DE10213780A1

DE10213780A1 - Verfahren und Mittel zur Herstellung therapeutisch interessanter Blutzusammensetzungen

Info

Publication number: DE10213780A1
Application number: DE10213780A
Authority: DE
Inventors: Hans Meijer; Julio Reinecke; Peter Wehling
Original assignee: Orthogen AG
Current assignee: Orthogen AG
Priority date: 2002-03-22
Filing date: 2002-03-22
Publication date: 2003-11-27
Also published as: WO2003080122A1; AU2003233947A1; EP1490112A1; JP2005529857A

Abstract

Die Produktion von eukaryontischen, rekombinanten Proteinen ist aufwendig und teuer, die korrekte Prozessierung der Proteine ist problematisch und es ist unmöglich, diese Proteine ohne Verunreinigungen herzustellen. DOLLAR A Dieses technische Problem wird durch die transiente, genetische Transformation Blutzellen, die direkt anschließende Kultivierung dieser Zellen im Serum und die Applikation von dem Protein im Serum ohne Aufreinigung gelöst: die Benutzung von Blut als Rohstoff und Produktionssystem und die Applikation des produzierten Proteins im Serum ist einfach und kostengünstig, die eukaryontischen Zellen prozessieren die Proteine korrekt, und in dem auto- oder homologen Produktionssystem treten keine Verunreinigungen auf. DOLLAR A Wenn für die Transformation ein Effektor-Protein genutzt wird, das heißt ein Protein, das die Produktion jeglicher Proteine anregt, kann sogar die Produktion mehrerer autologer Proteine möglicherweise in einem natürlichen Verhältnis erreicht werden. Beispiele für solche Effektor-Molekülen sind ein Transkriptionsfaktor, ein Protein, das Teil der Signal-Transduktionskette ist oder extrazelluläre Signalmolekülen, wie z. B. Zytokinen. Da viele Erkrankungen multifaktorielle Ursachen haben, ist die Produktion von mehreren Proteinen in einem physiologischen Verhältnis für die Anwendung von Proteinen als Arzneimittel sehr wünschenswert. DOLLAR A Ein besonderes Problem bei der beschriebenen Erfindung ist die niedrige Transfektionsrate der nuklearen Blutzellen und ...

Description

Die Produktion von eukaryontischen, rekombinanten Proteine ist aufwendig und teuer, die korrekte Prozessierung der Proteine ist problematisch und es ist unmöglich, diese Proteine ohne Verunreinigungen herzustellen.
Dieses technische Problem wird durch die transiente, genetische Transformation Blutzellen, die direkt anschliessende Kultivierung dieser Zellen im Serum und die Applikation von dem Protein im Serum ohne Aufreinigung gelöst: die Benutzung von Blut als Rohstoff und Produktionssystem und die Applikation des produzierten Proteins im Serum ist einfach und kostengünstig, die eukaryontischen Zellen prozessieren die Proteine korrekt und in dem auto- oder homologen Produktionssystem treten keine Verunreinigungen auf.
Wenn für die Transformation ein Effektor-Protein genutzt wird, das heißt ein Protein, das die Produktion jeglicher Proteine anregt, kann sogar die Produktion mehrerer autologer Proteine möglicherweise in einem natürlichen Verhältnis erreicht werden. Beispiele für solche Effektor-Molekulen sind ein Transkriptionsfaktor, ein Protein, das Teil der Signal-Transduktionskette ist oder extrazelluläre Signalmolekulen wie z. B. Zytokinen. Da viele Erkrankungen multifaktoriellen Ursachen haben, ist die Produktion von mehreren Proteinen in einem physiologischen Verhältnis für die Anwendung von Proteinen als Arzneimittel sehr wünschenswert.
Ein besonderes Problem bei der beschriebenen Erfindung ist die niedrige Transfektionsrate der nukleären Blutzellen und die Entfernung der DNA aus dem Serum bzw. Medium. Dieses Problem wird gelöst durch die Bindung der DNA an Trägern und/oder die Markierung der DNA. Die Träger führen abhängig von Ihren Größen zu Adherenz oder Fagozytosis. Im Falle von Adherenz binden Blutzellen an der Trägeroberfläche und nehmen die an der Trägeroberfläche gekoppelte DNA auf. Im Falle von Fagozytosis nehmen die Zellen die Träger auf, die an der Trägeroberfläche gekoppelte DNA wird freigesetzt und von der Zelle direkt aufgenommen. Da nur nukleären Blutzellen adherieren oder fagozytieren können, werden diese somit selektiert.

