). Para cada carga, la proteína se hace eluir de la columna utilizando un volumen lineal ocho veces el de la columna incrementando el gradiente de sal que circulaba a partir de NaCl 50-375 mM. El pico de la proteína completo para cada carga se recoge en una reserva. La recogida de cada pico de proteína se inicia cuando la absorbancia de U.V. sube a aproximadamente un 20% del máximo del pico. La reserva se detiene cuando la primera de cualquiera de las absorbancias de U.V deja de disminuir.
Velocidad de flujo -
7,5 cv/hora para el Equilibrado,
\quad
lavar 15 cv/hora para la carga
\quad
6 cv/hora para la elución
Cada purificación en columna se realiza a 4ºC.
Cada reserva IX-1 está lista para la purificación en una columna Toyo Pearl® Butyl 650M HIC (Toso Haas, Philadelphia, PA).
10
La columna se equilibra con 4-5 volúmenes de la columna de Tampón A antes de separar las cargas de cada material de la reserva IX-1. Cada reserva IX-1 se diluye 1:1 con Tampón de Dilución y el pH se ajusta a 6,0. Para cada carga, la reserva IX-1 diluida se carga en la columna. Para cada carga, la columna se carga con no más de diez gramos de proteína por litro de resina. Para cada carga, la columna se lava con 3 veces el volumen de la columna de tampón. Para cada carga, la proteína se hace eluir de la columna con un gradiente de volumen lineal ocho veces el de la columna disminuyendo el gradiente de sal que circula de NaCl 1,8 M a H_{2}O. La recogida de cada pico de proteína se inicia cuando la absorbancia de U.V. sube a aproximadamente un 15-20% del máximo del pico. La reserva se detiene cuando la primera de cualquiera de las absorbancias alcanzaba aproximadamente el 50% del máximo del pico o se detenía la disminución de la absorbancia.
Velocidad de Flujo -
6 cv/hora para el equilibrado, carga
\quad
y lavado
\quad
3 cv/hora para la elución
Cada purificación de la columna se realiza a la temperatura ambiente.
Cada reserva de HIC está lista para la concentración/diafiltración.
Concentración/Diafiltración (C/D)
Se utiliza una membrana de corte a un P.M. de 5.000 de celulosa regenerada PLCC® de 929,03 cm cuadrados (Milli-Pore, Bedford, MA) para la etapa de C/D para cada reserva de HIC. Cada reserva de HIC se concentra en torno a 200 mL y después se somete a diafiltración frente a 6-7 volúmenes de NaPO_{4} 20 mM pH 6,0 hasta que la conductividad es < 4 mm hora.
Cada etapa de concentración/diafiltración se realiza a la temperatura ambiente.
Cada reserva de C/D está lista para la purificación en una columna IX-2 - 365 mL SP-Sepharose HP® (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
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11 
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La columna se equilibra con 4 veces el volumen de la columna de Tampón de Equilibrado antes de separar las cargas de cada reserva de C/D. Cada reserva de C/D se carga en una columna utilizando no más de ocho gramos de proteína por litro de resina. Para cada carga, la columna se lava con 3 veces el volumen de la columna de Tampón de Equilibrado seguido de 3 veces el volumen de la columna de Tampón A. Para cada carga, la proteína se hace eluir de la columna con un gradiente lineal de ocho veces el volumen de la columna que consiste en un gradiente de pH de 6,3-6,8 y un gradiente de sal circulante de NaCl de 0 a 50 mM (Tampón B). La reserva se inicia a una D.O de 1 en la parte anterior del pico y se detiene al 50% del máximo del pico en la parte posterior.
En una realización alternativa, el sTNFR-1 truncado puede ser solubilizado, re-plegado y purificado como sigue:
C.1 Solubilización/Replegamiento:
Los IB lavados se solubilizan con urea 8 M, Tris 60 mM, cisteína 100 mM para dar una concentración final de urea 6,5 M, Tris 50 mM y cisteína 80 mM, pH 9,4 y 5-10 mg/mL de sTNFR-1 truncado. (El último está basado en una cuantificación de la cantidad de sTNFR-1 truncado en los IB lavados sobre una base en g/L). Se agita el material y después se repliega diluyendo 1:10 en urea 0,85 M fría (4-8ºC), Tris 50 mM, pH 9,8 (medida del pH tomada a 4-8ºC).
La solución de replegamiento se agita durante 24-72 horas a 4-8ºC. Transcurrido este tiempo, se añade ácido acético glacial (\sim 20 mM) y el pH se ajusta a 5,0. El producto precipitado se separa por centrifugación y el sobrenadante se conserva para cargar la primera columna.
D.1 Purificación
La reserva de precipitación ácida aclarada se carga en una columna SP-Sepharose Big Bead® (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) que ha sido equilibrada con acetato de sodio 20 mM, NaCl 75 mM, pH 5,0. La columna se carga con no más de 15 g de sTNFR-1 truncado por L de volumen del lecho. Después de cargar, la columna se lava con 3 veces el volumen de la columna de acetato de sodio 20 mM, NaCl 75 mM, pH 5,0 y se hace eluir con un gradiente lineal de 9 veces el de la columna de NaCl 75 mM a 450 mM en acetato de sodio 20 mM, pH 5,0. La etapa completa de la columna de SP-Sepharose Big Bead® (SP-BB) se realiza a 4-8ºC.
La reserva SP-BB se diluye 1:1 con NaCl 2M, acetato 60 mM, pH 4,5 y el pH se ajusta a 4,5 si fuera necesario. La reserva SP-BB diluida se carga sobre una columna Toyopearl® Butyl 650M (Toso Haas, Philadelphia, PA) que había sido equilibrada con NaCl 1M, acetato 30 mM, pH 4,5. La columna se carga con \sim 10-13 gramos de sTNFR-1 truncado por litro de volumen del lecho. Después de la carga, la columna se lava con 3 veces el volumen de la columna de NaCl 1M, acetato 30 mM, pH 4,5 y se hace eluir con un gradiente de volumen lineal 8 veces el de la columna de NaCl 1M-0M en acetato 30 mM, pH 4,5.
Las fracciones de sTNFR-1 truncado purificadas de la columna Butyl 650M se reúnen, se diluyen 1:5 con agua y se cargan sobre una columna SP-Sepharose High Performance® (SP-HP) (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) que se ha equilibrado con acetato 30 mM, pH 4,5 (carga de no más de \sim 15 g/L volumen del lecho). La columna se lava después con 3 veces el volumen de la columna de acetato 30 mM, pH 4,5 y se hace eluir con un gradiente lineal de 12 veces el volumen de la columna que va desde NaCl 100 mM a 400 mM en acetato 30 mM, pH 4,5. Las fracciones de sTNFR-1 truncado purificadas se reúnen y se ajustan a pH 5,0 con NaOH.
C. PEGilación 1. Preparación de sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa)
A una solución agitada, enfriada (4ºC) de sTNFR-2.6D/N105 (3,5 mg/ml) en acetato de sodio 50 mM, pH 4, se añade un exceso molar de 3 veces de t-BuPEG (mono-t-butoxi-polietilenglicol, PM medio=33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.). Se añade NaCNBH_{3} a una concentración final de 20 mM, y la mezcla de reacción se agita a 7ºC durante 18-24 horas.
El grado de modificación de la proteína durante el transcurso de la reacción se verifica mediante SEC HPLC utilizando una columna TSKG3000sw_{XL} (Toso Haas, Montgomeryville, PA) eluyendo con tampón fosfato de sodio 0,1 M pH 6,9, NaCl 0,5M, y 10% de etanol a 0,7 ml/min (Toso Haas, Montgomeryville, PA).
El pH de la mezcla de reacción se ajusta a aprox. 3,5 con HCl 1M, y la mezcla de reacción se diluye con agua a una concentración final de proteína de 1,5 mg/ml.
El sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) se separa del exceso de t-BuPEG y otros sub-productos de reacción utilizando la cromatografía de intercambio iónico SP Sepharose HP 16/10® (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
La mezcla de reacción se carga sobre la columna y el t-BuPEG que no ha reaccionado se hace eluir con 3 veces el volumen de la columna del Tampón A de partida (sodio acetato 20 mM, pH 4,0). El sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) se hace eluir utilizando un gradiente de volumen lineal 20 veces el de la columna de Tampón B 0-30% (NaCl 1M en acetato 20 mM, pH 4,0. El eluyente se controla a 280 nm. Cada fracción que contiene sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) se analiza mediante SDS-PAGE utilizando geles Pre-Cast en gradiente al 4-20% (Novex, San Diego, CA). Basándose en los resultados del análisis SDS-PAGE, las fracciones se reúnen, se concentran, y se esterilizan por filtración. Cada una de las reservas finales de sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) purificado se analiza de nuevo mediante SDS-PAGE y SEC HPLC. Esta proteína se formula en fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y NaCl 20 mM.
