DE69737814T2 - Gekürzte lösliche typ-i-rezeptoren für tumor-nekrose-faktor - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Entzündung. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf trunkierte Tumornekrosefaktor-Rezeptoren (sTNFRs).
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Entzündung ist die Abwehrreaktion des Körpers auf Verletzungen, wie z.B. solche, die durch mechanischen Schaden, Infektion oder antigene Stimulation verursacht werden. Eine Entzündungsreaktion kann sich pathologisch äußern, wenn die Entzündung durch einen ungeeigneten Stimulus, wie z.B. ein Autoantigen, induziert wird, sich in übertriebener Weise äußert oder weit nach dem Entfernen des schädlichen Agens fortbesteht. Eine derartige Entzündungsreaktion kann die Produktion bestimmter Zytokine umfassen.
  • Während die Ätiologie der Entzündung kaum verstanden ist, wurden in letzter Zeit beachtliche Informationen bezüglich der molekularen Aspekte der Entzündung gewonnen. Diese Forschung hat zu der Identifizierung bestimmter Zytokine geführt, von denen man glaubt, dass sie eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Entzündung spielen. Zytokine sind extrazelluläre Proteine, die das Verhalten von Zellen modifizieren, insbesondere von solchen Zellen, die sich in dem unmittelbaren Bereich der Zytokinsynthese und -freisetzung befinden. Tumornekrosefaktoren (TNFs) sind eine Klasse von Zytokinen, die von einer Vielzahl von Zellarten produziert werden, einschließlich Monozyten und Makrophagen.
  • Wenigstens zwei TNFs wurden zuvor beschrieben, und zwar TNF alpha (TNF-α) und TNF beta (TNF-β oder Lymphotoxin), und jedes ist als trimeres Molekül aktiv, und man glaubt, dass es die zelluläre Signalgebung durch Kreuzvernetzen von Rezeptoren initiiert (Engelmann et al. (1990), J. Biol. Chem., 265:14497-14505).
  • Mehrere Beweisketten schließen TNF-α und TNF-β als wichtige inflammatorische Zytokine ein. Diese bekannten TNFs haben wichtige physiologische Wirkungen auf etliche verschiedene Zielzellen, die an inflammatorischen Antworten auf eine Vielzahl von Stimuli beteiligt sind, wie z.B. Infektion oder Verletzung. Die Proteine veranlassen sowohl Fibroblasten als auch Synovialzellen, latente Collagenase und Prostaglandin E2 zu sezernieren, und sie veranlassen Osteozyten, die Knochenresorption zu stimulieren. Diese Proteine erhöhen die oberflächenadhäsiven Eigenschaften von Endothelzellen für Neutrophile. Sie veranlassen außerdem Endothelzellen, Koagulanzaktivität zu sezernieren und verringern ihre Fähigkeit, Gerinnsel zu lysieren. Zusätzlich leiten sie die Aktivität von Adipozyten weg von der Lagerung von Lipiden, indem sie die Expression des Enzyms Lipoproteinlipase inhibieren. TNFs veranlassen Hepatozyten außerdem, eine Klasse von Proteinen zu synthetisieren, die als "akute Phase-Recktanten" bekannt sind, die als Pyrogene auf den Hypothalamus wirken (Selby et al. (1988), Lancet, 1 (8583):483; Starnes, Jr. et al. (1988), J. Clin. Invest., 82:1321; Oliff et al. (1987), Cell, 50:555; und Waage et al. (1987), Lancet, 1 (8529):355). Außerdem haben vorklinische Ergebnisse mit verschiedenen prädiktiven Tiermodellen für Entzündung, einschließlich der rheumatoiden Arthritis, nahegelegt, dass die Inhibition von TNF eine starke Auswirkung auf das Fortschreiten der Erkrankung und die Schwere der Erkrankung haben kann (Dayer et al. (1994), European Cytokine Network, 5(6):563-571 und Feldmann et al. (1995), Annals Of The New York Academy Of Sciences, 66:272-278). Darüber hinaus haben kürzliche vorläufige klinische Studien zur rheumatoiden Arthritis an Menschen mit Inhibitoren von TNF erfolgversprechende Ergebnisse gezeigt (Rankin et al. (1995), British Journal Of Theumatology, 3(4):4334-4342; Elliott et al. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1077-1081; und Paleolog et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1082-1091).
  • Proteininhibitoren von TNF sind auf dem Gebiet offenbart. EP 308 378 berichtet, dass ein aus dem Urin von fiebernden Patienten abgeleitetes Protein eine TNF-inhibierende Aktivität hat. Die Wirkung dieses Proteins beruht vermutlich auf einem kompetitiven Mechanismus auf der Ebene der Rezeptoren. EP 308 378 offenbart ein Protein, das ausreichend rein ist, um durch dessen N-Terminus charakterisiert zu werden. Jedoch lehrt diese Referenz keine DNA-Sequenz oder rekombinant hergestellten TNF-Inhibitor.
  • Rekombinant hergestellte TNF-Inhibitoren wurden ebenfalls auf dem Gebiet offenbart. Zum Beispiel lehren die EP 393 438 und EP 422 339 die Aminosäuresequenzen und Nukleinsäuresequenzen eines reifen, rekombinanten humanen "30 kDa TNF-Inhibitors" (ebenfalls bekannt als ein p55-Rezeptor und als sTNFR-I) sowie eines reifen, rekombinanten humanen "40 kDa-Inhibitor" (auch bekannt als ein p75-Rezeptor und als sTNFR-II), ebenso wie modifizierte Formen davon, z.B. Fragmente, funktionelle Derivate und Varianten. EP 393 438 und EP 422 339 offenbaren außerdem Verfahren zum isolieren der Gene, die für die Kodierung der Inhibitoren verantwortlich sind, das Klonieren der Gene in geeignete Vektoren und Zellarten und das Exprimieren der Gene, um die Inhibitoren zu produzieren. Es wurde gezeigt, dass der reife, rekombinante, humane 30 kDa TNF-Inhibitor und der reife, rekombinante, humane 40 kDa TNF-Inhibitor fähig sind, TNF zu inhibieren ( EP 393 438 , EP 422 339 , PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16221 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/34326 ).
  • sTNFR-I und sTNFR-II sind Mitglieder der Nervenwachstumsfaktor-/TNF-Rezeptor-Superfamilie von Rezeptoren, die den Nervenwachstumsfaktor-Rezeptor (nerve growth factor receptor, NGF), das B-Zelt-Antigen CD40, 4-188, das T-Zell-Antigen der Ratte MRC OX40, das Fas-Antigen und die CD27- und CD30-Antigene umfasst (Smith et al. (1990), Science, 248:1019-1023).
  • Das am stärksten konservierte Merkmal in dieser Gruppe von Zelloberflächenrezeptoren ist die Cystein-reiche extrazelluläre Liganden-Bindungsdomäne, die in vier sich wiederholende Motive von etwa 40 Aminosäuren unterteilt werden kann und die 4-6 Cysteinreste an Positionen enthält, die sehr konserviert sind (Smith et al. (1990), s. o.).
  • EP 393 438 lehrt weiterhin einen 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und einen 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53, die trunkierte Versionen des vollständig langen rekombinanten 40 kDa TNF-Inhibitorproteins darstellen, in denen 51 bzw. 53 Aminosäuren an dem Carboxyterminus des reifen Proteins entfernt sind. Entsprechend würde ein Fachmann erkennen, dass die vierte Domäne sowohl von dem 30 kDa TNF-Inhibitor als auch dem 40 kDa-Inhibitor für die TNF-Inhibiton nicht notwendig ist. Tatsächlich haben verschiedene Gruppen diese Einsicht bestätigt. Derivate der 30 kDa und 40 kDa TNF-Inhibitoren mit deletierten Domänen wurden erzeugt, und diejenigen Derivat ohne die vierte Domäne behalten die vollständige TNF-Bindungsaktivität bei, während diejenigen Derivate ohne die erste, zweite bzw. dritte Domäne die TNF-Bindungsaktivität nicht behalten (Corcoran et al. (1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840; Chih-Hsueh et al. (1995), The Journal of Biological Chemistry, 270(6):2874-2878; und Scallon et al. (1995), Cytokine, 7(8):759-770).
  • Aufgrund der relativ geringen Inhibition der Zytotoxizität, die von dem 30 kDa TNF-Inhibitor und dem 40 kDa TNF-Inhibitor gezeigt wird (Butler et al. (1994), Cytokine, 6(6):616- 623), haben verschiedene Gruppen Dimere der TNF-Inhibitorproteine erzeugt (Butler et al. (1994), s. o.; und Martin et al. (1995), Exp. Neurol., 131:221-228). Jedoch können die Dimere eine Antikörperantwort erzeugen (Martin et al. (1995), s. o.; und Fisher et al. (1996), The New England Journal of Medicine, 334(26):1697-1702).
  • Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, funktionell aktive trunkierte sTNFRs zur Verfügung zu stellen. Dieser und weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung ersichtlich sein.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf funktionell aktive, verkürzte/trunkierte Formen von sTNFR-I, die hierin als "trunkierte sTNFR(s)" bezeichnet werden. Die trunkierten sTNFRs sind modifizierte Formen von sTNFR-I, die nicht die vierte Domäne (Aminosäurereste Thr127-Asn161 von sTNFR-I) enthalten; einen Teil der dritten Domäne (Aminosäurereste Asn111-Cys126 von sTNFR-I; und, optional, die nicht einen Teil der ersten Domäne (Aminosäurereste Asp1-Cys19 von sTNFR-I) enthalten. Diese neuen Inhibitoren von TNF (z.B. TNF-α und/oder TNF-β) haben eine allgemeine Anwendbarkeit.
  • Die trunktierten sTNFRs der vorliegenden Erfindung schließen die Proteine ein, die durch die Formel R1-[Cys19-Cys103]-R2 repräsentiert werden. Diese Proteine sind trunkierte Formen von sTNFR-I.
  • Mit "R1-[Cy219-Cys103]-R2" sind ein oder mehrere Proteine gemeint, in denen [Cys19-Cys103] die Reste 19 bis 103 von sTNFR-I repräsentieren, dessen Aminosäurereste-Nummerierungsschema in 1 (SEQ ID NR:2) bereitgestellt ist, um den Vergleich zu erleichtern; worin R1 eine methionylierte oder nicht-methionylierte Amingruppe von Cys19 oder des/der Amino-terminalen Aminosäurerest(e) repräsentiert, der/die ausgewählt ist/sind aus der folgenden Gruppe:
    Figure 00050001
    und worin R2 eine Carboxy-Gruppe von Cys103 oder den Carboxy-terminalen Aminosäureresten repräsentiert, ausgewählt aus der Gruppe aus:
    Figure 00050002
    wobei der genannte sTNFR eine reduzierte Antigenität im Vergleich zu löslichem TNFR-I aufweist, der die ersten drei Domänen umfasst; sowie Deletions- und/oder Substitutions-Muteine davon, die fähig sind, TNF zu inhibieren und eine Homologie zu der nativen Sequenz des genannten TNFR von mehr als 70 % aufweisen; sowie Konjugate des genannten TNFR mit wasserlöslichen Polymeren, wobei die Konjugate nicht die vierte Domäne von TNFR enthalten.
  • Beispielhafte trunkierte sTNFR-I gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen die folgenden Moleküle: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C105 bezeichnet); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C106 bezeichnet); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/N105 bezeichnet); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.30/d8 bezeichnet); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d18 bezeichnet); und NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d15 bezeichnet), entweder methionyliert oder nicht-methionyliert, sowie Varianten und Derivate davon.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können die trunkierten sTNFRs in glykosylierten oder nicht-glykosylierten Formen hergestellt werden. Trunkierte sTNFRs werden mit Hilfe von rekombinanten gentechnologischen Methoden hergestellt. In einer alternativen Ausführungsform werden trunkierte sTNFRs durch chemische Methoden oder eine Kombination aus rekombinanten und chemischen Methoden synthetisiert.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können trunkierte sTNFRs durch Anfügen der trunkierten sTNFRs an ein wasserlösliches Polymer derivatisiert werden. Zum Beispiel können die trunkierten sTNFRs mit einem oder mehreren Polyethylenglykolmolekülen konjugiert werden, um das pharmakokinetische Verhalten durch Erhöhen des scheinbaren Molekulargewichtes des Moleküls zu verbessern.
  • Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst die verschiedenen Polynukleotide, die für trunkierte sTNFRs kodieren. Geeignete Nukleinsäuresequenzen schließen z.B. die spezifisch in den Figuren dargestellten, ebenso wie degenerierte Sequenzen und natürlich vorkommende allele Variationen davon ein. Derartige Nukleinsäuresequenzen können bei der Expression von trunkierten sTNFRs in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen verwendet werden, wobei die Expressionsprodukte oder Derivate davon durch die Fähigkeit gekennzeichnet sind, die Aktivität von TNF zu modulieren.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet Vektoren, die die Polynukleotide enthalten, die für trunkierte sTNFRs kodieren, funktionell verbunden mit Amplifikations- und/oder Expressions-Kontrollsequenzen. Sowohl prokaryontische als auch eukaryontische Wirtszellen können mit solchen Vektoren stabil transformiert oder transfiziert werden, um die trunkierten sTNFRs zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin das rekombinante Produkt der trunkierten sTNFRs, wobei die Wirtszellen, welche die Polynukleotide enthalten, in einem geeigneten Nährmedium wachsen gelassen werden, und die von den Zellen exprimierten trunkierten sTNFRs optional aus den Wirtszellen und/oder dem Nährmedium isoliert werden.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst pharmazeutische Zusammensetzungen, die trunkierte sTNFRs oder Derivate davon enthalten. Üblicherweise können die trunkierten sTNFRs oder Derivate davon zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffen formuliert werden. Eine Vielzahl weiterer Formulierungsmaterialien können verwendet werden, um die Herstellung, Lagerung, Handhabung, Lieferung und/oder Effizienz der trunkierten sTNFRs oder Derivate davon zu erleichtern.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge trunkierter sTNFRs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von TNF-vermittelten Krankheiten (z.B. einer Erkrankung, die durch TNF-α und/oder TNF-β vermittelt wird). In einer Ausführungsform ist die TNF-vermittelte Krankheit Arthritis.
  • Die für die trunkierten sTNFRs kodierenden Polynukleotide können außerdem in der Zelltherapie oder in Gentherapieanwendungen verwendet werden.
  • Die trunkierten sTNFRs gemäß der vorliegenden Erfindung sind besonders geeignet zur Herstellung von Proteinmengen im Großmaßstab. Zum Beispiel besitzt sTNFR-I eine Deamidierungsstelle innerhalb der Aminosäuresequenz 111 bis 126 (Aminosäuren Asn111-Gly126). Es wird erwartet, dass das Fehlen dieser Stelle die biochemische Stabilität des gereinigten Proteins erhöht, mögliche Degradationsprodukte verringert und zu lagerstabileren Proteinen führt. Trunkierte sTNFRs haben weniger Disulfidbrücken als andere zuvor offenbarte TNF-Inhibitorproteine. Zum Beispiel hat sTNFR-I zwei Disulfidbrücken innerhalb der Aminosäuresequenz 111 bis 126 und drei Disulfidbrücken innerhalb der Aminosäuresequenz 127 bis 161; und sTNFR-II hat eine Disulfidbrücke zwischen Cys121 und Cys139, Cys142 und Cys157 und Cys163 und Cys178. Die verringerte Anzahl von Disulfidbrücken ist insofern wichtig, als dass eine höhere Anzahl dieser Verknüpfungen den Proteinrückfaltungsvorgang erschweren kann. Überraschenderweise weisen trunkierte sTNFRs weniger Stellen für antigene Epitope auf als die zuvor offenbarten TNF-Inhibitorproteine (z.B. hat eine verkürzte Form von sTNFR, die die ersten drei Domänen aufweist, Neo-Epitope, die durch die Exposition bestimmter Reste verursacht werden, siehe Beispiel III), was zu einer verhältnismäßig verringerten Antigenität führt und keine signifikante Verringerung der Clearancerate bei wiederholter Verabreichung zeigt. Es wird erwartet, dass die verringerte Immunogenität der trunkierten sTNFRs geeignet ist zur Behandlung von TNF-vermittelten Krankheiten, die insbesondere chronisch-inflammatorische Krankheiten einschließen.
  • Zusätzliche Aspekte und Vorteile der Erfindung werden den Fachleuten auf dem Gebiet bei Betrachtung der folgenden Beschreibung, die die Anwendung der vorliegenden Erfindung genauer beschreibt, ersichtlich sein.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Zahlreiche Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei der Durchsicht der Figuren offensichtlich werden, wobei:
  • 1 eine Nukleinsäuresequenz darstellt (SEQ ID NR:1), die für Asp1-Asn161 kodiert, vollständig langes rekombinantes humanes sTNFR-I. Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:2) von Asp1-Asn161.
  • 2 stellt eine Nukleinsäuresequenz dar (SEQ ID NR:3), die für NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C105 bezeichnet) kodiert. Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:4) von NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC[Cys19-Cys103]-FC-COOH.
  • 3 stellt eine Nukleinsäuresequenz dar (SEQ ID NR:5), die für NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH kodiert (auch als sTNFR-I 2.4D/C106 bezeichnet). Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:6) von NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cy103]-FNCSL-COOH.
  • 4 stellt eine Nukleinsäuresequenz dar (SEQ ID NR:7), die für NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH kodiert (auch als sTNFR-I 2.6D/N105 bezeichnet). Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 8) von NH2-MDSVCPQGKYIHIQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH.
  • 5 stellt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR:11) dar, die für NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH kodiert (auch als sTNFR-I 2.3D/d8 bezeichnet). Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:12) von NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH.
  • 6 stellt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR:9) dar, die für NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH kodiert (auch als sTNFR-I 2.3D/d18 bezeichnet). Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:10) von NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH.
  • 7 stellt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR:13) dar, die für NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH kodiert (auch als sTNFR-I 2.3D/d15 bezeichnet). Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:14) von NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH.
  • 8 stellt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NR:34) dar, die für Leu1-Thr179 kodiert, reifes rekombinantes humanes sTNFR-II. Ebenfalls dargestellt ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR:35) von Leu1-Thr179.
  • 9 stellt den Grad der Schwellung dar, die in einem Streptococcen-Zellwandinduzierten Reaktivierungsmodell induziert wurde, wie in Beispiel II beschrieben.
  • 10 stellt die Plasmaprofile von sTNFR-I 4D/C105db in gesunden Pavianen dar, nach einer 2-minütigen intravenösen Infusion von 0,2 mg/kg, wie in Beispiel III beschrieben.
  • 11 stellt die Plasmaprofile von sTNFR-I 3D/C105db in gesunden Pavianen dar, nach einer 2-minütigen intravenösen Infusion von 0,2 mg/kg, wie in Beispiel III beschrieben.
  • 12 stellt die Plasmaprofile von sTNFR-I 2.6D/C105db in gesunden Pavianen dar, nach einer 2-minütigen intravenösen Infusion von 0,2 mg/kg, wie in Beispiel III beschrieben.
  • 13 stellt das Verhältnis zwischen der Dosis und der Clearance von verschiedenen dimeren sTNFR-I-Konstrukten dar, wie in Beispiel III beschrieben.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung, dass sTNFR-I und sTNFR-II jeweils in ihrer Größe reduziert werden können, so dass nicht nur die vierte Domäne sondern ein Teil der dritten Domäne und, optional, ein Teil der ersten Domäne ausgeschlossen ist, und sie dennoch die biologische Aktivität behalten und eine reduzierte Antigenität aufweisen. Zumindest aus den folgenden Gründen wird es als vorteilhaft erachtet, diese biologisch aktiven trunkierten sTNFRs oder Derivate davon herzustellen. Erstens können diese Moleküle eine potenziell destabilisierende Deamidierungsstelle weniger aufweisen. Zweitens haben diese Moleküle weniger Disulfidbrücken, was die Rückfaltung und die Reinigung potenziell leichter macht. Drittens weisen diese Moleküle weniger Stellen für potenziell antigene Epitope auf.
  • Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "trunkierte(r) sTNFR(s)" ein oder mehrere biologisch aktive synthetische oder rekombinante Moleküle der Formel R1-[Cys19-Cys103]-R2 sowie Varianten davon (einschließlich Insertions-, Substitutions- und Deletionsvarianten), wie unten beschrieben.
  • Der Begriff "biologisch aktiv", wie hierin verwendet, bedeutet, dass ein trunkierter sTNFR ähnliche TNF-inhibierende Eigenschaften zeigt, jedoch nicht notwendigerweise sämtliche gleichen Eigenschaften und nicht notwendigerweise in dem gleichen Maße wie sTNFR-I. Im Allgemeinen haben trunkierte sTNFRs und Derivate davon die Fähigkeit, TNF zu inhibieren. Bioassays von trunkierten sTNFRs werden weiterhin in Beispiel 11 unten beschrieben. Die Auswahl der bestimmten TNF-inhibierenden Eigenschaften von Interesse ist abhängig von der gewünschten Verwendung eines trunkierten sTNFRs.
  • In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung können trunkierte sTNFRs vorteilhafterweise durch rekombinante Methoden in bakteriellen, Säuger- oder Insekten-Zellsystemen hergestellt werden und können entweder glykosylierte oder nicht-glykosylierte Formen des Proteins sein. Alternativ können trunkierte sTNFRs chemisch synthetisiert werden. Derzeit bevorzugte Herstellungsverfahren werden detaillierter unten beschrieben.
  • Trunkierte sTNFRs können üblicherweise jeweils isoliert und gereinigt werden, so dass sie im Wesentlichen frei von dem Vorhandensein anderen proteinösen Materials (d.h. nicht-trunkierter sTNFRs) sind. Vorzugsweise ist ein trunkierter sTNFR etwa 80 % frei von anderen Proteinen, die aufgrund der bei der Herstellung der trunkierten sTNFRs verwendeten Herstellungsmethode vorhanden sein können. Bevorzugter ist ein trunkier ter sTNFR etwa 90 % frei von anderen Proteinen, besonders bevorzugt etwa 95 % frei von anderen Proteinen und am bevorzugtesten etwa > 98 % frei von anderen Proteinen. Man wird jedoch verstehen, dass das gewünschte Protein mit anderen wirksamen Bestandteilen, klinischen Zusammensetzungen und/oder geeigneten pharmazeutischen Formulierungsmaterialien vor der Verabreichung kombiniert werden können, wie detaillierter unten beschrieben wird.
  • Trunkierte sTNFRs
  • In einer grundlegenden Ausführungsform können die trunkierten sTNFRs gemäß der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Proteine sein, die durch die folgende Formel repräsentiert werden: R1-[Cys19-Cys103]-R2 worin [Cys19-Cys103] die Reste 19 bis 103 von sTNFR-I repräsentieren, dessen Aminosäurereste-Nummerierungsschema in 1 (SEQ ID NR:2) bereitgestellt ist, um den Vergleich zu erleichtern; worin R1 eine methionylierte oder nicht-methionylierte Amingruppe von Cys19 oder des/der Amino-terminalen Aminosäurerest(e) repräsentiert, der/die ausgewählt ist/sind aus der folgenden Gruppe:
    Figure 00120001
    und worin R2 eine Carboxy-Gruppe von Cys103 oder den Carboxy-terminalen Aminosäureresten repräsentiert, ausgewählt aus der Gruppe aus:
    Figure 00120002
    sowie Varianten davon, vorausgesetzt jedoch, dass wenn R1 eine methionylierte oder nicht-methionylierte Amingruppe der Aminosäuresequenz VCPQGKYIHPQNNSIC oder eine N-terminale Trunkierung davon von 1 bis 15 Resten repräsentiert, R1-[Cys19-Cys103]-R2 nicht eine Additionsvariante mit der Formel R1-[Cys19-Cys103]-FNCSLCL-R3 ist, worin R3 eine Carboxylgruppe der Aminosäuresequenz Asn111-Asn161 der 1 oder eine Carboxy-terminale Trunkierung davon repräsentiert.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst eine oder mehrere Varianten von R1-[Cys19-Cys103]-R2, entweder methionyliert oder nicht-methionyliert. Der Begriff "trunkierte(r) sTNFR(s)" umfasst folglich eine oder mehrere natürlich vorkommende allele Variante(n) von R1-[Cys19-Cys103]-R2 sowie ein oder mehrere andere variante Proteine, von denen Aminosäuren deletiert wurden ("Deletionsvarianten"), in die Aminosäuren insertiert wurden ("Additionsvarianten") oder in denen Aminosäuren substituiert wurden ("Substitutionsvarianten") innerhalb der Aminosäuresequenz von R1-[Cys19-Cys103]-R2.
  • Aminosäuresequenz-Deletionen liegen üblicherweise im Bereich von etwa 20 Aminosäureresten, üblicher im Bereich von etwa 1 bis 10 Resten und am üblichsten im Bereich von etwa 1 bis 5 Resten, so dass die Proteinfaltung nicht gestört wird. N-terminale, C-terminale und interne Intrasequenz-Deletionen sind in Erwägung gezogen. Die Anzahl der gesamten Deletionen und/oder konsekutiven Deletionen wird so gewählt werden, dass die tertiäre Struktur des Proteins in der betroffenen Domäne, z.B. die Cystein-Kreuzvernetzung, erhalten bleibt.
  • Deletionen innerhalb der R1-[Cys19-Cys103]-R2 Aminosäuresequenz können in Bereichen, die eine geringe Homologie zu den Sequenzen anderer Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie in der Gruppe der Zellobertlächen-Membranproteine aufweisen, durchgeführt werden. Deletionen innerhalb der R1-[Cys19-Cys103]-R2 Aminosäuresequenz können in Bereichen mit substanzieller Homologie zu den Sequenzen anderer Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie durchgeführt werden und werden mit größerer Wahrscheinlichkeit die biologische Aktivität signifikant verändern. Insbesondere ist die Sequenzähnlichkeit unter Mitgliedern der NGF/TNF-Rezeptorfamilie besonders hoch in dem Bereich, der der ersten von zwei Disulfidschlaufen der Domäne 1 entspricht, in der gesamten Domäne 2 und der ersten Disulfidschlaufe der Domäne 3 (Banner et al. (1993), Cell, 73:431-445). Zum Beispiel sind zwei beispielhafte Deletionsvarianten von R1-[Cys19-Cys103]-R2 die Deletionsvarianten R1-[Cys19(ΔThr20)-Cys103]-R2 und R1-[Cys19(ΔCys19-Lys21)-Cys103]-R2, worin R1 und R2 wie oben definiert sind.
  • Aminosäuresequenz-Additionen können Amino- und/oder Carboxy-terminale Fusionen umfassen, die in ihrer Länge zwischen einem Rest und einhundert oder mehr Resten schwanken, ebenso wie interne Intrasequenz-Insertionen einzelner oder mehrerer Aminosäurereste. Interne Additionen können üblicherweise im Bereich von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten liegen, noch üblicher im Bereich von etwa 1 bis 5 Aminosäureresten und am üblichsten im Bereich von etwa 1 bis 3 Aminosäureresten.
  • Aminoterminus-Additionsvarianten umfassen die Addition eines Methionins (z.B. als Artefakt der direkten Expression des Proteins in rekombinanter Bakterienzellkultur) oder einen zusätzlichen Aminosäurerest oder eine Sequenz. Ein weiteres Beispiel einer aminoterminalen Insertion umfasst die Fusion einer Signalsequenz, und/oder mit anderen Prä-Pro-Sequenzen, um die Sekretion des Proteins aus den rekombinanten Wirtszellen zu erleichtern. Für prokaryontische Wirtszellen, die die nativen sTNFR-I- oder sTNFR-II-Signalsequenzen nicht erkennen und prozessieren, kann die Signalsequenz durch eine prokaryontische Signalsequenz ersetzt werden, die z.B. aus der Gruppe der Leader der alkalischen Phosphatase, Penicillinase oder des hitzestabilen Enterotoxin II ausgewählt ist. Für Hefezellen kann die Signalsequenz z.B. aus der Gruppe bestehend aus den Leadersequenzen der Hefeinvertase, des α-Faktors oder der sauren Phosphatase ausgewählt werden. Bei der Expression in Säugerzellen sind die nativen Signalsequenzen von sTNFR-I oder sTNFR-II ( EP 393 438 und EP 422 339 ) zufriedenstellend, obwohl andere Signalsequenzen des Säugers geeignet sein können (z.B. Sequenzen, die von anderen Mitgliedern der NGF/TNF-Rezeptorfamilie stammen).
  • Carboxyterminus-Additionsvarianten schließen nicht die Addition einer oder mehrerer Aminosäurereste ein, die zu der Rekonstruktion des sTNFR-I führen würden. Man wird erkennen, dass eine Carboxyterminus-Additionsvariante nicht die Addition von einem oder mehreren Carboxysäureresten einschließt, die zu der Rekonstruktion der dritten Domäne oder vierten Domäne von sTNFR-I führen würde. Ein Bespiel für Carboxyterminus-Additionsvarianten umfasst chimäre Proteine, die die Fusion von R1-[Cys19-Cys103]-R2 mit der gesamten oder einem Teil der konstanten Domäne einer schweren oder leichten Kette des humanen Immunglobulins umfassen. Es werden solche chimären Proteine bevorzugt, in denen der Immunglobulinteil jeweils sämtliche Domänen umfasst, bis auf die erste Domäne der konstanten Region der schweren Kette des humanen Immunglobulins, wie z.B. IgG, IgA, IgM oder IgE, insbesondere IgG, z.B. IgG1 oder IgG3. Ein Fachmann wird erkennen, dass jede Aminosäure von jedem Immunglobulinteil deletiert oder mit einer oder mehreren Aminosäuren substituiert werden kann oder eine oder mehrere Aminosäuren angefügt werden können, solange der TNF-bindende Teil TNF noch bindet und der Immunglobulinteil eine oder mehrere seiner charakteristischen Eigenschaften zeigt.
  • Eine weitere Gruppe von Varianten sind Aminosäure-Substitutionsvarianten. In diesen Varianten ist jeweils wenigstens ein Aminosäurerest in R1-[Cys19-Cys103]-R2 entfernt und ein anderer Rest an dessen Stelle insertiert. Substitutionsvarianten schließen allele Va rianten ein, die gekennzeichnet sind durch natürlich vorkommende Nukleotidsequenz-Austausche in der Population der Spezies, die zu einem Aminosäureaustausch führen können oder auch nicht. Der Fachmann auf dem Gebiet kann jede über die Bindungsstelle oder aktive Stelle des Polypeptids bekannte Information bei der Auswahl möglicher Mutationsstellen verwenden.
  • Ein Verfahren zum Identifizieren von Aminosäureresten oder Regionen für die Mutagenese eines Proteins wird "Alanin Scanning Mutagenese (alanine scanning mutagenesis)" genannt (Cunningham und Welle (1989), Science, 244:1081-1085. In diesem Verfahren wird ein Aminosäurerest oder eine Gruppe von Zielresten eines Proteins identifiziert (z.B. geladene Reste, wie z.B. Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (am bevorzugtesten Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Interaktion der Aminosäuren mit der umgebenden Umgebung in oder außerhalb der Zelle zu bewirken. Diejenigen Reste, die eine funktionelle Anfälligkeit gegenüber den Substitutionen zeigen, werden anschließend durch Einführen zusätzlicher oder ersetzender Reste an den Stellen der Substitution verfeinert. Folglich ist die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenzmodifikation vorgegeben und, um die Durchführung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann eine Alanin-Scanning- oder eine Zufallsmutagenese durchgeführt werden, und das resultierende variante Polypeptid kann auf die optimale Kombination einer bestimmten Aktivität und dem Grad an Aktivität untersucht werden.
  • Stellen von Interesse für substitutionelle Mutagenese schließen Stellen ein, in denen die in R1-[Cys19-Cys103]-R2 gefundenen Aminosäuren sich im Hinblick auf die Größe, Ladung und/oder Hydrophobizität der Seitenkette von sTNFR-ähnlichen Proteinen, wie z.B. sTNFR von verschiedenen anderen Spezies oder von anderen Mitgliedern der NGF/TNF-Rezeptorfamilie wesentlich unterscheiden.