Ausführungsformen

Verfahren

1. Blut nach Entnahme direkt in Spritze transformieren und im Serum inkubieren
2. Blut nach Entnahme mittels einer Spritze überfüllen in anderes Gefäß (Reservoir, Beutel) dann transformieren und im Serum inkubieren
3. Blutentnahme, Blutzellen (insbesondere nukleäre Zellen) von anderen Blutkomponenten trennen, diese Zellen transformieren und dann in Medium mit oder ohne Serum, alternativ in reinem Serum inkubieren

Transformation

1. DNA auf festen Träger (große Kugel: Benutzung Adherenz, kleine Kugel: Fagozytosis. Glas, magnetic Beads, Spritzenwand) Vorteil Aktivierung Blutzellen
2. Reine DNA (ggf. markiert mit z. B. Biotin)
- 1. ohne Zusatz
- 2. mit einem Zusatz, der die Transfektion und Expression des Transgens erhöht (z. B. Liposomen, Bindungspeptid etc.) Der Zusatz kann genutzt werden um
  - a) spezifische Zelltypen zu transformieren
  - b) die Aufnahme der DNA zu erhöhen
  - c) der nukleäre Transport der DNA zu optimieren
  - d) der Transkription zu erhöhen
  - e) eine Kombination dieser Faktoren
3. Elektroporation. Bei Applikation spezifischer elektrischer Felder werden nur Zellen ab einem bestimmten Größe transfiziert. Mit Hilfe dieser Technik können nukleäre Zellen transformiert werden.

Entfernung DNA

Nach der Inkubation sind abhängig von der Ausführungsform folgende Aufreinigungen möglich:

1. DNA gekoppelt an Träger
Nach der Inkubation wird das Serum zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wird das Serum, das die gewünschten Proteinen enthält entnommen und filtriert um die letzten Träger- und Zell resten zu entfernen.
2. Markierte DNA
Nach der Inkubation werden dem Serum Träger hinzugefügt, die eine Affinität für die markiert DNA besitzen (z. B. Biotin markierte DNA an Streptavidin gecoatede Träger binden). Die Träger können dann mittels Zentrifugation oder Magnetismus entfernt werden.
Alternativ kann das Serum mittels einem Filter, das eine Affinität für die DNA hast, gereinigt werden (z. B. Biotin markierte DNA an einem Streptavidin Filter binden). Somit werden in einem Schritt Zellresten und DNA entfernt.