2. Preparación de sTNFR-I 2.6D/N105-33 kDa(MePEG)
A una solución agitada, enfriada (7ºC) de sTNFR-2.6D/N105 (4 mg/ml) se le añade 10% de ácido acético hasta que el pH es de 5,0. A esta solución se añade NaCNBH_{3} 15 mM y un exceso molar de 2 veces de t-butoxi PEG (t-butoxi polietilenglicol, PM medio=33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.). La mezcla de reacción se agita brevemente a la misma temperatura y después se incuba durante \sim 18 horas.
Al cabo de 18 horas la concentración de proteína en la mezcla de reacción se ajusta a pH 3,0 con ácido cítrico.
El sTNFR-1 2.6D/N105-MePEG(33 kDa) se separa del exceso de MePEG y otros subproductos de la reacción mediante cromatografía de intercambio iónico utilizando una columna SP Sepharose HP® (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
La mezcla de reacción se carga (no más de 8 mg/ml de resina) en la columna y el MePEG que no ha reaccionado se hace eluir con 3 veces el volumen de la columna de tampón A de partida (citrato de sodio 20 mM, pH 3,0). El sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa) se hace eluir utilizando un gradiente de volumen lineal 16 veces el de la columna de NaCl de 0,1-0,5 M en citrato 20 mM, pH 3,0. El eluyente se controla a 280 nm. Cada fracción que contiene sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa) se analiza mediante SDS-PAGE utilizando geles Pre-Cast en gradiente del 4-20% (Novex, San Diego, CA). Basándose en los resultados del análisis de SDS-PAGE, las fracciones se reúnen, se concentran, y se esterilizan por filtración. Cada reserva final de sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa) purificado se analiza de nuevo mediante SDS-PAGE. El sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa) purificado se concentra a 5-20 mg/mL y se formula o bien en PBS, pH 6,5 (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 35-100 mM) o acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0.
3. Preparación de sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20 kDa)
Los procedimientos de la etapa A para la preparación de sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa), se repiten sustancialmente con la excepción de que se sustituye MePEG (mono-metoxipolietilenglicol, PM medio = 20 kDa, Shearwater Polymers, Inc.) por el MePEG (monometoxi-polietilenglicol, PM medio =33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.). Esta proteína se formula en fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y NaCl 20 mM.
4. Preparación de Productos Conjugados Adicionales
Se preparan productos conjugados adicionales de sTNFR-2.6D/N105 sustancialmente como sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa), con la excepción de se utilizan los siguientes tipos de aldehídos de PEG (Shearwater Polymers, Inc.):
monofuncional lineal - PM 5 kDa, 6 kDa, y 57 kDa;
monofuncional ramificado - PM 10 kDa, 20 kDa y 40 kDa;
difuncional lineal - PM 8 kDa y 20 kDa;
trifuncional ramificado - PM 10 kDa.
Estas proteínas se formulan en fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y NaCl 20 mM.
5. Método de Pegilación Alternativo
En una realización alternativa, las moléculas de sTNFR-1 truncado pueden ser pegiladas y purificadas mediante las siguientes técnicas:
El producto eluido de SP-HP (3-5 mg/mL ajustado a pH 5,0) se hace reaccionar con 2 moles de polietilenglicol (p. ej., MePEG o t-BuPEG) por mol de sTNFR-I 2.6D/N105 (\sim5 gramos de t-BuPEG por gramo de sTNFR-I 2.6D/N105). Tras la disolución del polietilenglicol, se añade cianoborohidruro de sodio 10–20 mM y la solución se incuba durante la noche a 7-15ºC. Al final de la reacción de pegilación (\sim 18 horas) la reacción se sofoca añadiendo glicina 10 mM.
La mezcla de pegilación se diluye con 4 volúmenes de acetato 50 mM, pH 4,0, se ajusta a pH 4,0 si es necesario, y se carga en una columna SP-HP que ha sido equilibrado con acetato 50 mM, pH 4,0. La columna se carga con no más de \sim 8 gramos de sTNFR-2.6D/N105 por litro de volumen del lecho. Después de cargar, la columna se lava con 3 veces el volumen de la columna de Tampón de Equilibrado y se hace eluir con un gradiente de NaCl 0-0,3M en acetato 50 mM acetato, pH 4,0. Las fracciones de sTNFR-2.6D/N105-30 kDa monopegiladas se recogen, se ajustan a pH 5,0, se concentran y se someten a diafiltración en un tampón de formulación isotópico. Todas las etapas de purificación se llevan a cabo a la temperatura ambiente. La proteína se formula o bien en PBS, pH 6,5 (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 35-100 mM) o bien en acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0.
6. Preparación de "dumbbell" sTNFR-I 2.6D/C105 pesa y "dumbbell" sTNFR-I 2.6D/C106
Se utiliza polietilenglicol activado con sulfona (preparado y purificado sustancialmente según la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 08/473.809, presentada el 7 de Junio, 1995 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 08/611.918, presentada el 6 de Marzo, 1996) [PEG-20,000-bis-vinil-sulfona], para dimerizar las proteínas sustancialmente de acuerdo con el método descrito en la Publicación PCT Núm. WO 95/34326, excepto por la reducción y las condiciones de reacción. Las proteínas se reducen antes del anclaje del polietilenglicol con 4 moles de DTT por un mol de proteína 5-6ºC, pH 7,6. Todas las reacciones se realizan en presencia de 30% de glicerol. Las proteínas dimerizadas se denominan sTNFR-I 2.6D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C106db. Cada proteína es formulada en PBS, pH 6,5 (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 35-100 mM) o acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0.
7. Preparación de Moléculas de sTNFR-I Comparativas
(i). Se prepara sTNFR-I 4D/N105 como se describe en EP 422339. Se prepara sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kda) pegilando sTNFR-I 4D/N105 sustancialmente de acuerdo con los procedimientos mostrados antes para la pegilación de sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa). Se prepara sTNFR-I 4D/N105-t-MePEG(33 kda) pegilando sTNFR-I 4D/N105 sustancialmente conforme a los procedimientos mostrados antes para la pegilación de sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33 kDa). Se preparan sTNFR-I 4D/C105 y sTNFR-I 4D/C105db como se describe en la Publicación PCT Núm. WO 95/34326. Esta proteína se formula en fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y NaCl 20 mM.
(ii). Se prepara sTNFR-I 4D/C105-33 kDa(MePEG) pegilando 4D/C105 sustancialmente de acuerdo con los procedimientos mostrados antes para la pegilación de sTNFR-I 2.6D/C105-33 kDa(MePEG) con la excepción de que la reacción se produce a pH 7,5 con 1,3 moles de DTT por mol de sTNFR-I durante \sim 5-6 horas, seguido de la separación del DTT en una columna SP-Sepharose® FF y PEGilación con 1,5-3 moles de PEG por mol de proteína durante al menos 15 horas a la temperatura ambiente. Esta proteína se formula o bien en PBS, pH 6,5 (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 35-100 mM) o bien acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0.
(iii). Se prepara sTNFR-I 3D/N105 (un truncamiento de 34 aminoácidos del extremo c de sTNFR-I 4D/N105) como sigue. Se lleva a cabo la amplificación mediante PCR utilizando sTNFR-I 4D/N105 como molde y los OLIGO núm. 13 y OLIGO núm. 14 que codifican NdeI y HindII, respectivamente, e hibridan con los extremos 5' y 3' del gen truncado, respectivamente. Las amplificaciones mediante PCR se realizan durante 25 ciclos; consistiendo cada ciclo en 30 segundos a 94ºC para la desnaturalización, 15 segundos a 60ºC para la hibridación, y 1 minuto a 72ºC para la elongación [termociclador Modelo 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. El producto de la PCR se purifica utilizando un QIAquick® PCR Purification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA). El producto de la PCR purificado se corta con NdeI y HindIII después se purifica en gel utilizando el QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA). El producto de la PCR aislado en gel se liga en pAMG11 y se transforma en células de E. coli FM15.
5' OLIGO núm. 13: (SEQ ID NO:80)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO núm. 14: (SEQ ID NO:81)
5'-CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT-3'
Esta proteína se formula en fosfato de sodio 10 mM, pH 6,5 y NaCl 20 mM.