  • Andere Stellen von Interesse schließen solche ein, in denen bestimmte Reste mit denen solcher sTNFR-I-ähnlichen Proteinen und sTNFR-II-ähnlichen Proteine ähnlich oder identisch sind. Derartige Positionen sind im Allgemeinen wichtig für die biologische Aktivität eines Proteins. Zum Beispiel würde ein Fachmann verstehen, dass vor der vorliegenden Erfindung die Wirkungen von trunkiertem sTNFR-I und sTNFR-II auf deren entsprechende dreidimensionalen Strukturen nicht vorhersagbar gewesen wäre. Jedoch würde ein Fachmann angesichts der hierin offenbarten Ergebnisse erkennen, dass die ersten Grundsätze zum Entwickeln einer Strategie zur Herstellung von Varianten zum Teil auf die zuvor für den vollständig langen sTNFR-I und sTNFR-II gewonnenen Informationen gestützt werden könnte. Entsprechend wurden die folgenden Informationen in Bezug auf sTNFR-I erhalten (Banner et al. (1993), s.o. und Fu et al. (1995), Protein Engineering, 8(12):1233-1241). Die Reste Tyr9, Thr39, His55 in Domäne 1, die Reste Phe49, Ser63, Asp82 in Domäne 2 und die Reste Tyr92 und Ser107 in Domäne 3 wurden als potenziell wichtig für die Stabilisierung der Struktur der Domänen 1, 2 bzw. 3 identifiziert. Die Rest Pro12 und His55 wurden als potenziell mit Ser86-Tyr87 in der Untereinheit C von TNFα interagierend identifiziert. Die Reste Glu45-Phe49 wurden als in einer Schlaufe liegend identifiziert, die möglicherweise mit den Resten Leu29-Arg32 der Untereinheit A von TNFα interagiert. Der Rest Gly48 wurde als potenziell mit Asn19-Pro20 in der Untereinheit A von TNFα interagierend identifiziert. Die Reste His58-Leu60 wurden als in einer Konformation des entfalteten Stranges identifiziert, und Seitenketten-Interaktionen mit den Resten Arg31-Ala33 in der Untereinheit A von TNFα wurden potenziell für den Rest His58 von sTNFR-I identifiziert, der spezifisch mit dem Rest Arg31 interagiert. Die Reste Lys64-Arg66 wurden als in einer Konformation des entfalteten Stranges liegend identifiziert und es wurde festgestellt, dass sie Seitenketten- und Hauptketten-Interaktionen mit den Resten Ala145-Glu146 und dem Rest Glu46 in der Untereinheit A von TNFα aufweisen. Der Rest Met69 wurde als möglicherweise interagierend mit dem Rest Tyr115 in der Untereinheit A von TNFα identifiziert. Die Reste His94-Phe101 wurden als eine Schlaufe bildend identifiziert, die mit den Resten Thr72-Leu75 und Asn137 in der Untereinheit C von TNFα interagiert, wobei der Rest Trp98 von sTNFR-I spezifisch mit den Resten Ser71-Thr72 in der Untereinheit C von TNFα interagiert, Leu100 von sTNFR-I in großer Nähe zu dem Rest Asn137 in der Untereinheit C von TNFα liegt und der Rest Gln102 von sTNFR-I spezifisch mit dem Rest Pro113 in der Untereinheit A von TNFα interagiert. Folglich würde ein Fachmann erkennen, dass diese Stellen zunächst durch Substitution in relativ konservativer Art und Weise modifiziert werden sollten.
  • Derartige konservative Substitutionen sind in Tabelle 1 unter der Überschrift "bevorzugte Substitutionen" gezeigt. Wenn derartige Substitutionen zu einer Veränderung der biologischen Aktivität führen, können substanziellere Änderungen (beispielhafte Substitutionen) eingeführt werden und/oder weitere Additionen/Deletionen können durchgeführt werden, und die resultierenden Produkte können untersucht werden. TABELLE 1: Aminosäure-Substitutionen
    Ursprünglicher Rest Bevorzugte Substitutionen Beispielhafte Substitutionen
    Ala (A) Val Val; Leu; Ile
    Arg (R) Lys Lys; Gln; Asn
    Asn (N) Gln Gln; His; Lys; Arg
    Asp (D) Glu Glu
    Cys (C) Ser Ser
    Gln (Q) Asn Asn
    Glu (E) Asp Asp
    Gly (G) Pro Pro
    His (H) Arg Asn; Gln; Lys; Arg
    Ile (I) Leu Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucin
    Leu (L) Ile Norleucin; Ile; Val; Met; Ala; Phe
    Lys(K) Arg Arg; Gln; Asn
    Met(M) Leu Leu; Phe; Ile
    Phe(F) Leu Leu; Val; Ile; Ala
    Pro(P) Gly Gly
    Ser(S) Thr Thr
    Thr(T) Ser Ser
    Trp(W) Tyr Tyr
    Tyr(Y) Phe Trp; Phe; Thr; Ser
    Val(V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucin
  • Bei der Herstellung derartiger Austausche in äquivalenter Weise kann der hydropathische Index der Aminosäuren berücksichtigt werden. Jeder Aminosäure wurde ein hydropathischer Index auf Grundlage ihrer Hydrophobizität und der Ladungseigenschaften zugeordnet, welches die Folgenden sind: Ioleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin (-0,4); Threonin (-0,7); Serin (-0,8); Tryptophan (-0,9); Tyrosin (-1,3); Prolin (-1,6); Histidin (-3,2); Glutamat (-3,5); Glutamin (-3,5); Aspartat (-3,5); Asparagin (-3,5); Lysin (-3,9) und Arginin (-4,5).
  • Die Bedeutung des hydropathischen Aminosäureindex bei dem Verleihen einer interaktiven biologischen Funktion für ein Protein ist allgemein auf dem Gebiet anerkannt (Kyte und Doolittle (1982), J. Mol. Biol., 157:105-131). Es ist bekannt, dass bestimmte Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden können, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder Wert aufweisen und dennoch eine ähnliche biologische Aktivität behalten. Bei dem Herstellen von Austauschen auf Grundlage des hydropathischen Index ist die Substitution von Aminosäuren, deren hydropathischen Indizes innerhalb ±2 liegen, bevorzugt, diejenigen, die im Bereich von ±1 liegen, sind besonders bevorzugt und diejenigen, die innerhalb ±0,5 liegen, sind am bevorzugtesten.
  • Es wird außerdem auf dem Gebiet verstanden, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren auf Grundlage der Hydrophilizität effektiv durchgeführt werden kann, insbesondere wenn das biologisch funktionell äquivalente Protein oder Peptid, das dadurch erzeugt wird, für den Gebrauch in immunologischen Ausführungsformen vorgesehen ist, wie in dem vorliegenden Fall.
  • US-Patent 4,554,101 legt dar, dass die höchste lokale durchschnittliche Hydrophilizität eines Proteins, wie es durch die Hydrophilizität seiner benachbarten Aminosäuren bestimmt wird, mit dessen Immunogenität und Antigenität korreliert, d.h. mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins.
  • Wie detailliert im US-Patent 4,554,101 ausgeführt, wurden Aminosäureresten die folgenden Hydrophilizitätswerte zugeordnet: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0), Aspartat (+3,0 ± 1), Glutamat (+3,0 ± 1); Serin (+0,3); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (-0,4); Prolin (-0,5 ± 1); Alanin (-0,5); Histidin (-0,5); Cystein (-1,0); Methionin (-1,3); Valin (-1,5); Leucin (-1,8); Isoleucin (-1,8); Tyrosin (-2,3); Phenylalanin (-2,5); Tryptophan (-3,4).
  • Bei der Durchführung von Austauschen auf Grundlage ähnlicher Hydrophilizitätswerte wird die Substitution von Aminosäuren, deren Hydrophilizitätswerte innerhalb von ±2 liegen, bevorzugt, diejenigen, die innerhalb von ±1 liegen, sind besonders bevorzugt und diejenigen, die innerhalb ±0,5 liegen, sind noch bevorzugter.
  • US-Patent 4,554,101 lehrt außerdem die Identifikation und Herstellung von Epitopen von primären Aminosäuresequenzen auf Grundlage der Hydrophilizität. Durch die im US-Patent 4,554,101 offenbarten Verfahren wäre der Fachmann auf dem Gebiet in der Lage, Epitope innerhalb einer Aminosäuresequenz zu identifizieren, wie z.B. in den sTNFR- Sequenzen, die hierin offenbart sind. Diese Regionen werden auch als "epitopische Kernregionen" bezeichnet.
  • Zahlreiche wissenschaftliche Publikationen wurden der Vorhersage der Sekundärstruktur sowie der Identifikation von Epitopen gewidmet, ausgehend von Analysen der Aminosäuresequenzen (Chou und Fasman (1974), Biochemistry, 13(2):222-245; Chou und Fasman, Biochemistry, 113(2):211-222; Chou und Fasman (1978); Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148; Chou und Fasman, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 und Chou und Fasman (1979), Biophys. J., 26:367-384). Darüber hinaus sind derzeit Computerprogramme erhältlich, welche die Vorhersage von antigenen Abschnitten und epitopischen Kernregionen von Proteinen unterstützt. Beispiele schließen die auf der Jameson-Wolf-Analyse basierenden Programme ein (Jameson und Wolf (1998), Comput. Appl. Biosci., 4(1):181-186 und Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1):187-191), das Programm PepPlot® (Brutlag et al. (1990) CARS, 6:237-245 und Weinberger et al. (1985), Science, 228:740-742), sowie weitere neue Programme für die Vorhersage der tertiären Struktur von Proteinen (Fetrow und Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11:479-483).
  • Es wird erwartet, dass konservative Modifikationen in den Aminosäuresequenzen (und die entsprechenden Modifikationen in den kodierenden Nukleinsäuresequenzen) von R1-[Cys19-Cys103]-R2 Proteine erzeugen, die ähnliche funktionelle und chemische Eigenschaften zu dem modifizierten Protein aufweisen.
  • Im Gegensatz dazu können substanzielle Modifikationen der funktionellen und/oder chemischen Eigenschaften von R1-[Cys19-Cys103]-R2 erreicht werden, indem Substitutionen ausgewählt werden, die sich in ihrer Wirkung auf die Aufrechterhaltung (a) der Struktur des Polypeptidrückgrades in dem Bereich der Substitution, z.B. als eine Blatt- oder Helix-Konformation, (b) in der Ladung oder Hydrophobizität des Proteins an der Zielstelle oder (c) in der Masse der Seitenkette signifikant unterscheiden. Natürlich auftretende Reste werden in Gruppen eingeteilt, auf Grundlage gemeinsamer Seitenketteneigenschaften:
    • 1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
    • 2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr;
    • 3) sauer: Asp, Glu;
    • 4) basisch: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
    • 5) Reste, welche die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro; und
    • 6) aromatisch: Trp, Tyr, Phe.
  • Nicht-konservative Substitutionen können den Austausch eines Mitgliedes aus einer dieser Gruppen durch ein anderes beinhalten. Derartig substituierte Reste können in Regionen von R1-[Cys19-Cys103]-R2 eingeführt werden, die homolog oder nicht homolog zu anderen Mitgliedern der NGF/TNF-Rezeptorfamilie sind.
  • Spezifische Mutationen der Sequenzen von R1-[Cys19-Cys103]-R2 können Substitutionen einer nicht-nativen Aminosäure an den N-Terminus, C-Terminus oder an irgendeiner anderen Stelle des Proteins umfassen, die durch das Hinzufügen eines N-verbundenen oder O-verbundenen Kohlenhydrates modifiziert ist. Derartige Modifikationen können von besonderer Nützlichkeit sein, wie z.B. bei dem Hinzufügen einer Aminosäure (z.B. Cystein), die vorteilhaft ist für die Verbindung mit einem wasserlöslichen Polymer, um ein Derivat zu bilden, wie unten beschrieben. Siehe z.B. 5, in der natürlich vorkommendes Asn105 von sTNFR-I zu Cys verändert wurde, um das Anfügen eines Polyethylenglykol-Moleküls zu erleichtern (Beispiel I).
  • Weiterhin können die Sequenzen von R1-[Cys19-Cys103]-R2 modifiziert werden, um Glykosylierungsstellen anzufügen oder N-verbundene oder O-verbundene Glykosylierungsstellen zu entfernen. Eine Asparagin-verbundene Glykosylierungserkennungsstelle umfasst eine Tripeptidsequenz, die spezifisch durch geeignete zelluläre Glykosylierungsenzyme erkannt wird. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asn-Xaa-Thr oder Asn-Xaa-Ser, wobei Xaa irgendeine Aminosäure außer Pro sein kann. Nachgewiesene oder vorhergesagte Asparaginreste von sTNFR-I befinden sich an den Positionen 14, 105 und 111. Nachgewiesene oder vorhergesagte Asparaginreste von sTNFR-II befinden sich an den Positionen 149 und 171. Eine Vielzahl von Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen kann durchgeführt werden, um N-verbundene oder O-verbundene Glykosylierungsstellen zu modifizieren oder hinzuzufügen, was zu einem Protein mit einer veränderten Glykosylierung führt.
  • In einer spezifischen Ausführungsform sind die Varianten im Wesentlichen homolog zu der Aminosäure von R1-[Cys19-Cys103]-R2. Der Begriff "im Wesentlichen homolog", wie hierin verwendet, meint einen Grad an Homologie, der vorzugsweise über 70 %, bevorzugter über 80 %, noch bevorzugter über 90 % und am bevorzugtesten sogar bei 95 % liegt. Die Prozentzahl der Homologie, wie hierin beschrieben, wird als Prozentzahl der Aminosäurereste berechnet, die in der kleineren der beiden Sequenzen zu finden sind, die mit identischen Aminosäureresten in der Sequenz übereinstimmen, die verglichen wird, wobei vier Lücken auf einer Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um dieses Alignment durchzuführen, wie von Dayhoff (1972), in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., dargelegt. Ebenfalls als im Wesentlichen homolog umfasst werden trunkierte sTNFRs, die mit Hilfe der Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen die Aminosäuresequenzen der SEQ ID NR:2 bzw. SEQ ID NR:35 isoliert werden, deren Gene durch Hybridisierung mit der DNA der SEQ ID NR:1 oder SEQ ID NR:34 oder mit Segmenten davon isoliert werden können.
  • Beispielhafte sTNFRs gemäß der vorliegenden Erfindung schließen die folgenden Moleküle ein: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C105 bezeichnet); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C106 bezeichnet); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC[Cys19-Cys103]-FN-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/N105 bezeichnet); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d8 bezeichnet); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d18 bezeichnet) und NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d15 bezeichnet), entweder methionyliert oder nicht-methionyliert, sowie Varianten und Derivate davon.
  • Die Herstellung von varianten trunkierten sTNFRs wird unten detaillierter beschrieben. Der Varianten können hergestellt werden, indem geeignete Nukleotidaustausche in die für die trunkierten sTNFRs kodierende DNA eingeführt werden oder durch chemische in vitro Synthese der gewünschten trunkierten sTNFRs. Die Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass viele Kombinationen von Deletionen, Insertionen und Substitutionen durchgeführt werden können, vorausgesetzt, dass die finalen trunkierten sTNFRs biologisch aktiv sind.
  • Mutagenesemethoden für das Ersetzen, die Insertion oder die Deletion einer oder mehrerer ausgewählter Aminosäurereste sind dem Fachmann auf dem Gebiet wohlbekannt (z.B. US-Patent Nr. 4,518,584 ). Es gibt zwei prinzipielle Variablen bei der Konstruktion einer jeden Aminosäuresequenz-Variante, die Lokalisierung der Mutationsstelle und die Art der Mutation. Bei der Konstruktion von jeder Variante wird die Lokalisierung einer jeden Mutationsstelle und die Art der Mutation von der/den biochemischen Eigenschaften) abhängig sein, die modifiziert werden soll(en). Jede Mutationsstelle kann ein zeln oder der Reihe nach modifiziert werden, z.B. durch (1) Substituieren zunächst mit einer Auswahl konservativer Aminosäuren und anschließend mit einer radikaleren Auswahl, abhängig von den erzielten Ergebnissen, (2) durch Deletieren des Ziel-Aminosäurerestes oder (3) durch Insertieren von Aminosäureresten neben die lokalisierte Stelle.
  • Chemisch modifizierte Derivate oder trunkierte sTNFRs können angesichts der hierin enthaltenen Offenbarungen hergestellt werden. Konjugate können unter Verwendung von glykosylierten, nicht-glykosylierten oder deglykosylierten trunkierten sTNFRs hergestellt werden. Üblicherweise werden nicht-glykosylierte trunkierte sTNFRs verwendet werden. Geeignete chemische Reste zur Derivatisierung trunkierter sTNFRs umfassen wasserlösliche Polymere.
  • Wasserlösliche Polymere sind wünschenswert, da das Protein, an das das jeweilige Polymer angefügt ist, in einer wässrigen Umgebung nicht präzipitieren wird, wie z.B. einer physiologischen Umgebung. Vorzugsweise wird das Polymer zur Herstellung eines therapeutischen Produktes oder einer therapeutischen Zusammensetzung pharmazeutisch annehmbar sein. Der Fachmann wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer auf Grundlage von Überlegungen auszuwählen, wie z.B. ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden wird und, falls ja, der gewünschten Dosierung, der Zirkulationszeit sowie der Resistenz gegenüber Proteolyse.
  • Geeignete, klinisch annehmbare, wasserlösliche Polymere umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Polyethylenglykol (PEG), Polyethylenglykolpropionaldehyd, Copolymere von Ethylenglykol/Propylenglykol, Monomethoxy-polyethylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol (PVA), Polyvinylpyrrolidon, Poly-1, 3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymer, Poly-(β-Aminosäuren) (entweder Homopolymere oder Zufalls-Copolymere), Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propropylenglykol-Homopolymere (PPG) und andere Polyalkylenoxide, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole (POG) (z.B. Glycerin) und andere polyoxyethylierte Polyole, polyoxyethyliertes Sorbitol oder polyoxyethylierte Glukose, Colonsäuren oder andere Kohlenhydratpolymere, Ficoll oder Dextran sowie Mischungen davon.
  • Wie hierin verwendet, soll Polyethylenglykol jede der Formeln umfassen, die zur Derivatisierung anderer Proteine verwendet wurden, wie z.B. Mono-(C1-C10)-alkoxy- oder Aryloxy-Polyethylenglykol. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bei der Herstellung haben.
  • Die wasserlöslichen Polymere können jeweils irgendein Molekulargewicht aufweisen und verzweigt oder unverzweigt sein. Die wasserlöslichen Polymere haben jeweils üblicherweise ein Molekulargewicht zwischen etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa (der Begriff "etwa" bedeutet, dass in Herstellungen eines wasserlöslichen Polymers einige Moleküle mehr, andere weniger als das angegebene Molekulargewicht wiegen werden). Das durchschnittliche Molekulargewicht eines jeden wasserlöslichen Polymers liegt vorzugsweise zwischen etwa 5 kDa und etwa 50 kDa, bevorzugter zwischen etwa 12 kDa und etwa 40 kDa und am bevorzugtesten zwischen etwa 20 kDa und etwa 35 kDa.
  • Im Allgemeinen gilt, je höher das Molekulargewicht oder je mehr Verzweigungen, desto höher das Polymer:Protein-Verhältnis. Andere Größen können verwendet werden, abhängig von dem gewünschten therapeutischen Profil (z.B. der Dauer der anhaltenden Freisetzung; den Auswirkungen, falls vorhanden, auf die biologische Aktivität; der Einfachheit in der Handhabung; dem Grad oder dem Fehlen von Antigenizität und anderen bekannten Wirkungen eines wasserlöslichen Polymers auf ein therapeutisches Protein).
  • Die wasserlöslichen Polymere sollten jeweils unter Berücksichtigung der Wirkungen auf die funktionellen oder antigenen Domänen des Proteins an das Protein angefügt werden. Im Allgemeinen kann eine chemische Derivatisierung unter jeglichen geeigneten Bedingungen durchgeführt werden, die verwendet werden, um ein Protein mit einem aktivierten Polymermolekül zur Reaktion zu bringen. Aktivierte Gruppen, die zum Verknüpfen des wasserlöslichen Polymers mit einem oder mehreren Proteinen verwendet werden können, schließen die Folgenden ein: Sulfon, Maleimid, Sulfhydril, Thiol, Triflat, Tresylat, Azidirin, Oxiran und 5-Pyridyl.
  • Die wasserlöslichen Polymere werden im Allgemeinen jeweils an den α- oder ε-Aminogruppen der Aminosäuren oder an einer reaktiven Thiolgruppe an das Protein angefügt, es ist jedoch auch vorgesehen, dass eine wasserlösliche Gruppe an irgendeine reaktive Gruppe des Proteins angefügt werden könnte, die ausreichend reaktiv ist, um an eine wasserlösliche Gruppe unter geeigneten Reaktionsbedingungen angefügt zu werden. Folglich kann ein wasserlösliches Polymer über eine reaktive Gruppe, wie z.B. eine freie Amino- oder Carboxyl-Gruppe, kovalent an ein Protein gebunden werden. Die Aminosäurereste, die eine freie Aminogruppe aufweisen, können Lysinreste und den N-terminalen Aminosäurerest umfassen. Diejenigen, die eine freie Carboxylgruppe ha ben, können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest umfassen. Diejenigen, die eine reaktive Thiolgruppe haben, umfassen Cysteinreste.
  • Verfahren zur Herstellung von Proteinen, die mit wasserlöslichen Polymeren konjugiert sind, werden im Allgemeinen jeweils die folgenden Schritte umfassen: (a) Reagieren eines Proteins mit einem wasserlöslichen Polymer unter Bedingungen, durch die das Protein an ein oder mehrere wasserlösliche Polymere angefügt wird und (b) Gewinnen des Reaktionsproduktes. Reaktionsbedingungen für die jeweilige Konjugation können aus jeglichen, den Fachleuten auf dem Gebiet bekannten oder den im Folgenden dargelegten Reaktionsbedingungen ausgewählt werden, sollten jedoch so ausgewählt werden, dass die Exposition gegenüber Reaktionsbedingungen, wie z.B. Temperaturen, Lösungsmitteln und pH-Werten, welche das zu modifizierende Protein inaktivieren würden, vermieden oder eingeschränkt wird. Im Allgemeinen werden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Reaktionen von Fall zu Fall auf Grundlage bekannter Parameter und dem gewünschten Ergebnis bestimmt werden. Zum Beispiel gilt: je größer das Verhältnis von wasserlöslichem Polymer zu Proteinkonjugat, desto höher der prozentuale Anteil des konjugierten Produktes. Das optimale Verhältnis (in Bezug auf die Effizienz der Reaktion, so dass es keinen Überschuss an nicht reagiertem Protein oder Polymer gibt) kann durch Faktoren, wie z.B. dem gewünschten Derivatisierungsgrad (z.B. Mono-, Di-, Tri- usw.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist und den verwendeten Reaktionsbedingungen, bestimmt werden. Das Verhältnis von wasserlöslichem Polymer (z.B. PEG) zu Protein wird im Allgemeinen im Bereich von 1:1 bis 100:1 liegen. Ein oder mehrere gereinigte Konjugate können aus jeder Mischung durch Standard-Reinigungsmethoden, einschließlich unter anderem der Dialyse, dem Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und Elektrophorese, hergestellt werden.
  • Es könnte speziell ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein gewünscht sein. Man kann ein wasserlösliches Polymer durch das Molekulargewicht, die Verzweigung, usw., das Verhältnis von wasserlöslichem Polymer zu Protein-(oder Peptid-) Molekülen in der Reaktionsmischung, der Art der durchzuführenden Reaktion und dem Verfahren zum Erhalt des ausgewählten N-terminal chemisch modifizierten Proteins auswählen. Das Verfahren zum Erhalt der N-terminalen chemisch modifizierten Proteinherstellung (d.h. das Abtrennen dieser Komponente von anderen monoderivatisierten Komponenten, falls notwendig) kann durch Aufreinigen des N-terminal chemisch modifizierten Proteinmate rials aus einer Population chemisch modifizierter Proteinmoleküle erfolgen. Eine selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch reduktive Alkylierung erreicht werden, die sich die differenzielle Reaktivität verschiedener Arten primärer Aminogruppen (Lysin im Vergleich zu der N-terminalen), die für die Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen, zu Nutze macht. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im Wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins an den N-Terminus mit einem eine Carbonylgruppe enthaltenen Polymer erreicht. Zum Beispiel kann man ein wasserlösliches Polymer selektiv an den N-Terminus des Proteins anfügen, indem die Reaktion bei einem pH durchgeführt wird, der es einem erlaubt, sich die pKA-Unterschiede zwischen der ε-Aminogruppe der Lysinreste und dem der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins zunutze zu machen. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird das Anfügen eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich an dem N-Terminus des Proteins statt und keine signifikante Modifikation anderer reaktiver Gruppen, wie z.B. der Lysin-Seitenketten-Aminogruppen, findet statt. Unter Verwendung der reduktiven Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer von der oben beschriebenen Art sein und sollte ein einziges reaktives Aldehyd für die Kopplung an das Protein aufweisen. Polyethylenglykolpropionaldehyd, das ein einzelnes reaktives Aldehyd enthält, kann verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung sieht speziell vor, dass das chemisch derivatisierte Protein Mono- oder Poly-(z.B. 2 bis 4) PEG-Reste enthält. Pegylierung kann durch jegliche auf dem Gebiet bekannte Pegylierungsreaktion durchgeführt werden. Verfahren zur Herstellung eines pegylierten Proteinproduktes werden im Allgemeinen die folgenden Schritte umfassen: (a) Reagieren eines Proteinproduktes mit Polyethylenglykol (wie z.B. einem reaktiven Ester oder einem Aldehydderivat von PEG) unter Bedingungen, durch die das Protein an eine oder mehrere PEG-Gruppen angefügt wird und (b) Gewinnen des/der Reaktionsprodukte(s). Im Allgemeinen werden die optimalen Reaktionsbedingungen für die Reaktionen von Fall zu Fall auf Grundlage bekannter Parameter und dem gewünschten Ergebnis bestimmt.
  • Den Fachleuten auf dem Gebiet stehen zahlreiche Verfahren zur Anheftung zur Verfügung. Siehe z.B. EP 0 401 384 ; siehe auch Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992), Focus an Growth Factors, 3(2):4-10 (veröffentlicht durch Mediscript, Mountain, Court, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK); EP 0 154 316 ; EP 0 401 384 ; WO 92/16221 ; WO 95/34326 sowie die weiteren hierin zitierten Publikationen, die sich auf Pegylierung beziehen.
  • Die Pegylierung kann spezifisch durch eine Acylierungsreaktion oder eine Aikylierungsreaktion mit einem reaktiven Polyethylenglykolmolekül durchgeführt werden. Folglich umfassen die Proteinprodukte in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung pegylierte Proteine, in denen die PEG-Gruppe(n) über Acyl- oder Alkyl-Gruppen angefügt ist (sind). Derartige Produkte können mono-pegyliert oder poly-pegyliert sein (z.B. 2 bis 6 und vorzugsweise 2 bis 5 PEG-Gruppen enthalten). Die PEG-Gruppen werden im Allgemeinen an den α- oder ε-Aminogruppen der Aminosäuren an das Protein angefügt, es ist jedoch auch vorgesehen, dass die PEG-Gruppen an irgendeine Aminogruppe an das Protein angeheftet werden könnten, die ausreichend reaktiv ist, um unter geeigneten Reaktionsbedingungen an eine PEG-Gruppe angeheftet zu werden.
  • Die Pegylierung durch Acylierung beinhaltet im Allgemeinen die Reaktion eines aktiven Esterderivates von Polyethylenglykol (PEG) mit dem Protein. Für die Acylierungsreaktionen sollte das/die ausgewählte(n) Polymer(e) eine einzelne reaktive Estergruppe haben. Jedes bekannte oder später entdeckte reaktive PEG-Molekül kann verwendet werden, um die Pegylierungsreaktion durchzuführen. Ein bevorzugter aktivierter PEG-Ester ist PEG, das zu N-Hydroxysuccinimid (NHS) verestert wurde. Wie hierin verwendet, ist vorgesehen, dass "Acylierung" ohne Beschränkungen die folgenden Arten der Verknüpfung zwischen dem therapeutischen Protein und einem wasserlöslichen Polymer, wie z.B. PEG, umfasst: Amid, Carbamat, Urethan und dergleichen (siehe Chamow (1994), Bioconjugate Chem., 5(2):133-140). Reaktionsbedingungen können aus jeglichen der auf dem Gebiet der Pegylierung bekannten oder den im Folgenden dargelegten ausgewählt werden, es sollten jedoch Bedingungen wie z.B. Temperaturen, Lösungsmittel und pH-Werte vermieden werden, die das zu modifizierende Protein inaktivieren würden.
  • Die Pegylierung durch Acylierung wird im Allgemeinen zu einem poly-pegylierten Protein führen. Vorzugsweise wird die verbindende Verknüpfung ein Amid sein. Ebenfalls bevorzugt wird das resultierende Produkt im Wesentlichen (z.B. > 95 %) nur mono-, di- oder tri-pegyliert sein. Jedoch können einige Spezies mit einem höheren Pegylierungsgrad in Mengen gebildet werden, die von den verwendeten spezifischen Reaktionsbedingungen abhängig sind. Wenn dies gewünscht ist, können stärker gereinigte pegylierte Spezies durch Standard-Reinigungsverfahren, einschließlich unter anderem der Dialyse, Aussalzen, Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und der Elektrophorese aus der Mischung (insbesondere von den nicht-reagierten Spezies) abgetrennt werden.
  • Die Pegylierung durch Alkylierung umfasst im Allgemeinen das Reagieren eines N-terminalen Aldehydderivates von PEG mit dem Protein in der Gegenwart eines Reduktionsmittels. Für die reduktive Alkylierungsreaktion sollte das (die) ausgewählte(n) Polymer(e) eine einzelne reaktive Aldehydgruppe haben. Ein beispielhaftes reaktives PEG-Aldehyd ist Polyethylenglykolpropionaldehyd, das in Wasser stabil ist, oder Mono-C1-C10-alkoxy- oder Aryloxyderivate davon (siehe US-Patent 5,252,714 ).
  • Die Pegylierung durch Alkylierung kann außerdem zu einem poly-pegylierten Protein führen. Darüber hinaus kann man die Reaktionsbedingungen manipulieren, um eine Pegylierung nur an der α-Aminogruppe des N-Terminus des Proteins (d.h. ein mono-pegyliertes Protein) wesentlich zu begünstigen. In den beiden Fällen der Monopegylierung oder Polypegylierung werden die PEG-Gruppen vorzugsweise über eine -CH2-NH-Gruppe an das Protein angefügt. Was insbesondere die -CH2-Gruppe anbetrifft, wird diese Art der Verknüpfung hierin als eine "Alkyl"-Verknüpfung bezeichnet.
  • Die reduktive Alkylierung zur Herstellung einer im Wesentlichen homogenen Population eines Mono-Polymer/Proteinproduktes wird im Allgemeinen die folgenden Schritte umfassen: (a) Reagieren eines Proteins mit einem reaktiven PEG-Molekül unter reduktiven Alkylierungsbedingungen, bei einem pH, der geeignet ist, die selektive Modifikation der α-Aminogruppe an dem Aminoterminus des genannten Proteins zu erlauben und (b) Gewinnen des (der) Reaktionsprodukt(e). Die Derivatisierung über reduktive Alkylierung zur Herstellung eines monopegylierten Produktes nutzt die pKa-Unterschiede zwischen den Lysin-Aminogruppen und der α-Aminogruppe an dem N-Terminus aus (wobei der pKa der pH ist, bei dem 50 % der Aminogruppen protoniert sind und 50 % nicht-protoniert sind).
  • Die Reaktion wird bei einem pH durchgeführt, der es einem erlaubt, sich die pKa-Unterschiede zwischen den ε-Aminogruppen der Lysinreste und dem der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins zunutze zu machen. Im Allgemeinen gilt: wenn der pH niedriger ist, wird ein größerer Überschuss von Polymer zu Protein gewünscht sein (d.h. je weniger reaktiv die N-terminale α-Aminogruppe, desto mehr Polymer wird benötigt, um optimale Bedingungen zu erreichen). Wenn der pH höher ist, muss das Verhältnis Polymer:Protein nicht so groß sein (d.h., es stehen mehr reaktive Gruppen zur Verfü gung, so dass weniger Polymermoleküle benötigt werden). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird der pH im Allgemeinen in den Bereich von 3 bis 9, vorzugsweise 3 bis 6 fallen. Für die reduktive Alkylierung sollte das Reduktionsmittel in wässriger Lösung stabil sein und vorzugsweise in der Lage sein, nur die Schiff'sche Base, die in dem Anfangsschritt der reduktiven Alkylierung gebildet wird, zu reduzieren. Geeignete Reduktionsmittel können ausgewählt werden aus Natriumborhydrid, Natriumcyanoborhydrid, Dimethylaminboran, Trimethylaminboran und Pyridinboran. Ein besonders geeignetes Reduktionsmittel ist Natriumcyanoborhydrid. Andere Reaktionsparameter, wie z.B. das Lösungsmittel, die Reaktionszeiten, Temperaturen und Arten der Reinigung der Produkte können von Fall zu Fall bestimmt werden, auf Grundlage der veröffentlichten Informationen, die sich auf die Derivatisierung von Proteinen mit wasserlöslichen Polymeren beziehen.
  • Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird das Anfügen eines wasserlöslichen Polymers (das eine reaktive Gruppe, wie z.B. ein Aldehyd, enthält) an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich an dem N-Terminus des Proteins statt und es tritt keine signifikante Modifikation anderer reaktiver Gruppen, wie z.B. der Lysin-Seitenketten-Aminogruppen auf. Die Herstellung wird üblicherweise zu mehr als 90 % aus Polymer/Proteinkonjugat bestehen und noch üblicher zu mehr als 95 % aus Monopolymer/Proteinkonjugat bestehen, wobei die übrigen zu beobachtenden Moleküle nicht-reagiert sind (d.h. Protein, dem die Polymerkomponente fehlt).
  • Eine spezifische Ausführung der vorliegenden Erfindung ist ein unverzweigtes Monomethoxy-Polyethylenglykolaldehyd-Molekül, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von entweder etwa 20 kDa oder etwa 33 kDa (z.B. zwischen 30 kDa und 35 kDa) aufweist, oder ein tertiäres Butylpolyethylenglykolaldehyd, das ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 33 kDa (z.B. zwischen 30 kDa und 35 kDa) hat, konjugiert durch reduktive Alkylierung mit sTNFR-I 2.6D/N105.