Beispiel 1

Herstellung und Verwendung einer Glasspritze mit Granulat

Die Fig. 1 zeigt eine 50 ml Spritze 1 aus Glas (Fortuna Optima, Best. Nr. 7.102.-44, wenn im folgenden nichts anderes angegeben, wurde diese Spritze in allen Beispielen eingesetzt) mit einem Kolben oder Stempel 3, einem abschraubbaren Verschluß 5 mit einem Verschlußansatz 13 (male Luer) und einer auf dem Verschlußansatz 13 angeordneten und diesen abschließenden abnehmbaren Kappe 7 mit Septum. Der Stempel 3 weist eine Sollbruchstelle 15 auf. So ist es möglich, nach Abbrechen des Stempels die Spritze direkt zu zentrifugieren. Dargestellt ist auch Granulat 9 aus Glas (Glasperlen der Firma Roth, Art. Nr. A 557.1). Die Größe der Granulatpartikel 9 liegt zwischen 1 und 3 mm Durchmesser, wobei jedoch auch kleinere Partikel, insbesondere größer als 100 µm, eingesetzt werden können, z. B. Glasmehl. Selbstverständlich können auch Spritzen, z. B. aus Glas oder Kunststoff, eingesetzt werden, die keine Sollbruchstelle im Stempel aufweisen.
Zur Herstellung der Spritze 1 wird die Oberfläche der inneren Struktur der fabrikneuen und originalverpackten Spritze 1 und des fabrikneuen und originalverpackten Granulats 9 modifiziert mit Hilfe eines handelsüblichen Chromschwefelsäure-Präparat, indem das Chromschwefelsäure-Präparat in die Spritze aufgenommen wird und die Spritzeninnenwand, das heißt Zylinderinnenwand und Kolben, sowie das Granulat damit geätzt werden. Die Spritze wird durch ein- bis zehnmaliges, vorzugsweise dreimaliges, vollständiges Aufziehen und Ausspritzen von 50%iger Chromschwefelsäure (Merck, Darmstadt, Best. Nr. 1.02499.2500, Chromschwefelsäure wird mit Biochrom Reinstwasser Ultra Pure Water No. L 0040 bis zur gewünschten Verdünnung verdünnt) behandelt und dabei gesäubert beziehungsweise modifiziert. Nach dem letzten Aufziehen wird die Spritze unten abgedichtet und in gefülltem Zustand 5 bis 30 min mit der Chromschwefelsäure inkubiert. Anschliessend wird der Spritzenkolben entfernt und zwei- bis zehnmal, vorzugsweise viermal, durch vollständiges Auffüllen und Ablaufenlassen des Spritzenzylinders mit frischem Reinstwasser durchgewaschen, wobei darauf zu achten ist, daß das Waschwasser vollständig ein- und ausgefüllt wird. Sodann wird der Spritzenkolben in 50%ige Chromschwefelsäure getaucht und gründlich mit destilliertem Wasser abgewaschen.
Eventuell in der Spritze vorhandene Wasserreste werden durch Betupfen des Lueranschlusses kapillar abgesaugt, um ein schnelles Trocknen der Spritze zu gewährleisten. Voneinander getrennte Kolben und Spritzen inklusive der eventuell darin enthaltenen Glasperlen werden in Melag-Folie mit Indikatorfeld (Melag, Melafol 1502) eingeschweißt (Melag, Melaseal). Die so verpackten Spritzen werden im Trockenschrank (Melag-Trockensterilisator) bei 80°C für mindestens 60 min getrocknet. Die getrockneten verpackten Spritzen werden anschliessend bei 132°C 30 min bei 2 bar autoklaviert (Wolf Autoclav HRM 242 II) und bei 80°C für mindestens 60 min ein weiteres Mal getrocknet.
Vor der Blutentnahme (siehe unten) wird Heparin (Liquemin N 2500, Heparin-Natrium 2500 I.E.) oder Citrat (ACDA) in die Spritze eingebracht, um eine Koagulation des später aufgenommenen Blutes zu verhindern. Der Einsatz von Coagulantien kann sich als vorteilhaft bei der Aufarbeitung von IL-1Ra- haltigem Serum erweisen.
Die Spritze 1 wird eingesetzt, indem Blut eines Patienten mit Hilfe eines nicht dargestellten Adapters entnommen wird, der die abschraubbare Kappe 7 mittels eines nicht dargestellten Schlauches mit einer nicht dargestellten Kanüle verbindet. Der Adapter weist eine Nadel auf, mittels derer das im Verschlußansatz 13 vorhandene Septum durchstochen wird. Anschliessend wird der Adapter abgenommen und eine Inkubation des Vollblutes bei 37°C für 24 Stunden unter dem Schutz der abnehmbaren Kappe 7, deren Septum sich selbsttätig geschlossen hat, durchgeführt. Die Inkubation kann stehend oder liegend erfolgen. Erfolgt die Inkubation stehend, wird das Plasma durch das Septum und einen sterilen Vorsatzfilter (0,2 µm) abgenommen. Zusätzlich oder alternativ kann eine Zentrifugation vorgesehen werden. Erfolgt die Inkubation liegend, wird das Blut zentrifugiert und das Plasma durch einen sterilen Vorsatzfilter (0,2 µm) abgenommen. Es kann aber auch vorgesehen sein, das Plasma durch das Septum abzunehmen ohne eine Zentrifugation durchzuführen. Anschliessend wird das Plasma zum Beispiel an einer Nervenwurzel oder einem Gelenk des Patienten reinjiziert.

Beispiel 2

Herstellung und Verwendung einer Kunststoff-Spritze mit Granulat für die Bluttransformation