(iv). Se prepara sTNFR-I 3D/C105 (un truncamiento de 34 aminoácidos del extremo c de sTNFR-I 4D/C105) sustancialmente como sTNFR-I 3D/N105, con la excepción de que el molde es sTNFR-I 4D/C105. Se formula sTNFR-I 3D/C105 o bien en PBS, pH 6,5 (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 35-100 mM) o bien en acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0.
(v). Se prepara sTNFR-I 3D/C105db sustancialmente como sTNFR-I 4D/C105db, con la excepción de que se utiliza sTNFR-I 3D/C105 como sustancia de partida en lugar de sTNFR-I 4D/C105. Se formula sTNFR-I 3D/C105db o bien en PBS, pH 6,5 (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 35-100 mM) o bien en acetato 20 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0.
Ejemplo II
Se evalúan diversas formas de TNFR-I soluble recombinante, truncado en cuanto a su capacidad para inhibir la actividad del TNF.
A. Análisis de Citotoxicidad de WEHI
El análisis WEHI es un análisis de proliferación celular in vitro (Edwards et al. (1991), Endocrinology. 128:989-996). Las líneas celulares son sensibles al TNF-\alpha (esto es, el TNF-\alpha es citotóxico).En presencia de un inhibidor de TNF-\alpha, las células son protegidas del efecto citotóxico y de este modo son capaces de proliferar.
Protocolo
Se suspenden las células 13 clon 164 WEHI sensibles al TNF (ATCC, Rockville, MD) a una concentración de 20 x 10^{4} células/mL en medio RPMI (Gibco, Grand Island, NY) con un suplemento de 5% de Suero de Ternera Fetal (Hyclone, Ogden, UT) y penicilina 50U/mL:estreptomicina 50 mg/mL. Se colocan 100 microlitos de esta suspensión celular en cada pocillo de placas de microtitulación de 96 células de fondo redondo, y se deja que las células se adhieran durante 4-6 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Se añaden a cada pocillo de 10 \muL de actinomicina-D de 0,0060 mg/mL (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se añaden a cada pocillo 10 microlitros de TNF\alpha humano recombinante a 50 ng/ml (concentración final 5 ng/ml). Se diluyen concentraciones 1:2 diluidas seriadamente de las diversas formas de sTNFR (sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 4D/C105 y sTNFR-I 4D/C105db) en PBS y después se añaden a pocillos por duplicado (10 \muL/pocillo) que contienen células 164 WEHI adherentes después de la adición de TNF-\alpha humano recombinante. Las células 13 clon 164 WEHI se incuban durante 18 horas a 37ºC en 5% de CO_{2}. Después de la incubación, se añaden 10 ml de una solución de 2 mg/mL del colorante orgánico MTT tetrazolio (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), y las células se incuban durante 4-6 horas más. Las células se solubilizan mediante la adición de 50 \muL de solución de DMF/SDS (20% SDS y 50% N,N-dimetilformamida, pH 4,7). La solución de DMF/SDS se pipetea arriba y abajo varias veces hasta que los cristales de MTT se disuelven, y las células se incuban durante 2-22 horas más. Se leen las absorbancias (abs) en un lector Vmax a 570. Se calcula el porcentaje de citotoxicidad específica a partir de las densidades ópticas utilizando la fórmula: % citotoxicidad específica = 100% X [abs (células + medio) - abs (células + muestra)]/abs(células + medio) - abs(células + TX-100)]. El número de unidades de TNF en cada muestra se determina utilizando las citotoxicidades específicas de los patrones murinos, como se ha descrito previamente. Los resultados del análisis WEHI se recopilan más abajo en la Tabla 2:
TABLA 2 Actividad in vitro en el análisis WEHI
12
Basándose en los resultados del análisis WEHI, no existen diferencias significativas entre sTNFR-I 2.6D/C106 y sTNFR-I 4D/C105 en términos de bioeficacia in vitro.
B. Análisis de Citotoxicidad L929
El análisis de citotoxicidad L929 es un análisis de proliferación celular in vitro (Parmely et al. (1993), J. Immunol., 151:389-396) que también evalúa la citotoxicidad de las muertes sensibles al TNF-\alpha. Las líneas celulares son sensibles a TNF-\alpha (esto es, TNF-\alpha es citotóxico). En presencia de un inhibidor de TNF-\alpha soluble, las células se protegen del efecto citotóxico y de este modo son capaces de proliferar.
Protocolo
La línea celular L929 se obtiene de la Colección de Cultivos Tipo Americana (Número de Catálogo CCL 1, NCTC clon 929, clon de la cepa L, tejido conectivo, ratón). El medio utilizado para la propagación es Medio RPMI 1640 con un suplemento de 10% FBS + 1% de Solución de L-Glutamina + 1% de Solución de Penicilina-Estreptomicina.
Se utilizan placas de microtitulación de 96 pocillos (Corning) en el análisis y solamente se utilizan los 60 pocillos internos. El patrón y la muestra de ensayo se someten a ensayo por triplicado en la misma placa.
El TNF\alpha utilizado en el análisis es de R&D Systems (Minneapolis, MN). La concentración final de TNF\alpha utilizada en el análisis es de 1 ng/mL en todos los pocillos del análisis.
El diluyente del análisis es medio de crecimiento de L929, 10 ng/mL de TNF\alpha, y 10 \mug/mL de Actinomicina D (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Las placas se cosechan utilizando una Solución XTT/MEN (1,5 mg/mL XTT + MEN 75 mM).
El día 1, las células se cultivan en placa sobre las placas de análisis. Se prepara una suspensión celular mediante tripsinización y resuspendiendo las células a 3,33x10^{4} células/mL. Se cultivan en placa 180 mL de esta suspensión celular en cada uno de los pocillos internos de las placas de análisis. Se dispensan 200 mL de medio de crecimiento en los 36 pocillos externos para ayudar a evitar los artefactos de la evaporación en el análisis. Las placas se dejan sedimentar a la temperatura ambiente, se cubren con aluminio y se quitan de las corrientes de aire, durante aproximadamente 1 hora. Las placas de análisis se colocan una incubadora a una humedad elevada a 37\pm2ºC y 5\pm1% de CO_{2}. Las placas se incuban durante aproximadamente 20-22 horas antes de la adición de diluciones seriadas de sTNFR-I.
El día 2, se preparan el patrón de sTNFR-I 4D/N105 y las muestras de ensayo: Patrón de sTNFR-I 4D/N105 diluido y muestras de ensayo a una concentración de aproximadamente 2,0 mg/mL, (u otra concentración apropiada). Realizar diluciones seriadas de esta concentración para crear una curva de dilución de 10 puntos que oscila entre aproximadamente 1,0 x 10^{6} ng/mL y 1,0 x 10^{-3} ng/mL, incluyendo un punto en 0 ng/mL (Diluyente de Análisis solamente). Si son apropiadas otras concentraciones, se pueden utilizar. Añadir 1000 \muL de cada dilución por triplicado en cada placa de análisis. Incubar las placas en una incubadora a 37ºC\pm2ºC con humedad elevada y 5\pm1% de CO_{2} durante 20\pm1 horas después de transferir alícuotas de diluciones seriadas a las placas de análisis.
El día 3, se añaden 50 \muL/pocillo de Solución de XTT/MEN a los 60 pocillos internos de las placas de análisis. Las placas se incuban en una incubadora a 37ºC\pm2ºC con humedad elevada y 5\pm1% de CO_{2} (Falcon, New York, New York) durante 24\pm0,5 horas.
El día 4, se lee la densidad óptica (D.O.) de las placas de análisis a 450 nm menos 650 nm en un lector de placa ELISA (SpectraMAX, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Si se obtienen valores de una D.O de 4.000 para los pocillos de la placa a estas longitudes de onda, se debe volver e leer la placa a 490 nm menos 650 nm inmediatamente, y los datos de 490 nm menos 650 nm se deben utilizar para el cálculo.
Se prepara una curva dosis-respuesta patrón vs log utilizando un ajuste de la curva logístico de cuatro parámetros. Calcular las concentraciones originales de las muestras desconocidas a partir de la curva patrón y calcular la DE_{50} para el patrón y el coeficiente de correlación para el ajuste de la curva patrón.