  • Die Pegylierung kann ferner im Speziellen über wasserlösliche Polymere durchgeführt werden, die wenigstens eine reaktive Hydroxygruppe haben (z.B. Polyethylenglykol), die mit einem Reagenz zur Reaktion gebracht werden können, das eine reaktive Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe aufweist, um die Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor umzuwandeln, wodurch ein "aktivierter Linker" gebildet wird, der nützlich zur Modifizierung verschiedener Proteine ist, um verbesserte biologisch aktive Konjugate zur Verfügung zu stellen. "Reaktives Carbonyl, Nitril oder Sulfon" bezeichnet eine Carbonyl-, Nitril- oder Sulfon-Gruppe, an die eine Gruppe aus zwei Carbonen gebunden ist, die eine reaktive Stelle für die Thiol-spezifische Kopplung an das zweite Carbon der Carbonyl-, Nitril- oder Sulfon-Gruppe hat ( WO 92/16221 ).
  • Die aktivierten Linker können monofunktionell, bifunktionell oder multifunktionell sein. Nützliche Reagenzien, die eine reaktive Sulfongruppe aufweisen, die in den Verfahren verwendet werden können, schließen ohne Einschränkung Chlorsulfon, Vinylsulfon und Divinylsulfon ein.
  • In einer spezifischen Ausführungsform wird das wasserlösliche Polymer mit einem Michael-Akzeptor aktiviert. WO 95/13312 beschreibt unter anderem wasseriösliche Sulfonaktivierte PEGs, die hoch selektiv für die Kopplung mit Thiolresten anstelle von Aminoresten auf Molekülen und auf Oberflächen sind. Diese PEG-Derivate sind für ausgedehnte Zeiträume in wässrigen Umgebungen bei pHs von etwa 11 oder weniger gegenüber der Hydrolyse stabil und können Verknüpfungen mit Molekülen bilden, um Konjugate zu erzeugen, die ebenfalls hydrolytisch stabil sind. Die Verknüpfung, durch die die PEGs und das biologisch aktive Molekül gekoppelt sind, umfasst einen Sulfonrest, der mit einem Thiolrest gekoppelt ist und hat die Struktur PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, wobei W das biologisch aktive Molekül repräsentiert und wobei der Sulfonrest Vinylsulfon ist oder ein aktives Ethylsulfon. Zwei besonders nützliche homobifunktionelle Derivate skid PEG-bis-chlorsulfon und PEG-bis-vinylsulfon.
  • Die internationale PCT Anmeldung Nr. US96/19459 lehrt Verfahren zur Herstellung Sulfon-aktivierter Linker durch Gewinnen einer Verbindung, die eine reaktive Hydroxylgruppe hat und durch Konvertieren der Hydroxylgruppe zu einem reaktiven Michael-Akzeptor, um einen aktivierten Linker zu bilden, wobei die Verwendung von Tetrahydrofuran (THF) als Lösungsmittel für die Konversion verwendet wird. Die internationale PCT Anmeldung Nr. US96/19459 lehrt ein Verfahren zur Reinigung der aktivierten Linker, das eine hydrophobe Interaktionschromatographie verwendet, um die Linker basierend auf der Größe und der Funktionalität der Endgruppen zu separieren.
  • Spezifisch sieht die vorliegende Erfindung die folgenden, in Prokaryonten exprimierten Moleküle vor, die chemisch derivatisiert wurden, um Mono- oder Poly-(z.B. 2 bis 4) PEG-Reste zu enthalten: sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 und sTNFR-I 2.3D/d15, entweder methionyliert oder nicht-methionyliert, sowie Varianten und Derivate davon.
  • Polyvalente Form(en)
  • Polyvalente Form(en), d.h. Moleküle, die mehr als eine aktive Komponente umfassen, können konstruiert werden. In einer Ausführungsform kann das Molekül mehrere Tumornekrosefaktor-Bindungsstellen für den TNF-Liganden besitzen (z.B. eine Kombination eines trunkierten sTNFR-Produktes). Darüber hinaus kann das Molekül wenigstens eine Tumornekrosefaktor-Bindungsstelle sowie, abhängig von der gewünschten Eigenschaft der polyvalenten Form, wenigstens eine Bindungsstelle für ein anderes Molekül besitzen (z.B. eine Kombination aus wenigstens einem trunkierten sTNFR-Produkt und wenigstens einem Interleukin-1-Rezeptorantagonisten ("IL-1ra"), wie unten beschrieben).
  • In einer Ausführungsform kann die polyvalente Form z.B. durch chemische Kopplung wenigstens eines trunkierten sTNFR-Produkts und einer weiteren Komponente, vorzugsweise einem weiteren trunkierten sTNFR-Produkts, mit irgendeinem klinisch annehmbaren Linker (z.B. wasserlösliches Polymer, wie oben beschrieben) konstruiert werden. Im Prinzip sollte der Linker weder eine neue Immunogenität verleihen, noch mittels der neuen Aminosäurereste die Hydrophobizität und Ladungsbalance der Struktur verändern und so deren Biodistribution und Clearance schädlich beeinträchtigen.
  • Bei der Verwendung als Linker können derartige Polymere Homopolymere, Zufalls- oder Block-Copolymere und Terpolymere sein, die auf den oben aufgelisteten Monomeren beruhen, geradkettig oder verzweigt, substituiert oder unsubstituiert. Das Polymer kann jegliche Länge oder Molekulargewicht haben, jedoch können diese Eigenschaften die biologischen Eigenschaften beeinträchtigen. Mittlere Polymer-Molekulargewichte, die besonders geeignet sind, um die Clearanceraten bei pharmazeutischen Anwendungen zu verringern, liegen in dem Bereich von 2000 bis 35000 Dalton. Darüber hinaus kann die Länge des Polymers verändert werden, um die gewünschte biologische Aktivität zu optimieren oder zu verleihen.
  • Aktivierungsgruppen, die verwendet werden können, um das wasserlösliche Polymer mit zwei oder mehreren Proteinen zu verbinden, umfassen die Folgenden: Sulfon, Maleimid, Sulfhydril, Thiol, Triflat, Tresylat, Azidirin, Oxiran und 5-Pyridil.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein bifunktioneller oder multifunktioneller aktivierter Linker, der wenigstens einen reaktiven Michael-Akzeptor hat, in Übereinstimmung mit dem US-Patent 5747639 gereinigt werden.
  • Die aktivierten Reste können unter Verwendung herkömmlicher Kopplungsmethoden verbunden werden (siehe PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16221 und PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/34326 . Weiterhin beschreibt die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16221 die Herstellung verschiedener dimerisierter sTNFR-I-Inhibitormoleküle, z.B. dimerisierten c105 sTNFR-I. Ein beispielhaftes polyvalentes Tumomekrosefaktor-Bindungsprotein mit der Formel (sTNFR-I 2.6D/C106)2-(20 kDa PEG) ist in Beispiel I offenbart.
  • Alternativ kann ein bivalentes Molekül aus zwei Tandemwiederholungen von trunkierten sTNFR-Produkten, separiert durch eine Polypeptid-Linkerregion, bestehen. Die Konstruktion der Polypeptidlinker ähnelt im Design der Insertion kurzer Loop-Sequenzen zwischen Domänen bei dem de novo Entwurf von Proteinen (Mutter (1988), TIBS, 13:260-265 und Reagan und DeGrado (1988), Science, 241:976-978. Es wurde gezeigt, dass ein Linker, der für Einzelkettenantikörper geeignet ist, wirksam bei der Herstellung einer dimeren Form des rekombinanten humanen sTNFR-II ist (Neve et al. (1996), Cytokine, 8(5):365-370). Mehrere verschiedene Linkerkonstrukte wurden zusammengefügt und es wurde gezeigt, dass sie nützlich für Antikörper sind; die funktionsfähigsten Linker variieren in der Größe von 12 bis 25 Aminosäuren (Aminosäuren, die nicht-reaktive Seitengruppen haben, z.B. Alanin, Serin und Glycin), die zusammen eine hydrophile Sequenz ergeben, die einige wenige gegensätzlich geladene Reste haben, um die Löslichkeit zu verstärken, und die flexibel sind (Whitlow und Filpula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105 und Brigido et al. (1993), J. Immunol., 150:469-479).
  • In einer weiteren Ausführungsform können trunkierte sTNFRs chemisch mit Biotin gekoppelt werden, und die Biotin/trunkierten sTNFRs, die konjugiert sind, werden anschließend an Avidin binden gelassen, was zu tetravalenten Avidin/Biotin/trunkiertes sTNFR-Molekülen führt. Trunkierte sTNFRs können außerdem kovalent mit Dinitrophenol (DNP) oder Trinitrophenol (TNP) gekoppelt werden, und die resultierenden Konjugate können mit anti-DNP- oder anti-TNP-IgM präzipitiert werden, um decamere Konjugate mit einer Valenz von 10 für die TNF-Bindungsstellen zu bilden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform können ferner rekombinante Fusionsproteine hergestellt werden, die einen trunkierten sTNFR haben, wobei jedes rekombinante chimäre Molekül eine sTNFR-Sequenz hat, wie oben beschrieben, substituiert durch die variablen Domänen von einer der schweren und leichten Ketten des Immunglobulinmo leküls oder beiden, und das die gesamten konstanten Domänen oder Teile davon hat, jedoch wenigstens eine konstante Domäne der schweren oder leichten Kette von humanem Immunglobulin. Zum Beispiel kann jedes derartige chimäre trunkierte sTNFR/IgG1-Fusionsprotein aus zwei chimären Genen hergestellt werden: einer trunkierten sTNFR/humane Kappa leichte Kette Chimäre (trunkiertes sTNFR/Ck) und einer trunkierten sTNFR/humane Gamma-1 schwere Kette Chimäre (trunkiertes sTNFR/Cg-1). Nach der Transkription und Translation der beiden chimären Gene, wie unten beschrieben, können die Genprodukte zu einem einzigen chimären Molekül zusammengesetzt werden, das eine von einem trunkierten sTNFR gezeigte Bivalenz hat. Zusätzliche Details, die sich auf die Konstruktion derartiger chimärer Moleküle beziehen, sind in dem US-Patent 5,116,964 , der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/09622 , PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/16437 und der EP 315062 offenbart.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform können ferner rekombinante Fusionsproteine hergestellt werden, die einen trunkierten sTNFR haben, wobei jedes rekombinante chimäre Molekül eine sTNFR-Sequenz hat, wie oben beschrieben, und wenigstens einen Teil der Region 186-401 von Osteoprotegerin (OPG), wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 96309363.8 beschrieben.
  • Polynukleotide
  • Die vorliegende Erfindung stellt ferner Polynukleotide zur Verfügung, die für trunkierte sTNFRs kodieren. Basierend auf der vorliegenden Beschreibung und unter Verwendung der universellen Kodontabelle kann ein Fachmann sämtliche der Nukleinsäuresequenzen, die für die Aminosäuresequenzen der trunkierten sTNFRs kodieren, einfach betimmen. Vorliegend bevorzugte Nukleinsäuresequenzen schließen solche Polynukleotide, die für sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 und sTNFR 2.3D/d15 kodieren. Beispiele für verschiedene Polynukleotide sind in den 2, 3, 4, 5, 6 und 7 dargestellt.
  • Rekombinante Expressionsmethoden, die in Übereinstimmung mit den unten dargestellten Beschreibungen durchgeführt werden, können verwendet werden, um diese Polynukleotide herzustellen und die kodierten Proteine zu exprimieren. Zum Beispiel kann ein Fachmann durch Insertieren einer Nukleinsäuresequenz, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, in einen geeigneten Vektor leicht große Mengen der gewünschten Nukleotidsequenz herstellen. Die Sequenz kann anschließend verwendet werden, um Detektionssonden oder Amplifikationsprimer zu erzeugen. Alternativ kann ein Polynuk eotid, das für einen trunkierten sTNFR kodiert, in einen Expressionsvektor insertiert werden. Durch Einführen des Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt kann der gewünschte trunkierte sTNFR in großen Mengen hergestellt werden.
  • Wie weiterhin hierin beschrieben, stehen zahlreiche Wirts/Vektor-Systeme zur Propagierung der gewünschten Nukleinsäuresequenzen und/oder der Herstellung der trunkierten sTNFRs zur Verfügung. Diese schließen Plasmide, virale und Insertionsvektoren sowie prokaryontische und eukaryontische Wirte ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Der Fachmann auf dem Gebiet kann ein Wirts/Vektor-System, das in der Lage ist, heterologe DNA zu propagieren oder zu exprimieren, anpassen, um die Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen oder zu exprimieren.
  • Darüber hinaus erkennen die Fachleute auf dem Gebiet, dass die neuen Nukleinsäuresequenzen angesichts der vorliegenden Offenbarung degenerierte Nukleinsäuresequenzen umfassen, die für trunkierte sTNFRs kodieren, welche die in den Figuren dargestellten Sequenzen haben, sowie solche Nukleinsäuresequenzen, die mit den komplementären Sequenzen dieser Nukleinsäuresequenzen hybridisieren (vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen) (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laborstory, Seiten 387 bis 389). Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen sind die Hybridisierung in 4 × SSC bei 62 bis 67°C, gefolgt von einem Waschschritt mit 0,1 × SSC bei 62 bis 67°C für etwa eine Stunde. Alternativ sind beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen die Hybridisierung in 45 bis 55°% Formamid, 4 × SSC bei 40 bis 45°C. Ebenfalls eingeschlossen sind DNA-Sequenzen, die mit den in den 1 und 9 dargestellten Nukleinsäuresequenzen unter relaxierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren und für trunkierte sTNFRs kodieren. Beispiele für derartige Hybridisierungsbedingungen mit schwacher Stringenz sind 4 × SSC bei 45 bis 55°C oder die Hybridisierung mit 30 bis 40 % Formamid bei 40 bis 45°C.
  • Ebenfalls durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt werden rekombinante DNA-Konstrukte, die Vektor-DNA zusammen mit den DNA-Sequenzen umfassen, die für trunkierte sTNFRs kodieren. In jedem derartigen DNA-Konstrukt befindet sich die Nukleinsäuresequenz, die für einen trunkierten sTNFR kodiert (mit oder ohne Signalpeptide) in funktioneller Verbindung mit einer geeigneten Expressionskontrollsequenz oder regulatorischen Sequenz, die fähig ist, die Replikation und/oder Expression des trunkierten sTNFR in einem ausgewählten Wirt zu steuern.
  • Rekombinante Expression
  • Herstellung von Polynukleotiden
  • Nukleinsäuresequenzen, die für trunkierte sTNFRs kodieren, können auf verschiedenen Wegen einfach erhalten werden, einschließlich und ohne Beschränkung der chemischen Synthese, des Screenings von cDNA- oder genomischen Bibliotheken, des Screenings von Expressionsbibliotheken und/oder der PCR-Amplifikation von cDNA. Diese Verfahren und andere, die zur Isolierung derartiger Nukleinsäuresequenzen nützlich sind, sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); durch Ausubel et al., Herausgeber Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press, (1994) und durch Berger und Kimmel, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Band 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA, (1987) dargelegt.
  • Die chemische Synthese von Nukleinsäuresequenzen, die für trunkierte sTNFRs kodieren, kann unter Verwendung von auf dem Gebiet wohlbekannten Verfahren, wie z.B. den von Engels et al. (1989), Angew. Chem. Intl. Hers., 28:716-734 und Wells et al. (1985), Gene, 34:315 dargelegten, erreicht werden. Diese Verfahren schließen unter anderem die Phosphotriester-, Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Verfahren der Nukleinsäuresequenzsynthese ein. Große Nukleinsäuresequenzen, z.B. solche, die größer als etwa 100 Nukleotide lang sind, können in mehreren Fragmenten synthetisiert werden. Die Fragmente können anschließend aneinanderligiert werden, um Nukleinsäuresequenzen zu bilden, die für trunkierte sTNFRs kodieren. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Polymer-unterstützte Synthese unter Verwendung der Standard-Phoshoramidit-Chemie.
  • Alternativ kann eine geeignete Nukleinsäuresequenz durch Screening einer geeigneten cDNA-Bibliothek (d.h. einer Bibliothek, die von einer oder mehreren Gewebequellen hergestellt wurde, von denen angenommen wird, dass sie das Protein exprimieren) oder einer genomischen Bibliothek (einer Biblithek, die aus gesamter genomischer DNA hergestellt wurde) erhalten werden. Die Quelle der cDNA-Bibliothek ist üblicherweise ein Gewebe von irgendeiner Spezies, von der angenommen wird, dass sie das gewünschte Protein in ausreichenden Mengen exprimiert. Die Quelle der genomischen Bibliothek kann irgendein Gewebe oder mehrere Gewebe aus irgendeinem Säuger oder einer anderen Spezies sein, von der angenommen wird, dass sie ein Gen enthält, das für einen trunkierten sTNFR kodiert.
  • Hybridisierungsmedien können unter Verwendung von einer oder mehreren Nukleinsäuresonden (Oligonukleotide, cDNA oder genomische DNA-Fragmente, die einen annehmbaren Grad an Homologie mit der cDNA oder dem Gen aufweisen, das kloniert werden soll), die selektiv mit cDNA(s) oder Gen(en) hybridisieren, die/das in der Bibliothek vorhanden ist (sind), auf das Vorhandensein einer DNA untersucht werden, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, Die Sonden, die üblicherweise für ein derartiges Screening verwendet werden, kodieren für einen kurzen Bereich der DNA-Sequenz aus derselben oder einer ähnlichen Spezies, wie der Spezies, aus der die Bibliothek hergestellt wurde. Alternativ können die Sonden degeneriert sein, wie hierin erörtert wird.
  • Die Hybridisierung wird üblicherweise durch Annealen der Oligonukleotidsonde oder der cDNA mit den Klonen unter stringenten Bedingungen, die das nicht-spezifische Binden verhindern, jedoch das Binden solcher Klone erlauben, die einen signifikanten Grad an Homologie mit der Sonde oder dem Primer aufweisen, erreicht. Typische stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind zum Teil von der Größe (d.h. der Anzahl der Nukleotide) der cDNA oder der Oligonukleotidsonde abhängig und davon, ob die Sonde degeneriert ist. Die Wahrscheinlichkeit zur Identifizierung eines Klones wird ebenfalls bei der Zusammenstellung des Hybridisierungsmediums berücksichtigt (z.B., ob eine cDNA-Bibliothek oder eine genomische Bibliothek gescreent wird).
  • Wird ein DNA-Fragment (wie z.B. eine cDNA) als Sonde verwendet, umfassen übliche Hybridisierungsbedingungen, wie die in Ausubel et al. (1994), Herausgeber, s. o., dargestellten. Nach der Hybridisierung wird das Hybridisierungsmedium bei einer geeigneten Stringenz gewaschen, die von verschiedenen Faktoren, wie z.B. der Größe der Sonde, der erwarteten Homologie der Sonde mit dem Klon, dem zu untersuchenden Hybridisierungsmedium, der Anzahl der untersuchten Klone und dergleichen abhängig ist. Beispiele für stringente Waschlösungen, die im Allgemeinen eine geringe Ionentärke aufweisen und bei relativ hohen Temperaturen verwendet werden, sind die Folgenen: eine derartige stringente Waschlösung ist 0,015 M NaCl, 0,005 M NaCitrat und 0,1 % SDS bei 55 bis 65°C; eine weitere derartige stringente Waschlösung ist 1 mM Na2EDTA, 40 mM NaHPO4, pH 7,2 und 1 % SDS bei etwa 40 bis 50°C; und eine weitere stringente Waschlösung ist 0,2 × SSC und 0,1 % SDS bei etwa 50 bis 65°C.
  • Es gibt außerdem beispielhafte Protokolle für stringente Waschbedingungen, in denen Oligonukleotidsonden verwendet werden, um Hybridisierungsmedien zu untersuchen. Zum Beispiel verwendet ein erstes Protokoll 6 × SSC mit 0,05 % Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur zwischen etwa 35°C und 63°C, abhängig von der Länge der Sonde. Zum Beispiel werden 14 Basen lange Sonden bei 35 bis 40°C gewaschen, 17 Basen lange Sonden bei 45 bis 50°C, 20 Basen lange Sonden bei 52 bis 57°C und 23 Basen lange Sonden bei 57 bis 63°C. Die Temperatur kann um 2 bis 3°C erhöht werden, wenn der Hintergrund der nicht-spezifischen Bindung hoch erscheint. Ein zweites Protokoll verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) für das Waschen. Eine derartige stringente Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2 % SDS.
  • Ein weiteres geeignetes Verfahren zum Erhalt einer geeigneten Nukleinsäuresequenz ist die Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Verfahren wird cDNA von Poly(A) + RNA oder Gesamt-RNA unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase hergestellt. Zwei Primer, die üblicherweise komplementär zu zwei unterschiedlichen Bereichen der cDNA sind (Oligonukleotide), die für einen trunkierten sTNFR kodiert, werden anschließend zusammen mit einer Polymerase, wie z.B. der Tag-Polymerase, zu der cDNA gegeben, und die Polymerase amplifiziert die cDNA-Region zwischen den beiden Primern.
  • Die Oligonukleotidsequenzen, die als Sonden oder Primer ausgewählt werden, sollten eine geeignete Länge aufweisen und ausreichend eindeutig sein, um das Ausmaß der nicht-spezifischen Bindung, die während des Screenings oder der PCR-Amplifikation auftreten kann, zu minimieren. Die tatsächliche Sequenz der Sonden oder Primer beruht im Allgemeinen auf konservierten oder hoch homologen Sequenzen oder Regionen. Optional können die Sonden oder Primer vollständig oder teilweise degeneriert sein, d.h., sie können eine Mischung von Sonden/Primern enthalten, die alle für dieselbe Aminosäuresequenz kodieren, jedoch unterschiedliche Kodons dafür verwenden. Eine Alternative zur Herstellung degenerierter Sonden besteht darin, ein Inosin in einigen oder sämtlichen Kodonpositionen zu platzieren, die sich in den Spezies unterscheiden. Die Oligonukleotidsonden oder Primer können durch chemische Syntheseverfahren für DNA, wie oben beschrieben, hergestellt werden.
  • Wie oben beschrieben, ist eine Variantensequenz eine natürliche Sequenz (d.h. eine allele Variation) oder eine synthetische Sequenz, die ein oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -deletionen und/oder -insertionen im Vergleich zu der Sequenz der 2, 3, 4, 5, 6 und 7 enthält, und die zu der Expression von Aminosäuresequenzvariationen im Vergleich zu der Wildtyp-Aminosäuresequenz führt. Die Herstellung synthetischer varianter Sequenzen ist auf dem Gebiet wohlbekannt und wird z.B. in Sambrook et al. (1989), s.o. und Wells et al. (1985), Gene, 34:315 beschrieben.
  • Vektoren
  • DNA, die für trunkierte sTNFRs kodiert, kann für die weitere Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression in Vektoren insertiert werden. Geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich, oder der Vektor kann spezifisch konstruiert werden. Die Auswahl oder Konstruktion eines geeigneten Vektors wird abhängig sein (1) davon, ob er zur DNA-Amplifikation oder für die DNA-Expression verwendet werden soll, (2) von der Größe der DNA, die in den Vektor insertiert werden soll und (3) von der beabsichtigten Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert werden soll.
  • Die Vektoren umfassen jeweils eine Nukleinsäuresequenz, die für ein gewünschtes Protein kodiert, funktionell verbunden mit einer oder mehreren der folgenden Expresionskontrollsequenzen oder regulatorischen Sequenzen, die in der Lage sind, die Expression eines gewünschten Proteins durch eine gewählte Wirtszelle zu kontrollieren oder anderweitig zu bewirken. Jeder Vektor enthält verschiedene Komponenten, abhängig von dessen Funktion (Amplifikation der DNA oder Expression der DNA) und dessen Kompatibilität mit der vorgesehenen Wirtszelle. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen eine oder mehrere der Folgenden, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Selektionsgene oder Markergene, Promotoren, Enhancerelemente, eine Transkriptions-Terminationssequenz und dergleichen. Diese Komponenten können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden.
  • Beispiele für geeignete prokaryontische Klonierungsvektoren schließen Bakteriophagen, wie z.B. lambda-Derivate oder Plasmide aus E. coli ein (z.B. pBR322, colE1, pUC, den F-Faktor und Bluescript®-Plasmidderivate (Stratagene, LaJOIIa, CA)). Weitere geeignete Expressionsvektoren, von denen zahlreiche Arten auf dem Gebiet für die unten beschriebenes Wirtszellen bekannt sind, können ebenfalls für diesen Zweck verwendet werden.
  • Signalsequenz
  • Die Nukleinsäure, die für eine Signalsequenz kodiert, kann 5' der Sequenz insertiert werden, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, z.B. kann sie eine Komponente eines Vektors sein oder sie kann ein Teil einer Nukleinsäure sein, die für einen trunkierten sTNFR kodiert. Die Nukleinsäure, die für diese nativen Signalsequenzen von sTNFR-I und sTNFR-II kodieren, sind bekannt ( EP 393 438 und EP 422 339 ).
  • Replikationsursprung
  • Expressions- und Klonierungsvektoren umfassen im Allgemeinen eine Nukleinsäuresequenz, die dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. In einem Klonierungsvektor handelt es sich bei dieser Sequenz üblicherweise um eine, die dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren und umfasst Replikationsursprünge oder autonome Replikationssequenzen. Derartige Sequenzen sind wohlbekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, und verschiedene Ursprünge (z.B. SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugerzellen geeignet. Im Allgemeinen wird der Replikationsursprung für Säuger-Expressionsvektoren nicht benötigt (z.B. wird der SV40-Replikationsursprung häufig nur verwendet, da er den frühen Promotor enthält).
  • Selektionsgen
  • Die Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten jeweils üblicherweise ein Selekionsgen. Dieses Gen kodiert für ein "Marker"-Protein, das für das Überleben oder das Wachstum der transformierten Wirtszellen notwendig ist, wenn diese in einem selektiven Kulturmedium wachsen gelassen werden. Wirtszellen, die nicht mit dem Vektor transformiert sind, enthalten das Selektionsgen nicht und werden daher nicht in dem Kulturmedium überleben. Übliche Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen verleihen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin; (b) die auxotrophe Defizienten komplementieren oder (c) die entscheidende Nährstoffe zuführen, die in dem Kulturmedium nicht zur Verfügung stehen.
  • Andere Selektionsgene können verwendet werden, um die zu exprimierenden Gene zu amplifizieren. Amplifikation ist der Vorgang, in dem Gene, die für die Herstellung eines Proteins, das für das Wachstum entscheidend ist, in den Chromosomen von aufeinanderfolgenden Generationen rekombinanter Zellen in Tandem wiederholt werden. Beispiele geeigneter selektierbarer Marker für Säugerzellen schließen Dihydrofolatreduktase (DHFR) und Thymidinkinase ein. Die Zelltransformanten werden einem Selektionsdruck ausgesetzt, an den nur die Transformanten in einzigartiger Weise angepasst sind und aufgrund der in dem Vektor vorhandenen Marker überleben. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der transformierten Zellen unter Bedingungen, unter denen die Konzentration des Selektionsmittels in dem Medium schrittweise geändert wird, was zur Amplifikation sowohl der Selektionsgene als auch der für die trunkierten sTNFRs kodierenden DNA führt, ausgeübt. Als ein Ergebnis werden erhöhte Mengen der trunkierten sTNFRs von der amplifizierten DNA synthetisiert.
  • Zum Beispiel werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zunächst durch Kultivieren sämtlicher Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotrexat enthält, einem kompetitiven Antagonisten von DHFR, identifiziert. Wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist eine geeignete Wirtszelle die Ovar-Zelllinie des chinesischen Hamsters, der eine DHFR-Aktivität fehlt (Urlaub und Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77(7):4216-4220). Die transformierten Zellen werden anschließend erhöhten Konzentrationen an Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zu der Synthese mehrerer Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehreren Kopien der anderen DNA, die in dem Expressionsvektor vorhanden ist, wie z.B. der für einen trunkierten sTNFR kodierenden DNA.
  • Promotor
  • Expressions- und Klonierungsvektoren werden üblicherweise jeweils einen Promotor enthalten, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und funktionell mit einer Nukleinsäuresequenz verbunden ist, die für einen trunkierten sTNFR kodiert. Ein Promotor ist eine nicht-translatierte Sequenz, die stromaufwärts (5') des Startkodons eines strukturellen Gens lokalisiert ist (im Allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp), und die die Transription und Translation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz kontrolliert, wie z.B. derjenigen, die für einen trunkierten sTNFR kodiert. Ein Promotor kann üblicherweise in eine von zwei Klassen eingeteilt werden, induzierbare Promotoren und konstitutive Promotoren. Ein induzierbarer Promotor initiiert erhöhte Transkriptionslevel der DNA unter seiner Kontrolle in Antwort auf Veränderungen in den Kulturbedingungen, wie z.B. der Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder einer Veränderung der Temperatur. Eine große Zahl von Promotoren, die von einer Vielzahl potenzieller Wirtszellen erkannt werden, sind wohlbekannt. Ein Promotor kann funktionell mit einer DNA verbunden sein, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, indem der Promotor durch Restriktionsenzymverdau aus der Ursprungs-DNA entfernt wird und die gewünschte Promotorsequenz insertiert wird. Die native sTNFR-I-Promotorsequenz oder sTNFR-II-Promotorsequenz kann verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der DNA, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, zu steuern. Ein heterologer Promotor wird jedoch bevorzugt, wenn er eine höhere Transkription und höhere Ausbeuten des exprimierten Proteins im Vergleich zu dem nativen Promotor erlaubt und wenn er mit dem Wirtszellsystem, das für die Verwendung ausgewählt wurde, kompatibel ist. Zum Beispiel können jegliche nativen Promotorsequenzen anderer NGF/TNF-Familienmitglieder verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der für einen trunkierten sTNFR kodierenden DNA zu steuern.
  • Promotoren, die für die Verwendung mit prokaryontischen Wirten geeignet sind, schließen die beta-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme ein; die alkalische Phosphatase, ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem; ein bakterielles Lumineszenz (IuxR)-Genystem und Hybridpromotoren, wie z.B. den tac-Promotor. Weitere bekannte bakterielle Promotoren sind ebenfalls geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, wodurch sie dem Fachmann auf dem Gebiet ermöglichen, sie mit den gewünschten DNA-Seuenz(en) unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, wie benötigt, zu ligieren, um jede benötigte Restriktionsstelle vorzusehen.
  • Geeignete Promotorsequenzen für die Verwendung mit Hefewirten sind ebenfalls auf dem Gebiet wohlbekannt. Geeignete Promotoren zur Verwendung mit Säuger-Wirtszellen sind ebenfalls bekannt und schließen die aus den Genomen von Viren erhaltenen ein, wie z.B. das Polyoma-Virus, Geflügelpest-Virus, Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), bovinen Papillom-Virus, Vogel-Sarcom-Virus, Zytomegalievirus, ein Retrovirus, Hepatitis B-Virus und am bevorzugtesten Simian-Virus 40 (SV40). Weitere geeignete Säugerpromotoren schließen heterologe Säugerpromotoren ein, z.B. Hitzeschockpromotoren und den Actinpromotor.
  • Enhancer-Element
  • Die Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten üblicherweise jeweils eine Enhancersequenz, um die Transkription einer DNA-Sequenz, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, durch höhere Eukaryonten zu verstärken. Enhancer sind cis-agierende DNA-Elemente, üblicherweise mit einer Länge von etwa 10 bis 300 bp, die auf den Promotor wirken, um dessen Transkription zu erhöhen. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig. Sie wurden 5' und 3' der Transkriptionseinheit festgestellt. Hefe-Enhancer werden vorteilhafterweise mit Hefe-Promotoren verwendet. Mehrere Enhancersequenzen, die aus Säuergenen erhältlich sind, sind bekannt (z.B. Globin, Elastase, Albumin, alpha-Feto-Protein und Insulin). Darüber hinaus sind virale Enhancer, wie z.B. der SV40-Enhancer, der Zytomegalievirus frühe Promotor-Enhancer, der Polyoma-Enancer und Adenovirus-Enhancer beispielhafte Enhancer-Elemente für die Aktivierung eukaryontischer Promotoren. Während ein Enhancer an einer Position 5' oder 3' einer für einen trunkierten sTNFR kodierenden DNA in einen Vektor gespleißt werden kann, ist er üblicherweise an einer 5'-Stelle des Promotors lokalisiert.
  • Transkriptionstermination
  • In eukaryontischen Wirtszellen verwendete Expressionsvektoren enthalten üblicherweise eine Sequenz, die für die Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig ist. Derartige Sequenzen sind in Allgemeinen aus den 5'- und gelegentlich aus den 3'-nicht translatierten Bereichen eukaryontischer DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in den nicht-translatierten Teilen der für einen trunkierten sTNFR kodierenden mRNA transkribiert werden.
