DE4219626A1

DE4219626A1 - Methode zur Einschleusung therapeutisch relevanter Gene in Körperzellen

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Publication number: DE4219626A1
Application number: DE19924219626
Authority: DE
Inventors: Peter Wehling
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-06-16
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 1993-12-23

Description

1. Einleitung

Degenerative Erkrankungen des Bewegungsappa rates insbesondere der Wirbelsäule stellen den häufigsten Erkrankungstyp des älteren Menschen dar. Nach Untersuchungen des "National Center for Health Statistics" leiden annähernd 500 von 1000 Personen über 65 Jahren an degenerativen Erkran kungen. Die Zahlen dürften für die Bundesrepublik ähnlich hoch liegen.

Bandscheibe und Wirbelsäulengelenke sind Orga ne, die mit Medikamenten schwierig zu erreichen sind. Intravenöse und orale Verabreichungen von Medikamenten mit potentiell analgetischer und ar throsehemmender Wirkung erreichen nur bedingt den Bandscheibenraum bzw. den Innenraum ar throtisch veränderter kleinen Wirbelgelenke, da die entsprechenden Strukturen verminderten Anschluß an das vaskuläre System haben. Vermindert wer den die Gewebespiegel therapeutischer Substan zen in der Bandscheibe und den kleinen Wirbelge lenke außerdem durch die passive Diffusion von den Kapillaren in die Bandscheibe bzw. den Gelen kinnenraum. Dabei gilt, daß je größer das verab reichte Molekül ist, um so niedriger die Diffusion in diese Zielgebiete ist. Der Zugang von großen thera peutisch wirksamen Molekülen (z. B. Proteinen) in diese Areale ist damit wesentlich erschwert.

Obwohl intraartikuläre und intradiskale Injektionen einen direkten Zugang von Medikamenten ermögli chen und damit die genannten Probleme umgehen, haben therapeutisch interessante Substanzen (z. B. IL-1 Antagonisten) eine kurze Halbwertzeit im Ge webe. Wegen der Chronizität sind viele Injektionen erforderlich. Wiederholte Injektionen bergen das Risiko der bakteriellen Infektion.

Bisher ist es daher üblich, systemisch mit hohen Gewebespiegeln zu therapieren, um so eine effekti ve therapeutische Dosis in der Zielstruktur (Band scheibe u. Wirbelgelenke) zu erlangen. Allgemeine Nebenwirkungen werden damit begünstigt.

Das gleiche gilt auch für die Therapie von Nerven erkrankungen. Bedingt durch die Ausbildung der Bluthirnschranke sind Anwendungen großer therap. Proteine sehr erschwert.

2. Gentherapie bei Wirbelsäulenerkrankungen

Das grundlegende therapeutische Konzept des mo lekularbiologischen Ansatzes des Patentes liegt darin, den Gencode der Chondrozyten, Fibrobla sten und Nervenzellen der Wirbelsäule so zu verän dern, daß diese Zellen Proteine mit therapeutischen Eigenschaften synthetisieren (Beispiel Wirbelgelen ke Abb. 1). Im Falle der Expression der Gene syn thetisieren und sezernieren Chondrozyten, Neuro ne und Fibroblasten antiinflammatorische und anal getische Moleküle in den Bandscheibenraum oder in den Gelenkinnenraum.

Durch diesen Zugang kann das Repertoire der z.Z. therapeutisch genutzten relativ kleinen Moleküle auf neue größere Proteine ausgeweitet werden. Dies wäre von Vorteil, da einige Proteine (z. B. Hemm stoffe der Zytokine) Eigenschaften aufweisen, die sie für die o.g. Erkrankungen favorisieren. Wegen ihrer Größe, schlechten Penetration in die bradytro phen Gewebe und wegen ihrer physiologischen In stabilität wurden bisher solche Substanzen auf ih ren praktischen therapeutischen Nutzen nur wenig untersucht.