In diesem Beispiel wird steriles Granulat aus Glas eingesetzt. Die Oberfläche des Granulats wird mit Hilfe eines handelsüblichen Chromschwefelsäure-Präparat im Batch-Verfahren, wie im Beispiel 1 ausgeführt, modifiziert. Anschliessend wird das Granulat mit Wasser gespült, um die Chromschwefelsäure-Reste wegzuwaschen. Dann wird das Granulat bei 121°C unter einem Druck von 2 bar mindestens 20 min inkubiert, um so das Granulat zu sterilisieren und mit Wasser zu sättigen. Das Granulat wird anschliessend getrocknet bei 80°C für 20 min.
Das Granulat wird mehrmals mit einer Salzlösung gewaschen und für mindestens 2 Stunden in einer Plasmid- Salzlösung inkubiert. Dieses Plasmid enthält mindestens eine Sequenz die für eine Protein codiert ("coding region") sowie ein Steuer-Einheit ("promoter"), die in eukaryontische Zellen wirksam ist, wie z. B. das pcDNA1-IL-1Ra Plasmid. Entscheidend für eine hohe Proteinproduktion ist die Pyrogenfreiheit der verwendeten DNA. Die Kugel werden nach der Inkubation gewaschen und mit EtOH oder Gas sterilisiert.
Eine herkömmliche, nicht modifizierte, fabrikneue und originalverpackte Polypropylenspritze (50 ml, Becton Dickinson, Heidelberg, Art. Nr 00137) wird mit dem modifizierten und sterilisierten Granulat (1, 2, 4 oder 10 cm³) sowie mit einer hinreichenden Menge eines Antikoagulans wie Heparin (Liquemin, Heparin-Natrium 2500 I.E.) oder Citrat (zum Beispiel ACDA) befüllt. Die befüllte Spritze wird inklusive Abnahmekanüle und Schlauch verpackt und anschliessend Gamma- oder Elektronen-sterilisiert.
Der Anwender entnimmt das sterile Besteck und entnimmt dem Patienten Blut. Die Spritze verfügt an ihrer Öffnung in dem Verschlußansatz über ein Septum, welches zur Entnahme durch das Abnahmezubehör, also die Nadel des Adapters, durchstochen wird. Nach Abnahme des Adapters verschließt sich das Septum selbsttätig wieder. Nach Blutentnahme wird der Spritzenstempel an einer Sollbruchstelle abgebrochen. Die Spritze mit Blut wird 24 Stunden bei 37°C bis 41°C inkubiert. Die Inkubation erfolgt liegend, das Blut wird umgefüllt und zentrifugiert nach der Zentrifugation wird das Plasma durch einen sterilen Vorsatzfilter, zum Beispiel 0,2 µm, abgenommen. Die Reinjektion des Plasma erfolgt zum Beispiel an einer Nervenwurzel, ins Gelenk oder in die Bandscheibe.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer induzierten Blutzusammensetzung aus Blut, wobei im Blut enthaltende Blutzellen transient oder stabil mit mindestens einem Nucleinsäuremolekül transformiert werden, vorzugsweise mit einem Nucleinsäuremolekül, welches mindestens ein therapeutisch interessantes Protein oder ein Effektorprotein codiert und eine induzierte Blutzusammensetzung erhalten wird, deren Blutzellen transient oder stabil das therapeutisch interessante Protein und/oder das Effektorprotein exprimieren und gegebenenfalls sezernieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die induzierte Blutzusammensetzung eine Blutzusammensetzung ist, die mindestens ein therapeutisch interessantes Protein in höherer Konzentration als eine nicht transformierte Blutzusammensetzung enthält, zum Beispiel Cytokine, wie natürliches oder abgewandeltes IL-1Ra (IRAP) (Interleukin 1 Rezeptorantagonist).

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die induzierte Blutzusammensetzung eine Blutzusammensetzung ist, in deren Blutzellen ein Effektorprotein exprimiert wird, welches in nicht transformierten Blutzellen gar nicht oder nicht in dieser Menge exprimiert wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Blut einem Patienten mit einer Spritze entnommen und das Blut mit dem mindestens einen Nucleinsäuremolekül in der Spritze transformiert wird, ohne vorher die zu transformierenden Blutzellen von anderen Blutkomponenten abzutrennen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Blut einem Patienten mit einer Spritze entnommen, in ein anderes Gefäß gefüllt und in diesem Gefäß transformiert wird, ohne vorher die zu transformierenden Blutzellen von anderen Blutkomponenten abzutrennen.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Blut einem Patienten entnommen, Blutzellen, insbesondere nucleäre Zellen, von anderen Blutkomponenten getrennt, die Blutzellen transformiert und in Medium mit oder ohne Serum oder in reinem Serum inkubiert wird.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül, insbesondere DNA oder RNA, immobilisiert auf festen Trägern, zum Beispiel großen oder kleinen Kugeln, beispielsweise aus Glas, oder magnetischen Kügelchen oder der Wand der Spritze, zur Transformation verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül, insbesondere DNA oder RNA, gegebenenfalls markiert mit einer Markersubstanz, zur Transformation verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül, insbesondere die DNA oder RNA, zusammen mit einem Zusatz, der die Transfektion und/oder Expression des Nucleinsäuremoleküls erhöht, transformiert wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül durch Elektroporation transformiert wird.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüceh, wobei das Nucleinsäuremolekül ein die Expression körpereigener Proteine induzierendes, reprimierendes oder regulierendes Nucleinsäuremolekül ist, zum Beispiel ein Antisensekonstrukt, RNA- Element oder ein transposables Element.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül in einem Vektor enthalten ist, zum Beispiel einem Plasmid.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell verbunden zu mindestens einem regulatorischen Element, zum Beispiel einem Promotor, Enhancer oder Intron, vorliegt, insbesondere einem blutzellspezifischen regulatorischen Element.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Nucleinsäuremolekül funktionell verbunden zu einem ein Signalpeptid für die Proteinsezernierung aus der Zelle codierenden Nucleotidabschnitt vorliegt.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei nach der Transformation, Expression und Sezernierung des codierten therapeutisch interessanten Proteins aus den transformierten Zellen in das Serum die Zellen vom Serum abgetrennt werden und ein induziertes Serum erhalten wird.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Nucleinsäuremolekül mit Hilfe von Liposomen, viralen Vektoren oder, gegebenenfalls säurelabil, gebunden an Mikroglaskügelchen transformiert wird.