Resultados
Los resultados del Análisis de Citotoxicidad para L929 se recopilan más abajo en la Tabla 3:
TABLA 3 Actividad in vitro en el análisis de Citotoxicidad para L929
13
Los datos indican que sTNFR-I 4D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C106db son activos y tienen respuestas a las dosis comparables cuando se comparan con el patrón. Los datos indican que sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kda) y sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG(33 kda) son casi 2 logs más bajos en actividad, pero son activos en este análisis, sin embargo cuando se comparan con sTNFR-I 4D/C105db.
14
Estos datos indican que el sTNFR-I 3D/C105db es activo y los valores de la DE_{50} están en el intervalo del sTNFR-I 4D/C105db (Ronda núm. 1), el sTNFR-I 2.6D/C105db (Ronda núm. 1), y el sTNFR-I 2.6D/C106db (Ronda núm. 1). Los datos también indican que el sTNFR-I 3D/N105 es menos activo que el patrón interno sTNFR-I 4D/C105.
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C. Modelo de reactivación inducido por pared celular Estreptocócica
El modelo de artritis de reactivación inducida por pared cellar estreptocócica en análisis de ratas se completa utilizando los protocolos conocidos (Esser et al. (1985), Arthritis And Rheumatism, 28:1402-1411 y Makarov et al. (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:402-406).
Protocolo
Se inyecta intra-articularmente en la articulación del tobillo derecho, una suspensión estéril de productos de pared estreptocócica que contiene peptidoglicano-polisacárido (SCW) (Lee Laboratory, Grayson, GA) en ratas hembra Lewis (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA), con un peso de 175 a 185 gramos cada una a una dosis de 1,5 mg/10 mg por articulación. Se inyecta solución salina en la articulación contralateral para proporcionar un control. La inyección intra-articular de SCW ocasiona una artritis aguda de una duración relativamente corta con hinchazón de la articulación alcanzando el máximo a los uno o dos días de la inyección. Después de un período de veinte días, durante el cual se resolvió la reacción inflamatoria aguda, se administra de nuevo SCW mediante inyección intravenosa a una dosis de 200 mg/200 mL por rata. La segunda dosis d SCW es suficiente para reactiva la inflamación en la articulación del tobillo en el que se había inyectado previamente SCW y tiene un efecto pequeño sobre el tobillo en el que se ha inyectado solución salina. Para evaluar el grado de inflamación durante el período de 72 horas siguiente a la inyección intravenosa de SCW, se miden las dimensiones de la articulación del tobillo mediante medidas del calibre del tobillo del tobillo posterior a las 0, 24, 36, 48, y 72 horas de la reactivación de la artritis y después se recoge el miembro posterior contralateral para la histología (p. ej., inflamación, formación del pannus, lesión de cartílago y lesión
ósea).
Resultados
Los efectos del sTNFR-I 2.6D/C106db cuando se administraba se sometían a ensayo en el desarrollo de hinchazón durante la reactivación de la artritis. Los inhibidores y el vehículo se administraban cada uno en una única inyección intravenosa 24 horas antes de la reactivación con SCW.
El sTNFR-I 2.6D/C106db demuestra una eficacia estadísticamente significativa en la reducción de la hinchazón de la articulación, mediante análisis de varianza (ANOVA) prueba post-hoc de Fisher (Statview®) a las cuatro dosis los días dos y tres después de la reactivación y a todas menos una dosis (1,5 mg/kg) el día uno. Esta reducción de la hinchazón es compatible con el control positivo de sTNFR-I 4D/C105db administrado a una dosis de 0,5 mg/kg diariamente (esto es; 8,8 nM) partiendo del día uno pre-reactivación a tres días después de la reactivación. Los sTNFR también muestran una eficacia significativa cuando se considera la cantidad hinchazón de los tres días en su totalidad. El área bajo la curva (AUC) presente una relación dosis-respuesta a todas las dosis (véase la Figura 9, donde el sTNFR-I 2.6D/C106db se denomina "sTNFR-I 2.6D" y el sTNFR-I 4D/C105db se denomina "sTNFR-I 4D").
El sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) muestra una reducción significativa en la anchura del tobillo e índices histológicos cuando se comparan con el grupo de control de la enfermedad en el modelo.
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D. Modelo de D-galactosamina/Lipopolisacárido
El modelo de D-galactosamina (D-GalNH_{2})/Lipopolisacárido (LPS) (Parmely et al. (1993), supra), es un modelo de letalidad animal in vivo, altamente dependiente de TNF-\alpha. Adicionalmente, se ha demostrado que los ratones autoinmunes MRL-1pr/1pr son extremadamente sensibles al TNF-\alpha inducido por LPS o SEB (Mountz et al. (1995), J. Immunol., 155:4829-4837).
Protocolo
Después de ayunar durante la noche, ratones hembra MRL-1pr/1pr (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) de 6-8 semanas de edad reciben una sensibilización I.P. con los siguientes reactivos farmacológicos: 25 mg de D-GalNH_{2} (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) suspendidos en Solución Salina Equilibrada de Hank (Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY) (50 mg/mL); y lipopolisacárido (LPS) de E. coli Serotipo 0127:B8 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en solución salina tamponada con fosfato libre de endotoxinas, estéril (PBS) (25 mg/ratón) o SEB (Toxin Technologies, Sarasota, FL) en solución salina normal (50 mg/ratón). Las diversas formas de sTNFR se administran en diluciones seriadas 1:2 (dosificaciones mg/kg) para obtener curvas DE_{50} generadas con soporte lógico estadístico de MacIntosh (Statview®, Mountain View, CA). La vigila letalidad +48 h después de la sensibilización.
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Resultados
Como se muestra más abajo en la Tabla 4, cuando se administra sTNFR-I 2.6D/C106db como se ha descrito antes, 1 hora antes de la sensibilización con LPS/DGalNH_{2}, la DE_{50} (esto es, la dosis de sTNFR-I 2.6D/C106db requerida para una protección del 50%) a las 48 horas es de \sim50 \mug/kg (N=8 ratones individuales). En comparación con el sTNFR-I 4D/C105db, no existen diferencias significativas (P > 0,05) en la capacidad de esta forma para evitar la letalidad (DE_{50} = \sim50 \mug/kg; N=8 ratones individuales).
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TABLA 4 Comparación de sTNFR y formas de sTNFR Truncado Optimizado en el Modelo LPS/D-GaINH_{2} 
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Los datos indican que sTNFR-I 2.6D/C106db tiene una actividad equivalente en comparación con sTNFR-I 4D/C105db, pero que sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) es menos activo en este modelo con una DE_{50} of \sim400 \mug/kg (n=5 ratones individuales). Adicionalmente, la actividad del sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20 kDa ramificado) y 2.6D/N105-MePEG (40 kDa ramificado) es menor en este modelo.
E. Modelo de Artritis inducido por Coadyuvante
La artritis reumatoide inducida en ratas por coadyuvante guarda muchas semejanzas con la artritis reumatoide humana. El propósito de este experimento es demostrar que la administración generalizada de sTNFR truncados tiene un efecto atenuante de la patogénesis de la artritis inducida por coadyuvante en ratones.
Protocolo
Se canulan ratas Lewis macho (5-7/grupo) (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) que pesan al menos 200g con catéteres SQ y se deja que se recuperen durante varios días. Después se colocan en jaulas de infusión y se aclimatan durante una semana antes de iniciar la infusión salina.
El día 0, se inyectan en todas las ratas 100 \mul de Coadyuvante Completo de Freund (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al que se añade coadyuvante sintético, N,N-dioctildecildecil-N',N-bis(2-hidroxi-etil)propanodiamina, 50 mg/ml. El día 8, se administran a diferentes grupos de ratas sTNFR-I 4D/C105 y sTNFR-I 2.6D/N105 mediante infusión SQ continua.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
TABLA 5 Artritis inducida por coadyuvante
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Sorprendentemente el sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y el sTNFR-I 4D/C105db tienen una actividad anti-artrítica comparable en la artritis por coadyuvante en ratas Lewis, aunque el sTNFR-I 4D/C105db es más potente en los análisis de citotoxicidad WEHI-164 y L929 in vitro, así como en el modelo LPS/GalN.
F. Modelo de artritis inducida por Colágeno
La artritis inducida por colágeno de tipo II en ratas guarda muchas semejanzas con la artritis reumatoide humana. El propósito de este experimento es demostrar que la administración generalizada de sTNFR truncados tiene un efecto atenuante sobre la patogénesis de la artritis inducida por colágeno de tipo II en ratas y ratones.