Der jetzige wissenschaftliche Stand in der Diskus sion der biochemischen Verursachung degenerati ver Erkrankungen des Bewegungsapparates läßt den Schluß zu, daß Interleukin-1 (IL-1) der ent scheidende Mediator der pathologischen Verände rungen ist (3, 10). IL-1 ruft synoviale Entzündung, Knorpelverlust und Knochenresorption hervor (2, 5, 6, 7). In tierexperimentellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, daß Antikörper gegen IL-1 den Ausprägungsgrad der experimentellen Arthritis we sentlich abschwächen (10). Auch erste klinische Untersuchungen zur Behandlung der Arthrose mit IL-1 Rezeptorantagonisten (IRAP) erscheinen viel versprechend (1, 4). Im Zusammenhang degenera tiver Wirbelsäulenerkrankungen ist das Zusammen spiel der Interleukine mit dem peripheren Nervensy stem von besonderem Interesse (9).

Mit Blick auf diesen Hintergrund wird vom Erfinder vorgeschlagen, ein Gentransfersystem bei degene rativen Wirbelsäulenerkrankungen und degenerati ven Nervenerkrankungen einzuführen,das insbe sondere die Wirkungen von IL-1 mit einem neuarti gen Gentransfersystem anatagonisiert. Dabei konnte entweder das Gen für IRAP oder für einen IL-1 Rezeptor in Fibroblasten, Chondrozyten und Neuronen codiert werden. Mit diesem gentechni schen Transfersystem lassen sich aber auch zu sätzliche oder alternative Gene für andere thera peutische Proteine in die Wirbelgelenke, Nerven oder in den Bandscheibenraum einbringen.

3. Strategien des Gentransfers

2 verschiedene Systeme werden vom Erfinder vor geschlagen(Abb. 2).

Der direkte Zugang wird durch Injektion eines Vektors in die kleinen Wirbelgelenke, in die Band scheibe oder in den peripheren Nerven möglich, der Fibroblasten, Chondrozyten und Nervenzellen in situ überträgt (linke Seite Abb. 2).

Beim indirekten Zugang wird Bandscheibengewe be, Fibroblasten und Chondrozyten der kleinen Wir belgelenke oder Nerv entnommen, diese Zellen in vitro verändert und in das Entnahmegebiet retrans plantiert (rechte Seite Abb. 2).

Mit Hinblick auf die Entwicklung in der Endoskopie erscheint der indirekte Zugang für einen chirur gisch klinischen Einsatz besonders elegant, wäh rend der direkte Zugang technisch einfacher durch zuführen ist und eine allgemeine klinische Anwen dung damit erleichtert wird.

Der direkte Zugang wird aber durch die Unfähigkeit des retroviralen Vektors erschwert, ruhende Zellen in situ zu infizieren, da Retroviren Zellteilung zur In fektion benötigen. Allerdings kann die Zellteilung durch Entzündung, Verletzung oder partielle Gewe beentnahme selbst angeregt werden. Andere Vek toren (z. B. Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren oder Herpesviren) infizieren auch nicht teilende Zel len, so daß diese Vektoren die vorgenannten Pro bleme umgehen könnten.

Beim jetzigen Stand der Entwicklung ist zu erwar ten, daß der indirekte Zugang als effektiver anzuse hen ist, da die Kotransduktion eines selektiven Mar kers eine Identifikation teilender Zellen ermöglicht.

4. Experimente

Nach Entnahme der Fibroblasten, Chondrozyten und Nerven aus den kleinen Wirbelgelenken, der Band scheibe und dem Nervenkanal im Tierexperiment wurden die angelegten Zellkulturen mit einem Re trovirus infiziert (BAG-Virus oder MFGLac-Z Virus) der Marker Gene für B-Galactosidase (lac Z) enthält und gegenüber dem Neomycin Analog (G 418 neo+) resistent ist.

Diese neo-selektierten Zellen (Menge 10⁶) wurden in den ursprünglichen Gewebebereich (Bandschei be, kleine Wirbelgelenke und Nerv) retransplan tiert, um die Persistenz und Expression dieser Ge ne in ihrer natürlichen Umgebung in vivo zu unter suchen.

12 Wochen nach Transplantation (s. Abb. 3 Histolo gie) konnte ein Überleben dieser gentechnisch ver änderten Zellen in ihrer natürlichen Umgebung be obachtet werden, erkennbar an der dunkelblauen Färbung der Zellen. Es zeigte sich außerdem eine regelrechte Kolonisation. Aus dem dann wieder ent nommenen Gewebe konnten diese veränderten Zellen in vitro erneut untersucht werden. Eine Ab stoßungsreaktion zeigte sich nicht. Die Experimente zeigen eindeutig, daß ein Marker-Gen in diese Zel len eingebracht werden kann, das sich in situ expri mieren kann.