  • Vektorkonstruktion
  • Die Konstruktion eines geeigneten Vektors, der eine oder mehrere der oben angegebenen Komponenten enthält (zusammen mit der kodierenden Sequenz, die für einen trunkierten sTNFR kodiert), wird durch Standard-Ligationsmethoden erreicht. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zugeschnitten und in der gewünschten Reihenfolge religiert, um den benötigten Vektor zu erzeugen. Um zu bestätigen, dass die korrekte Sequenz konstruiert wurde, kann die Ligationsmischung verwendet werden, um E. coli zu transformieren, und erfolgreiche Transformanden können mittels bekannter Methoden, wie oben beschrieben, selektiert werden. Größere Mengen der Vektoren aus den Transformanten werden anschließend hergestellt, durch Restriktionsendonukleaseverdau analysiert und/oder sequenziert, um das Vorhandensein des gewünschten Konstruktes zu bestätigen.
  • Ein Vektor, der die transiente Expression einer DNA, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, in Säugerzellen gewährleistet, kann ebenfalls verwendet werden. Im Allgemeinen umfasst die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, effizient in einer Wirtszelle zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum hohe Konzentrationen des gewünschten Proteins, das durch den Expressionsvektor kodiert wird, synthetisiert. Jedes transiente Expressionssystem, das einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfasst, erlaubt die praktische positive Identifikation von Proteinen, die durch klonierte DNAs kodiert werden, ebenso wie das rasche Screenen derartiger Proteine auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften, d.h. die Identifizierung biologisch aktiver trunkierter sTNFRs.
  • Wirtszellen
  • Sämtliche der verschiedenen rekombinanten Wirtszellen, die jeweils eine Nukleinsäuresequenz für die Verwendung bei der Expression eines gewünschten Proteins enthalten, wird ebenfalls von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt. Beispielhafte prokaryontische und eukaryontische Wirtszellen umfassen Bakterienzellen, Säuerzellen, Pilzzellen, Insektenzellen, Hefezellen oder Pflanzenzellen.
  • Prokaryontische Wirtszellen umfassen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt: Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen (z.B. E. coli (HB101, DH5a, DH10 und MC1016); Bacilli, wie z.B. B. subtilis; Pseudomonas-Arten, wie z.B. P. aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella typhimurium; oder Serratia marcescans. Als eine spezifische Ausführungsform kann ein gewünschtes Protein in E. coli exprimiert werden.
  • Zusätzlich zu prokaryontischen Wirtszellen können eukaryontische Mikroben, wie z.B. filamentöse Pilze oder Hefen, geeignete Wirte für die Expression trunkierter sTNFRs sein. Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe ist der am häufigsten verwendete Mikroorganismus unter den niederen eukaryontischen Wirts-Mikroorganisen, jedoch sind etliche weitere Gattungen, Arten und Stämme wohlbekannt und allgemein erhältlich.
  • Ein trunkierter sTNFR kann in glykosylierter Form durch jede der zahlreichen geeigneten Wirtszellen, die von multizellulären Organismen abgeleitet sind, exprimiert werden. Derartige Wirtszellen sind fähig zur komplexen Prozessierung und besitzen Glykosylierungsaktivitäten. Im Prinzip kann jede höhere eukaryontische Zellkultur verwendet werden, ob diese Kultur Vertebratenzellen oder Invertebratenzellen umfasst, einschließlich Pflanzen- und Insektenzellen. Als eine spezifische Ausführungsform kann ein gewünschtes Protein in Baculoviruszellen exprimiert werden.
  • Vertebratenzellen können verwendet werden, da die Propagierung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ein wohlbekanntes Verfahren darstellt. Beispiele für geeignete Säuger-Wirtszelllinien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: Affen-Nieen-CV1-Linie, die mit SV40 transformiert ist (COS-7), humane embryonale Nierenlinie (293 Zellen oder 293 Zellen, die für das Wachstum in Suspensionskultur subkloniert wurden), Babyhamster-Nierenzellen und Qvarzellen des chinesischen Hamsters. Andere geeignete Säugerzelllinien schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: HeLa, Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, die von Swiss, Balb-c oder NIH-Mäusen abgeleitet wurden und BHK- oder HaK-Hamster-Zelllinien. Als eine spezifische Ausführungsform kann ein gewünschtes Protein in COS-Zellen exprimiert werden.
  • Eine Wirtszellen kann mit einer gewünschten Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen, welche die Expression der Nukleinsäure erlauben, transfiziert und vorzugsweise transformiert werden. Die Auswahl geeigneter Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultivierung, Amplifikation, Screening und Produktherstellung und -reinigung sind auf dem Gebiet wohlbekannt (Gething und Sambrook (1981), Nature, 293:620-625 oder alternativ Kaufman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7):1750-1759 oder US-Patent Nr. 4,419,446 ). Zum Beispiel kann für Säugerzellen ohne Zellwände das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren verwendet werden. Die Elektroporation, Mikroinjektion und weitere bekannte Methoden können ebenfalls verwendet werden.
  • Es ist außerdem möglich, dass trunkierte sTNFRs durch homologe Rekombination oder mit rekombinanten Produktionsverfahren unter Verwendung von Kontrollelementen hergestellt werden, die in Zellen eingeführt werden, die bereits für trunkierte sTNFRs kodierende DNA enthalten. Die homologe Rekombination ist eine Methode, die ursprünglich zum Targeting von Genen, zum Induzieren von Mutationen oder zur Korrektur von Mutationen in transkriptionsaktiven Genen entwickelt wurde (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid. Res. and Mol. Biol., 36:301). Das Grundverfahren wurde als ein Verfahren zur Einführung spezifischer Mutationen in spezifische Regionen des Säugergenoms entwickelt (Thomas et al. (1986), Cell, 44:419-428; Thomas und Capecchi (1987), Cell, 51:503-512 und Doetschman et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587) oder um spezifische Mutationen in fehlerhaften Genen zu korrigieren (Doetschman et al. (1987), Nature, 330:576-578). Beispielhafte Methoden sind im US-Patent Nr. 5,272,071 ; WO 92/01069 ; WO 93/03183 ; WO 94/12650 und WO 94/31560 beschrieben.
  • Durch homologe Rekombination kann die in das Genom zu insertierende DNA-Sequenz zu einer spezifischen Region des Gens von Interesse geleitet werden, indem es an die Targeting-DNA angefügt wird. Die Targeting-DNA ist eine DNA, die komplementär (homolog) zu einer Region der genomischen DNA ist. Kurze Abschnitte der Targeting-DNA, die komplementär zu einer spezifischen Region des Genoms sind, werden mit dem pa rentalen Strang während des DNA-Replikationsprozesses in Kontakt gebracht. Eine allgemeine Eigenschaft von DNA, die in eine Zelle eingeführt wurde, ist, dass sie hybridisiert und daher mit anderen Abschnitten endogener DNA durch gemeinsame homologe Regionen rekombiniert. Wird dieser komplementäre Strang an ein Oligonukleotid angeheftet, das eine Mutation oder eine andere DNA-Sequenz enthält, wird auch dieses in den neu synthetisierten Strang als Ergebnis der Rekombination eingeführt. Als ein Ergebnis der Korrekturlesefunktion ist es für die neue DNA-Sequenz möglich, als Template zu dienen. Folglich wird die transferierte DNA in das Genom eingebaut.
  • Ist die Sequenz eines bestimmten Genes bekannt, wie z.B. die Nukleinsäuresequenz eines trunkierten sTNFR, kann die Expressionskontrollsequenz (ein Abschnitt der DNA, der komplementär zu einem ausgewählten Bereich des Genes ist) synthetisiert oder anderweitig erhalten werden, wie z.B. durch geeignete Restriktion der nativen DNA an spezifischen Erkennungsstellen, welche den Bereich von Interesse begrenzen. Dieser Abschnitt dient als Zielsequenz bei der Insertion in die Zelle und wird mit deren homologer Region innerhalb des Genoms hybridisieren. Wenn diese Hybridisierung während der DNA-Replikation stattfindet, wird dieser DNA-Abschnitt und jede daran angefügte zusätzliche Sequenz als ein Okazaki-Fragment wirken und in den neu synthetisierten Tochterstrang der DNA eingefügt werden.
  • An diese Abschnitte der Targeting-DNA werden DNA-Regionen angefügt, die mit der Expression eines trunkierten sTNFR Interagieren können. Zum Beispiel wird ein Promotor/Enanerelement, ein Suppressor oder ein exogenes, die Transkription modulierendes Element in das Genom der vorgesehenen Wirtszelle insertiert, in ausreichender Nähe und Orientierung, um die Transkription der DNA, die für den gewünschten trunkierten sTNFR kodiert, zu beeinflussen. Das Kontrollelement kodiert nicht für den trunkierten sTNFR, sondern kontrolliert stattdessen einen Abschnitt der DNA, der in dem Wirtszellgenom vorhanden ist. Folglich kann die Expression eines trunkierten sTNFR nicht durch Transfektion von DNA, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, erreicht werden, sondern eher durch die Verwendung von Targeting-DNA (die Homologiebereiche mit dem endogenen Gen von Interesse enthält), die mit DNA-regulatorischen Segmenten gekoppelt ist, welche die endogene Gensequenz mit erkennbaren Signalen für die Transkription eines trunkierten sTNFR versehen.
  • Kultivieren der Wirtszellen
  • Das Verfahren zur Kultivierung der jeweiligen einen oder mehreren Wirtszelle(n) zur Herstellung eines gewünschten Proteins wird von vielen Faktoren und Berücksichtigungen abhängig sein; das optimale Herstellungsverfahren für eine bestimmte Situation wird den Fachleuten auf dem Gebiet durch minimale Experimentierung offensichtlich sein. Derartige rekombinante Wirtszellen werden in geeignetem Medium kultiviert, und der exprimierte trunkierte sTNFR wird anschließend optional aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und gereinigt (oder aus der Zelle, wenn er intrazellulär exprimiert wird), durch geeignete Mittel, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
  • Spezifisch kann jede der rekombinanten Zellen, die zum Herstellen eines gewünschten trunkierten sTNFRs verwendet werden, in Medien kultiviert werden, die zum Induzieren von Promotoren, zum Selektieren geeigneter rekombinanter Wirtszellen oder zur Amplifizierung des Gens, das für den gewünschten trunkierten sTNFR kodiert, geeignet sind. Die Medien können wie benötigt mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Nariumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nukleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Gentamicin), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die im Allgemeinen mit Endkonzentrationen in dem mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder anderen Energiequellen ergänzt werden. Andere Zusätze können ebenfalls eingeschlossen sein, in geeigneten Konzentrationen, wie die Fachleute auf dem Gebiet erkennen werden. Geeignete Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH und dergleichen sind den Fachleuten auf dem Gebiet für die Verwendung mit den ausgewählten Wirtszellen ebenso bekannt.
  • Das resultierende Expressionsprodukt kann anschließend unter Verwendung von Methoden, die auf dem Gebiet bekannt sind, nahezu bis zur Homogenität gereinigt werden. Beispielhafte Reinigungsmethoden sind in EP 393 438 und EP 422 339 offenbart.
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen
  • Pharmazeutische Zusammensetzungen werden jeweils im Allgemeinen eine therapeutisch wirksamen Menge trunkierter sTNFRs und chemisch modifizierter Derivate trunkierter sTNFRs (zusammengefasst "trunkierte sTNFR-Produkt(e)") in Beimischung mit einem Träger/Vehikel enthalten. Dieser Träger umfasst vorzugsweise ein oder mehrere pharmazeutisch und physiologisch annehmbare Formulierungsmaterialien zusammen mit dem/den trunkierten sTNFR-Produkt(en) und Material zur kontrollierten Freisetzung.
  • Das primäre Lösemittel in einem Träger kann entweder wässriger oder nicht-wässriger Art sein. Darüber hinaus kann der Träger weitere pharmazeutisch annehmbare Arzneiträger zur Veränderung oder zum Aufrechterhalten des pH, vorzugsweise zwischen 5 bis 6,5 und bevorzugter zwischen 5,5 bis 6,0 (z.B. Puffer wie Citrate, Phosphate und Aminosäuren wie Glycin); Füllstoffe für lyophilisierte Formulierungen (z.B. Mannitol und Glycin); Osmolarität (z.B. Mannitol und Natriumchlorid); Tenside (z.B. Polysorbat 20, Polysorbat 80, Triton und Pluronic); Viskosität; Klarheit; Farbe; Sterilität; Stabilität (z.B. Sucrose und Sorbitol); Antioxidanzien (z.B. Natriumsulfit und Natriumhydrogensulfit); Konservierungsmittel (z.B. Benzoesäure und Salicylsäure); Geruch der Formulierung; Geschmacksmittel und Verdünnungsmittel; Auflösungsrate (z.B. Löslichmacher und Lösungsmittel wie z.B. Alkohole, Polyethylenglykole und Natriumchlorid); Freisetzungsrate; Emulgatoren; Suspensionsmittel; Lösungsmittel; Füllstoff; Trägerstoffe; Verdünnungsmittel; Arzneimittelträger und/oder pharmazeutische Adjuvantien enthalten. Weitere wirksame Verabreichungsformen, wie z.B. parenterale Formulierungen mit langsamer Freisetzung, Inhalationssprays, oral-aktive Formulierungen oder Suppositorien, sind ebenfalls vorgesehen. Die Zusammensetzung kann weiterhin partikuläre Herstellungen polymerer Verbindungen, wie z.B. Masse-Erosionspolymere (z.B. Poly(milchsäure-co-glykoläure)-(PLGA)-Copolymere, PLGA-Polymermischungen, Blockcopolymere von PEG und Milchsäure und Glykolsäure, Poly(cyanoacrylate)); Oberflächen-Erosionspolymere (z.B. Poly(anhydride) und Poly(orthoester)); Hydrogelester (z.B. Pluronicpolyole, Poly(vinyl-lkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Maleinanhydrid-Alkylvinyl-Ether-Copolymere, Cellulose, Hyaluronsäurederivate, Alginat, Collagen, Gelatine, Albumin und Stärken und Dextrane) sowie Zusammensetzungssysteme davon; oder Herstellungen von Liposomen oder Mikrosphären umfassen. Derartige Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die in vivo-Freisetzungsrate und die in vivo-Clearancerate der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Die optimale pharmazeutische Formulierung für ein gewünschtes Protein wird von dem Fachmann auf dem Gebiet, abhängig von dem Verabreichungsweg und der gewünschten Dosierung bestimmt werden. Beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Esston, PA 18042, Seiten 1435-1712; Gombotz und Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; Leone-Bay et al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haas et al. (1995), Clinical Im munology and Immunopathology, 75(1):93; WO 94/06457 ; WO 94/21275 ; FR 2706772 und WO 94/21235 offenbart.
  • Spezifische Zusammensetzungen mit anhaltender Freisetzung sind von den folgenden Lieferanten erhältlich: Depotech (DepofoamTM, ein multivesikuläres Liposom); Alkermes (ProLeaseTM, ein PLGA-Mikrosphär). Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass Hyaluronan Hyaluronsäure, Salze davon (wie z.B. Natriumhyaluronat), Ester, Ether, enzymatische Derivate und kreuzvernetzte Gele von Hyaluronsäure sowie chemisch modifizierte Derivate von Hyaluronsäure (wie z.B. Hylan) umfasst. Beispielhafte Formen von Hyaluronan sind in Peyron und Balazs (1974), Path. Biol., (22(8):731-736; Isdale et al. (1991), J. Drug Dev., 4(2):93-99; Larsen et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129-1134; Namiki, et al. (1982), International Jornal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11):501-507; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Release, 35:67-72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthrose and Cartilage, 4:99-110; Sakakibara et al. (994), Clinical Orthopaedics and Related Reserarch, 299:282-292; Meyers and Brandt (1995), 22(9):1732-1739; Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand, 66(266):116-120; Cascone et al. (1995), Biomaterials, 16(7):569-574; Yerashalmi et al. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2):267-273; Bernatchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5):677-681; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1):38-43; Gombotz und Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332-351; US-Patente Nrn. 4,582,865 , 4,605,691 , 4,636,524 , 4,713,448 , 4,716,154 , 4,716,224 , 4,772,419 , 4,851,521 , 4,957,774 , 4,863,907 , 5,128,326 , 5,202,431 , 5,336,767 , 5,356,883 ; europäische Patentanmeldungen Nrn. 0 507 604 A2 und 0 718 312 A2 ; und WO 96/05845 offenbart. Spezifische Hyaluronanzusammensetzungen sind von den folgenden Lieferanten erhältlich: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (SynviscTM, eine 90:10-Mischung eines Hylanfluids und Hylangels); Fidia S.p.A., Abano Terme, Iralien (HyalganTM, das Natriumsalz einer aus dem Hahnenkamm stammenden Hyaluronsäure (~500000 bis ~700000 MW)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokyo, Japan (ArtzTM, eine 1 % Lösung einer aus dem Hahnenkamm stammenden Hyaluronsäure, -700000 MW); Pharmacia AB, Stockholm, Schweden (HealonTM, eine aus dem Hahnenkamm stammende Hyaluronsäure, ~4 × 106 MW); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (SurgicoatTM, eine rekombinante Hyaluronsäure); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Hyaluronic Acid FCH, eine Hyaluronsäure mit hohem Molekulargewicht (z.B. -1,5 bis 2,2 × 106 MW), die aus Kulturen von Streptococcus zooepidemicus hergestellt wurde; Natriumhyaluronat MV, ~1,0 bis 1,6 × 106 MW und Natriumhyaluronat LV, ~1,5 bis 2,2 × 106 MW); Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Schweiz (Hyaluronsäure, Natriumsalz (1997 Firmenkatalog Nr. 385908), hergestellt aus Streptococcus sp.); Intergen Company, Purchase, NY (eine aus dem Hahnenkamm stammende Hyaluronsäure, > 1 × 106 MW); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ und Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • Sobald die pharmazeutische Zusammensetzung formuliert wurde, kann sie in sterilen Behältern als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder dehydriertes oder lyohilisiertes Puder gelagert werden. Derartige Formulierungen können entweder in einer ready-to-use-Form oder in einer Form, die eine Wiederherstellung vor der Verabreichung erfordert (z.B. lyophilisiert), gelagert werden.
  • In einer spezifischen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Kits zur Herstellung einer Einzeldosis-Verabreichungseinheit. Die Kits können jeweils sowohl einen ersten Behälter enthalten, der ein getrocknetes Protein enthält und einen zweiten Behälter, der eine wässrige Formulierung enthält. Kits, die von dieser Erfindung umfasst sind, sind vorgefüllte Spritzen mit einer oder mehreren Kammern; beispielhafte vorgefüllte Spritzen (z.B. Flüssigspritzen und Lyospritzen, wie z.B. Luo-Ject®, eine vorgefüllte Lyospritze mit Doppelkammer), sind von der Vetter GmbH, Ravensburg, Deutschland erhältlich.
  • Verwendungen
  • Trunkierte sTNFR-Produkte können als Forschungsreagenzien und als therapeutische und diagnostische Mittel nützlich sein. Folglich können die trunkierten sTNFRs in diagnostischen in vitro und/oder in vivo Assays verwendet werden, um die Menge an nativem sTNFR-I oder sTNFR-II in einem Gewebe oder in einer Organprobe zu quantifizieren oder Zellen, die TNF exprimieren, zu bestimmen und/oder zu isolieren (Scallon et al. (1995), s. o.). In Untersuchungen von Geweben oder Organen wird es aufgrund von unmarkiertem nativem sTNFR-I oder sTNFR-II, der an TNF bindet, weniger Radioaktivität von 125I-trunkierten sTNFRs geben, die an TNF binden, im Vergleich zu einer standardisierten Bindungskurve von 125I-trunkierten sTNFRs. In ähnlicher Weise kann die Verwendung von 125I-trunkierten sTNFRs verwendet werden, um die Gegenwart von TNF in verschiedenen Zellarten nachzuweisen.
  • Diese Erfindung sieht außerdem die Verwendung von trunkierten sTNFR-Produkten bei der Herstellung von Antikörpern sowie die resultierenden Antikörper vor (wobei speziell solche eingeschlossen sind, die außerdem an natives sTNFR-I binden). Es können Antikörper entwickelt werden, die an trunkierte sTNFRs binden, wie z.B. an Epitope innerhalb der R1-[Cys19-Cys103]-R2-Aminosäuresequenz. Der durchschnittliche Fachmann auf dem Gebiet kann wohlbekannte, veröffentlichte Verfahren verwenden, um monoklonale und polyklonale Antikörper zu erhalten oder rekombinante Antikörper, welche die verschiedenen Proteine, die durch die Aminosäuresequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert werden, spezifisch erkennen und binden. Derartige Antikörper können anschließend verwendet werden, um den vollständig langen, reifen 30 kDa TNF-Inhibitor zu reinigen und zu charakterisieren.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung eines trunkierten sTNFRs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung bestimmter Erkrankungen und medizinischer Zustände (von denen viele als inflammatorische Erkrankungen charakterisiert werden können), die durch TNF vermittelt werden. Eine Erkrankung oder ein medizinischer Zustand wird als eine "TNF-vermittelte Erkrankung" betrachtet, wenn die spontane oder experimentelle Erkrankung mit erhöhten Konzentrationen an TNF in Körperflüssigkeiten oder in Geweben, die benachbart zu dem Fokus der Erkrankung oder der Indikation in dem Körper liegen, assoziiert ist. TNF-verittelte Erkrankungen können außerdem durch die folgenden beiden Bedingungen erkannt werden: (1) pathologische Befunde, die mit einer Erkrankung assoziiert sind, können durch die Verabreichung von TNF experimentell in Tieren nachgeahmt werden, und (2) die in den experimentellen Tiermodellen der Erkrankung induzierte Pathologie kann durch Behandlung mit Mitteln, welche die Wirkung von TNF inhibieren, inhibiert oder beseitigt werden. Viele TNF-vermittelte Erkrankungen erfüllen zwei dieser drei Bedingungen und weitere werden alle drei Bedingungen erfüllen. Eine nicht abschließende Liste TNF-vermittelter Erkrankungen, ebenso wie die damit zusammenhängenden Folgekrankheiten und damit assoziierten Symptome, die jeweils in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden können, sind: ARDS (adult respiratory distress syndrome); Cachexie/Anorexie; Krebs (z.B. Leukämien); das chronische Müdigkeitssyndrom; die graft versus host-Abstoßung; Hyperalgesie; inflammatorische Darmerkrankung; neuroinflammatorische Erkrankungen; ischämische/Reperusionsverletzung, einschließlich der cerebralen Ischämie (Gehirnverletzung als Folge eines Traumas, Epilepsie, Hämorrhagie oder Infarkt, wobei jede davon zur Neurodegeneration führen kann); Diabetes (z.B. juveniler Typ 1 Diabetes Mellitus); Multiple Sklerose; Okularerkrankungen; Schmerz; Pankreatitis; polmonare Fibrose; rheuma tische Erkrankungen (z.B. rheumatoider Arthritis, Osteoarthrose, juvenile (rheumatoide) Arthritis, seronegative Polyarthritis, ankylosierende Spondylitis, Reiters-Syndrom und reaktive Arthritis, psoriatische Arthritis, enteropathische Arthritis, Polymyositis, Dermatomyositis, Sklerodermie, systemische Sklerose, Vaskulitis, cerebrale Vaskulitis, Sjögren-Syndrom, rheumatisches Fieber, Polychondritis und Polymyalgia rheumatica und Riesenzellarteriitis); septischer Schock; Nebenwirkungen der Bestrahlungstherapie; systemischer Lupus erythematodes; temporale mandibulare Gelenkserkrankung; Thyeroiditis und Gewebetransplantation.
  • Die trunkierten sTNFR-Produkte können jeweils in therapeutisch wirksamen Mengen für die Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen an einen Patienten verabreich werden, wie oben definiert, einschließlich z.B. rheumatischer Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis). Es ist beabsichtigt, dass der Begriff "Patient" Tiere umfasst (z.B. Katzen, Hunde und Pferde), ebenso wie Menschen.
  • Ein trunkiertes sTNFR-Produkt kann über die topische, enterale oder parenterale Verabreichung verabreicht werden, einschließlich und ohne Beschränkung der intravenösen, intramuskulären, intraarteriellen, intrathekalen, intrakapsulären, intraorbitalen, intrakardialen, intradermalen, intraperitonealen, transtrachealen, subkutanen, subkutikulären, intraartikulären, subkapsulären, subarachnoidalen, intraspinalen, intraventrikulären und intrasternalen Injektion und Infusion. Ein trunkiertes sTNFR-Produkt kann außerdem über orale Verabreichung verabreicht werden oder durch Schleimhäute verabreicht werden, d.h. intranasal, sublingual, bukkal oder rektal für die systemische Verabreichung.
  • Es wird bevorzugt, dass trunkierte sTNFR-Produkte durch intraartikuläre, subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Injektion verabreicht werden. Darüber hinaus kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt durch eine fortdauernde Infusion verabreicht werden (z.B. durch konstante oder intermittierende implantierte oder externe den Infusionsfluss modulierende Vorrichtungen), so dass die gewünschte Konzentration an trunkiertem sTNFR-Produkt im Blut für die Dauer der Verabreichung kontinuierlich zur Verfügung gestellt wird. Dies wird vorzugsweise durch Mittel der kontinuierlichen Infusion erreicht, z.B. über eine Minipumpe, wie z.B. eine osmotische Minipumpe. Auf diese Art und Weise kann man sichergehen, dass die Arzneimittelmenge in der gewünschten Konzentration aufrecht erhalten wird und man kann Blutproben entnehmen und die Menge des Arzneimit tels in dem Blutstrom beobachten. Verschiedene Pumpen sind kommerziell erhältlich, von Lieferanten, wie z.B. MiniMed Inc., Sylmar, CA (z.B. MT507) und Alza Corp., Palo Alto, CA (z.B. Alzet osmotische Pumpe, Modell 2MLI).
  • Es ist außerdem vorgesehen, dass andere Arten der kontinuierlichen oder fast kontinuierlichen Dosierung praktiziert werden können. Zum Beispiel kann eine chemische Derivatisierung zu Formen des Proteins mit anhaltender Verabreichung führen, welche die Wirkung der kontinuierlichen Präsenz in dem Blutstrom haben, in vorhersagbaren Mengen, basierend auf einer bestimmten Dosierungsprozedur.
  • Verwendungsweisen der trunkierten sTNFR-Produkte für die Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, einschließlich inflammatorischer Zustände eines Gelenkes (z.B. Osteoarthrose, psoriatische Arthritis und rheumatoide Arthiritis), werden in der europäischen Patentanmeldung 567566 dargelegt. Als Beispiel, jedoch nicht Beschränkung, können in einer spezifischen Ausführungsform trunkierte sTNFR-Produkte zur Behandlung von rheumatoider Arthritis und Osteoarthrose intraartikulär verabreicht werden. Als Beispiel, jedoch nicht Beschränkung, können trunkierte sTNFR-Produkte in einer anderen spezifischen Ausführungsform zur Behandlung von rheumatoider Arthritis, inflammatorischer Darmerkrankung, Kachexie/Anorexie oder multipler Sklerose subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Als Beispiel, jedoch nicht Beschränkung, können die trunkierten sTNFR-Produkte in noch einer weiteren spezifischen Ausführungsform für die Behandlung von Gehirnverletzungen als Folge eines Trauma, Epilepsie, Blutung oder Infarkt intravenös verabreicht werden; oder sie können für die Behandlung einer Gehirnverletzung als Folge eines Trauma intraventrikulär verabreicht werden. Eine bevorzugte Weise für die Behandlung von Arthritis umfasst: (1) eine einzige intra-artikuläre Injektion eines trunkierten sTNFR-Produkts, die periodisch verabreicht wird, wie benötigt, um das Aufflammen von Arthritis zu verhindern oder zu beseitigen und (2) regelmäßige subkutane Injektionen eines trunkierten sTNFR-Produktes. Die Anfangsbehandlung für septischen Schock sollte so bald wie möglich nachdem eine Septikämie oder die Möglichkeit einer Septikämie diagnostiziert wurde, begonnen werden. Zum Beispiel kann die Behandlung sofort nach einer Operation oder einem Unfall oder irgendeinem anderen Vorkommnis, welches das Risiko für einen septischen Schock in sich birgt, begannen werden. Bevorzugte Behandlungsweisen des ARDS umfasst: (1) einzelne oder mehrere intratracheale Verabreichungen eines trunkierten sTNFR-Produktes und (2) Bolus oder kontinuierliche intravenöse Infusion eines trunkierten sTNFR-Produktes.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist die Zelltherapie, z.B. die Implantation von Zellen, die einen trunkierten sTNFR produzieren, ebenfalls vorgesehen. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Implantieren von Zellen in Patienten umfassen, die fähig sind, biologisch aktive Formen eines trunkierten sTNFR zu synthetisieren und zu sezernieren. Derartige Zellen, die einen trunkierten sTNFR produzieren, können Zellen sein, die normalerweise keinen trunkierten sTNFR produzieren, jedoch so modifiziert wurden, dass sie einen trunkierten sTNFR produzieren oder es können Zellen sein, deren Fähigkeit zur Produktion eines trunkierten sTNFRs durch Translation mit einem Polynukleotid, das zur Expression und Sekretion eines trunkierten sTNFRs geeignet ist, erhöht wurde. Um eine mögliche immunologische Reaktion in Patienten durch die Verabreichung eines trunkierten sTNFRs einer fremden Spezies zu minimieren, ist bevorzugt, dass die Zellen aus derselben Spezies stammen wie der Patient (z.B. human), oder dass die Zellen mit Material eingekapselt werden, das eine Barriere gegen die Immunerkennung zur Verfügung stellt, oder dass die Zellen in eine immunologisch priviligierte anatomische Stelle platziert werden, wie z.B. in die Hoden, das Auge oder das zentrale Nervensystem.
  • Humane oder nicht-humane tierische Zellen können in biokompatiblen, semi-permeablen polymeren Einschlüssen oder Membranen in Patienten implantiert werden, um die Freisetzung eines trunkierten sTNFRs zu ermöglichen, jedoch die Zerstörung der Zellen durch das Immunsystem des Patienten oder durch andere zerstörerische Faktoren aus dem umgebenden Gewebe zu verhindern. Alternativ können die eigenen Zellen des Patienten, die ex vivo transformiert wurden, um einen trunkierten sTNFR zu produzieren, direkt ohne eine solche Verkapselung in den Patienten implantiert werden. Die Methodik für die Membranverkapselung lebender Zellen ist den durchschnittlichen Fachleuten auf dem Gebiet geläufig, und die Herstellung verkapselter Zellen und ihre Implantation in Patienten kann erreicht werden.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform ist außerdem die in vivo-Gentherapie vorgesehen, in der eine Nukleinsäuresequenz, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, direkt in einen Patienten eingeführt werden kann. Zum Beispiel kann eine Nukleinsäuresequenz, die für einen trunkierten sTNFR kodiert, durch lokale Injektion eines Nukleinsäurekonstruktes, mit oder ohne geeigneten Liefervektor, wie z.B. einen Adeno-assoziierten Virusvektor, in Zielzellen eingeführt werden. Alternative virale Vektoren schließen Retrovirus-, Adenovirus-, Herpes simplex Virus- und Papillom-Virus-Vektoren ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Ein physischer Transfer kann in vivo durch lokale Injektion des gewünschten Nukleinsäurekonstruktes oder eines anderen geeigneten Liefervektors, der die gewünschte Nukleinsäuresequenz enthält, durch Liposomen-vermittelten Transfer, direkte Injektion (Nackt-DNA), Rezeptor-vermittelten Transfer (Liganden-DNA-Komplex) oder Mikropartikelbeschuss (Genpistole) erreicht werden.
  • Beispielhafte Zell- und Gentherapiemethoden sind in dem US-Patent Nr. 4,892,538 ; US-Patent Nr. 5,011,472 ; US-Patent Nr. 5,106,627 ; DE 4219626 , WO 94/20517 und 96/22793 offenbart.
  • Unabhängig von der Art der Verabreichung benötigt die Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung eine Dosis oder Gesamt-Dosisprozedur mit einem trunkierten sTNFR, die wirksam ist, die Symptome der Erkrankung zu verringern oder zu lindern. Weitere Faktoren bei der Bestimmung der geeigneten Dosierung können die Erkrankung oder den Zustand beinhalten, der zu behandeln ist oder verhindert werden soll, die Schwere der Erkrankung, den Verabreichungsweg und das Alter, Geschlecht und den medizinischen Zustand des Patienten. Die weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosierung für die Behandlung zu bestimmen, wird routinemäßig von den Fachleuten auf dem Gebiet durchgeführt, insbesondere angesichts der Dosierungsinformationen und Assays, die hierin offenbart werden. Die Dosierung kann außerdem durch die Verwendung bekannter Assays zur Bestimmung von Dosierungen, die im Zusammenhang mit geeigneten Daten zur Dosiswirkung stehen, bestimmt werden. Die spezifische Dosis wird in Übereinstimmung mit dem ungefähren Körpergewicht oder der Körperoberfläche des Patienten berechnet.