Protocolo con Ratas
Las ratas Lewis hembra (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA), tenían cánulas implantadas SQ y estaban aclimatadas a las trabas de la infusión continua. Con posterioridad fueron inmunizadas con colágeno de tipo II bovino en coadyuvante completo de Freund. Los días 13, 14 o 15 después de la inmunización, los animales con artritis establecida fueron subdivididos al azar en grupos de ocho animales cada uno. Los grupos experimentales son infundidos con vehículo o diversas dosis de sTNFR-I como se describe en la Tabla 6 durante 7 días. Se evalúa la inflamación de la para mediante medición con un calibre de las articulaciones del tobillo diariamente. El día 7, los animales se someten a eutanasia y se recogen las patas para la determinación del peso como un índice de la inflamación. Las articulaciones del tobillo y la rodilla se recogen para la evaluación histopatológica de los parámetros de la artritis.
Los resultados se exponen en la Tabla 6A.
TABLA 6A Artritis inducida por colágeno
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Interesantemente, en el modelo de colágeno establecido en rata todos los grupos de tratamiento tienen casi la misma eficacia (p. ej.; forma de la curva, porcentaje (%) de inhibición del área bajo la curva (AUC), que oscila entre el 30-59%, e inhibición de peso de la pata que oscila entre 40-64%. Ningún grupo de tratamiento es estadísticamente diferente de cualquier otro en este modelo de artritis.
Protocolo en ratón
Se inmunizan ratones DBA/1 macho (Jackson Laboratories, Inc., Bar Harbor, ME), con colágeno bovino de tipo II (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) en coadyuvante completo de Freund. Los días 24, 25 y 26 después de la inmunización, los animales con artritis establecida son subdivididos al azar en grupos de ocho animales cada uno. A los grupos experimentales se les administra dos veces al día por ruta IP o bien solución salina o bien sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33 kDa), durante 3 días consecutivos (días +27, +28, +29). Se evalúa la inflamación de la pata mediante medición con calibre de las articulaciones del tobillo. El día +34, se someten a eutanasia los animales y se recogen las patas para la determinación del peso como índice de inflamación. Las articulaciones del tobillo y la rodilla se recogen para la evaluación histopatológica de los parámetros artríticos.
Los resultados se muestran en la Tabla 6B.
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TABLA 6B Artritis inducida por colágeno
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G. Modelo en Rata de Infusión Continua de Producción de TNF-\alpha Inducida por LPS
Se implantan IV en la yugular sTNFR-I 2.6D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C106db, sTNFR-I 2.6D/N105 y sTNFR-I 4D/N105 con minibombas Alzet® (Alza Corp., Palo Alto, CA), según las instrucciones del fabricante, para una infusión continua durante 48 horas (1 mg/kg). Los niveles en suero de TNF-\alpha, medidos mediante un ELISA (Genzyme, Cambridge, MA) disminuyen significativamente en comparación con los controles +2 horas después de una sensibilización con LPS de dosis elevada.
Ejemplo III Estudios de Inmunogenicidad
Se evalúan diversas formas de TNFR-I solubles recombinantes, truncadas en cuanto a la inmunogenicidad en diversos modelos animales.
A. Roedores
Se administran subcutáneamente sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y sTNFR-I 4D/C105db (control) (4 mg/kg) los días 1 y 5 de los experimentos a ratas Sprague Dawley hembra (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) (n=6-8/grupo). Se recogen muestras de sangre retro-orbital semanalmente hasta el día 21 después de la administración inicial. Las muestras se evalúan en cuanto a la producción de los anticuerpos IgM e IgG.
TABLA 7 Inmunogenicidad en Roedores
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Como se observa en la Tabla 7, sTNFR-I 4D/C105db administrado subcutáneamente (SC) los días ^{+}1 y ^{+}5, registra los títulos de anticuerpo IgG anti sTNFR-I de rata superiores los días ^{+}21 que el sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) que tenía títulos de anticuerpo muy débiles, si los tenía. También se observan tendencias similares en la inmunogenicidad en ratas que desarrollan anticuerpos IgM anti-sTNFR-I de rata los días ^{+}21. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) no genera anticuerpos IgM anti-sTNFR de rata los días ^{+}21.
B.Papio anubis
El objetivo de la Parte 1, Fase A del estudio es determinar la farmacocinética e inmunogenicidad de sTNFR-I 4D/C105db (0,2 mg/kg peso corporal [PC]), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg PC), o sTNFR-I 2.6D/C105db (0,2 mg/kg PC), respectivamente, cuando se administraban IV dos veces al babuino sano, con una diferencia de 21 días.
El estudio de la Parte 1 se divide en dos fases. La Parte 1, Fase A está destinada a determinar la farmacocinética e inmunogenicidad de los diferentes constructos de sTNF-RI en el babuino sano en respuesta a dos inyecciones. Se subdividen doce babuinos en tres grupos. Mientras se anestesian, cada grupo recibe 0,2 mg/kg PC de sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 3D/C105db, o sTNFR-I 2.6D/C105db. Se estudian tres babuinos en cada sesión. Los animales son vigilados durante 21 días y después reciben una segunda inyección IV idéntica de proteína y se estudian durante 21 días más. Se determinan la farmacocinética y la inmunogenicidad a intervalos después de eso.
La parte 1, Fase B del estudio está destinada a evaluar la eficacia de estas preparaciones en un modelo bien establecido de letalidad mediada por TNF-\alpha (Espat et al., J. Surg. Res., 59:153-158, 1995). La bacteremia por E. coli letal es inducida en 16 animales en grupos de cuatro, mediante la administración de 5-10 x 10^{10}cfu/kg de E. coli viva. Se compara un grupo placebo con los babuinos pretratados IV con sTNFR-I 4D/C105db (0,2 mg/kg peso corporal [PC]), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg PC), o sTNFR-I 2.6D/C105db administrados a 1 mg/kg PC.
En ambas fases del estudio de la Parte 1, se mantuvieron en ayunas babuinos macho y hembra adultos Young Papio anubis (6-11 kg) (Biomedical Research Foundation, San Antonio, TX) durante la noche. Los animales se anestesiaron con cetamina (10 mg/kg i.m.) y se insertó una cánula percutáneamente en la vena cefálica. La anestesia se mantiene mediante la administración inicial de hasta 35 mg/kg de pentobarbital sódico seguido de inyecciones repetidas de 3-5 mg/kg/hr de pentobarbital sódico. La vía respiratoria superior se asegura mediante la colocación de un tubo endotraqueal con globo, y los animales mantienen su respiración espontánea. Se coloca percutáneamente un catéter en la arteria femoral que permite la toma repetida de muestras de sangre arterial generalizada así como el control continuo del ritmo cardíaco y la presión sanguínea arterial media por medio de un monitor cardíaco con monitor de anestesia Datascope 2000 (Datascope, San Antonio, TX). Se recogen muestras de sangre arterial a intervalos, con anti-coagulante de EDTA o heparina, y se enfrían sobre hielo inmediatamente después de la recogida. Se separa la fracción de plasma mediante centrifugación a 4ºC, y se almacena a -70ºC hasta que se analiza. Se controla la temperatura interna vía una sonda rectal. Se coloca un catéter urinario permanente de tipo Foley para permitir la recogida de orina y para controlar la excreción de orina y el aclaramiento de creatinina. Se controlan los parámetros hemodinámicos cada quince minutos. Todos los animales reciben cloruro de sodio al 0,9% (4 ml/kg) como fluido de mantenimiento i.v. En los estudios de la fase B, los animales reciben fluido adicional (10 ml/kg cada 15 min), si se satisfacen dos de los siguientes criterios fisiológicos: 1) la presión media arterial caía en más del 30%; 2) el ritmo cardíaco se incrementaba en más del 30%, y 3) la excreción de orina caía a <1 ml/kg/hr. Después de la toma de muestras de sangre de la línea base y de un período de espera de al menos una hora para permitir el equilibrado se inicia la infusión de
proteínas.
En el grupo de estudios de la Parte 1 Fase A, se infunden proteínas recombinantes vía la vena cefálica y se observan los animales durante un período de ocho horas después de cuyo momento se separan todos los catéteres y los animales se hacen volver a sus jaulas durante 21 días. A las 24 y 48 horas y los días 3, 5, 8, 11, 16, y 21, los animales se anestesian brevemente con cetamina IM (10 mg/kg) y se obtienen muestras de sangre venosa. El día 21, los animales se vuelven a anestesiar, reciben una segunda inyección de la proteína, y se repite el procedimiento completo realizado el día cero durante 21 días más, en cuyo momento los animales se someten a eutanasia.