Außerdem gelang es bei Fibroblasten, Chondrozyten und Neuronen den Gen-Code für einen Interleukin- 1 Rezeptorantagonisten in einen Retrovirus zu in korporieren. Die Zellen, die mit diesem Virus infi ziert wurden, waren in der Lage, Interleukin-1 Re zeptor Antagonisten zu produzieren.

5. Klinische Perspektive

Durch die gentechnisch mögliche Veränderung der Eigenschaften der Fibroblasten, Nervenzellen und Chondrozyten ergibt sich eine neuartige Strategie in der Behandlung schmerzhafter degenerativer Er krankungen der Bandscheibe (Abb. 5), des Nerven (Abb. 4) und der kleinen Wirbelgelenke (Abb. 5).

Beim jetzigen Stand müssen die beschriebenen Verfahren verfeinert, ausgeweitet und auf ihre Si cherheit in größeren Serien untersucht werden.

Besonders interessant erscheint therapeutisch die Möglichkeit, Gene mit antagonisierender Wirkung von IL-1 zu transduzieren.

Die o.g. gentechnologischen Verfahren in Verbin dung mit Transplantationstechniken aus der Endo skopie (z. B. transarthroskopische Synovektomie und Diskektomie) werden einen innovativen Schub in der Behandlung dieser Erkrankungen erwarten lassen.

Da es sich bei dem Patentgegenstand prinzipiell um eine somatische Gentherapie handelt, ist ein Ver stoß gegen ethische Normen nicht gegeben.

Abb. 1 Das grundlegende therapeutische Konzept des molekularbiologischen Ansatzes liegt darin, den Gencode der Chondrozyten und der Fibroblasten der kleinen Wirbelgelenke und der Bandscheibe so zu verändern, daß diese Zellen Proteine mit therapeutischen Eigenschaften synthetisieren. Im Falle der Expression der Gene synthetisieren und sezernieren Chondrozyten und Fi broblasten (wie hier dargestellt) antiinflammatorische und analgetische Mole küle in den Gelenkinnenraum.

Abb. 2 direkter und indirekter Zugang am Beispiel der kleinen Wirbelgelenke.

Der direkte Zugang wird durch Injektion eines Vektors in die kleinen Wirbelgelenke, in die Bandscheibe oder in den peripheren Nerven möglich, der Fibroblasten, Chondrozyten und Nervenzellen in situ überträgt (linke Seite Abb. 2).

Beim indirekten Zugang wird Bandscheibengewebe, Fibroblasten und Chondrozyten der kleinen Wirbelgelenke oder Nerv entnommen, diese Zellen in vitro verändert und in das Entnahmegebiet retransplantiert (rechte Seite Abb. 2).

Abb. 3 (Histologie): Histologische Darstellung von Fibroblasten der Bandscheibe des Kaninchen nach Transplantation gentechnisch veränderter Zellen. Die dunkel gefärb ten Gewebeanteile entsprechen Fibroblasten, die zuvor außerhalb des Kniegelenkes gentechnisch verändert und retransplantiert wurden.

12 Wochen nach Transplantation (s. Abb. 3 Histologie) konnte ein Überleben dieser gentechnisch veränderten Zellen in ihrer natürlichen Umgebung beobachtet werden, erkennbar an der dunkelblauen Färbung der Zellen. Es zeigte sich außerdem eine re gelrechte Kolonisation. Aus dem dann wieder entnommenen Gewebe konnten diese veränderten Zellen in vitro erneut untersucht werden. Eine Abstoßungsreaktion zeigte sich nicht. Die Experimente zeigen eindeutig, daß ein Marker-Gen in diese Zellen ein gebracht werden kann, das sich in situ exprimieren kann.

Abb. 4 Nerv: Anwendung der Erfindung bei Erkrankungen des Nerven. Therapeutische Gene werden in Makrophagen oder in Fibroblasten eingebracht, die dann therapeutische Proteine exprimieren.

Abb. 5 Wirbelsäule: Bildliche Darstellung der Anwendung der Erfin dung, Möglichkeiten des Gentransfers an der Wirbelsäule (s. Text).