  • Die Dosierungshäufigkeit ist abhängig von den pharmakokinetischen Parametern des trunkierten sTNFRs in der verwendeten Formulierung. Der trunkierte sTNFR kann einmal verabreicht werden oder in Fällen von schweren oder anhaltenden Erkrankungen täglich in weniger häufigen Dosen verabreicht werden oder mit einer Anfangs-Bolus-Dosis, gefolgt von einer kontinuierlichen Dosis oder einer anhaltenden Verabreichung verabreicht werden. Bei der parenteralen Verabreichung kann eine parenterale Einheitsdosis z.B. jeweils bis zu 10 mg sein, üblicherweise bis zu 15 mg und noch üblicherweise bis zu 20 mg. Bei einer Verabreichung in einer artikulären Höhle wird die pharmazeutische Zusammensetzung vorzugsweise als eine einzelne Injektionsform verabreicht, z.B. mit einer 3 bis 10 ml-Spritze, die z.B. eine Dosis zwischen etwa 5 mg/ml bis 10 mg/ml trunkierten sTNFR, gelöst in isotonischer, phosphatgepufferter Salzlösung, enthält. Die Herstellung kann in eine artikuläre Höhle mit einer Häufigkeit von z.B. einmal in 7 bis 10 Tagen verabreicht werden. Auf eine solche Art und Weise wird die Verabreichung kontinuierlich durchgeführt, z.B. 4- bis 5-mal, während die Dosis, falls nötig, verändert wird.
  • In einigen Fällen können die trunkierten sTNFR-Produkte als Ergänzung zu einer anderen Therapie und auch mit anderen pharmazeutischen Formulierungen, die für die zu behandelnde Indikation geeignet sind, verabreicht werden. Ein trunkiertes sTNFR-Produkt und jedes der einen oder mehreren traditionellen oder neuen anti-inflammatorischen Arzneimittel können separat oder in Kombination verabreicht werden.
  • Trunkierte sTNFR-Produkte (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Proteine) und ein jedes der einen oder mehreren zusätzlichen anti-inflammatorischen Arzneimittel können separat oder in Kombination verabreicht werden. Informationen bezüglich der folgenden Verbindungen können in The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Sixteenth Ausgabe, Merck, Sharp & Dohme Research Laborstories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) und in Pharmaprojects, PJB Publications Ltd. gefunden werden.
  • Die vorliegende Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, umfasst akute und chronische Entzündungen, wie z.B. rheumatische Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis) umfasst Erstlinien-Therapeutika zur Kontrolle von Schmerz und Entzündung, die als nicht-steroidale, anti-inflammatorische Arzneimittel (NSAIDs) klassifiziert werden. Sekundäre Behandlungen umfassen Corticosteroide, langsam wirkende anti-rheumatische Arzneimittel (slow acting antirheumatic drugs, SAARDs) oder Krankheit-modifizierende (disease modifying, DM) Arzneimittel.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination mit irgendeinem oder mehreren NSAIDs zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich akuter und chronischer Entzündung, wie z.B. rheumatischen Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis); und graft versus host-Erkrankung, verwendet werden. NSAIDs verdanken ihre anti-inflammatorische Wirkung zumindest teilweise der Inhibition der Prostaglandinsynthese (Goodman und Gilman in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", MacMillan, 7. Ausgabe (1985)). NSAIDs können in neun Gruppen eingeteilt werden: (1) Salicylsäurederivate; (2) Propi onsäurederivate; (3) Essigsäurederivate; (4) Fenaminsäurederivate; (5) Carboxylsäurederivate; (6) Butansäurederivate; (7) Oxycame; (8) Pyrazole und (9) Pyrazolone.
  • In einer spezifischen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), das in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeiner oder mehreren Salicylsäurederivaten, Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden kann. Derartige Salicylsäurederivate, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbare Salze davon umfassen: Acetaminosalol, Aloxiprin, Aspirin, Benorylat, Bromsaligenin, Calciumacetylsalicylat, Cholin-Magnesium-Trisalicylat-Diflusinal, Etersalat, Fendosal, Gentisinsäure, Glykolsalicylat, Imidazolsalicylat, Lysinacetylsalicylat, Mesalamin, Morpholinsalicylat, 1-Naphthylsalicylat, Olsalazin, Parsalmid, Phenylacetylsalicylat, Phenylsalicylat, Salacetamid, Salicylamid-O-essigsäure, Salsalat und Sulfasalazin. Es ist beabsichtigt, dass strukturell verwandte Salicylsäurederivate, die ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften haben, ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einer oder mehreren Propionsäurederivaten, Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Propionsäurederivate, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Alminoprofen, Benzoxaprofen, Bucloxinsäure, Carprofen, Dexindoprofen, Fenoprofen, Flunoxaprofen, Fluprofen, Flurbiprofen, Furcloprofen, Ibuprofen, Ibuprofenalumin, Ibuproxam, Indoprofen, Isoprofen, Ketoprofen, Loxoprofen, Miroprofen, Naproxen, Oxaprozin, Piketoprofen, Pimeprofen, Pirprofen, Pranoprofen, Protizininsäure, Pyridoxiprofen, Suprofen, Tiaprofensäure und Tioxaprofen. Strukturell verwandte Propionsäurederivate haben ähnliche analgetische und antiinflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie auch von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Essigsäurederivaten, Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Essigsäurederivate, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbare Salze davon umfassen: Acemetacin, Alclofenac, Amfenac, Bufexamac, Cinmetacin, Clopirac, Delme tacin, Diclofenacnatrium, Etodolac, Felbinac, Fenclofenac, Fenclorac, Fenclozinsäure, Fentiazac, Furofenac, Glucametacin, Ibufenac, Indomethacin, Isofezolac, Isoxepac, Ionazolac, Metiazinsäure, Oxametacin, Oxpinac, Pimetacin, Proglumetacin, Sulindac, Talmetacin, Tiaramid, Tiopinac, Tolmetin, Zidometacin und Zomepirac. Strukturell verwandte Essigsäurederivate haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Fenaminsäurederivaten, Prodrug-Estern und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Fenaminsäurederivate, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Enfenaminsäure, Etofenamat, Flufenaminsäure, Isonixin, Meclofenaminsäure, Meclofenamatnatrium, Medofenaminsäure, Mefanaminsäure, Nifluminsäure, Ralniflumat, Terofenamat, Tolfenaminsäure und Ufenamat. Strukturell verwandte Fenaminsäurederivate haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Carboxylsäurederivaten, Prodrug-Estern und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Carboxylsäurederivate, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Clidanac, Diflunisal, Flufenisal, Inoridin, Ketorolac und Tinoridin. Strukturell verwandte Carboxylsäurederivate haben ähnliche analgetische und antiinflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Butansäurederivaten, Prodrug-Estern und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Butansäurederivate, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Bumadizon, Butibufen, Fenbufen und Xenbucin. Strukturell verwandte Butansäurederivate haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Oxicamen, Prodrug-Estern und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Oxycame, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Droxicam, Enolicam, Isoxicam, Piroxicam, Sudoxicam, Tenoxicam und 4-Hydroxyl-1,2-benzothiazin-1,1-dioxid-4-(N-phenyl)-carboxamid. Strukturell verwandte Oxycame haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Pyrazolen, Prodrug-Estern und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Pyrazole, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Difenamizol und Epirizol. Strukturell verwandte Pyrazole haben ähnliche analgetische und antiinflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Pyrazolonen, Prodrug-Estern und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon verwendet werden. Die Pyrazolone, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbaren Salze davon umfassen: Apazon, Azapropazon, Benzpiperylon, Feprazon, Mofebutazon, Morazon, Oxyphenbutazon, Phenylbutazon, Pipebuzon, Propylphenazon, Ramifenazon, Suxibuzon und Thiazolinobutazon. Strukturell verwandte Pyrazolone haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren NSAIDs verwendet werden: ε-Acetamidocapronsäure, S-Adenosylmethionin, 3-Amino-4-hydroxybutansäure, Amixetrin, Anitrazafen, Antrafenin, Bendazac, Bendazaclysinat, Benzydamin, Beprozin, Broperamol, Bucolom, Bufezolac, Ciproquazon, Cloximat, Diazidamin, Deboxamat, Detomidin, Difenpiramid, Difenpyramid, Difisalamin, Ditazol, Emorfazon, Fanetizolmesylat, Fenflumizol, Floctafenin, Flumizol, Flunixin, Fluproquazon, Fopirtolin, Fosfosal, Guaimesal, Guaiazolen, Isonixirn, Lefetamin HCl, Leflunomid, Lofemizol, Lotifazol, Lysinclonixinat, Meseclazon, Nabumeton, Nictindol, Nimesulid, Orgotein, Orpanoxin, Oxaceprolm, Oxapadol, Paranylin, Perisoxal, Perisoxalcitrat, Pifoxim, Piproxen, Pirazolac, Pirfenidon, Proquazon, Proxazol, Thielavin B, Tifiamizol, Timegadin, Tolectin, Tolpadol, Tryptamid und solche, die durch eine Firmencodenummer bezeichnet werden, wie z.B. 480156S, AA861, AD1590, AFP802, AFP860, AI77B, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ONO3144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SOAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TAI-901 (4-Benzoyl-1-indancarboxylsäure), TVX2706, U60257, UR2301 und WY41770. Strukturell verwandte NSAIDs haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften wie die oben genannten NSAIDs und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung und gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Corticosteroiden, Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich akuter und chronischer Entzündung, wie z.B. rheumatischen Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juveniler (rheumatoider) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis); und multipler Sklerose, verwendet werden. Corticosteroide, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbare Salze davon schließen Hydrocortisone und Verbindungen ein, die von Hydrocortisonen abgeleitet sind, wie z.B. 21-Acetoxypregnenolon, Alciomerason, Algeston, Amcinonid, Beclomethason, Betamethason, Betamethasonvalerat, Budesonid, Chlorprednison, Clobetasol, Clobetasolpropionat, Clobetason, Clobetasonbutyrat, Clocortolon, Cloprednol, Corticosteron, Cortison, Cortivazol, Deflazacon, Desonid, Desoximerason, Dexamethason, Diflorason, Diflucortolon, Difluprednat, Enoxolon, Fluazacort, Flucloronid, Flumethason, Flumethasonpivalat, Flunisolid, Flucinolonacetonid, Fluocinonid, Fluorocinolonacetonid, Fluocortinbutyl, Fluocortolon, Fluorocortolonhexanoat, Diflucortolonvalerat, Fluoromethoion, Fluperolonacetat, Fluprednidenacetat, Fluprednisolon, Flurandenolid, Formocortal, Halcinonid, Halometason, Halopredonacetat, Hydrocortamat, Hydrocortison, Hy drocortisonacetat, Hydrocortisonbutyrat, Hydrocortisonphosphat, Hydrocortison-21-natriumsuccinat, Hydrocortisontebutat, Mazipredon, Medryson, Meprednison, Methylprednicolon, Mometasonfuroat, Paramethason, Prednicarbat, Prednisolon, Prednisolon-21-diedryaminoacetat, Prednisolonnatriumphosphat, Prednisolonnatriumsuccinat, Prednisolonnatrium-21-m-sulfobenzoat, Prednisolonnatrium-21-stearoglykolat, Prednisolontebutat, Prednisolon-21-trimethylacetat, Prednison, Prednival, Prednyliden, Prednyliden-21-diethylaminoacetat, Tixocortol, Triamcinolon, Triamcinolonacetonid, Triamcinolonbenetonid und Triamcinolonhexacetonid. Strukturell verwandte Corticosteroide haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandnung, Nachbehandlung und gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren langsam wirkenden antirheumatischen Arzneimitteln (slow-acting antirheumatic drugs, SAARDs) oder Krankheitsmodifizierenden antirheumatischen Arzneimitteln (disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs), Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich akuter und chronischer Entzündung, wie z.B. rheumatischen Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juveniler (rheumatoider) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis); und multipler Sklerose verwendet werden. SAARDs oder DMARDs, Prodrug-Ester und pharmazeutisch annehmbare Salze davon umfassen: Allocupreid-Natrium, Auranofin, Aurothioglucose, Aurothioglycanid, Azathioprin, Brequinar-Natrium, Bucillamin, Calcium-3-aurothio-2-propanol-1-sulfonat, Chlorambucil, Chlorquin, Clobuzarit, Cuproxolin, Cyclophosphamid, Cyclosporin, Dapson, 15-Deoxyspergualin, Diacerein, Glucosamin, Goldsalze (z.B. Cycloquingoldsalz, Goldnatriumthiomalat, Goldnatriumthiosulfat), Hydroxychloroquin, Hydroxyharnstoff, Kebuzon, Levamisol, Lobenzarit, Melittin, 6-Mercaptopurin, Methotrexat, Mizoribin, Mycophenolat-mofetil, Myoral, Stickstoffsenfgas, D-Penicillamin, Pyridinolimidazole, wie z.B. SKNF86002 und S8203580, Rpamycin, Thiole, Thymopoietin und Vincristin. Strukturell verwandte SAARDs oder DMARDs haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren COX2-Inhibitoren, deren Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich der akuten und chronischen Entzündung, verwendet werden. Beispiele für COX2-Inhibitoren, Prodrug-Ester oder pharmazeutisch annehmbare Salze davon umfassen z.B. Celecoxib. Strukturell verwandte COX2-Inhibitoren haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren antimikrobielle(n) Mittel(n), deren Prodrug-Estern oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich der akuten und chronischen Entzündung, verwendet werden. Beispiele für antimikrobielle Mittel umfassen z.B. Ampicillin, Amoxycillin, Aureomicin, Bacitracin, Ceftazidim, Ceftriaxon, Cefotaxim, Cephachlor, Cephalexin, Cephradin, Ciprofloxacin, Clavulansäure, Cloxacillin, Dicloxacillan, Erythromycin, Flucloxacillan, Gentamicin, Gramicidin, Methicillan, Neomycin, Oxacillan, Penicillin und Vancomycin. Strukturell verwandte antimikrobielle Mittel haben ähnliche analgetische und anti-inflammatorische Eigenschaften und es ist beabsichtigt, dass sie ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sind.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einem oder mehreren der folgenden Verbindungen zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich der akuten und chronischen Entzündung verwendet werden: Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor; Thalidomid; BN 50730; Tenidap; E 5531; Tiapafant PCA 4248; Nimesulid; Panavir; Rolipram; RP 73401; Peptid T; MDL 201,449A; (1R,3S)-Cis-1-[9-(2,6-diaminopurinyl)]-3-hydroxy-4-cyclopenten-hydrochlorid; (1R,3R)-Trans-1-[9-(2,6-diamino)purin]-3-acetoxycyclopentan; (1R,3R)-Trans-1-[9-adenyl)-3-azidocyclopentanhydrochlorid und (1R,3R)-Trans-1-(6-hydroxy-purin-9-yl)-3-azidocyclopentan.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einem oder mehreren zusätzlichen TNF-Inhibitoren zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, verwendet werden, einschließlich der akuten und chronischen Entzündung. TNF-Inhibitoren umfassen Verbindungen und Proteine, welche die in vivo-Synthese oder die extrazelluläre Freisetzung von TNF blockieren, einschließlich der folgenden Verbindungen.
  • Zusätzliche TNF-Inhibitoren umfassten anti-TNF Antikörper (z.B. den MAK 195F Fab-Antikörper (Holler et al. (1993), 1st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147; den CDP 571 anti-TNF monoklonalen Antikörper (Raukin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342); den BAY X 1351 murinen anti-Tumor-Nekrosefaktor monoklonalen Antikörper (Kieft et al. (1995), 7. European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9, dessen Offenbarung hiermit durch Referenz eingeschlossen ist); den CenTNF cA2 anti-TNF monoklonalen Antikörper (Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1125-1227 und Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1105-1110).
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit dem löslichen rekombinanten humanen Fas-Antigen oder rekombinanten Versionen davon verwendet werden ( WO 96/20206 und Mountz et al., J. Immunology, 155:4829-4837; und EP 510 691 ). WO 96/20206 offenbart sezerniertes humanes Fas-Antigen (nativ und rekombinant, einschließlich Ig-Fusionsprotein), Verfahren zum Isolieren der Gene, die für die Kodierung des löslichen rekombinaten humanen Fas-Antigens verantwortlich sind, Verfahren zum Klonieren des Gens in geeignete Vektoren und Zellarten und Verfahren zum Exprimieren des Gens, um die Inhibitoren herzustellen. EP 510 691 lehrt DNAs, die für humanes Fas-Antigen kodieren, einschließlich des löslichen Fas-Antigens; Vektoren, die die genannten DNAs exprimieren und Transformanten, die mit dem Vektor transfiziert sind. Bei parenteraler Verabreichung liegen die Dosen eines Fas-Antigen-Fusionsproteins jeweils üblicherweise im Bereich von 1 μg/kg bis 100 μg/kg.
  • In einer spezifischen Ausführungsform kann ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit irgendeinem oder mehreren Interleukin-1-Inhibitoren zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, wie oben definiert, einschließlich der akuten chronischen Entzündung, wie z.B. rheumatischer Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheuma toide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis); Gehirnverletzung als Folge eines Trauma, Epilepsie, Blutung oder Infarkt; und multipler Sklerose verwendet werden. Klassen von Interleukin-1-Inhibitoren schließen Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten ein (jede Verbindung, die fähig ist, die Aktivierung von zellulären Rezeptoren für IL-1 spezifisch zu verhindern), wie z.B. IL-1ra, wie unten beschrieben; anti-IL-1-Rezeptor monoklonale Antikörper (z.B. EP 623674 ); IL-1-bindende Proteine, wie z.B. lösliche IL-1-Rezeptoren (z.B. U.S.P. 5,492,888 , U.S.P. 5,488,032 , U.S.P. 5,464,937 , U.S.P. 5,319,071 und U.S.P. 5,180,812 ; anti-IL-1 monoklonale Antikörper (z.B. WO 9501997 , WO 9402627 , WO 9006371 , U.S.P. 4935343 , EP 264778 , EP 267611 und EP 220063 ); IL-1-Rezeptor akzessorische Proteine, z.B. WO 96/23067 , sowie weitere Verbindungen und Proteine, welche die in vivo-Synthese oder die extrazelluläre Freisetzung von IL-1 blockieren.
  • Interleukin-1-Rezeptor-Antagonist (IL-1ra) ist ein humanes Protein, das als natürlicher Inhibitor von Interleukin-1 wirkt. Bevorzugte Rezeptorantagonisten, ebenso wie Verfahren zur Herstellung und Verfahren zu ihrer Verwendung sind in US-Patent Nr. 5,075,222 beschrieben (hierin als das '222-Patent bezeichnet); WO 91/08285 ; WO 91/17184 ; AU 9173636 ; WO 92/16221 ; WO 93/21946 ; PCT internationale Anmeldung Nr. US 97/02131 , die eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die (a) eine wirksame Menge eines Polymers mit kontrollierter Freisetzung (z.B. Hyaluronsäure) und (b) eine wirksame Menge eines IL-1 ra umfasst; WO 94/06457 ; WO 94/21275 ; FR 2706772 ; WO 94/21235 ; DE 4219626 , WO 94/20517 und WO 96/22793 . Die Proteine umfassen glykosylierte ebenso wie nicht-glykosylierte IL-1-Rezeptorantagonisten.
  • Spezifisch werden drei bevorzugte Formen von IL-1ra (IL-1raα, IL-1raβ und IL-1rax) in US-Patent Nr. 5,075,222 von Hannum et al. mit dem Titel "Interleukin-1-Inhibitoren", die jeweils von derselben kodierenden DNA-Sequenz abgeleitet sind, offenbart und beschrieben. Alle drei dieser Interleukin-1-Inhibitoren besitzen ähnliche funktionelle und immunologische Aktivitäten. Verfahren zur Herstellung von IL-1-Inhibitoren, insbesondere von IL-1ras, sind ebenfalls in dem '222-Patent offenbart. Eines der offenbarten Verfahren umfasst das Isolieren der Inhibitoren aus humanen Monozyten (wo sie natürlicherweise produziert werden). Ein zweites offenbartes Verfahren umfasst das Isolieren des Genes, das für das Kodieren der IL-1ras verantwortlich ist, das Klonieren des Gens in geeignete Vektoren und Zellarten, das Exprimieren des Gens, um die IL-1ras zu produzieren und das Gewinnen der IL-1ras. Das letztere Verfahren, das beispielhaft für rekombinante DNA-Verfahren im Allgemeinen ist, ist ein bevorzugtes Verfahren. In einer spezifischen Ausführungsform enthält ein IL-1ra eine N-terminale Methionylgruppe als Folge der Expression in E. coli. Modifizierte IL-1ras können verwendet werden. Die modifizierten IL-1ras umfassen z.B. Muteine von Inhibitoren, in denen ein Cysteinrest eine Aminosäure an einer oder mehreren Stellen in der Aminosäuresequenz eines natürlichen vorkommenden Inhibitors ersetzt. Derartige Muteine können anschließend ortsselektiv mit funktionalisierten Polyethylenglykol-(PEG)-Einheiten oder anderen Sulfhydrilenthaltenen Polyethern zur Reaktion gebracht werden, um IL-1ra PEG-Spezies zu erzeugen. PCT-Veröffentlichungsnummer WO 92/16221 offenbart eine Reihe von modifizierten IL-1ra-Spezies und Verfahren zur Herstellung derartiger PEG-modifizierter Inhibitoren.
  • Eine zusätzliche Klasse von IL-1-Inhibitoren beinhaltet Verbindungen, die in der Lage sind, die Aktivierung zellulärer Rezeptoren für IL-1 spezifisch zu verhindern. Derartige Verbindungen schließen IL-1-bindende Proteine ein, wie z.B. lösliche Rezeptoren und monoklonale Antikörper. Solche Verbindungen umfassen außerdem monoklonale Antikörper gegen die Rezeptoren. Eine weitere Klasse von Interleukin-1-Inhibitoren schließt Verbindungen und Proteine ein, welche die in vivo-Synthese und/oder extrazelluläre Freisetzung von IL-1 blockieren. Derartige Verbindungen beinhalten Agentien, welche die Transkription von IL-1-Genen oder die Prozessierung von IL-1-Präproteinen beeinträchtigen.
  • Das oben Gesagte dient als Beispiel und schließt andere Behandlungen, die mit diesen anti-inflammatorischen Verbindungen verwendet werden sollen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind oder zu denen die Fachleute auf dem Gebiet unter Verwendung der in dieser Beschreibung dargelegten Richtlinien gelangen könnten, nicht aus.
  • Es ist besonders vorteilhaft, Zusammensetzungen der zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindungen in Einheitsdosierungsformen zur Erleichterung der Verabreichung und der Einheitlichkeit der Dosierung zu formulieren. "Einheitsdosierungsform", wie hierin verwendet, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einheitliche Dosierungen für zu behandelnde Säuger-Individuen geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindungen enthält, die so berechnet ist, dass sie den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit dem benötigten pharmazeutischen Träger hervorruft. Wie hierin verwendet, umfasst ein "pharmazeutisch annehmbarer Träger" sämtliche Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakteriellen und antifungalen Mittel, isotonischen Agentien und ab sorptionsverzögernden Mittel und dergleichen, die mit dem aktiven Inhaltsstoff und mit der Art der Verabreichung und den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel sind und für den Empfänger nicht schädlich sind. Die Verwendung derartiger Medien und Agentien ist auf dem Gebiet wohlbekannt (siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Esston, PA 18042, Seiten 1435-1712). Ergänzende Wirkstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden.
  • Für die orale therapeutische Verabreichung kann die zusätzliche anti-inflammatorische Verbindung mit Arzneiträgerstoffen aufgenommen werden und in der Form einnehmbarer Tabletten, bukkaler Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Oblaten und dergleichen verwendet werden, oder sie kann direkt mit der Nahrung in die Diät einbezogen werden. Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und dergleichen können außerdem folgendes enthalten: ein Bindemittel, wie z.B. Gum tragacanth, Acacia, Maisstärke oder Gelatine; Trägerstoffe, wie z.B. Dicalciumphosphat; ein Aufschlussmittel, wie z.B. Maisstärke, Algininsäure und dergleichen; ein Schmiermittel, wie z.B. Magnesiumstearat; ein Süßungsmittel, wie z.b. Sucrose, Lactose oder Saccharin; oder ein Aromastoff, wie z.B. Pfefferminz, Öl der Moosbeere oder Kirschen- oder Orangenaroma. Ist die Einheitsdosierungsform eine Kapsel, kann sie zusätzlich zu dem Material der oben genannten Art einen flüssigen Träger enthalten. Verschiedene weitere Materialien können als Beschichtung vorhanden sein oder die physikalische Form der Einheitsdosierung anderweitig modifizieren. Zum Beispiel können Tabletten, Pillen oder Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet sein. Natürlich sollte jedes bei der Herstellung irgendeiner Einheitsdosierungsform verwendete Material pharmazeutisch rein und in den verwendeten Mengen im Wesentlichen nicht-toxisch sein. Darüber hinaus kann die zusätzliche anti-inflammatorische Verbindung in einer Herstellung und Formulierung mit verzögerter Freisetzung eingeschlossen werden. Die Menge der zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindung in einer derartigen therapeutisch nützlichen Zusammensetzung ist so, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
  • Für die parenterale therapeutische Verabreichung kann jede zusätzliche anti-inflammatorische Verbindung in einer sterilen, injizierbaren Lösung enthalten sein. Die sterile injizierbare Lösung kann durch Aufnehmen der zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindung in der benötigten Menge in einen geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger mit verschiedenen anderen unten aufgezählten Inhaltsstoffen (benötigt), gefolgt von einer Filtersterilisation, hergestellt werden. Im Falle von Dispersionen kann jede durch Aufnehmen der zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindung in einen sterilen Träger, der das basische Dispersionsmedium und die benötigten weiteren Inhaltsstoffe von den unten aufgezählten enthält, hergestellt werden. Im Fall von sterilen injizierbaren Lösungen kann jede durch Aufnehmen eines Puders der zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindung und optional von irgendeinem zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoff aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon, wobei der Puder durch eine geeignete Methode (z.B. Vakuumtrocknung oder Gefriertrocknung) hergestellt wird, eingearbeitet werden.
  • Die spezifische Dosis der zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindung wird in Übereinstimmung mit dem ungefähren Körpergewicht oder der Oberfläche des Patienten berechnet. Weitere Faktoren bei der Bestimmung der ungefähren Dosierung können die zu behandelnde oder zu verhindernde akute oder chronisch-inflammatorische Erkrankung oder Zustand, die Schwere der Erkrankung, den Weg der Verabreichung und das Alter, Geschlecht und den medizinischen Zustand des Patienten umfassen. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosierung für die Behandlung zu bestimmen, die jede der oben genannten Formulierungen umfasst, wird von den Fachleuten auf dem Gebiet routinemäßig durchgeführt. Dosierungen können außerdem durch die Verwendung bekannter Assays für die Bestimmung von Dosierungen, die im Zusammenhang mit geeigneten Dosisantwortdaten verwendet werden, bestimmt werden.
  • Folglich können z.B. die Dosen der zur Behandlung einer bestimmten akuten oder chronischen inflammatorischen Erkrankung, wie z.B. rheumatischen Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") Arthritis), ausgewählten zusätzlichen anti-inflammatorischen Verbindung variiert werden, um einen gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen. Hat eine der zusätzlichen antiinflammatorischen Verbindungen Nebenwirkungen, kann es den Patienten während alternierender Behandlungszeiträumen einer Kombinationstherapie verabreicht werden. Zum Beispiel ist eine chronische Methotrexatbehandlung mit gastrointestinaler, hepatischer, Knochenmarks- und pulmonarer Toxizität assoziiert (Sandoval et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:49-56).
  • Tests zur Überwachung der Verbesserung einer Erkrankung können spezifische Tests umfassen, die z.B. auf die Bestimmung der systemischen Antwort auf Entzündung ge richtet sind, welche die Blutsenkungsgeschwindigkeit (erythrocyte sedimentation rate, ESR) und die Akutphase-Proteine (acute phase reactants, APR) umfasst. Es werden Beobachtungen der Schwellung, usw. der betroffenen Körperteile gemacht. Eine Verbesserung der Steifheit und des Griffes (sofern anwendbar) sowie der Verringerung des Schmerzes des Patienten wird ebenfalls beobachtet. Wenn der Zustand des Patienten stabil ist, wird er erneut wöchentlich mit derselben Dosierung behandelt und wöchentlich untersucht. Vorausgesetzt, dass der Zustand des Patienten stabil ist, kann die Behandlung fortgesetzt werden. Nach 6 Monaten der Behandlung werden anatomische Veränderungen des Skelettes durch radiologische Bildgebung bestimmt, z.B. durch eine Röntgenaufnahme.
  • Am Ende eines solchen Zeitabschnittes wird der Patient erneut untersucht. Ein Vergleich der radiologischen Beurteilung der ESR und der APR vor der Behandlung und nach der Behandlung zeigt die Wirksamkeit der Behandlungen an. In Übereinstimmung mit der Wirksamkeit der Behandlungen und dem Zustand des Patienten kann die Dosierung für die Dauer der Behandlung erhöht werden oder konstant gehalten werden.
  • Vorzugsweise kann eine der folgenden Kombinationen in einem Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer akuten oder chronischen inflammatorischen Erkrankung oder eines akuten oder chronischen inflammatorischen Zustandes, wie oben definiert, wie z.B. rheumatischen Erkrankungen (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococceninduzierte ("septische") Arthritis) verwendet werden: ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) und Methotrexat; ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), Methotrexat und ein IL-1-Inhibitor, vorzugsweise IL-1ra; ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) und irgeneines oder mehrere, ausgewählt aus Methotrexat, einem Immunsuppressor (z.B. Cyclosporin), Ciprofloxacin, dem Fas-Antigen und einem IL-1-Inhibitor, vorzugsweise IL-1ra; ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) und Methotrexat und ein Immunsuppressor (z.B. Cyclosporin); ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) und Methotrexat und Ciprofloxacin; und ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) und Methotrexat und ein IL-1-Inhibitor, vorzugsweise IL-1ra; ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein) und irgendeines oder mehrere, ausgewählt aus Methotrexat, Sulphasazin und Hydroxychloroquin; ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), Methotrexat und Hydroxychloroquin; und ein trunkiertes sTNFR-Produkt (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), Methotrexat und Sulphasazin.
  • In einer bevorzugten spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. intraartikulär, subkutan oder intramuskulär) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit Methotrexat und/oder einem IL-1-Inhibitor (z.B. IL-1ra) und/oder dem löslichen rekombinaten humanen Fas-Antigen, um rheumatische Erkrankungen zu behandeln, wie oben definiert (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") und die damit assoziierten Symptome.
  • In einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. intravenös oder intraventrikulär) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einem Gewebe-Plasminogenaktivator und/oder einem IL-1-Inhibitor (z.B. IL-1ra), um eine Gehirnverletzung als Folge eines Trauma, Epilepsie, Blutung oder Infarkt zu behandeln, die jeweils zu einer Neurodegeneration führen.
  • In einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. subkutan oder intramuskulär) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einem oder mehreren ausgewählt aus einem Corticosteroid, Cyclosporin, FK-506 oder einem Interferon (z.B. α-Interferon, β-Interferon, γ-Interferon oder Konsensus-Interferon) und/oder IL-1ra, um multiple Sklerose zu behandeln.
  • In einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. subkutan oder intramuskulär) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehand lung oder gleichzeitige Behandlung) mit G-CSF und/oder IL-1ra, um inflammatorische Darmerkrankung zu behandeln.
  • In einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. subkutan oder intramuskulär) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit Leptin, MarinolTM oder MegaceTM, um Kachxie/Anorexie zu behandeln.
  • In einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. subkutan, intraventrikulär oder intrathekal) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einem NSAID (z.B. Indamethacin) und/oder einem IL-1-Inhibitor (z.B. IL-1ra), um Alzheimer'sche Krankheit zu behandeln.
  • In einer spezifischen bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung (z.B. subkutan, intraventrikulär oder intratekal) eines trunkierten sTNFR-Produktes (z.B. R1-[Cys19-Cys103]-R2-Protein), optional formuliert in einer Formulierung mit verzögerter Freisetzung (z.B. Hyaluronan)), optional in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder gleichzeitige Behandlung) mit einem löslichen rekombinanten humanen Fas-Antigen, um Krebs zu behandeln (z.B. Leukämien); Diabetes (z.B. juveniler Typ 1 Diabetes Mellitus); Graft versus host-Abstoßung; Hepatitis; ischämische/Reperfusionsverletzung, einschließlich cerebraler Ischämie (Gehirnverletzung als Folge eines Trauma, Epilepsie, Blutung oder Infarkt, wobei jedes davon zu einer Neurodegeneration führen kann); neuroinflammatorische Erkrankungen; rheumatische Erkrankungen, wie oben definiert (z.B. Lyme-Krankheit, juvenile (rheumatoide) Arthritis, Osteoarthrose, psoriatische Arthritis, rheumatoide Arthritis und Staphylococcen-induzierte ("septische") und Gewebstransplantation.
  • Weitere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei Betrachtung der folgenden veranschaulichenden Beispiele verstanden werden.
  • BEISPIELE
  • Standardverfahren für viele der in den folgenden Beispielen beschriebenen Methoden oder geeignete alterbative Methoden werden in weithin anerkannten Handbüchern der Molekularbiologie, wie z.B. Sambrook et al. (1989), s.o. und Ausubel et al. (1990), s.o. bereit gestellt. Um es dem Leser leichter zu machen, bezieht sich "mL" auf Millilister, "L" bezieht sich auf Liter.