En los estudios de la Parte 1 fase B, una hora antes de la infusión de E. coli, se asignan cuatro animales al azar para recibir placebo o uno de los constructos mencionados anteriormente. Se observan los animales durante un período de ocho horas momento después del cual se separan todos los catéteres, los animales se hacen volver a sus jaulas y se observa la posterior supervivencia a la bacteramia letal. Los animales con un exceso de malestar se someten a eutanasia. El excesivo malestar es definido por IACUC como: 1) fracaso al mantenerse sentado o en posición erguida a lo largo de las 12 horas previas, 2) fracaso al tomar alimento o agua en las 12 horas previas, 3) sangrado incontrolable de los sitios de los catéteres, o 4) insensibilidad a los estímulos externos. Se obtienen muestras de sangre venosa a las -1, 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24 horas, 48 horas, y los días 3, 5, 8, 11, 16, y 21. A los 21 días, se someten a eutanasia los animales supervivientes.
La presencia de anticuerpos de Papio para las proteínas recombinantes administradas se determina mediante ELISA sándwich. Muy brevemente, los constructos de sTNFR-1 se aplican como recubrimiento sobre las placas de ELISA (1 \mug/ml) y se añaden los plasmas de babuino diluidos (1:50 a 1:100.000) (100 \muL). Una vez que las muestras se han lavado, se añade proteína A conjugada con peroxidada de rábano picante (HRP) (0,5 \mug/ml), y los análisis se visualizan con TMB.
Resultados (Parte I)
Las vidas medias en plasma diferían significativamente entre los tres constructos. La desaparición de curvas se determina utilizando un método independiente del modelo y las vidas medias aparentes se evalúan generalmente entre 8 y 172 horas. En los animales nunca sometidos a tratamiento "naïve", la vida media en plasma es la más larga en los babuinos tratados con el constructo del dominio 4.0 (29 horas) y disminuye sucesivamente en los babuinos tratados con sTNFR-I 3D/C105db (24,7 horas) y sTNFR-I 2.6D/C105db (21,5 horas). La diferencia, aunque estadísticamente significativa, es solamente del 26%.
Inesperadamente, después de la segunda administración de las proteínas a los respectivos babuinos, las vidas medias en plasma tienden a ser mucho más cortas, indicando un aclaramiento más rápido. Esta disminución de la vida media es muy pronunciada en los babuinos que reciben sTNFR-I 4D/C105db donde ésta se acorta en un 48% (p<0,01) [Figura 10]. Las reducciones en la vida media son intermedias en los babuinos tratados con sTNFR-I 3D/C105db (31%) [Figura 11] y menores en los animales a los que se ha administrado sTNFR-I 2.6D/C105db (14%) [Figura 12]. Las reducciones en la vida media no son estadísticamente diferentes en los babuinos tratados con sTNFR-I 2.6D/C105db.
Todas las preparaciones son inmunogénicas en babuinos. Sin embargo, la frecuencia de inmunogenicidad es mayor en los babuinos tratados con sTNFR-I 4D/C105db, intermedia en los animales tratados con sTNFR-I 3D/C105db, y más baja en los animales a los que se ha administrado sTNFR-I 2.6D/C105db (Tabla 8).
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TABLA 8 Respuestas de Anticuerpos Pico^{1}
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Las respuestas de anticuerpos se desarrollaban generalmente entorno al día ocho después de la administración de los constructos y están presentes el día 21 del período de estudio. Además, las respuestas de anticuerpos tienden a ser más fuertes durante la respuesta a la segunda inyección de constructos de proteína.
Los cuatro babuinos que recibían sTNFR-I 4D/C105db desarrollaban anticuerpos, dos de los cuatro animales que recibían sTNFR-I 3D/C105db desarrollaban anticuerpos y uno de los cuatro babuinos que recibían sTNFR-I 2.6D/C105db desarrollaban anticuerpos. Mediante ANOVA de Kruskall-Wallis, la magnitud de la respuesta de anticuerpos (transformado log) es significativamente diferente entre los tres grupos como una función del tiempo (p<0,05). Los análisis post-hoc sugieren que la diferencia significativa en las respuestas de anticuerpos está principalmente entre los animales que reciben sTNFR-I 4D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C105db con respuestas intermedias (y no significativas) de los animales tratados con sTNFR-I 3D/C105db.
Se observa una relación correlativa entre el desarrollo de anticuerpos y el cambio en el aclaramiento entre los dos estudios de 21 días (p<0,01). De manera no inesperada, en aquellos animales que desarrollan una respuesta de anticuerpos fuerte después de la primera administración de constructo, la proteína es aclarada más rápidamente después de la segunda administración. Se compara el cambio en el aclaramiento entre la primera y la segunda inyección entre los animales que desarrollaban una respuesta de anticuerpos (n=7) y aquellos que no (n=5) [Figura 13].
Los anticuerpos que se detectan en el plasma de los babuinos se evalúan en un número seleccionado de animales en cuanto a la citotoxicidad directa en la línea celular ME-180 y la capacidad neutralizadora en un análisis con L-929. No se observa no citotoxicidad ni neutralización con los anticuerpos generados para ninguno de los tres constructos.
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En el estudio con babuinos de la Fase I Parte A, los animales que desarrollan las respuestas de anticuerpos más fuertes también tienen el incremento más rápido en el aclaramiento de los constructos después de su segunda administración. De este modo, tales descubrimientos sugieren que las respuestas de anticuerpos pueden reducir la vida media biológica y de este modo, se puede requerir un ajuste de la eficacia terapéutica de los constructos, y la dosis. Sin embargo, no parece haber ninguna respuesta clínica adversa a la presencia de los anticuerpos cuando se administran los constructos una segunda vez. De este modo, los esfuerzos terapéuticos para modificar tales constructos para reducir la inmunogenicidad, sin afectar significativamente a la vida media o a la eficacia, están destinados principalmente a reducir la necesidad de incrementar los ajustes de la dosis, y no el riesgo de las reacciones adversas.
Resultados de la Parte 1 Fase B
Finalmente, en el babuino nunca sometido a tratamiento, los tres constructos son casi igualmente eficaces al evitar la lesión mediada por citocinas después de la bacteremia por E. coli cuando se administran a una dosis de 1,0 mg/kg PC. Uno de los 4 babuinos tratados con placebo sobrevive; 4 de los 4 babuinos tratados con sTNFR-I 4D/C105db- y sTNFR-I 3D/C105db sobreviven; y 3 de los 4 babuinos tratados con sTNFR-I 2.6D/C105db sobreviven, respectivamente. Los tres constructos evitan la bioactividad de TNF\alpha y proporcionan un exceso de capacidad neutralizadora.
Parte II
El propósito específico del estudio de la Parte II en babuinos es determinar si una exposición repetida (esto es 3 inyecciones separadas) de los animales a diversos constructos de sTNF-RI da como resultado una inmunogenicidad adicional y disminuye las vidas medias. Adicionalmente, este estudio se diseña para comparar la inmunogenicidad y la farmacocinética de varios constructos de sTNF-RI, incluyendo sTNFR-I 2.6D/C105db y sTNFR-I 4D/C105db, y sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa). Finalmente, este estudio está diseñado para evaluar la transcendencia clínica de la respuesta de anticuerpos y alterar el aclaramiento de la respuesta subsiguiente a la sensibilización por una lesión mediada por TNF\alpha (bacteremia por E. coli).
Los días 0, 21 y 42, se administran a los babuinos I.V. 0,2 mg/kg de los diversos constructos (sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa), o sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa), respectivamente). El día *63, los babuinos reciben 2,0 mg/kg PC de sus respectivos constructos. El día *65 (esto es; 48 horas más tarde), los babuinos son sensibilizados con una dosis letal de E. coli como se esboza en la Parte I anterior. Los principales descubrimientos de la Parte II son los siguientes:
Resultados (Parte II)
En general, sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) tienen vidas medias más largas que TNFR-I 4D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C105db en el babuino nunca sometido a tratamiento, con independencia del número de dominios. Las vidas medias oscilan entre 30-35 horas para las formas STNFR-I monopegiladas en comparación con 10-20 horas para las formas pegiladas diméricas. Adicionalmente, sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y TNFR-1 4D/C105db tienen vidas medias más largas que 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y sTNFR-I 2.6D/C105db en el animal nunca sometido a tratamiento.
sTNFR-I 4D/C105db y sTNFR-I 2.6D/C105db también son inmunogénicos, con una modesta tendencia a una reducción de la inmunogenicidad con sTNFR-I 2.6D/C105db. No obstante, solamente TNFR-I 4D/C105db muestra una reducción del aclaramiento con las administraciones repetidas. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) no son antigénicos, ni sus tasas de aclaramiento cambian significativamente con la administración repetida.