17. Verfahren zur Transformation von Zellen, insbesondere im Blut vorhandenen Zellen, zum Beispiel Blutzellen, mit Nucleinsäuremolekülen, wobei die Zellen oder Blutzellen mit den Nucleinsäuremolekülen in Kontakt gebracht, die Zellen oder die im Blut vorhandenen Blutzellen transformiert und stabil oder transient transformierte Zellen oder Blutzellen erhalten werden.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Nucleinsäuremoleküle vor der Transformation säurelabil an Mikroglaskügelchen gebunden werden.

19. Verfahren zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei dem menschlichen oder tierischen Körper Blut, vorzugsweise mittels einer Spritze, entnommen, ein Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche durchgeführt und die induzierte Blutzusammensetzung dem menschlichen oder tierischen Körper wieder reappliziert wird, gegebenenfalls allein das Blutserum nach Abtrennung von den transformierten Blutzellen.

20. Verwendung von Mikroglaskügelchen, insbesondere säurelabil gebundene Nucleinsäuren aufweisende Mikroglaskügelchen, für die Transformation von Vollblut, insbesondere nucleären Zellen im Vollblut, insbesondere für die Expression und Sezernierung von Proteinen in Blut, insbesondere Blutzellen.

21. Verwendung von Mikroglaskügelchen, insbesondere säurelabil gebundene Nucleinsäuren aufweisende Mikroglaskügelchen, für die Transformation von biologischen Zellen, insbesondere tierischen, pflanzlichen oder humanen Zellen.

22. Verwendung von Blut, insbesondere Vollblut, für die Transformation von Nucleinsäuremolekülen, codierend therapeutisch interessante Proteine oder Effektorproteine, in die Blutzellen des Blutes, insbesondere für die Gentherapie und/oder die Behandlung von Leukämie, für die Behandlung von traumatischen, degenerativen, chronisch inflammatorischen Erkrankungen des Nervensystems, des Bewegungsapparates oder verschiedener innerer Organe.

23. Verwendung von Blut für die Herstellung eines Arzneimittelkits für gentherapeutische Zwecke und/oder die Behandlung von Leukämie, für die Behandlung von traumatischen, degenerativen, chronisch inflammatorischen Erkrankungen des Nervensystems, des Bewegungsapparates oder verschiedener innerer Organe.

24. Verwendung von Nucleotidmolekülen, insbesondere codierend für therapeutisch interessante Proteine oder Effektorproteine, für die Transformation von Blut und die Expression und gegebenenfalls Sezernierung des therapeutisch interessanten Proteins beziehungsweise Effektorproteins, zum Beispiel für die Leukämiebehandlung, für die Behandlung von traumatischen, degenerativen, chronisch inflammatorischen Erkrankungen des Nervensystems, des Bewegungsapparates oder verschiedener innerer Organe.

25. Verwendung von Nucleotidmolekülen, insbesondere codierend für therapeutisch interessante Proteine oder Effektorproteine, für die Herstellung eines Arzneimittelkits, für die Transformation von Blut und die Expression und gegebenenfalls Sezernierung des therapeutisch interessanten Proteins beziehungsweise Effektorproteins, zum Beispiel für die Behandlung von traumatischen, degenerativen, chronisch inflammatorischen Erkrankungen des Nervensystems, des Bewegungsapparates oder verschiedener innerer Organe.