  • Beispiel I
  • Das folgende Beispiel lehrt die Herstellung verschiedener Formen trunkierter, rekombinanter löslicher TNFR-I: NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (sTNFR-I 2.6D/C105); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH (sTNFR-I 2.6D/N105); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d8); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d18) und NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d15).
  • A. Herstellung der DNA
  • 1. sTNFR-I 2.6D/C106
  • Die PCR-Amplifikation von sTNFR-I 2.6D/C106 wird unter Verwendung eines Templates einer klonierten DNA, die von dem Klon lambda-gt107ctnfbp ( EP 422339 ) abgeleitet ist und der folgenden PCR-Primer durchgeführt:
    5' OLIGO#1: (SEQ ID NR:68)
    5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
    3' OLIGO#2: (SEQ ID NR:69)
    5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCATG-3'
  • OLIGO#1 und OLIGO#2 kodieren für Ndel und HindIII und annealen an dem 5'- bzw. 3'-Ende des trunkierten Gens. Die PCR-Amplifikation wird für 25 Zyklen laufen gelassen; jeder Zyklus besteht aus 30 Sekunden bei 94°C für die Denaturierung, 15 Sekunden bei 55°C für das Annealen und 1 Minute bei 72°C für die Elongation [Modell 2400 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwald, CT)]. Das PCR-Produkt wird unter Verwendung eines QIAquickTM PCR Purification Kit (QIAGEN, Chartsworth, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wird mit NdeI und HindIII geschnitten, anschließend unter Verwendung des QIAquickTM Gel Extraction Kits (QIAGEN, Chatsworth, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gereinigt. Das durch das Gel isolierte PCR-Produkt wird in pAMG11 ( WO 95/26746 ) ligiert und in FM15 E. coli-Zellen (ATCC 55765) ligiert.
  • 2. sTNFR-I 2.6D/C105
  • Die PCR-Amplifikation von sTNFR-I 2.6D/C105 wird unter Verwendung der sTNFR-I 2.6D/C106 Plasmid-DNA als Template und den folgenden PCR-Primern durchgeführt:
    OLIGO#3: (SEQ ID NR:70)
    5'-ACTCGA GGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA-3'
    OLIGO#4: (SEQ ID NR: 71)
    5'-CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3'
  • OLIGO#3 und OLIGO#4 kodieren für BamHI und eine Mutation N(105)C, gefolgt von einem Stopkodon. Die OLIGOS werden so konstruiert, dass sie sich vollständig um das Template herum ausdehnen, um die neue BamHI-Stelle für die Ligation einzuführen. Die PCR-Amplifikation wird für 35 Zyklen laufen gelassen; 10 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus 10 Sekunden bei 92°C für die Denaturierung, 30 Sekunden bei 55°C für das Annealen und 4 Minuten bei 68°C für die Elongation besteht, gefolgt von 25 Zyklen, wobei jeder Zyklus aus 10 Sekunden bei 92°C für die Denaturierung, 30 Sekunden bei 55°C für das Annealen und 4 Minuten + 20 Sekunden bei 68°C für die Elongation besteht [Modell 2400 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwald, CT)]. Das PCR-Produkt wird über ein Gel unter Verwendung eines QlAquickTM Gel Extraction Kits (QIAGEN, Chartsworth, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gereinigt, mit BamHI geschnitten, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Es wird anschließend resuspendiert, in pAMG11 ligiert und in FM15 E. coli-Zellen transformiert.
  • 3. sTNFR-I 2.6D/N105
  • Die PCR-Amplifikation von sTNFR-I 2.6D/N105 wird unter Verwendung der sTNFR-I 2.6D/C106 Plasmid DNA als Template und den folgenden PCR-Primern durchgeführt:
    5' OLIGO#5: (SEQ ID NR:72)
    5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
    3' OLIGO#6: (SEQ ID NR:73)
    5'-CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-3'
  • OLIGO#5 und OLIGO#6 kodieren für NdeI und BamHI und annealen an dem 5'- bzw. 3'-Ende des trunkierten Gens. Die PCR-Amplifikation wird für 30 Zyklen durchgeführt; wobei jeder Zyklus aus 45 Sekunden bei 95°C für die Denaturierung, einer Minute bei 65°C für das Annealen und 2 Minuten bei 72°C für die Elongation besteht [Modell 2400 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwald, CT)].
  • Das PCR-Produkt wird anschließend unter Verwendung des WizardTM DNA Clean-Up Systems (Promega, Madison, WI) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wird mit NdeI und BamHI geschnitten, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Es wird anschließend resuspendiert, in pAMG11 ligiert und in FM15 E. coli Zellen transformiert.
  • Auf Grundlage der obigen Beschreibung gemäß der vorliegenden Erfindung werden die Fachleute auf dem Gebiet erkennen, dass eine Vielzahl von Materialien und Methoden für eine geeignete Expression in einer Wirtszelle (z.B. in E. coli und anderen Bakterien) einfach verwendet oder angepasst werden kann.
  • 4.sTNFR 2.3D/d18; STNFR-I 2,3D/d8 und sTNFR-I 2.3D/d15
  • Die PCR-Amplifikation von sTNFR-I 2.3D/d18; sTNFR-I 2.3D/d8 und sTNFR-I 2.3D/d15 wird jeweils unter Verwendung der 2.6D/C106 Plasmid-DNA als Template und den folgenden PCR-Primern durchgeführt: sTNFR-I 2.3D/d8 PCR-Primer:
    5' OLIGO#7: (SEQ ID NR:74)
    5'-CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3'
    3' OLIGO#8: (SEQ ID NR:75)
    5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
    sTNFR-I 2.3D/d115 PCR-Primer:
    5' OLIGO#9: (SEQ ID NR:76)
    5'-CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3'
    3' OLIGO#10: (SEQ ID NR: 77)
    5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
    sTNFR-I 2.3D/d18 PCR-Primer:
    5' OLIGO#11: (SEQ ID NR:78)
    5'-CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3'
    3'' OLIGO#12: (SEQ ID NR:79)
    5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
  • OLIGO#7, OLIGO#9 und OLIGO#11 kodieren jeweils für NdeI und OLIGO#8, OLIGO#10 und OLIGO#12 kodieren jeweils für HindIII. Die PCR-Amplifikationen werden für 25 Zyklen durchgeführt; wobei jeder Zyklus aus 45 Sekunden bei 95°C für die Denaturierung, 1 Minute bei 65°C für das Annealen und 2 Minuten bei 72°C für die Elongation besteht [Modell 2400 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwald, CT)]. Die PCR-Produkte werden unter Verwendung des WizardTM DNA Clean-Up Systems (Promega, Madison, WI) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers gereinigt. Die gereinigten PCR-Produkte werden mit NdeI und HindIII geschnitten, mit Pheno/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Sie werden resuspendiert, in pAMG11 ligiert und in FM15 E. coli-Zellen transformiert.
  • B. Herstellung in E. coli:
  • Zunächst wird ein kleines, frisch kultiviertes Inokulum des gewünschten rekombinanten E. coli-Klons, der das gewünschte Konstrukt für sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.6D/C105 sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR 2.3D/d18, sTNFR-I 2.3D/d8 und sTNFR-I 2.3D/d15 enthält, durch Transferieren des gesamten Inhalts einer gefrorenen Glycerin-Lagerampulle zur Animpfung (ca. 1,5 ml) in einen 2 I-Kolben, der 500 ml Luria-Nährlösung enthält, gestartet. Die Kultur wird in einem Rotationsschüttler bei 37°C mit 350 Upm inkubiert. Die Dichte der Kultur wird bestimmt, indem die Absorption bei 660 nm (OD660) gemessen wird. Die Impfkultur wird bis zu einer Dichte von > 2,0 OD660 wachsen gelassen, zu welchem Zeitpunkt 125 ml aseptisch in den 15 I-Produktionsfermentor transferiert werden, der 10 I steriles Wachstumsmedium enthält.
  • Das Batch-Medium und die Fermentationsbedingungen für die Produktions-Fermentation sind die Fermentationsbedingungen für komplexes Medium, wie von Smith (1993), "A Chemically-Defined Medium for the Overproduction of a Recombinant Protein in E. coli", Doktorarbeit, Colorado State University, beschrieben. hauptsächlich lehrt die Referenz die Verwendung eines komplexen Mediums, das Caseinhydrolysat, Salze, Glycerin und Antischaum enthält, die in dem Fermentor sterilisiert werden. Nachdem der Tank auf unter 40°C gekühlt wurde, werden durch einen Filter sterilisierte Spurenmineralien und Thiaminhydrochlorid dazugegeben.
  • Ist die Temperatur des Mediums stabil bei 37°C, wird das Medium mit der Impfkultur inokuliert. Das Kulturwachstum wird durch Messen der OD660 beobachtet. Die Kultur wird durch die automatische Zugabe von 5 M Natriumhydroxid und 5 M Hydrosalzsäure bei einem pH von 6,0 gehalten. Liegt die OD660 zwischen 9,5 und 10,5, wird die Kultur durch aseptische Zugabe von sterilem Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) mit einer Endkonzentration von 0,50 mM induziert. Die Kultur wird bei Beendigung des Wachstums geerntet.
  • Das Kulturmedium und die Wachstumsbedingungen sind wie von Smith (1993), siehe oben, beschrieben, mit den folgenden Ausnahmen: Ammoniumsulfat (2,0 g/l) und L-Cysteinhydrochloridmonohydrat (1,0 g/l) werden zu dem Medium dazugegeben; Tetracyclinhydrochlorid wird aus dem Medium weggelassen; der pH wird bei 6,0 mit Natriumhydroxid und Salzsäure aufrechterhalten, eher als bei 7,0 nur mit Natriumydroxid; die Wachstumstemperatur wird auf 37°C erhöht; die Konzentration des Induktors wurde von 0,15 mM auf 0,50 mM IPTG erhöht; und die Kriterien für die Ernte erfolgen auf Grundlage des Wachstumsstillstandes eher als nach der Induktion.
  • Bei Beendigung der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugation in 500 ml-Flaschen geerntet. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10000 Upm für 30 Minuten pelletiert. Die gewonnene Zellpaste wird in einem Aufschlusspuffer, der aus 50 mM Tris und 5 mM EDTA bei pH 8,0 zusammengesetzt ist, auf 15 % Feststoffe verdünnt. Die suspendierten Zellen werden anschließend lysiert, indem die Lösung dreimal durch einen Homogenisator gegeben wird (APV Gaulin, Inc., Everett, MA), der mit einem Druck von 8000 psi arbeitet. Das Homogenat wird anschließend bei 10000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert, um die Einschlusskörperchen (inclusion bodies, IBs) zu gewinnen. Die IBs werden gewaschen, indem sie in Aufschlusspuffer resuspendiert werden und die Lösung ein drittes Mal bei 10000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert wird. Die IBs werden in entionisiertem Wasser (Verhältnis 1:1) resuspendiert und ein letztes Mal bei 10000 Upm für 30 Minuten für den zweiten Waschschritt zentrifugiert. Die zurückgewonnenen, gewaschenen Einschlusskörperchen für jedes Protein sind bereit für die Solubilisierung, Rückfaltung und Reinigung. Jeder Lauf ergibt etwa 200 bis 250 g IBs.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann der trunkierte sTNFR wie folgt fermentiert werden:
    Zunächst wird ein kleines, frisch kultiviertes Inokulum des gewünschten rekombinanten E. coli-Klons, der das gewünschte Konstrukt für sTNFR-I 2.6D/N105 oder sTNFR-I 2.6D/C106 enthält, gestartet, indem der gesamte Inhalt einer gefrorenen Glycerin-Lagerampulle zum Animpfen (ca. 1,5 ml) in einen 2 I-Kolben gegeben wird, der 500 ml eines 10 g/l BBL Hefeextraktes, pH 7,0, enthält. Die Kultur wird in einem rotierenden Schüttler bei 33°C bei 300 Upm inkubiert. Die Dichte der Kultur wird bestimmt, indem die Absorption bei 600 nm (OD600) gemessen wird. Die Impfkultur wird bis zu einer Dichte von > 2,0 OD600 wachsen gelassen, zu welchem Zeitpunkt sie aseptisch in den 15 I-Produktionsfermenter, der 71 steriles Wachstumsmedium enthält, transferiert wird (80 ml).
  • Die Produktionsfermentation wendet ein Fed-Batch-Verfahren an. Das Batch-Medium ist ein komplexes Medium, das Hefeextrakt, Salze und Antischaum enthält, die in dem Fermenter sterilisiert werden. Nachdem der Tank auf unter 40°C gekühlt wurde, werden durch einen Filter sterilisierte Spurenmineralien, Glucose, Magnesiumsulfat und Hexametaphosphat dazugegeben. Zwei Zufütterungen werden verwendet, wobei die erste eine Kohlenstoff-haltige Zufütterung ist (Glucose/Magnesiumsulfat) und die zweite eine Stickstoff-Zufütterung ist, die Hefeextrakt enthält.
  • Ist die Temperatur des Batch-Mediums stabil bei 33°C, wird das Medium mit der Impfkultur inokuliert. Das Kulturwachstum wird durch Messen der OD600 beobachtet. Die Kultur wird bei einem pH von 7,0 durch die automatische Zugabe von Ammoniumhydroxid und 48,7 % Zitronensäure aufrechterhalten. Wenn die OD600 zwischen 8,0 und 12,0 ist, wird die Zufütterung I unter Verwendung einer exponentiellen Zufütterungsrate begonnen. Wenn die OD600 zwischen 30 und 40 liegt, wird die Zufütterung 11 unter Verwendung einer konstanten Zufütterungsrate begonnen. Wenn die OD600 67 bis 83 erreicht hat, wird die Kultur durch die aseptische Zugabe eines sterilen Autoinduktors (Homoserinlacton) mit einer Endkonzentration von 0,6 mg/l induziert. Beide Zufütterungsraten I und II werden bei der Induktion auf eine konstante Rate umgestellt. Die Kultur wird nach 16±2 Stunden nach der Induktion geerntet.
  • Bei Beendigung der Fermentation werden die Zellen durch Zentrifugation in 500 ml Flaschen geerntet. Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10000 Upm für 30 Minuten pelletiert. Die gewonnene Zellpaste wird in einem Aufschlusspuffer, der aus 50 mM Tris und 5 mM EDTA bei pH 8,0 zusammengesetzt ist, auf 15 % Feststoffe verdünnt. Die suspendierten Zellen werden anschließend lysiert, indem die Lösung dreimal durch einen Homogenisator gegeben wird (APV Gaulin, Inc., Everett, MA), der mit einem Druck von 8000 psi arbeitet. Das Homogenat wird anschließend bei 10000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert, um die Einschlusskörperchen (inclusion bodies, IBs) zu gewinnen. Die IBs werden gewaschen, indem sie in Aufschlusspuffer resuspendiert werden und die Lösung ein drittes Mal bei 10000 Upm für 30 Minuten zentrifugiert wird. Die IBs werden in entionisiertem Wasser (Verhältnis 1:1) resuspendiert und ein letztes Mal bei 10000 Upm für 30 Minuten für den zweiten Waschschritt zentrifugiert. Die gewonnenen, gewaschenen Einschlusskörperchen sind bereit für die Solubilisierung, Rückfaltung und Reinigung.
  • C. Solubilisierung/Rückfaltung:
  • Die gewaschenen IBs aus jeder vollständigen 10 I-Fermentation werden in 800 ml eines Solubilisierungspuffers (50 mM Tris, 8 M Harnstoff, 160 mM Cystein, pH 9,5) solubilisiert. Der pH der Solubilisierungsmischung wird mit 10 N NaOH auf 9,5 eingestellt und bei Raumtemperatur für 2 bis 3 Stunden rühren gelassen. Jeder Durchlauf ergab etwa 200 bis 250 g IBs.
  • Jede Solubilisierungsmischung wird 1:20 in kaltem Renaturierungspuffer (50 mM Tris, 1,1 M Harnstoff) verdünnt. Jedes Endvolumen beträgt etwa 16 I. Danach wird jede Mischung mit 6 N HCl auf einen pH von 9,7 eingestellt und langsam bei 4°C für 2 bis 3 Tage gerührt.
  • Der pH einer jeden Mischung wird anschließend mit Eisessigsäure und 6 N HCl auf 5,0 eingestellt. In jeder Mischung wird ein Präzipitat gebildet, das durch Zentrifugation bei 10000 × g in einer Beckman-Zentrifuge Modell J2-HS entfernt wird. Jedes Material wird anschließend durch einen 5 μm und einen 0,2 μm Filter gefiltert.
  • D. Reinigung:
  • Die rückgefalteten Materialien sind bereit für die Säulenreinigung auf einer IX-1 SP-Sepharose Big BeadTM-Säule (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). IX-1 SP-Sepharose Big BeadTM-Säule (4,4 cm × 20 cm)
    Puffer A Puffer B
    25 mM Acetat 25 mM Acetat
    50 mM NaCl 375 mM NaCl
    pH 5,0 pH 5,0
  • Eine Säule wird mit 4 bis 5 Säulenvolumina Puffer A äquilibriert, bevor die Beladungen des jeweiligen rückgefalteten Materials getrennt werden. Die Materialien für die Rückfaltung werden für die Reinigung getrennt voneinander auf die Säule geladen. Für jede Beladung wird die Säule mit nicht mehr als 12 g Protein pro Liter Harz beladen. Für jede Beladung wird die Säule anschließend mit 3 bis 4 Säulenvolumina Puffer A gewaschen (bis U.V. auf die Grundlinie zurückgekehrt ist). Für jede Beladung wird das Protein unter Verwendung eines linearen zunehmenden Salzgradienten von 8 Säulenvolumina, der von 50 bis 375 mM NaCl läuft, eluiert. Der vollständige Proteinpeak für jede Beladung wird in einer Vereinigung gesammelt. Die Sammlung eines jeden Proteinpeaks wird begonnen, wenn die UV-Absorption auf etwa 20 % des Peakmaximums gestiegen ist, Die Vereinigung wird beendet, wenn entweder die UV-Absorption etwa 50 % des Peakmaximums erreicht hat, oder die Absorption aufhört zu fallen, was zuerst auftritt.
    Durchflussrate – 7,5 cv/h für die Äquilibrierung, Waschschritt
    15 cv/h für die Beladung und
    6 cv/h für die Elution
  • Jede Säulenreinigung wird bei 4°C durchgeführt.
  • Jeder IX-1-Pool ist bereit für die Reinigung auf einer Toyo PearlTM Butyl 650M HIC-Säule (Toso Haas, Philadelphia, PA). 300 ml - Tovo Pearl ButylTM 650M-Säule (4,4 cm × 20 cm)
    Puffer A Verdünnungspuffer Puffer B
    20 mM NaPO4 40 mM Na NaPO4 Milli Q H2O
    1,8 M NaCl, pH 6,0 4 M NaCl pH 6,0
  • Die Säule wird mit 4 bis 5 Säulenvolumina Puffer A äquilibriert, bevor die Beladungen eines jeden IX-1 Pool-Materials separiert wird. Jeder IX-1-Pool wird 1:1 mit Verdünnungspuffer verdünnt, und der pH wird auf 6,0 eingestellt. Für jede Beladung wird der verdünnte IX-1-Pool auf eine Säule geladen. Für jede Beladung wird die Säule mit nicht mehr als 10 g Protein pro Liter Harz beladen. Für jede Beladung wird die Säule mit 3 Säulenvolumina Puffer gewaschen. Für jede Beladung wird das Protein mit einem linearen zunehmenden Salzgradienten mit 8 Säulenvolumina, der von 1,8 M NaCl bis H2O läuft, eluiert. Die Sammlung eines jeden Proteinpeaks wird begonnen, wenn die UV-Absorption auf etwa 15 bis 20 % des Peakmaximums gestiegen ist. Die Vereinigung wird gestoppt, wenn entweder die UV-Absorption etwa 50 % des Peakmaximums erreicht hat oder die Absorption aufhört, zu fallen, was früher stattfindet.
    Durchflussrate – 6 cv/h für die Äquilibrierung, die Beladung und den Waschschritt
    3 cv/h für die Elution.
  • Jede Säulenreinigung wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Jeder HIC-Pool ist bereit für die Konzentration/Diafiltration.
  • Konzentration/Diafiltration (C/D)
  • Eine Membran aus 1 sq ft PLCCTM regenerierter Cellulose mit einem Cutoff von 5000 M.W. (Milli-Pore, Redford, MA) wird für den C/D-Schritt eines jeden HIC-Pools verwendet. Jeder HIC-Pool wird auf etwa 200 ml konzentriert und anschließend gegen 6-7 Volumina 20 mM NaPO4, pH 6,0 diafiltriert, bis die elektrische Leitfähigkeit < 4 mm Stunden beträgt.
  • Jeder Konzentrations-/Diafiltrationsschritt wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
  • Jeder C/D-Pool ist anschließend bereit für die Reinigung auf einer IX-2 – 365 ml SP-Sepharose HPTM-Säule (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ). IX-2 – 365 ml SP-Sepharose HP TM-Säule (5 cm × 18,5 cm)
    Äquilibrierungspuffer Puffer A Puffer B
    20 mM Na NaPO4 20 mM NaPO4 20 mM NaPO4
    pH 6,0 pH 6,3 50 mM NaCl pH 6,8
  • Die Säule wird mit 6 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer äquilibriert, bevor die Beladungen eines jeden C/D-Pools separiert werden. Jeder C/D-Pool wird auf die Säule geladen, wobei nicht mehr als 8 g pro Protein pro Liter Harz verwendet werden. Für jede Beladung wird die Säule mit 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen, gefolgt von 3 Säulenvolumina Puffer A. Für jede Beladung wird das Protein mit einem linearen Gradienten aus 8 Säulenvolumina, der aus einem pH-Gradienten von 6,3 bis 6,8 und einem Salzgradienten, der von 0 bis 50 mM NaCl läuft (Puffer B), von der Säule eluiert. Die Vereinigung wird bei 1,0 O.D. begonnen, bis zu der Vorderseite des Peaks und bei 50 % des Peakmaximums auf der Rückseite beendet.
  • In einer alternativen Ausführungsform kann der trunktierte sTNFR-I solubilisiert, rückgefaltet und gereinigt werden wie folgt:
  • C.1 Solubilisierung/Rückfaltung:
  • Die gewaschenen IBs werden mit 8 M Harnstoff, 60 mM Tris, 100 mM Cystein solubilisiert, um eine Endkonzentration von 6,5 M Harnstoff, 50 mM Tris und 80 mM Cystein, pH 9,4 und 5 bis 10 mg/ml trunkiertem sTNFR-1 zu ergeben. (Letzteres basiert auf einer Quantifizierung der Menge an trunkiertem sTNFR in gewaschenen IBs auf einer g/L-Basis.) Das Material wird bei Raumtempertur für 90 Minuten rühren gelassen und wird anschließend rückgefaltet, indem es 1:10 in kaltem (4 bis 8°C) 0,85 M Harnstoff, 50 mM Tris, pH 9,8 verdünnt wird (pH-Messung durchgeführt bei 4 bis 8°C).
  • Die Rückfaltungs-Lösung wird für 24 bis 72 Stunden bei 4 bis 8°C rühren gelassen. Am Ende dieser Zeit wird Eisessig dazugegeben (~20 mM), und der pH wird auf 5,0 einge stellt. Das Präzipitat, das sich bildet, wird durch Zentrifugation entfernt, und der Überstand wird für die Beladung der ersten Säule aufgehoben.
  • D.1 Reinigung
  • Der geklärte saure Präzipitationspool wird auf eine SP-Sepharose Bis Bead TM-Säule (Pharmacid Biotech, Inc., Piscataway, NJ), die mit 20 mM Natriumacetat, 75 mM NaCl, pH 5,0, äquilibriert wurde, geladen. Die Säule wird mit nicht mehr als 15 g trunkiertem sTNFR-1 pro L Bettvolumen beladen. Nach der Beladung wird die Säule mit 3 Säulenvolumina 20 mM Natriumacetat, 75 mM NaCl, pH 5,0 beladen und mit einem linearen Gradienten mit 9 Säulenvolumina von 75 mM bis 450 mM NaCl in 20 mM Natriumacetat, pH 5,0, eluiert. Der gesamte SP-Sepharose Big BeadTM-Säulen (SP-BB)-Schritt wird bei 4 bis 8°C durchgeführt.
  • Der SP-BB-Pool wird 1:1 mit 2M NaCl, 60 mM Acetat, pH 4,5 verdünnt, und der pH wird auf 4,5 eingestellt, wenn notwendig. Der verdünnte SP-BB-Pool wird auf eine ToyopearlTM-Butyl 650M-Säule (Toso Haas, Philadelphia, PA), die mit 1 M NaCl, 30 mM Acetat, pH 4,5 äquilibriert wurde, geladen. Die Säule wird mit ~10-13 g eines trunkierten sTNFR-1 pro Liter Bettvolumen beladen. Nach dem Beladen wird die Säule mit 3 Säulenvolumina 1 M NaCl, 30 mM Acetat, pH 4,5 gewaschen und mit einem linearen Gradienten aus 8 Säulenvolumina von 1 M bis OM NaCl in 30 mM Acetat, pH 4,5, eluiert.
  • Die gereinigten Fraktionen des trunkierten sTNFR-1 von der Butyl 650M-Säule werden vereinigt, 1:5 mit Wasser verdünnt und auf eine SP-Sepharose High PerformanceTM-Säule (SP-HP) (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ), die mit 30 mM Acetat, pH 4,5 äquilibriert wurde, geladen (wobei die Beladung nicht mehr als ~15 g/l Bettvolumen beträgt). Die Säule wird anschließend mit 3 Säulenvolumina 30 mM Acetat, pH 4,5 gewaschen und mit einem linearen Gradienten aus 12 Säulenvolumina, der von 100 mM bis 400 mM NaCl geht, in 30 mM Acetat, pH 4,5, eluiert. Die gereinigten Fraktionen des trunkierten sTNFR-1 werden vereinigt und mit NaOH auf pH 5,0 eingestellt.
  • C. PEGylierung:
  • 1. Herstellung von sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa).
  • Zu einer gekühlten (4°C), gerührten Lösung von sTNFR-2.6D/N105 (3,5 mg/ml) in 50 mM Natriumacetat, pH 4, wird ein 3-facher molarer Überschuss an t-BuPEG (Mono-t-butoxy-polyethylenglykol, durchschnittliches MW = 33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.) dazugegeben. NaCNBH3 wird mit einer Endkonzentration von 20 mM dazugegeben, und die Reaktionsmischung wird bei 7°C für 18 bis 24 Stunden gerührt.
  • Das Ausmaß der Proteinmodifikation während des Verlaufes der Reaktion wird mittels einer SEC HPLC unter Verwendung einer TSKG3000swXL-Säule (Toso Haas, Montgomeryville, PA) überwacht, wobei mit 0,1 M Natriumphosphatbuffer pH 6,9, 0,5 M NaCl und 10 % Ethanol mit 0,7 ml/min eluiert wird (Toso Haas, Montgomeryville, PA).
  • Der pH der Reaktionsmischung wird mit 1 M HCl auf ca. 3,5 eingestellt, und die Reaktionsmischung wird mit Wasser auf eine Protein-Endkonzentration von 1,5 mg/ml verdünnt.
  • sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wird von dem Überschuss an t-BuPEG und anderen Reaktions-Nebenprodukten durch Verwendung einer SP Sepharose HP 16/10TM-Ionenaustauschchromatografie (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) abgetrennt.
  • Die Reaktionsmischung wird auf die Säule geladen, und das nicht-reagierte t-BuPEG wird mit 3 Säulenvolumina des Startpuffers A (20 mM Natriumacetat, pH 4,0) eluiert. Das sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wird unter Verwendung eines linearen Gradienten mit 20 Säulenvolumina von 0 bis 30 % Puffer B (1 M NaCl in 20 mM Acetat, pH 4,0 eluiert. Das Eluat wird bei 280 nm überprüft. Jede Fraktion, die sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) enthält, wird mittels SDS-PAGE unter Verwendung von vorgegossenen 4 bis 20 % Gradientengelen (Novex, San Diego, CA) analysiert. Auf Grundlage der Ergebnisse der SDS-PAGE-Analyse werden die Fraktionen vereinigt, konzentriert und steril filtriert. Jeder endgültige Pool von gereinigtem sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wird erneut mittels SDS-PAGE und SEC HPLC analysiert. Dieses Protein wird in 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 und 20 mM NaCl formuliert.
  • 2. Herstellung von sTNFR-I 2.6D/N105-33kDa (MePEG).
  • Zu einer gekühlten (7°C), gerührten Lösung von sTNFR-2.6D/N105 (4 mg/ml) wird 10 % Essigsäure dazugegeben, bis der pH 5,0 beträgt. Zu dieser Lösung wird 15 mM NaCNBH3 und ein 2-facher molarer Überschuss an t-Butoxy PEG (t-Butoxypolyethylenglykol, durchschnittliches MW = 33kDa, Shearwater Polymers, Inc.) gegeben. Die Reaktionsmischung wird kurz bei derselben Temperatur gerührt und anschließend für ~18 Stunden inkubiert.
  • Nach 18 Stunden wird die Proteinkonzentration in der Reaktionsmischung mit Zitronensäure auf einen pH von 3,0 eingestellt.
  • sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) wird von dem Überschuss an MePEG und anderen Reaktions-Nebenprodukten mittels Ionenaustauschchromatografie unter Verwendung einer SP Sepharose HPTM-Säule (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) abgetrennt.
  • Die Reaktionsmischung wird auf die Säule geladen (nicht mehr als 8 mg/ml Harz), und das nicht-reagierte MePEG wird mit 3 Säulenvolumina des Startpuffers A (20 mM Natriumcitrat, pH 3,0) eluiert. Das sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) wird unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 16 Säulenvolumina von 0,1 bis 0,5 M NaCl in 20 mM Citrat, pH 3,0 eluiert. Das Eluat wird bei 280 nm überprüft. Jede Fraktion, die sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) enthält, wird mittels SDS-PAGE unter Verwendung von vorgefertigten 4 bis 20 % Gradientengelen (Novex, San Diego, CA) analysiert. Auf Grundlage der Ergebnisse der SDS-PAGE-Analysen werden die Fraktionen vereinigt, konzentriert und steril filtriert. Jeder Endpool von gereinigtem sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) wird erneut mittels SDS-PAGE analysiert. Das gereinigte sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) wird auf 5 bis 20 mg/ml konzentriert und entweder in PBS, pH 6,5 (10 mM Natriumphosphat, 35 bis 100 mM NaCl) oder in 20 mM Acetat, 100 mM NaCl, pH 5,0 formuliert.
  • 3. Herstellung von sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20kDa).
  • Die Arbeitsschritte aus Schritt A für die Herstellung von sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) werden im Wesentlichen wiederholt, mit der Ausnahme, dass MePEG (Monomethoxy-polyethylenglykol, durchschnittliches MW = 20kDa, Shearwater Polymers, Inc.) anstelle von MePEG (Mono-methoxy-polyethylenglykol, durchschnittliches MW = 33kDa, Shearwater Polymers, Inc.) verwendet wird. Dieses Protein wird in 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 und 20 mM NaCl formuliert.
  • 4. Herstellung zusätzlicher Koniugate.
  • Zusätzliche Konjugate von sTNFR-2.6D/N105 werden im Wesentlichen wie sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) hergestellt, mit der Ausnahme, dass die folgenden Arten von PEG-Aldehyden (Shearwater Polymers, Inc.) verwendet werden:
    linear monofunktionell - MW 5kDa, 6kDa und 57kDa;
    verzweigt monofunktionell - MW 10kDa, 20kDa und 40kDa;
    linear difunktionell - MW 8kDa und 20kDa;
    verzweigt trifunktionell - MW 10kDa.
  • Diese Proteine werden in 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 und 20 mM NaCl formuliert.
  • 5. Alternative Pegylierungsverfahren
  • In einer alternativen Ausführungsform können die trunkierten sTNFR-I-Moleküle durch die folgenden Methoden pegyliert und gereinigt werden:
    Das SP-HP-Eluat (3 bis 5 mg/ml, eingestellt auf pH 5,0) wird mit 2 Mol Polyethylenglykol (z.B. MePEG oder t-BuPEG) pro Mol sTNFR-I 2.6D/N105 zur Reaktion gebracht (~5 Gramm t-BuPEG pro Gramm sTNFR-I 2.6D/N105). Nach der Auflösung des Polyethylenglykols werden 10 bis 20 mM Natriumcyanoborhydrid dazugegeben und die Lösung wird über Nacht bei 7 bis 15°C inkubieren gelassen. Am Ende der Pegylierungsreaktion (~ 18 Stunden) wird die Reaktion durch Hinzufügen von 10 mM Glycin gestoppt.
  • Die Pegylierungsmischung wird mit 4 Volumina 50 mM Acetat, pH 4,0 verdünnt, falls notwendig auf pH 4,0 eingestellt, und auf eine SP-HP-Säule gegeben, die mit 50 mM Acetat, pH 4,0 äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit nicht mehr als ~8 g sTNFR-2.6D/N105 pro Liter Bettvolumen beladen. Nach dem Beladen wird die Säule mit 3 Säulenvolumina Äquilibrierungspuffer gewaschen und mit einem linearen 0 bis 0,3 M NaCl-Gradienten in 50 mM Acetat, pH 4,0 eluiert. Die sTNFR-2.6D/N105-30kDa monopegylierten Fraktionen werden gesammelt, auf pH 5,0 eingestellt, konzentriert und in einen isotonischen Formulierungspuffer diafiltriert. Sämtliche Reinigungsschritte werden bei Raumtemperatur ausgeführt. Das Protein wird entweder in PBS, pH 6,5 (10 mM Natri umphosphat, 35 bis 100 mM NaCl) oder in 20 mM Acetat, 100 mM NaCl, pH 5,0 formuliert.