El suero obtenido de cada babuino (N=3) tratado con diferentes compuestos los días ^{+}21, día ^{+}42, y día ^{+}61 son evaluados in vitro en cuanto a la inmunorreactividad (por medio de un ELISA de captura sándwich) para otros constructos utilizando los constructos diferentes a los del antígeno de captura. Por ejemplo, el suero obtenido de babuinos a los que se ha administrado 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) el día ^{+}21 (Tabla 9) no "reacciona" con ninguno de sTNFR-I 4D/C105db o sTNFR-I 4D/N105 cuando estos compuestos se utilizan sobre una placa ELISA como antígeno de captura.
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Una reacción positiva es una repuesta de anticuerpos de título >1:400. Los datos del día ^{+}42 y ^{+}61 se muestran en las Tablas 10 y 11. Importantemente, existe una reacción positiva in vitro con el suero obtenido de un babuino tratado previamente con 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) cuando se somete a ensayo frente al antígeno de captura de sTNFR-I 4D/C105db (Tabla 11).
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En el babuino expuesto previamente a los constructos tres veces, la eficacia para una respuesta a una lesión mediada por TNF\alpha es la más grande de (1) sTNFR-I 4D/C105db, (2) sTNFR-I 2.6D/C105db, (3) sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) y (4) 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) (como se determina mediante la supervivencia, el fallo multiorgánico de los sistemas (MSOF), la IL-6 en suero y las respuestas WBC). La "advertencia" es que este estudio no consideraba las diferencias en la capacidad neutralizadora de TNF de los diferentes constructos.
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C. Chimpancé
El objetivo de este estudio es evaluar la inmunogenicidad de las diferentes formas de sTNF-RI que son inyectadas repetidamente a lo largo de un período de un mes. Las formas de sTNF-RI sometidas a ensayo en este estudio son: sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa), sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa), y sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa). Existen un total de 3 Chimpancés por grupo de tratamiento.
El régimen de dosificación/parámetros de este estudio son los siguientes: Cada chimpancé recibe el artículo de ensayo en forma de una inyección de bolo intravenoso 0,1 mg/kg, dos veces a la semana los Lunes y Viernes durante 4 semanas (8 dosis en total). El volumen de la dosis es variable dependiendo de la concentración del artículo de ensayo suministrado. Se obtiene una muestra de suero de 5 ml de cada animal el Día 0 antes del tratamiento. Se obtienen muestras de suero adicionales los días 7, 14, 21, y 28.
Los datos brutos de la inmunogenicidad en chimpancé se muestran en la Tabla 12.
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(Tabla pasa a página siguiente)
26
El día ^{+}28, todos los animales (N=3) tratados con sTNFR-I 4D/C105db o sTNFR-I 2.6D/C105db registran una reacción positiva (medida mediante ELISA), con el título más alto observado como 1:12.800 o 1:3200, respectivamente (Tabla 12) (Nota: En esta parte del experimento, todos los antígenos "inmunizadores" se utilizan como los correspondientes antígenos de captura inmovilizados sobre la placa de ELISA). Un animal tratado con sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) tiene una reacción de anticuerpos positiva los días ^{+}21 y ^{+}28 (Tabla 12). Importantemente, no se observa que los animales tratados con sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa) o sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) hayan desarrollado anticuerpos anti-sTNFR-I a lo largo de todo el experimento (Tabla 12).
Como se describe en la sección experimental con babuinos anterior, los sueros obtenidos de cada chimpancé (N=3) tratado con las diferentes formas de sTNF-RI los días ^{+}28 son evaluados in vitro en cuanto a la inmunorreactividad (mediante ELISA) con otros constructos utilizando formas de sTNF-RI como antígeno de captura. Una reacción positiva es una respuesta de anticuerpos de título >1:400. Importantemente, el suero obtenido de chimpancés a los que se ha administrado sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33 kDa) no "reacciona" con sTNFR-I 4D/C105db, o sTNFR-I 4D/N105 cuando estos compuestos se utilizan en la placa de ELISA como antígeno de captura (Tabla 13).
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(Tabla pasa a página siguiente)
27
Esto también se observa con animales tratados con sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kDa), o sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33 kDa) (Tabla 13).
Ejemplo IV
La EAE es una enfermedad desmielinizante inflamatoria con recaídas agudas o crónicas del SNC que resulta de la sensibilización de los animales genéticamente susceptibles con neuroantígenos tales como la proteína básica de mielina (MBP). La EAE es un modelo animal aceptado en la técnica y utilizado a menudo para MS humana.
Se anestesian ratas Lewis hembra (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y se inmunizan el Día 0 en la almohadilla de la pata del miembro posterior izquierdo con 0,1 mL de una emulsión que contiene proteína básica de mielina (MBP) en coadyuvante completo de Freund disuelto en solución salina tamponada con fosfato (PBS) con un volumen igual de coadyuvante completo de Freund (CFA) que contiene 5 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Lab MI). Las ratas de control reciben 0,1 ml de la emulsión de PBS/CFA sin MPBP en la almohadilla del pie del miembro posterior izquierdo.
La evaluación de la enfermedad clínica se basa en un sistema de puntuación de 0 a 5 convencional. El espectro de la clasificación es: 0, normal; 0,5, pérdida parcial de tono en la cola; 1, pérdida completa de tono en la cola, 2, arrastre de un miembro posterior; 3 parálisis de ambos miembros posteriores; 4, morbilidad; y 5, muerte. Todas las inyecciones de constructos de sTNFR-I o vehículo se administran a 1 mg/kg S.C. en días alternos empezando el día 9 después de la inmunización. Todos los animales están terminados el día 21. Los resultados se expresan en dos formas, puntuación de la gravedad clínica como función del tiempo, y puntuación clínica integrada para cada rata a lo largo del curso de la enfermedad calculado como el área bajo la curva de la puntuación clínica diaria versus el tiempo. Los valores de los grupos tratados para la puntuación clínica integrada se comparan estadísticamente con los del grupo de control utilizando la prueba de Mann-Whitney.
Los animales tratados con vehículo tienen un comienzo de enfermedad en torno al día 10, la enfermedad presenta un pico en día 16 y después declina. El sTNFR-I 4D/C106db atenúa los síntomas clínicos aproximadamente un 73%, cuando se comparan con los animales tratados con vehículo. El sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kda) también atenúa los síntomas clínicos aproximadamente un 85%. El sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33 kda) y el sTNFR-I 2.6DN105-t-BuPEG(33 kDa) son igualmente potentes al atenuar los síntomas clínicos (64 y 57%, respectivamente).
En conclusión, parece que los sTNFR truncados son eficaces en la mediación de algunas de las secuelas clínicas de este modelo animal de MS.
<110> Amgen Inc.