Literaturverzeichnis Gentherapie

1. Carter DB et al. (1990)
Purification, cloning, expression and biological characterization of an interleukin-1 receptor antagonist protein. Nature 344, 633-638
2. Dingle JT, Saklatvala J, Hembry R, Tyler J, Fell HB, Jubb R (1979)
A cartilage catabolic factor from synovium. Biochem. J. 184, 177-180
3. Firestein GS, Alvaro-Garcis JM, Maki R (1990)
Quantitative analysis of cytokine gene expression in rheumatoid arthritis. J. Immunol. 144, 3347-3353
4. Hannum CH et al (1990)
Interleukin-1 receptor antagonist activity of a human interleukin-1 inhibitor. Nature 343, 336-340
5. Hubbard JR, Steinberg JJ, Bednar MS, Sledge CB (1988)
Effect of purified human interleukin-1 on cartilage degradation. J. Orthop. Res. 6, 180-187
6. Pettipher ER, Higgs GA, Henderson B (1986)
Interleukin-1 induces leukocyte infiltration and cartilage proteoglycan degradation in the synovial joint. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8749-8753
7. Stashenko P, Dewhirst FE, Peros WJ, Kent RL, Ago JM (1987)
Synergistic interactions between interleukin-1, tumor necrosis factor, and lymphotoxin in bone resorption. J. Immunol. 138, 1464-1468
8. Van den Berg WB, Van de Loo FAJ, Otterness I, Arntz O, Jooster LAB (1991)
In vivo evidence for a key role of IL-1 in cartilage destruction in experimental arthritis. In Drugs in Inflammation. M. J. Parnham et al., eds. (Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz) 159-164
9. Wehling P, Bandara G, Evans CH (1989)
Synovial cytokines impair the function of the sciatic nerve in rats: a possible element in the pathophysiology of radicular syndromes. Neuro Ortop. 7, 55-59
10. Wood DD, Ihrie EJ, Hamerman D (1985)
Release of Interleukin-1 from human synovial tissue in vitro. Arthritis Rheum. 28, 853-862

Claims

1. Methode eines Gentransfersystems zur Einschleusung therapeutischer Gene mit tels Vektoren in Körperzellen und anschließender davon abhängiger Expression thera peutischer Proteine und Sekretion dieser therapeutischen Proteine in den extrazellulä ren Bereich durch die gentechnisch veränderten Körperzellen.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnete daß die Körperzellen Nerven zellen, immunkompetente Zellen, mesenchymale oder ektodermale Zellen sind.

3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Körperzellen periphere Nervenzellen, Makrophagen, Lymphozyten, Fibroblasten, Chondrozyten sind.

4. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die exprimierten the rapeutischen Proteine entzündungshemmende, schmerzstillende, regenerierende, im munsteigernde, hypotensive, antidegenerative und antiarthrotische Eigenschaften aufweisen.

5. Methode nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die exprimierten the rapeutischen Proteine zur Gruppe der Zytokine, seiner Inhibitoren, zur Gruppe der Opiate, zur Gruppe der Prostaglandine und deren Hemmstoffe gehören.

6. Methode nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die exprimierten the rapeutischen Proteine zur Gruppe der Interleukininhibitoren gehören.

7. Methode nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die exprimierten the rapeutischen Proteine zur Gruppe der Interleukin-1 Inhibitoren gehören.

8. Methode nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene durch einen Vektor in vivo direkt in das Zellgebiet eingebracht werden, und das der Vektor zur Gruppe der Retroviren, Adenoviren, Adeno-assoziierte Viren, Herpesviren oder Lipo somen gehört.

9. Methode nach Anspruch 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß die zu verändernden Zellen aus dem Körper transplantiert werden, die teilungsfähigen Körperzellen in vitro selektioniert werden, die Gene durch einen Vektor in vitro direkt in die Zellen einge bracht werden, und daß der Vektor aus der Gruppe der Retroviren, Adenoviren, Ade no-assoziierte Viren, Herpesviren oder Liposomen gehört , und daß diese gentech nisch veränderten Zellen in den Körper retransplantiert werden und therapeutische Proteine exprimieren und in den extrazellulären Bereich sezernieren.

10. Methode nach Anspruch 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß insbesondere degene rative Erkrankungen der Wirbelsäule und der Nerven Gegenstand der erfundenen Methode sind.