  • 6. Herstellung von sTNFR-I 2.6D/C105 dumbbell und sTNFR-I 2.6D/C106 dumbbell.
  • Sulfon-aktiviertes Polyethylenglykol (hergestellt und gereinigt im Wesentlichen in Übereinstimmung mit der US-Patentanmeldung Nr. 08/473,809 , eingereicht am 07. Juni 1995 sowie US-Patentanmeldung Nr. 08/611,918 , eingereicht am 06. März 1996) [PEG-20000-bis-vinylsulfon], wird verwendet, um Proteine im Wesentlichen in Übereinstimmung mit dem in PCT Veröffentlichungsnummer WO 95/34326 beschriebenen Verfahren zu dimerisieren, bis auf die Reduktions- und Reaktionsbedingungen. Die Proteine werden vor dem Anheften des Polyethylenglykols mit 4 mol DTT pro Mol Protein bei 5 bis 6°C, pH 7,6 reduziert. Sämtliche Reaktionen werden in der Gegenwart von 30 Glycerin durchgeführt. Die dimerisierten Proteine werden als sTNFR-I 2.6D/C105db und sTNFR-I 2.6D/C106db bezeichnet. Jedes Protein wird entweder in PBS, pH 6,5 (10 mM Natriumphosphat, 35 bis 100 mM NaCl) oder 20 mM Acetat, 100 mM NaCl, pH 5,0 formuliert.
  • 7. Herstellung komparativer sTNFR-I-Moleküle
    • (i). sTNFR-I 4D/N105 wird wie in EP 422339 beschrieben hergestellt. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) wird hergestellt, indem sTNFR-I 4D/N105 im Wesentlichen in Übereinstimmung mit den oben für die Pegylierung von sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) dargelegten Methoden pegyliert wird. sTNFR-I 4D/N105-t-MePEG (33kDa) wird hergestellt, indem sTNFR-I 4D/N105 im Wesentlichen in Übereinstimmung mit den für die Pegylierung von sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) oben dargelegten Methoden pegyliert wird. sTNFR-I 4D/C105 und sTNFR-I 4D/C105db werden wie in der PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/34326 beschrieben hergestellt. Dieses Protein wird in 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 und 20 mM NaCl formuliert.
    • (ii). sTNFR-I 4D/C105-33kDa (MePEG) wird hergestellt, indem 4D/C105 im Wesentlichen in Übereinstimmung mit den oben für die Pegylierung von sTNFR-I 2.6D/C105-33kDa (MePEG) dargelegten Methoden pegyliert wird, mit der Ausnahme, dass die Reaktion bei pH 7,5 mit 1,3 mol DTT pro Mol sTNFR-I für ~5-6 Stunden stattfindet, gefolgt von einem Entfernen des DTT auf einer SP-SepharoseTM FF-Säule und einer PE-Gylierung mit 1,5-3 Mol PEG pro Mol Protein für wenigstens 15 Stunden bei Raumtem peratur. Dieses Protein wird entweder in PBS, pH 6,5 (10 mM Natriumphosphat, 35 bis 100 mM NaCl) oder 20 mM Acetat, 100 mM NaCl, pH 5,0 formuliert.
    • (iii). sTNFR-I 3D/N105 (eine Trunkierung der C-terminalen 34 Aminosäuren von sTNFR-I 4D/N105) wird wie folgt hergestellt. Die PCR-Amplifikation wird unter Verwendung von sTNFR-I 4D/N105 als das Template und OLIGO#13 und OLIGO#14, die für NdeI bzw. HindII kodieren und an die 5'- bzw. 3'-Enden des trunkierten Gels annealen, durchgeführt. PCR-Amplifikationen werden für 25 Zyklen durchgeführt; wobei jeder Zyklus aus 30 Sekunden bei 94°C für die Denaturierung, 15 Sekunden bei 60°C für das Annealen und 1 Minute bei 72°C für die Elongation [Modell 2400 Thermocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)] besteht. Das PCR-Produkt wird unter Verwendung eines QIAquickTM PCR Purification Kits (QIAGEN, Chatsworth, CA) gereinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wird mit NdeI und HindIII geschnitten, anschließend unter Verwendung des QIAquickTM Gel Extraction Kits (QIAGEN, Chatsworth, CA) über ein Gel gereinigt. Das über das Gel isolierte PCR-Produkt wird in pAMG11 ligiert und in FM15 E. coli-Zellen transformiert. 5' OLIGO#13: (SEQ ID NR:80) 5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3' 3' OLIGO#14: (SEQ ID NR:81) 5'-CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT-3' Dieses Protein wird in 10 mM Natriumphosphat, pH 6,5 und 20 mM NaCl formuliert.
    • (iv). sTNFR-I 3D/C105 (eine Trunkierung der C-terminalen 34 Aminosäuren von sTNFR-I 4D/C105) wird im Wesentlichen wie sTNFR-I 3D/N105 hergestellt, mit der Ausnahme, dass das Template sTNFR-I 4D/C105 ist. sTNFR-I 3D/C105 wird entweder in PBS, pH 6,5 (10 mM Natriumphosphat, 35 bis 100 mM NaCl) oder 20 mM Acetat, 100 mM NaCl, pH 5,0 formuliert.
    • (v). sTNFR-I 3D/C105db wird im Wesentlichen wie sTNFR-I 4D/C105db hergestellt, mit der Ausnahme, dass sTNFR-I 3D/C105 anstelle von sTNFR-I 4D/C105. sTNFR-I 3D/C105db als Ausgangsmaterial verwendet wird. sTNFR-I 3D/C105db wird entweder in PBS, pH 6,5 (10 mM Natriumphosphat, 35 bis 100 mM NaCl) oder 20 mM Acetat, 100 mM NaCl, pH 5,0 formuliert.
  • Beispiel II
  • Verschiedene Formen trunkierter, rekombinanter löslicher TNFR-I werden auf ihre Fähigkeit untersucht, die TNF-Aktivität zu inhibieren.
  • A. WEHT Zytotoxizitäts-Assay:
  • Das WEHI-Assay ist ein in vitro Zellproliferations-Assay (Edwards et al. (1991), Endocrinology. 128:989-996). Die Zelllinien sind sensitiv gegenüber TNF-α (d.h. TNF-α ist zytotoxisch). In der Gegenwart eines TNF-α-Inhibitors werden die Zellen vor der zytotoxischen Wirkung geschützt und sind folglich in der Lage, zu proliferieren.
  • Protokoll:
  • TNF-sensitive WEHT 164 Klon 13 Zellen (ATCC, Rockville, MD) werden mit einer Konzentration von 20 × 104 Zellen/ml in RPMI-Medium (Gibco, Grand Island, NY), das mit 5 % fötalem Kälberserum (Hyclone, Ogden, UT) und Penicillin 50 U/ml:Streptomycin 50 mg/ml ergänzt ist, suspendiert. 100 Mikroliter dieser Zellsuspension werden in jeder Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden gegeben, und die Zellen werden 4 bis 6 Stunden bei 37°C in 5 % CO2 anheften gelassen. Zu jeder Vertiefung werden 10 μl einer 0,0060 mg/ml Actinomycin-D-Lösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) gegeben. 10 Mikroliter rekombinantes humanes TNFα mit einer Konzentration von 50 ng/ml (Endkonzentration 5 ng/ml) werden zu jeder Vertiefung dazugegeben. Seriell verdünnte 2-fache Konzentrationen der verschiedenen sTNFR-Formen (sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 4D/C105 und sTNFR-I 4D/C105db) werden in PBS verdünnt und anschließend zu Duplikatvertiefungen gegeben (10 μl/Vertiefung), welche die adhärenten WEHT 164-Zellen enthalten, nach der Zugabe von rekombinantem humanem TNF-α. WEHT-164 Klon 13 Zellen werden 18 Stunden bei 37°C in 5 % CO2 inkubiert. Nach der Inkubation werden 10 ml einer 2 mg/ml Lösung des organischen Farbstoffes MTT Tetrazolium (3-[4,5-Dimethylthiozol-2-yl]2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) dazugegeben, und die Zellen werden für weitere 4 bis 6 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zugabe von 50 μl DMF/SDS-Lösung (20 % SDS und 50 % N,N-Dimethylformamid, pH 4,7) solubilisiert. Die DMF/SDS-Lösung wird mehrere Male auf und ab pipettiert, bis sämtliche MTT-Kristalle aufgelöst sind, und die Zellen werden für weitere 2 bis 22 Stunden inkubiert. Die Absorptionen (abs) werden in einem Vmax-Lesegerät bei 570 bestimmt. Die prozentuale spezifische Zytotoxizität wird unter Verwendung der Formel: % spezifische Zytotoxizität = 100 % X[abs (Zellen + Medium) – abs (Zellen + Probe)]/abs(Zellen + Medium) – abs(Zellen + TX-100)] aus den optischen Dichten berechnet. Die Anzahl von TNF-Einheiten in jeder Probe wird unter Verwendung der prozentualen spezifischen Zytotoxizitäten der murinen Standards, wie zuvor beschrieben, bestimmt.
  • Die Ergebnisse des WEHI-Assays sind unten in Tabelle 2 zusammengestellt: TABELLE 2: In vitro-Aktivität in dem WEHI-Assay.
    Verbindung IC50 (ng/ml)
    sTNFR-1 2.6D/C106 208
    sTNFR-1 4D/C105 238
    sTNFR-1 4D/C105db N/A
  • Auf Grundlage der Ergebnisse des WEHI-Assays gibt es keine signifikanten Unterschiede zwischen dem sTNFR-I 2.6D/C106 und dem sTNFR-I 4D/C105, was die in vitro-Bioeffizienz angeht.
  • B. L929-Zytotoxizitäts-Assay:
  • Das L929-Zytotoxizitäts-Assay ist ein in vitro Zellproliferations-Assay (Parmely et al. (1993), J. Immunol., 151:389-396), das ebenfalls die Zytotoxizität der TNF-α-sensitiven Tötung untersucht. Die Zelllinien sind sensitiv gegenüber TNF-α (d.h. TNF-α ist zytotoxisch). In der Gegenwart eines löslichen TNF-α-Inhibitors werden die Zellen vor der zytotoxischen Wirkung geschützt und sind folglich in der Lage, zu proliferieren.
  • Protokoll:
  • Die L929-Zelllinie wird von der American Type Culture Collection (Katalognummer CCL 1, NCTC Klon 929, Klon des Stammes L, Bindegewebe, Maus) erhalten. Das für die Propagierung verwendete Medium ist RPMI-Medium 1640, das mit 10 % FBS +1 % L-Glutaminlösung +1 % Penicillin-Streptomycin-Lösung ergänzt wird.
  • 96-Well Mikrotiterplatten (Corning) werden in dem Assay verwendet, und nur die inneren 60 Vertiefungen werden verwendet. Der Standard und die Testprobe werden in 3-facher Ausführung auf derselben Platte untersucht.
  • Das in dem Assay verwendete TNFα stammt von R&D Systems (Minneapolis, MN). Die in dem Assay verwendete Endkonzentration von TNFα beträgt 1 ng/ml in sämtlichen Vertiefungen des Assays.
  • Das Verdünnungsmittel für das Assay ist L929 Wachstumsmedium, 10 ng/ml TNFα und 10 μg/ml Actinomycin D (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
  • Die Platten werden unter Verwendung einer XTT/MEN-Lösung (1,5 mg/ml XTT + 75 mM MEN) geerntet.
  • Am Tag 1 werden die Zellen in den Assay-Platten ausplattiert. Eine Zellsuspension wird hergestellt, indem die Zellen trypsiniert werden und mit 3,33 × 104 Zellen/ml resuspendiert werden. 180 ml dieser Zellsuspension werden in jede der inneren 60 Vertiefungen der Assay-Platten ausplattiert. 200 ml Wachstumsmedium wird in die äußeren 36 Vertiefungen verteilt, um Evaporationsartifakten in dem Assay vorzubeugen. Die Platten werden für etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen, mit Folie bedeckt und ohne dem Zug ausgesetzt zu sein. Die Assay-Platten werden in einen Inkubator mit 37 ± 2°C, hoher Luftfeuchtigkeit und 5 ± 1 % CO2 gestellt. Die Platten werden für etwa 20 bis 22 Stunden inkubiert, bevor die seriellen sTNFR-I Verdünnungen dazugegeben werden.
  • Am Tag 2 wird der sTNFR-I 4D/N105-Standard und die Testproben hergestellt: Verdünne den sTNFR-I 4D/N105-Standard und die Testproben auf eine Konzentration von etwa 2,0 mg/ml (oder eine andere geeignete Konzentration). Stelle serielle Verdünnungen dieser Konzentration her, um eine 10-Punkte-Verdünnungskurve im Bereich von etwa 1,0 × 106 ng/ml bis 1,0 × 10-3 ng/ml zu erzeugen, einschließlich eines 0 ng/ml Punktes (nur Assay-Verdünnungsmittel). Wenn weitere Konzentrationen geeignet sind, können diese verwendet werden. Gib 1000 μl einer jeden Verdünnung in 3-facher Ausführung auf jede Assay-Platte. Inkubiere die Platten in einem Inkubator bei 37°C ± 2°C, hoher Luftfeuchtigkeit, 5 ± 1 % CO2 für 20 ± 1 Stunden nach dem Transfer der Aliquots der seriellen Verdünnungen auf die Assay-Platten.
  • Am Tag 3 werden 50 μl/Vertiefung der XTT/MEN-Lösung zu den inneren 60 Vertiefungen der Assay-Platten gegeben. Die Platten werden in einem Inkubator bei 37°C ± 2°C, hoher Luftfeuchtigkeit, 5 ± 1 % CO2 (Falcon, New York, New York) für 24 ± 0,5 Stunden inkubiert.
  • Am Tag 4 wird die optische Dichte (O.D.) der Assay-Platten bei 450 nm minus 650 nm auf einem ELISA-Plattenlesegerät bestimmt (SpectraMAX, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Werden Werte von 4000 CD für die Vertiefungen in einer Platte bei diesen Wellenlängen erreicht, sollte die Platte sofort erneut bei 490 nm minus 650 nm gelesen werden, und die Daten von 490 nm minus 650 nm sollte für die Berechnung verwendet werden.
  • Eine Standard-Dosis-Antwortkurve gegenüber log wird hergestellt, indem eine logistische Kurvenanpassung mit vier Parametern verwendet wird. Die ursprünglichen Konzentrationen der unbekannten Proben werden aus der Standardkurve berechnet, und der ED50 für den Standard und der Korrelationskoeffizient für die Standardkurven-Anpassung werden berechnet.
  • Ergebnisse:
  • Die Ergebnisse des L929 Zytotoxizitäts-Assays sind unten in Tabelle 3 zusammengestellt: TABELLE 3: In vitro-Aktivität in dem L929 Zytotoxizitäts-Assay.
    Verbindung Konzentration (mg/ml) ED50 (ng/ml)
    sTNFR-I 4D/C105db 7,8 1,0 ± 0,1
    sTNFR-I 2.6D/C105db 2,6 1,1 ± 0,0
    sTNFR-I 2.6D/C106db 2,2 1,0 ± 0,1
    sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 2,0 229,2 ± 8
    sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa) 1,1 325,5 ± 147
    sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG(331 kDa) 1,7 210,2 ± 9
    Interner Std:
    sTNFR-I 4D/C105 3,5 314,8 ± 188,1
  • Die Daten zeigen, dass der sTNFR-I 4D/C105db und der sTNFR-I 2.6D/C105db und sTNFR-I 2.6D/C106db aktiv sind und vergleichbare Dosisantworten im Vergleich zu dem Standard aufweisen. Die Daten zeigen ferner, dass der sTNFR-I sTNFR-I 4D/N105-t- BuPEG (33kDa) und sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG (33kDa) fast 2 Logstufen niedriger in ihrer Aktivität sind, jedoch im Vergleich zu dem sTNFR-I 4D/C105db in diesem Assay nichtsdestotrotz aktiv sind.
    Lauf #2:
    sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2,27 ± 0,3
    sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2,0*
    sTNFR-I 3D/C105db 1,9 1,8*
    sTNFR-I 3D/N105 2,4 413,3*
    Interner Std:
    sTNFR-I 4D/C105 3,5 115,9 ± 42,1
    • * Einzelner Datenpunkt
  • Diese Daten zeigen, dass der sTNFR-I 3D/C105db aktiv ist und die ED50-Werte in dem Bereich von sTNFR-I 4D/C105db (Lauf #1), sTNFR-I 2.6D/C105db (Lauf #1) und sTNFR-I 2.6D/C106db (Lauf #1) liegen. Die Daten zeigen ferner, dass der sTNFR-I 3D/N105 weniger aktiv ist als der interne Standard sTNFR-I 4D/C105.
  • C. Streptococcen-Zellwand-induziertes Reaktivierungsmodell:
  • Die Assays für das Streptococcen-Zellwand-induzierte Reaktivierungsmodell für Arthritis in Ratten wird unter Verwendung bekannter Protokolle durchgeführt (Esser et al. (1985), Arthritis and Rheumatism, 28:1402-1411 und Makarov et al. (1996), Proc. Natl. Acad.
  • Sci. USA, 93:402-406).
  • Protokoll:
  • Weibliche Lewis-Ratten (Charles River Laborstories, Inc., Wilmington, MA), die jeweils 175 bis 185 g wiegen, werden intraartikulär in das rechte Fußgelenk mit einer sterilen Suspension von Streptococcen-Zellwandprodukten, die Peptidoglycan-Polysaccharid enthalten (SCW) (Lee Laborstory, Grayson, GA), mit einer Dosis von 1,5 mg/10 mg Gelenk injiziert. Salzlösung wird in das kontralaterale Gelenk injiziert, um eine Kontrolle zur Verfügung zu stellen. Die intraartikuläre Injektion von SCW verursacht eine akute Arthritis mit relativ kurzer Dauer, wobei die Schwellung des Gelenkes einen oder zwei Tage nach der Injektion ihren Höhepunkt erreicht. Nach einer Dauer von zwanzig Tagen, während der sich die akute Entzündungsreaktion auflöst, wird SCW erneut durch intravenö se Injektion mit einer Dosis von 200 mg/200 ml pro Ratte verabreicht. Die zweite Dosis SCW ist ausreichend, um die Entzündung in dem Fußgelenk, dem zuvor SCW injiziert wurde, zu reaktivieren und hat geringe Wirkungen auf das mit Salzlösung injizierte Gelenk. Um das Ausmaß der Entzündung während des 72-stündigen Zeitraumes nach der intravenösen Injektion von SCW zu untersuchen, werden die Dimensionen des Fußgelenkes durch die Vermessung des hinteren Gelenkes mit einem Gelenk-Meßschieber 0, 24, 36, 48 und 72 Stunden nach Reaktivierung der Arthritis gemessen, und anschließend wird die kontralaterale hintere Extremität für die Histologie gewonnen (z.B. Entzündung, Pannusbildung, Knorpelschaden und Knochenschaden).
  • Ergebnisse:
  • Die Wirkungen der Verabreichung des sTNFR-I 2.6D/C106db auf die Entwicklung einer Gelenkschwellung während der Reaktivierung der Arthritis werden untersucht. Die Inhibitoren und Vehikel werden jeweils in einer einzigen intravenösen Injektion 24 Stunden vor der Reaktivierung mit dem SCW verabreicht.
  • sTNFR-I 2.6D/C106db zeigt eine statistisch signifikante Wirksamkeit bei der Verringerung der Gelenkschwellung, durch Analyse der Varianz (ANOVA) Fisher's post-hoc-Test (Statview®), bei allen vier Dosen an den Tagen zwei und drei nach der Reaktivierung und bei allen bis auf eine Dosis (1,5 mg/kg) am Tag eins. Diese Verringerung der Schwellung ist vergleichbar mit der positiven Kontrolle von sTNFR-I 4D/C105db, die mit einer Dosis von 0,5 mg/kg täglich (d.h. 8,8 nM) verabreicht wird, beginnend am Tag eins vor der Reaktivierung bis drei Tage nach der Reaktivierung. Die sTNFRs zeigen ferner eine signifikante Wirksamkeit, wenn der Grad der Schwellung über die drei Tage als Ganzes betrachtet wird. Die Fläche unter der Kurve (area under the curve, AUC) zeigt bei sämtlichen Dosen einen Dosisantwort-Zusammenhang (siehe 9, in der sTNFR-I 2.6D/C106db als "sTNFR-I 2.6D" bezeichnet wird und der sTNFR-I 4D/C105db als "sTNFR-I 4D" bezeichnet wird).
  • Der sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) zeigt eine signifikante Verringerung der Breite des Gelenkes und der histologischen Indizes, im Vergleich zu der Krankheits-Kontrollgruppe in dem Modell.
  • D. D-Galactosamin/Lipopolysaccharid-Modell:
  • Das D-Galactosamin (D-GaINH2)/Lipopolysaccharid (LPS)-Modell (Parmely et al. (1993), siehe oben) ist ein hochgradig TNF-α-abhängiges in vivo Tiermodell für Lethalität. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass MRL-Iprl/Ipr Autoimmunmäuse extrem sensitiv gegenüber LPS- oder SEB-induziertem TNF-α sind (Mountz et al. (1995), J. Immunol., 155:4829-4837).
  • Protokoll:
  • Nach einer Nahrungskarenz über Nacht erhalten 6-8 Wochen alte weibliche MRL-Ipr/Ipr-Mäuse (Jackson Laborstory, Bar Harbor, ME) eine I.P. Challenge mit den folgenden pharmakologischen Reagenzien: 25 mg D-GaINH2 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), suspendiert in Hanks balancierter Salzlösung (Gibco Laborstories, Inc., Grand Island, NY) (50 mg/ml); und Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli Serotyp 0127:B8 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in steriler, Endotoxin-freier Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) (25 mg/Maus) oder SEB (Toxin Technologies, Sarasota, FL) in normaler Salzlösung (50 mg/Maus). Die verschiedenen Formen von sTNFR werden in seriellen 2-fachen Verdünnungen (mg/kg Dosierungen) verabreicht, um ED50-Kurven zu erhalten, die mit statistischer Software für den Macintosh (Statview®, Mountain View, CA) erzeugt werden. Die Lethalität wird über 48 Stunden nach der Challenge beobachtet.
  • Ergebnisse:
  • Wie in Tabelle 4 gezeigt, ist die ED50 (d.h. die Dosis sTNFR-I 2.6D/C106db, die für 50 % Schutz benötigt wird) nach 48 Stunden ~50 μg/kg (N = 8 individuelle Mäuse), wenn der sTNFR-I 2.6D/C106db wie oben beschrieben 1 Stunde vor der LPS/DGaINH2 Challenge verabreicht wird. Im Vergleich zu dem sTNFR-I 4D/C105db gibt es keine signifikanten (P > 0,05) Unterschiede in der Fähigkeit dieser Form, die Lethalität zu verhindern (ED50 = ~50 ng/kg; N = 8 individuelle Mäuse). TABELLE 4: Vergleich von sTNFR und optimierten trunkierten sTNFR-Formen im LPS/D-GaINH2-Modell
    Agens ED100 ED50
    sTNFR-I 4D/C105db ~100 μg/kg ~50 μg/kg
    sTNFR-I 2.6D/106db ~100 μg/kg ~50 μg/kg
    sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) ~2 mg/kg ~400 μg/kg
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20kDa) ~800-1000 μg/kg ~1 mg/kg
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20kDa, verzweigt) 2 mg/kg ~1-1,5 mg/kg
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (40kDa, verzweigt) 1,5 mg/kg ~1 mg/kg
  • Die Daten zeigen, dass sTNFR-I 2.6D/C106db eine vergleichbare Aktivität im Vergleich zu sTNFR-I 4D/C105db aufweist, dass jedoch sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) in diesem Modell mit einer ED50 von ~400 μg/kg (n = 5 individuelle Mäuse) weniger aktiv ist.
  • Darüber hinaus sind der sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20kDa, verzweigt) und 2.6D/N105-MePEG (40kDa, verzweigt) weniger aktiv in diesem Modell.
  • E. Modell der Adjuvans-induzierten Arthritis:
  • Die durch ein Adjuvans induzierte rheumatoide Arthritis in Ratten weist zahlreiche Ähnlichkeiten zu der humanen rheumatoiden Arthritis auf. Der Zweck dieses Experimentes ist zu zeigen, dass die systemische Verabreichung trunkierter sTNFRs eine lindernde Wirkung auf die Pathogenese der Adjuvans-induzierten Arthritis in Mäusen hat.
  • Protokoll:
  • Männliche Lewis-Ratten (5-7/Gruppe) (Charles River Laborstories, Inc., Wilmington, MA), die wenigstens 200 g wiegen, werden mit SQ-Kathetern katheterisiert und für mehrere Tage erholen gelassen. Sie werden anschließend in Infusionskäfige gesetzt und vor der ersten Infusion mit Salzlösung eine Woche lang eingewöhnt.
  • Am Tag 0 wird allen Ratten 100 μl Freunds komplettes Adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) injiziert, dem ein synthetisches Adjuvans, N,N-Dioctyldecyldecyl-N',N-bis(2-hydroxyethyl)propandiamin, 50 mg/ml, dazugegeben wird. Am Tag 8 wird ver schiedenen Rattengruppen durch kontinuierliche SQ-Infusion sTNFR-I 4D/C105 und sTNFR-I 2.6D/N 105 verabreicht.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5: Adjuvans-induzierte Arthritis
    Verbindung Dosis (mg/kg/Std) AUC% (% Inh.) Pfotengewicht (% Inh.) Entzündung Knochen Res.
    Histopathologie
    (% Inh.) % Inh.)
    Studie #1
    sTNFR-I 4D/C105 5 61 46 37 89
    1 49 45 26 855
    0,2 33 40 14 34
    sTNFR-I 2.6D/N105 1 55 53 33 51
    Studie #2
    sTNFR-I 2.6D/N105 5 42 ND 19 67
    1 38 ND 13 49
    Studie #3
    sTNFR-I 2.6D/N105- 9 50 40 13 27
    MePEG(20kDa) 3 35 34 9 22
    1 36 30 0 0
    sTNFR-I 2.6D/N105- 9 43 37
    MePEG(33kDa) 3 38 33
    1 24 20
  • Überraschenderweise weisen der sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) und der sTNFR-I 4D/C105db eine vergleichbare anti-arthritische Aktivität in der Adjuvans-Arthritis in Lewis-Ratten auf, obwohl der sTNFR-I 4D/C105db in den WEHI-164- und L929- in vitro-Zytotoxizität-Assays ebenso wie in dem LPS/GaIN-Modell wirksamer ist.
  • F. Modell der Collagen-induzierten Arthritis:
  • Die Typ II Collagen-induzierte Arthritis in Ratten weist zahlreiche Ähnlichkeiten mit humaner rheumatoider Arthritis auf. Der Zweck dieses Experimentes ist zu zeigen, dass die systemische Verabreichung trunkierter sTNFRs eine lindernde Wirkung auf die Pathogenese der Typ II Collagen-induzierten Arthritis in Ratten und Mäusen hat.
  • Ratten-Protokoll:
  • Weiblichen Lewis-Ratten (Charles River Laborstories, Inc., Wilmington, MA) wurden SW-Kanülen implantiert und sie werden eingewöhnt, um sie für die kontinuierliche Infusion anbinden. Anschließend werden sie mit bovinem Typ II Collagen in Freunds inkomplettem Adjuvans immunisiert. An den Tagen 13, 14 oder 15 nach der Immunisierung werden Tiere mit einer festgestellten Arthritis zufällig in Gruppen mit jeweils 8 Tieren unterteilt. Die Versichsgruppen werden mit Vehikel oder verschiedenen Dosen sTNFR-I wie in Tabelle 6 beschrieben, für 7 Tage infundiert. Die Pfotenschwellung wird durch tägliche Messung der Fußgelenke mit einem Meßschieber bestimmt. Am Tag 7 werden die Tiere euthanisiert, und die Pfoten werden für die Gewichtsbestimmung als Index der Entzündung gesammelt. Die Fußgelenke und Kniegelenke werden für die histopathologische Auswertung arthritischer Parameter gesammelt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 6A dargelegt. TABELLE 6A: Collagen-induzierte Arthritis
    Verbindung Dosis (mg/kg/Std) AUC% (% Inh.) Pfotengewicht (% Inh.) Entzündung Knochen Res.
    Histopathologie
    (% Inh.) % Inh.)
    Studie #1
    sTNFR-I 4D/C105 5 65 81 ND ND
    1 35 34 ND ND
    0,2 19 22 ND ND
    sTNFR-I 2.6D/N105 1 39 41 ND ND
    Studie #2 (mg/kg/Tag)
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kD) 3 50 60 76 46
    sTNFR-I 4D/N105- MePEG(33kD) 3 47 50 ND ND
    Studie #3 (mg/kg/Tag)
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kD) 9 25 44 ND ND
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kD) 3 25 37 ND ND
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20)kD) 9 35 52 ND ND
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kD) 3 35 37 ND ND
  • Interessanterweise weisen in dem etablierten Collagen-Modell der Ratte sämtliche Behandlungsgruppen fast die gleiche Wirksamkeit auf (z.B. Kurvenform, Prozent (%) Inhibition der Fläche unter der Kurve (AUC), die im Bereich von 30 bis 59 % liegt und Pfotengewichts-Inhibition, die im Bereich von 40 bis 64 % liegt. Die Gruppe ohne Behandlung unterscheidet sich statistisch von jeder anderen in diesem Arthritis-Modell.
  • Maus-Protokoll:
  • Männliche DBA/1 (Jackson Laborstories, Inc., Bar Harbor, ME) werden mit bovinem Typ II-Collagen (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in Freunds inkomplettem Adjuvans immunisiert. An den Tagen 24, 25 und 26 nach der Immunisierung werden Tiere mit festgestellter Arthritis zufällig in Gruppen von jeweils acht Tieren unterteilt. Den Versuchsgruppen wird zweimal täglich auf dem IP-Weg entweder Salzlösung oder sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (33kDa) an 3 aufeinanderfolgenden Tagen (Tage +27, +28, +29) verabreicht. Die Pfotenentzündung wird durch tägliche Messung der Fußgelenke mit einem Meßschieber bestimmt. Am Tag +34 werden die Tiere euthanasiert, und die Pfoten werden für die Gewichtsbestimmung als Index für die Entzündung gesammelt. Die Fuß- und Kniegelenke werden für die histopathologische Auswertung arthritischer Parameter gesammelt.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6B dargestellt. TABELLE 6B: Collagen-induzierte Arthiris
    Verbindung Dosis (mg/kg 2T) AUC% (% Inh.) Gesamt-Histopathologie
    (% Inh.)
    Studie #1
    sTNFR-I 4D/C105db 3 49 39
    sTNFR-I 4D/K105 -t-BuPEG(33kD) 3 63 55
    Studie #2
    sTNFR-I 2.6D/K105-MePEG(33kD) 9 73 ND
    sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kD) 3 75 ND
  • G. Ratten-Modell der kontinuierlichen Infusion der LPS-induzierten TNF-α-Produktion:
  • sTNFR-I 2.6D/C105db und sTNFR-I 2.6D/C106db, sTNFR-I 2.6D/N105 und sTNFR-I 4D/N105 werden i.v. jugular mit AlzetTM Minipumpen (Alza Corp., Palo Alto, CA) in Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers für eine kontinuierliche Infusion über 48 Stunden (1 mg/kg) implantiert. Die TNF-α-Serumkonzentrationen, die mittels ELISA gemessen werden (Genzyme, Cambridge, MA), sind im Vergleich zu den Kontrollen +2 Stunden nach einer Challenge mit einer hohen Dosis LPS signifikant verringert.
  • Beispiel III: Immunogenitätsstudien
  • Verschiedene Formen eines trunkierten, rekombinanten löslichen TNFR-I werden in verschiedenen Tiermodellen auf Immunogenität untersucht.