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<120> TRUNCATED SOLUBLE TUMOR NECROSIS FACTOR TYPE-I AND TYPE-II RECEPTORS
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<130> A415Erev
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\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US 97/12244
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<141> 1997-07-09
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/021,443
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1996-07-09
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/032,534
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 1996-12-06
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/037,737
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<151> 1997-01-23
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/039,314
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<151> 1997-02-07
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/039,792
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<151> 1997-03-04
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<160> 81
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<210> 1
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<211> 483
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1) .. (483)
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<400> 1
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28 
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<210> 2
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<211> 161
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 2
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29 
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<210> 3
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<211> 332
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(324)
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<400> 3
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30 
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<210> 4
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<211> 106
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 4
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31 
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<210> 5
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<211> 339
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(333)
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<400> 5
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32 
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<210> 6
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 6
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33 
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<210> 7
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<211> 333
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(324)
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34 
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<211> 106
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 8
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35 
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<210> 9
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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36 
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<213> Humana Recombinante
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<400> 10
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37 
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<211> 315
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(309)
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<400> 11
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38 
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<211> 101
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<212> PRT
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<213> Humano Recombinante
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<400> 12
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39 
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<211> 294
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<220>
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<221> CDS
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<222> (4)..(288)
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<400> 13
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40 
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<212> PRT
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<213> Humano Recombinante
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41 
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<213> Humano Recombinante
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<400> 15
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 22
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\sa{Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys}
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\sa{Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys}
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<210> 27
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 27
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\sa{Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys}
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<210> 28
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 28
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\sa{Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile}
\sac{Cys}
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<210> 29
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<211> 18
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser}
\sac{Ile Cys}
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<210> 30
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<222> (1)..(705)
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42 
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
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<213> Humana Recombinante
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 50
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\sa{Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln}
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
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\sa{Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala}
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln}
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<211> 22
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 54
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\sa{Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp}
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr}
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<400> 56
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\sa{Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr}
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\sa{Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg}
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\sa{Ala Gln Cal Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys}
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<211> 30
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana Recombinante
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<400> 62
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala pro Glu Pro Gly Ser Thr}
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<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
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\sa{Leu Pro ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser}
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<211> 4
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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<211> 6
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\sa{ala Pro Leu Arg Lys Cys}
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Humana Recombinante
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\sa{Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg}
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<211> 31
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<212> ADN
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ggttagccat atggacagcg tttgccccca a 
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 
\hfill
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<213> Humano Recombinante
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\hskip-.1em\dddseqskip
actcgaggat ccgcggataa ataagtaacg atccggtcca 
\hfill
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caggtcggat cctatcagca gaagcactgg aaaaggtttt c 
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 72
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\hskip-.1em\dddseqskip
ggttagccat atggacagcg tttgccccca a 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 73
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgcggatccc tattaattga agcactggaa aagg 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano Recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccccatatgt atatccaccc tcaaaataat 
\hfill
30 
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<210> 75
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 75
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cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 38
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccccatatgt cgattagctg taccaagtgc cacaaagg 
\hfill
38 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 77
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\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 
\hfill
33 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano Recombinante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
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ccccatatgt gtaccaagtg ccacaaagga 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
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<211> 33
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano Recombinante
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagcttt tacagagagc aattgaagca ctg 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 80
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<211> 31
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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<400> 80
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ggttagccat atggacagcg tttgccccca a 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
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<212> ADN
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<213> Humano Recombinante
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaagcttt taggtgcaca cggtgttctg ttt 
\hfill
33

Claims (28)

1. Un sTNFR truncado que tiene la siguiente fórmula:
R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-R_{2}
donde [Cys^{19}-Cys^{103}] representa los restos 19 a 103 de sTNFR-I, cuyo esquema de numeración de restos aminoácido se proporciona en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) para facilitar la comparación;
donde R_{1} representa un grupo amina metionilado o no metionilado de Cys^{19} o del resto o los restos aminoácido del extremo amino seleccionados del grupo:
\vskip1.000000\baselineskip
44 
\vskip1.000000\baselineskip
y donde R_{2} representa un grupo carboxi de Cys^{103} o de restos aminoácido carboxi terminales seleccionados del grupo:
46
donde dicho sTNFR tiene una antigenicidad reducida en comparación con el TNFR-I que comprende los tres primeros dominios; y las muteínas de deleción y/o sustitución de los mismos capaces de inhibir el TNF y tener una homología con la secuencia nativa de dicho sTNFR de más del 70%; y productos conjugados de dicho sTNFR con polímeros solubles en agua, donde los productos conjugados no contienen el cuarto dominio de TNFR.
2. El sTNFR truncado según la reivindicación 1, seleccionado entre NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FC-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C105): NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}
-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.60/C106); NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FN-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/N105); NH_{2}-MYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}-FNCSL-
COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d8): NH_{2}-M-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d18); y NH_{2}-MSIS-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.3D/d15).
3. La proteína de unión de necrosis tumoral según la reivindicación 1 o 2, donde dicha secuencia de aminoácidos no está glicosilada.
4. La proteína de unión de necrosis tumoral según la reivindicación 1 o 2, donde dicha secuencia de aminoácidos está glicosilada.
5. La proteína de unión de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proteína está conjugada con un polímero soluble en agua.
6. Una proteína de unión de necrosis tumoral polivalente que comprende al menos una proteína de unión de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Una proteína de unión de necrosis tumoral polivalente que tiene la fórmula R_{a}-X-R_{b}, donde:
X comprende un conector, donde dicho conector es un polímero soluble en agua; y
R_{a} y R_{b} son moléculas biológicamente activas unidas covalentemente a dicho polímero soluble en agua, donde al menos uno de R_{a} y R_{b} es una proteína de unión de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. La proteína de unión de necrosis tumoral polivalente de la reivindicación 7, donde el polímero soluble en agua es polietilenglicol.
9. La TNFbp según la reivindicación 8, donde dicho sTNFR truncado se selecciona entre R_{a}-X-R_{b}, donde:
X comprende un conector, donde dicho conector es PEG-20.000-bis-vinilsulfona; y
R_{a} y R_{b} son cada uno NH_{2}-MDSVCPOGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FC-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C105); o
R_{a}-X-R_{b}, donde;
X comprende un conector, donde dicho conector es PEG-20.000-bis-vinilsulfona;
y
R_{a} y R_{b} son cada uno NH_{2}-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSL-COOH (también referido como sTNFR-I 2.6D/C106).
10. La proteína de unión de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por TNF.
11. La proteína de unión de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para su uso en el tratamiento de la artritis.
12. Un polinucleótido que codifica la proteína de unión de necrosis tumoral según la reivindicación 1 o 2.
13. Una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de unión del factor de necrosis tumoral donde la secuencia de nucleótidos se selecciona entre las siguientes:
(a) una secuencia de ADNc como se muestra en la Fig. 2;
(b) una secuencia de ADNc como se muestra en la Fig. 3;
(c) una secuencia de ADNc como se muestra en la Fig. 4;
(d) una secuencia de ADNc como se muestra en la Fig. 5;
(e) una secuencia de ADNc como se muestra en la Fig. 6;
(f) una secuencia de ADNc como se muestra en la Fig. 7;
(g) una secuencia que es degenerada en las regiones codificadoras o porciones de las mismas de (a), (b), (c), (d), (e) y (f); y
(h) una secuencia que es complementaria a (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) y (h),
siempre que sin embargo, el ácido nucleico no codifique una proteína que tenga la fórmula R_{1}-[Cys^{19}-Cys^{103}]-FNCSLCL-R_{3}
donde [Cys^{19}-Cys^{103}] representa los restos 19 a 103 de sTNFR-I, cuyo esquema de numeración de los restos aminoácido se proporciona en la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) para facilitar la comparación;
donde R_{1} representa un grupo amina metionilado o no metionilado de una secuencia de aminoácidos que comprende NNSIC y R_{3} representa un grupo carboxilo de los restos aminoácido Asn^{111}-Asn^{161} de la Figura 1 o un truncamiento carboxi terminal de Asn^{111}-Asn^{161} de la Figura 1.
14. Un polinucleótido que tiene la secuencia mostrada en las Figuras 2, 3, 4, 5, 6 o 7.
15. Un vector que comprende un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14 conectado operativamente a una secuencia de control de la expresión.
16. Una célula anfitriona procariótica o eucariótica que contiene un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
17. Un método que comprende desarrollar células anfitrionas de la reivindicación 16 en un medio nutriente adecuado y, opcionalmente, aislar dichos sTNFR truncados de dichas células o dicho medio nutriente.
18. El método para producir la proteína de unión de necrosis tumoral según la reivindicación 17, donde dichas células anfitrionas son de E. coli.
19. El método para producir la proteína de unión del factor de necrosis tumoral según la reivindicación 17, donde dichas células anfitrionas son células de ovario de hámster Chino.
20. Un método que comprende las etapas de:
(a)
cultivar una célula anfitriona procariótica o eucariótica de la reivindicación 16;
(b)
mantener dicha célula anfitriona en condiciones que permitan la expresión del sTNFR truncado por dicha célula anfitriona; y
(c)
aislar opcionalmente el sTNFR truncado expresado por dicha célula anfitriona.
21. Una proteína de unión de necrosis tumoral que es el producto de la expresión recombinante de una célula anfitriona procariótica o eucariótica que contiene un polinucleótido exógeno de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
22. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión del factor de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 asociada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
23. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión del factor de necrosis tumoral producida según el método de la reivindicación 17 asociada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
24. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión del factor de necrosis tumoral producida según el método de la reivindicación 20 asociada con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
25. Un método de preparación de una composición farmacéutica donde una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de unión del factor de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
26. El uso de la proteína de unión del factor de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para preparar un medicamento para tratar una enfermedad mediada por TNF.
27. El uso según la reivindicación 26, donde la enfermedad mediada por TNF es la artritis.
28. Un kit para preparar una formulación de proteína acuosa que comprende la proteína de unión del factor de necrosis tumoral según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un segundo recipiente que tiene un disolvente fisiológicamente aceptable.
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