  • A. Nager:
  • sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) und sTNFR-I 4D/C105db (Kontrolle) werden an den Tagen 1 und 5 der Experimente weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) (n = 6-8/Gruppe) subkutan verabreicht (4 mg/kg). Retro-orbitale Blutproben werden wöchentlich bis Tag 21 nach der ersten Verabreichung gesammelt. Die Proben werden auf IgM- und IgG-Antikörperproduktion untersucht. TABELLE 7: Nager-Immunogenität
    Zeit [Tage] 0,01 7 14 21
    Gruppe+Tier# TITER IgM TITER IgM TITER IgM TITER IgM
    sTNFR-I 2.6D/N 105-33kdaPEG
    1 NEG 0 0 0
    2 NEG 0 0 0
    3 NEG 0 0 0
    4 NEG 0 0 0
    6 NEG 0 0 0
    sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(331 kDa) 0 0,00 0,00 0,00
    SEM 0 0,00 0,00 0,00
    Kontrolle
    7 0 0 50 0
    8 0 0 50 0
    3 0 0 100 0
    9 0 0 0 0
    10 0 0 100 50
    11 0 0 100 0
    12 0 0 100 0
    13 0 0 0 0
    Kontrolle 0 0 62,5 6,3
    SEM 0 0 15,7 6,3
    Zeit [Tage] 0,01 7 14 21
    Gruppe+Tier# TITER IgM TITER IgM TITER IgM TITER IgM
    sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)
    1 NEG NEG 0 0
    2 NEG NEG 0 0
    3 NEG NEG 0 0
    4 NEG NEG 0 0
    6 NEG NEG 0 0
    sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 0,00 0,00 0,00 0,00
    SEM 0,00 0,00 0,00 0,00
    Kontrolle
    7 NEG NEG 0 200
    8 NEG NEG 0 200
    9 NEG NEG 0 0
    10 NEG NEG 0
    11 NEG NEG 200 400
    12 NEG NEG 0 200
    13 N EG N EG 200 800
    14 NEG NEG 0 50
    Kontrolle 0 0 50 231,3
    SEM 0 0 32,7 94,0
  • Wie in der Tabelle 7 zu sehen ist, verzeichnet das an den Tagen +1 und +5 subkutan (SC) verabreichte sTNFR-I 4D/C105db die höheren Ratten-anti-sTNFR-I IgG-Antikörpertiter bis +21 Tage als der sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa), der sehr schwache Antikörpertiter zeigt, sofern überhaupt vorhanden. Ähnliche Tendenzen bei der Immunogenität werden auch in Ratten beobachtet, die bis zum Tag +21 anti-sTNFR-I IgM-Antikörper entwickeln. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) erzeugt bis zum Tag +21 keine Ratten-anti-sTNFR-I IgM-Antikörper.
  • B. Papio anubis:
  • Das Ziel des ersten Teils 1, Phase A der Studie ist, die Pharmakokinetiken und die Immunogenität des sTNFR-I 4D/C105db (0,2 mg/kg Körpergewicht [BW]), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg BW) bzw. sTNFR-I 2.6D/C105db (0,2 mg/kg BW) festzustellen, wenn dieser gesunden Pavianen zweimal im Abstand von 21 Tagen i.v. verabreicht wird.
  • Der Teil 1 der Studie ist in zwei Phasen eingeteilt. Teil 1, Phase A zielt darauf ab, die Pharmakokinetiken und die Immunogenität der verschiedenen sTNF-RI-Konstrukte in den gesunden Pavianen in Antwort auf zwei Injektionen zu bestimmen. 12 Paviane werden in drei Gruppen unterteilt. Während sie anästhesiert sind, erhält jede Gruppe 0,2 mg/kg BW jeweils von sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 3D/C105db bzw. sTNFR-I 2.6D/C105db. Drei Paviane werden in jeder Sitzung untersucht. Die Tiere werden für 21 Tage beobachtet und erhalten anschließend eine zweite, identische I.V.-Injektion des Proteins und werden für weitere 21 Tage untersucht. Die Pharmakokinetiken und die Immunogenität werden danach in Intervallen bestimmt.
  • Teil 1, Phase B der Studie zielt darauf ab, die Effizienz dieser Präparationen in einem gut etablierten Modell der TNFα-vermittelten Lethalität (Espat et al., J. Surg. Res., 52:153-158, 1995) zu untersuchen. Eine lethale E. coli-Bakteriämie wid in 16 Tieren in Gruppen von vier durch Verabreichung von 5-10 × 1010 cfu/kg lebender E. coli induziert. Eine Placebogruppe wird mit Pavianen verglichen, die I.V. mit einem sTNFR-I 4D/C105db (0,2 mg/kg Körpergewicht [bodyweight, BW]), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg BW) oder sTNFR-I 2.6D/C105db, der mit 1 mg/kg BW verabreicht wird, vorbehandelt wurden.
  • In beiden Phasen des Teils 1 der Studie werden junge erwachsene männliche und weibliche Papio anubis Paviane (6 bis 11 kg) (Biomedical Research Foundation, San Antonio, TX) über Nacht fasten gelassen. Die Tiere werden mit Ketamin (10 mg/kg i.m.) anästhesiert und die Schädelvene wird perkutan katheterisiert. Die Anästhesie wird durch eine erste Verabreichung von bis zu 35 mg/kg Natriumpentobarbital, gefolgt von wiederholten Injektionen von 3-5 mg/kg/Std Natriumpentobarbital aufrechterhalten. Der obere Luftweg wird durch Einsetzen eines geblockten endotrachealen Tubus gesichert, und die Tiere behalten ihre Spontanatmung. Ein Katheter wird perkutan in die Oberschenkelarterie gesetzt, der eine wiederholte Probenentnahme von systemischem arteriellem Blut ebenso wie eine ständige Überwachung der Herzfrequenz und des mittleren arteriellen Blutdrucks über einen Datascope 2000-Anästhesiemonitor (Datascope, San Antonio, TX) Herzmonitor erlaubt. Proben des arteriellen Blutes werden in Intervallen gesammelt, mit EDTA oder Heparin anti-koaguliert und direkt nach der Entnahme auf Eis gekühlt. Die Plasmafraktion wird durch Zentrifugation bei 4°C abgetrennt und bei -70°C bis zur Untersuchung gelagert. Die Kerntemperatur wird über eine rektale Sonde beobachtet. Ein Dauer-Katheter des Typ Foley wird gesetzt, um die Sammlung von Urin zu ermöglichen und die Urinausscheidung und Creatinin-Clearance zu überwachen. Hämodynamische Parameter werden alle 15 Minuten beobachtet. Sämtliche Tiere erhalten 0,9 % Natriumchlorid (4 ml/kg) als i.v.-Erhaltungsflüssigkeit. In den Phase-B-Studien erhalten die Tiere zusätzliche Flüssigkeit (10 ml/kg alle 15 Minuten), wenn zwei der folgenden physiologischen Kriterien zutreffen: 1) der mittlere arterielle Druck fiel um mehr als 30 %; 2) die Herzfrequenz nimmt um mehr als 30 % zu und 3) die Urinausscheidung fällt auf < 1 ml/kg/Std. Nach der Blutprobenentnahme für die Nulllinie und einer Wartezeit von höchstens einer Stunde, um eine Äquilibrierung zu ermöglichen, wird mit der Infusion der Proteine begonnen.
  • In dem Teil 1, Phase A-Studienset werden rekombinante Proteine über die Schädelvene infundiert, und die Tiere werden über einen Zeitraum von 8 Stunden beobachtet, wobei danach sämtliche Katheter entfernt und die Tiere für 21 Tage in ihre Käfige zurückgesetzt werden. Nach 24 und 48 Stunden und an den Tagen 3, 5, 8, 11, 16 und 21 werden die Tiere kurz mit IM-Ketamin (10 mg/kg) anästhesiert und Proben des venösen Blutes werden entnommen. Am Tag 21 werden die Tiere erneut anästhesiert, erhalten eine zweite Injektion des Proteins, und die gesamte Prozedur, die am Tag null durchgeführt wurde, wird für weitere 21 Tage wiederholt, zu welchem Zeitpunkt die Tiere euthanisiert werden.
  • In den Teil 1, Phase B-Studien werden eine Stunde vor der Infusion von E. coli vier Tiere zufällig bestimmt, um entweder ein Placebo oder eines der zuvor erwähnten Konstrukte zu erhalten. Die Tiere werden für einen Zeitraum von acht Stunden beobachtet, wobei danach sämtliche Katheter entfernt werden, die Tiere in ihre Käfige zurückgebracht werden und das anschließende Überleben der lethalen Bakteriämie beobachtet wird. Tiere mit übermäßigen Beschwerden werden euthanisiert. Übermäßige Beschwerden sind definiert durch die IACUC als: 1) Nicht-Aufrechterhalten der sitzenden oder stehenden Position über die vorangehenden 12 Stunden, 2) Nicht-Aufnahme von Futter oder Wasser innerhalb der vorangehenden 12 Stunden, 3) unkontrollierbare Blutung aus der Katheterstelle oder 4) Nicht-Reagieren auf externe Stimuli. Proben des venösen Blutes werden zum Zeitpunkt -1, 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 24 Stunden, 48 Stunden und an den Tagen 3, 5, 8, 11, 16 und 21 entnommen. Am Tag 21 werden die überlebenden Tiere euthanisiert.
  • Das Vorhandensein von Papio-Antikörpern gegen die verabreichten rekombinanten Proteine werden mittels eines Sandwich ELISA bestimmt. Kurz beschrieben werden die sTNFR-1-Konstrukte auf ELISA-Platten (1 μg/ml) geschichtet, und verdünntes Plasma (1:50 bis 1:100000) der Paviane (100 μl) wird dazugegeben. Nachdem die Proben gewaschen sind, wird eine Meerrettichperoxidase (horse radish peroxidase, HRP), die mit Protein A konjugiert ist, dazugegeben (0,5 μg/ml), und die Assays werden mit TMB sichtbar gemacht.
  • Ergebnisse (Teil I):
  • Die Halbwertszeiten im Plasma unterschieden sich bei den drei Konstrukten signifikant. Die Eliminations-Kurven werden unter Verwendung einer Modell-unabhängigen Methode bestimmt, und die scheinbaren Halbwertszeiten werden im Allgemeinen zwischen 8 und 172 Stunden bestimmt. In naiven Tieren ist die Plasma-Halbwertszeit am längsten in Pavianen, die mit dem 4.0-Domäne-Konstrukt behandelt wurden (29 Stunden) und nimmt sequenziell in Pavianen, die mit dem sTNFR-I 3D/C105db (24,7 Stunden) und sTNFR-I 2.6D/C105db (21,5 Stunden) behandelt wurden, ab. Der Unterschied beträgt, obwohl er statistisch signifikant ist, nur 26 %.
  • Unerwarteterweise neigen die Plasma-Halbwertszeiten nach der zweiten Verabreichung der Proteine an die entsprechenden Paviane dazu, viel kürzer zu sein, was auf eine schnellere Clearance hindeutet. Diese Abnahme der Halbwertszeit ist am stärksten in Pavianen ausgeprägt, die sTNFR-I 4D/C105db erhalten, bei denen sie um 48 % verkürzt ist (p < 0,01) [10]. Die Verkürzungen der Halbwertszeit liegen bei den Pavianen, die mit den sTNFR-I 3D/C105db behandelt wurden, dazwischen (31 %) [11] und ist am geringsten in den Tieren, denen sTNFR-I 2.6D/C105db verabreicht wurde (14 %) [12]. Die Verkürzungen der Halbwertszeit sind in Pavianen, die mit dem sTNFR-I 2.6D/C105db behandelt wurden, nicht statistisch unterschiedlich.
  • Sämtliche Präparationen sind in den Pavianen immunogen. Jedoch ist die Häufigkeit der Immunogenität am höchsten, in den Pavianen, die mit dem sTNFR-I 4D/C105db behandelt wurden, im mitteleren Bereich in Tieren, die mit dem sTNFR-I 3D/C105db behandelt wurden und am geringsten in Tieren, denen sTNFR-I 2.6D/C105db verabreicht wurde (Tabelle 8). TABELLE 8: Höchstwerte der Antikörperantworten1
    Erste 21 Tage Zweite 21 Tage
    Median 25 %-75 % Median 25 %-75 %
    sTNFR-I 4D/C105db (n = 4) 3,20 3,20 3,20 3,95 3,50 4,40
    sTNFR-I 3D/C105db (n = 4) 1,60 0,00 3,65 3,50 1,30 4,75
    sTNFR-I 2.6D/C105db (n = 4) 0,00* 0,00 1,75 1,45 0,00 3,50
    • 1 Logarithmische Skala (umgekehrte Verdünnung des Plasmas, die notwendig ist, um eine halb-maximale Absorption in einem Sandwich-ELISA zu produzieren; siehe Experimentelle Verfahren)
    • * p = 0,056, mittels Kruskal-Wallis Zwei-Wege-ANOVA (log-transformierte Werte fielen in Tests auf Normalverteilung durch)
  • Die Antikörper-Antworten entwickeln sich üblicherweise um den 8. Tag nach der Verabreichung der Konstrukte und sind bis zum Tag 21 des Studienzeitraums vorhanden. Darüber hinaus neigen die Antikörper-Antworten dazu, während der Antwort auf die zweite Injektion der Proteinkonstrukte stärker zu werden.
  • Alle vier Paviane, die den sTNFR-I 4D/C105db erhielten, entwickeln Antikörper, zwei der vier Tiere, die den sTNFR-I 3D/C105db erhielten, entwickeln Antikörper und einer der vier Paviane, die den sTNFR-I 2.6D/C105db erhielten, entwickelt Antikörper. Mittels Kruskall-Wallis ANOVA unterscheidet sich die Stärke der Antikörper-Antwort (log-transformiert) signifikant in den drei Gruppen als eine Funktion der Zeit (p < 0,05). Posthoc-Analysen legen nahe, dass der signifikante Unterschied in den Antikörper-Antworten prinzipiell zwischen Tieren auftritt, die sTNFR-I 4D/C105db und sTNFR-I 2.6D/C105db erhielten, wobei mittlere (und nicht-signifikante) Antworten von Tieren erhalten wurden, die mit sTNFR-I 3D/C105db behandelt wurden.
  • Ein korrelativer Zusammenhang zwischen der Entwicklung von Antikörpern und der Änderung der Clearance zwischen den beiden 21 Tage-Studien (p < 0,01) ist zu beobach ten. Nicht unerwartet wird das Protein in solchen Tieren, die eine stärkere Antikörperantwort nach dem ersten Verabreichen des Konstruktes entwickelten, nach der zweiten Verabreichung schneller eliminiert. Eine Veränderung bei der Clearance zwischen den ersten und zweiten Injektionen wird zwischen Tieren verglichen, die eine Antikörper-Antwort entwickelten (n = 7) und solchen, die dies nicht taten (n = 5) [13].
  • Die Antikörper, die in dem Plasma der Paviane detektiert werden, werden bei einer ausgewählten Anzahl von Tieren in der ME-180-Zelllinie auf direkte Zytotoxizität und in einem L-929-Assay auf neutralisierende Eigenschaft untersucht. Bei Antikörpern, die gegen irgendeines der drei Konstrukte erzeugt wurden, wird weder eine Zytotoxizität noch eine Neutralisierung beobachtet.
  • In der Phase I, Teil A Pavian-Studie weisen Tiere, welche die stärksten Antikörper-Antworten entwickelten, auch die rascheste Zunahme bei der Clearance der Konstrukte nach deren zweiten Verabreichung auf. Folglich legen derartige Beobachtungen nahe, dass die Antikörper-Antworten die biologische Halbwertszeit verringern können und damit die therapeutische Wirksamkeit der Konstrukte, und Dosisanpassungen können erforderlich sein. Jedoch scheint es keine nachteilige klinische Antwort auf das Vorhandensein der Antikörper zu geben, wenn die Konstrukte ein zweites Mal verabreicht werden. Folglich sind therapeutische Bemühungen, derartige Konstrukte so zu modifizieren, dass die Immunogenität verringert ist, ohne die Halbwertszeit oder Wirksamkeit signifikant zu beeinträchtigen, in erster Linie darauf gerichtet, den Bedarf an zunehmenden Dosisanpassungen zu verringern, eher als das Risiko nachteiliger Reaktionen.
  • Teil 1 Phase B-Ergebnisse:
  • Letztendlich sind in den naiven Pavianen alle drei Konstrukte fast gleich wirksam in der Vorbeugung eines Zytokin-vermittelten Schadens nach einer E. coli-Bakteriämie, wenn sie mit einer Dosis von 1,0 mg/kg BW verabreicht werden. Einer von 4 Placebo-behandelten Pavianen überlebt; 4 von 4 mit sTNFR-I 4D/C105db und sTNFR-I 3D/C105db behandelten Pavianen überleben bzw. 3 von 4 mit sTNFR-I 2.6D/C105db behandelten Pavianen überleben. Alle drei Konstrukte verhindern eine TNFα-Bioaktivität und stellen einen Überschuss an neutralisierender Eigenschaft zur Verfügung.
  • Teil II:
  • Das spezifische Ziel der Teil II-Studie in Pavianen ist, festzustellen, ob wiederholte Exposition (d.h. 3 getrennte Injektionen) von Tieren gegenüber verschiedenen sTNFR-I-Konstrukten zu einer weiteren Immunogenität und Verringerung der Halbwertszeiten führt. Zusätzlich ist diese Studie konzipiert, um die Immunogenität und Pharmakokinetiken mehrerer sTNFR-I-Konstrukte zu vergleichen, einschließlich sTNFR-I 2.6D/C105db und sTNFR-I 4D/C105db und sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) sowie sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa). Schließlich ist diese Studie konzipiert, um die klinische Bedeutung der Antikörperantwort zu bewerten und die Clearance bei der nachfolgenden Antwort auf eine Challenge einer TNFα-vermittelten Schädigung (E. coli-Bakteriämie) zu verändern.
  • An den Tagen 0, 21 und 42 wird Pavianen I.V. 0,2 mg/kg der verschiedenen Konstrukte (sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) bzw. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa)) verabreicht. Am Tag +63 erhalten die Paviane 2,0 mg/kg BW ihrer entsprechenden Konstrukte. Am Tag +65 (d.h. 48 Stunden später) werden die Paviane mit einer lethalen Dosis von E. coli, wie oben in Teil I ausgeführt, gechallenged. Die wichtigsten Ergebnisse des Teils II sind die Folgenden:
  • Ergebnisse (Teil II):
  • Im Allgemeinen weisen sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) und sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) längere Halbwertszeiten als TNFR-I 4D/C105db und sTNFR-I 2.6D/C105db in den naiven Pavianen auf, unabhängig von der Anzahl von Domänen. Die Halbwertszeiten liegen im Bereich von 30-35 Stunden für die monopegylierten sTNFR-I-Formen im Vergleich zu 10-20 Stunden für die dimeren pegylierten Formen. Darüber hinaus weisen sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) und TNFR-I 4D/C105db längere Halbwertszeiten als 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) und sTNFR-I 2.6D/C105db in dem naiven Tier auf.
  • sTNFR-I 4D/C105db und sTNFR-I 2.6D/C105db sind außerdem immunogen, wobei es einen leichten Trend zur verringerten Immunogenität bei sTNFR-I 2.6D/C105db gibt. Jedoch zeigt nur TNFR-I 4D/C105db eine verringerte Clearance bei wiederholten Verabreichungen. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) und 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) sind weder antigen, noch verändern sich ihre Clearanceraten signifikant bei einer wiederholten Verabreichung.
  • Das von jedem Pavian, der mit den verschiedenen Verbindungen an den Tagen +21, +42 und +61 behandelt wurde, erhaltene Serum (N = 3) wird (mittels Sandwich Capture ELISA) in vitro auf Immunreaktivität gegen andere Konstrukte untersucht, indem die verschiedenen Konstrukte als das Capture-Antigen verwendet werden. Zum Beispiel "reagiert" Serum, das aus Pavianen erhalten wurde, denen der 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) am Tag +21 verabreicht wurde (Tabelle 9), nicht mit dem sTNFR-I 4D/C105db und sTNFR-I 4D/N105, wenn diese Verbindungen auf der ELISA-Platte als die Capture-Antigene verwendet werden.
  • Figure 01060001
  • Eine positive Reaktion ist eine Antikörperantwort mit einem Titer > 1:400. Die Daten von den Tagen +42 und +61 sind in den Tabellen 10 und 11 gezeigt. Bedeutenderweise gibt es eine positive Reaktion in vitro mit Serum, das von einem Pavian erhalten wurde, der zuvor mit dem 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) behandelt wurde, wenn dieses gegen das sTNFR-I 4D/C105db Capture-Antigen getestet wurde (Tabelle 11).
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • In den Pavianen, denen zuvor dreimal die Konstrukte verabreicht wurden, ist die Wirksamkeit gegenüber einer Antwort auf eine TNFα-vermittelte Schädigung am Höchsten in (1) sTNFR-I 4D/C105db, (2) sTNFR-I 2.6D/C105db, (3) sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) und (4) 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) (wie durch Überleben, multiples Organversagen (multi-system organ failure, MSOF), IL-6 in Serum und WBC-Antworten bestimmt wurde). Der "Vorbehalt" ist, dass diese Studie nicht die Unterschiede in der TNF-neutralisierenden Funktion der verschiedenen Konstrukte berücksichtigt hat.
  • C. Schimpanse:
  • Das Ziel dieser Studie ist, die Immunogenität der verschiedenen sTNF-RI-Formen zu untersuchen, die wiederholt über den I.V.-Weg über einen Zeitraum von 1 Monat in Schimpansen injiziert werden. Die in dieser Studie untersuchten sTNF-RI-Formen sind: sTNFR-I 2.6D/C105db, sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa), sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) und sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa). Es sind insgesamt 3 Schimpansen pro Behandlungsgruppe.
  • Die Dosisanwendung/Parameter dieser Studie sind wie folgt: jeder Schimpanse erhält den Testartikel als eine intravenöse Bolusinjektion mit 0,1 mg/kg, zweimal wöchentlich, Montags und Freitags für 4 Wochen (insgesamt 8 Dosen). Das Dosisvolumen variiert abhängig von der Konzentration des gelieferten Testartikels. Eine Serumprobe von 5 ml wird am Tag 0 vor der Behandlung von jedem Tier gewonnen. Zusätzliche Serumproben werden kurz vor der Verabreichung des Arzneimittels an den Tagen 7, 14, 21 und 28 entnommen.
  • Die Rohdaten zur Schimpansen-Immunogenität sind in Tabelle 12 gezeigt.
  • Figure 01110001
  • Am Tag +28 verzeichnen sämtliche Tiere (N = 3), die entweder mit sTNFR-I 4D/C105db oder sTNFR-I 2.6D/C105db behandelt wurden, eine positive Reaktion (gemessen mittels ELISA, wobei der höchste Titer mit 1:12800 bzw. 1:3200 beobachtet wurde (Tabelle 12) (Hinweis: In diesem Teil des Experimentes werden sämtliche "immunisierende" Antigene als die entsprechenden Capture-Antigene, die auf der ELISA-Platte immobilisiert sind, verwendet). Ein Tier, das mit sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) behandelt wurde, zeigt an den Tagen +21 und +28 eine positive Antikörperreaktion (Tabelle 12). Bedeutenderweise wurde nicht festgestellt, dass Tiere, die entweder mit sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) oder sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) behandelt wurden, während des Experimentes anti-sTNFR-I-Antikörper entwickelten (Tabelle 12).
  • Wie in dem experimentellen Abschnitt oben zu den Pavianen beschrieben, wurde Serum, das von jedem Schimpansen erhalten wurde (N = 3), die mit den verschiedenen sTNF-RI-Formen behandelt wurden, am Tag +28 in vitro auf eine Immunreaktivität (durch ELISA) gegen andere Konstrukte untersucht, indem sTNF-RI-Formen als die Capture-Antigene verwendet wurden. Eine positive Reaktion ist eine Antikörperantwort mit einem Titer > 1:400. Bedeutenderweise "reagiert" Serum, das von Schimpansen erhalten wurde, denen der sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33kDa) verabreicht wurde, nicht mit sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/N105, wenn diese Verbindungen auf der ELISA-Platte als das Capture-Antigen verwendet werden (Tabelle 13).
  • Figure 01130001
  • Dies wird ebenfalls bei Tieren beobachtet, die entweder mit den sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) oder dem sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) behandelt wurden (Tabelle 13).
  • Beispiel IV
  • EAE ist eine akute oder chronisch rezidivierende inflammatorische demyelisierende Erkrankung des ZNS, die aus einer Sensibilisierung genetisch empfänglicher Tiere mit Neuroantigenen, wie z.B. dem Myelin-basischen Protein (MBP) resultiert. EAE ist ein auf dem Gebiet akzeptiertes und häufig verwendetes Tiermodell für akute humane MS.
  • Weibliche Lewis-Ratten (Jackson Laborstories, Bar Harbor, ME) werden am Tag 0 anästhesiert und in die Pfote der linken hinteren Extremität mit 0,1 ml einer Emulsion immunisiert, die Myelin-basisches Protein (MBP) in komplettem Freunds Adjuvans, gelöst in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit einem gleichen Volumen komplettem Freunds Adjuvans (CFA), das 5 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra enthält (Difco Lab MI). Kontrollratten erhalten 0,1 ml der PBS/CFA-Emulsion ohne MBP in die Pfote der linken hinteren Extremität.
  • Die Auswertung einer klinischen Erkrankung erfolgt auf Grundlage eines üblichen 0-5-Bewertungssystems. Das Spektrum der Klassifizierung ist: 0, normal; 0,5, teilweiser Verlust des Schwanztonus; 1, vollständiger Verlust des Schwanztonus, 2, Nachziehen einer hinteren Extremität; 3, Lähmung beider hinterer Extremitäten; 4, krank; und 5, tot. Sämtliche Injektionen der sTNFR-I-Konstrukte oder Vehikel werden mit 1 mg/kg S.C. jeden zweiten Tag, beginnend am Tag 9 nach der Immunisierung, verabreicht. Alle Tiere werden am Tag 21 beendet. Die Ergebnisse werden auf zwei Weisen dargestellt, der Wert der klinischen Schwere als eine Funktion der Zeit, und der integrierte klinische Wert für jede Ratte über den gesamten Verlauf der Erkrankung wird berechnet als die Fläche unter der Kurve (AUC) des täglichen klinischen Wertes versus der Zeit. Die Werte für die behandelten Gruppen für die integrierte klinische Bewertung werden mit denen der Kontrollgruppe unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests statistisch verglichen.
  • Mit Vehikel behandelte Tiere zeigen einen Beginn der Krankheit etwa an Tag 10, die Erkrankung zeigte ihren Höhepunkt am Tag 16 und ging dann zurück. sTNFR-I 4D/C106db schwächt die klinischen Symptome im Vergleich zu Tieren, die mit Vehikel behandelt wurden, um etwa 73 % ab. Der sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) schwächt die klini schen Symptome ebenfalls um etwa 85 % ab. Der sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33kDa) und der sTNFR-I 2.6DN105-t-BuPEG (33kDa) sind bei der Abschwächung der klinischen Symptome ähnlich wirksam (64 bzw. 57 %).
  • In der Schlussfolgerung scheint es, dass trunkierte sTNFRs bei der Vermittlung einiger der klinischen Folgekrankheiten in diesem Tiermodell für MS wirksam sind.
  • Sequenzprotokoll
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Claims (28)

  1. Ein trunkierter sTNFR, der die folgende Formel hat: R1-[Cys19-Cys103]-R2 worin [Cys19-Cys103] die Reste 19 bis 103 des sTNFR-I repräsentieren, dessen Aminosäurereste-Nummerierungsschema in 1 (SEQ ID Nr. 2) bereitgestellt ist, um den Vergleich zu erleichtern; worin R1 eine methionylierte oder nicht-methionylierte Amingruppe von Cys19 oder des/der Amino-terminalen Aminosäurereste(s) repräsentiert, ausgewählt aus der folgenden Gruppe:
    Figure 01400001
    und worin R2 eine Carboxy-Gruppe von Cys103 oder den Carboxy-terminalen Aminosäureresten repräsentiert, ausgewählt aus der Gruppe aus:
    Figure 01410001
    wobei der genannte sTNFR eine reduzierte Antigenität im Vergleich zu löslichem TNFR-I hat, der die ersten drei Domänen umfasst; sowie Deletions- und/oder Substitutions-Muteine davon, die fähig sind, TNF zu inhibieren und eine Homologie zu der nativen Sequenz des genannten TNFR von mehr als 70 % aufweisen; sowie Konjugate des genannten TNFR mit wasserlöslichen Polymeren, wobei die Konjugate nicht die vierte Domäne von TNFR enthalten.
  2. Der trunkierte sTNFR gemäß Anspruch 1, ausgewählt aus NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C105 bezeichnet); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C106 bezeichnet); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/N105 bezeichnet); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d8 bezeichnet); NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d18 bezeichnet); und NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.3D/d15 bezeichnet).
  3. Das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die genannte Aminosäuresequenz nicht glykosyliert ist.
  4. Das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die genannte Aminosäuresequenz glykosyliert ist.
  5. Das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiert ist.
  6. Ein polyvalentes Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, das wenigstens ein Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst.
  7. Ein polyvalentes Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, das die Formel Ra-X-Rb hat, worin: X einen Linker umfasst, wobei der genannte Linker ein wasserlösliches Polymer ist; und Ra und Rb biologisch aktive Moleküle sind, die kovalent mit dem genannten wasserlöslichen Polymer verbunden sind, wobei wenigstens eines von Ra und Rb ein Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
  8. Das polyvalente Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß Anspruch 7, worin das wasserlösliche Polymer Polyethylenglykol ist.
  9. Das TNFbp gemäß Anspruch 8, worin der genannte trunkierte sTNFR ausgewählt ist aus Ra-X-Rb, worin: X einen Linker umfasst, wobei der genannte Linker PEG-20.000-bis-Vinylsulfon ist; und Ra und Rb beide NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C105 bezeichnet) sind; oder Ra-X-Rb, wobei: X einen Linker umfasst, wobei der genannte Linker PEG-20.000-bis-Vinylsulfon ist; und Ra und Rb beide NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH (auch als sTNFR-I 2.6D/C106 bezeichnet) sind.
  10. Das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung bei der Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung.
  11. Das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung bei der Behandlung von Arthritis.
  12. Ein Polynukleotid, das für das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß Anspruch 1 oder 2 kodiert.
  13. Eine Nukleinsäuresequenz, die eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein kodiert, wobei die Nukleotidsequenz aus den folgenden ausgewählt ist: (a) einer cDNA Sequenz, wie sie in 2 gezeigt ist; (b) einer cDNA Sequenz, wie sie in 3 gezeigt ist, (c) einer cDNA Sequenz, wie sie in 4 gezeigt ist, (d) einer cDNA Sequenz, wie sie in 5 gezeigt ist, (e) einer cDNA Sequenz, wie sie in 6 gezeigt ist, (f) einer cDNA Sequenz, wie sie in 7 gezeigt ist, (g) einer Sequenz, die in den kodierenden Bereichen oder Teilen davon von (a), (b), (c), (d), (e) und (f) degeneriert ist; und (h) einer Sequenz, die komplementär zu (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) und (h) ist, unter der Voraussetzung jedoch, dass die Nukleinsäure nicht für ein Protein kodiert, das die Formel R1-[Cys19-Cys103]-FNCSLCL-R3 hat worin [Cys19-Cys103] die Reste 19 bis 103 von sTNFR-I repräsentieren, dessen Aminosäurereste-Nummerierungsschema in 1 (SEQ ID Nr. 2) bereitgestellt wird, um den Vergleich zu erleichtern; worin R1 eine methionylierte oder nicht-methionylierte Amingruppe einer Aminosäure-Sequenz repräsentiert, die NNSIC umfasst und R3 eine Carboxyl-Gruppe der Aminosäurereste Asn111-Asn161 aus 1 oder eine Carboxy-terminale Trunkierung von Asn111-Asn161 aus 1 repräsentiert.
  14. Ein Polynukleotid, das die Sequenz hat, die in den 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 dargestellt ist.
  15. Ein Vektor, der ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 umfasst, das funktionell mit einer Expressions-Kontroll-Sequenz verbunden ist.
  16. Eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 enthält.
  17. Ein Verfahren, welches das Wachstum von Wirtszellen gemäß Anspruch 16 in einem geeigneten Nährmedium und, optional, das Isolieren des genannten trunkierten sTNFR aus den genannten Zellen oder dem genannten Nährmedium umfasst.
  18. Das Verfahren zur Herstellung des Tumornekrosefaktor-Bindungsproteins gemäß Anspruch 17, worin die genannten Wirtszellen E.coli sind.
  19. Das Verfahren zur Herstellung des Tumornekrosefaktor-Bindungsproteins gemäß Anspruch 17, worin die genannten Wirtszellen Ovarzellen des Chinesischen Hamsters sind.
  20. Ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: (a) Kultivieren einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle gemäß Anspruch 16; (b) Halten der genannten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des trunkierten sTNFR durch die genannte Wirtszelle erlauben; und (c) optional, Isolieren des trunkierten sTNFR, der durch die genannte Wirtszelle exprimiert wird.
  21. Ein Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, das das rekombinante Expressionsprodukt einer prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszelle ist, die ein exogenes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 enthält.
  22. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfasst.
  23. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, das in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Anspruch 17 hergestellt wurde, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfasst.
  24. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein, das in Übereinstimmung mit dem Verfahren gemäß Anspruch 20 hergestellt wurde, in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfasst.
  25. Ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, worin eine therapeutisch wirksame Menge des Tumornekrosefaktor-Bindungsproteins gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Vehikel(n) vermischt wird.
  26. Verwendung des Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung.
  27. Verwendung gemäß Anspruch 26, wobei die TNF-vermittelte Erkrankung Arthritis ist.
  28. Ein Kit zur Herstellung einer wässrigen Protein-Formulierung, die das Tumornekrosefaktor-Bindungsprotein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 umfasst, sowie einen zweiten Container, der ein physiologisch annehmbares Lösungsmittel enthält.
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