DE1907014A1 - Verfahren zur Trennung von Blutkomponenten,insbesondere von immunologisch aktiven Globulinen,von anderen Komponenten - Google Patents

Verfahren zur Trennung von Blutkomponenten,insbesondere von immunologisch aktiven Globulinen,von anderen Komponenten

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DE1907014A1 DE19691907014 DE1907014A DE1907014A1 DE 1907014 A1 DE1907014 A1 DE 1907014A1 DE 19691907014 DE19691907014 DE 19691907014 DE 1907014 A DE1907014 A DE 1907014A DE 1907014 A1 DE1907014 A1 DE 1907014A1
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Description

: 190701A
DR. ALFRED RIEDEL
Patentanwalt - 8 MÜNCHEN 22
j Thiersdistr. 8/IV :
!Telefon: (0811) 226913
H 105
Wolfgang Haller, Washington / USA
Verfahren aur Trennung von Blutkomponenten, insbesondere von immunologisch aktiven Globulinen, von anderen
- Komponenten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung von Blutkomponenten, insbesondere von immunologisch aktiven Globuli» nen, von anderen Komponenten mit Hilfe der sogenannten ste° rischen Chromatographie, bei dem das zu trennende Plasma oder Serum in ursprünglicher oder bereits grob vorfraktionierter Form in eine mit einer porösen Hilfssubstanz gefüllte Chro~ matographiesäule eingebracht und mit einem wäßrigen Lösungsmittel elüiert sowie das aus der Chromatographiesäule austretende Eluat fraktionsweise gesammelt wird, worauf die einzelnen Fraktionen gegebenenfalls konzentriert und/oder noch weiter gereinigt werden,
Serumproteine mit immunologischer Aktivität, nämlich die so«= genannten Immunoglobuline, sind bekanntlich die wichtigsten natürlichen Abwehrstoffe des tierischen und menschlichen
Körpers gegen Mikroben und schädliche Zellen, z.B. Bakte=*
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rien und Vireru Derartige Immunoglobuline sind daher in der Medizin von besonderer Bedeutung, da sie bei verschiedenen Indikationen therapeutische Verwendung finden können, seB„ bei der Behandlung und Prophylaxe virulenter Infektionskrankheiten, bei konstitutionellem Fehlen von Iraraunoglobülinen sowie bei vorübergehendem Fehlen von Immunoglobuline»α Vorübergehendes Fehlen bestimmter Immunoglobuline ist zaB<, bei Neugeborenen normal, da die Plazenta der Mutter nur für die niedermolekularen Immunoglobuline, nicht jedoch für die höhermolekularen Immunoglobuline durchlässig isto Ba die von der Plazenta zurückgehaltenen Immunoglobuline insbesondere für die Abwehr bakterieller Infektionen verantwortlich, sind, erklärt öjren Fehlen die hohe Anfälligkeit ύοώ. Sengeborenen für bakterielle Infektionen,= Solche Infektionen werden Z0B0 von im Darm der Mutter vorliegenden Erregern der ubiquitären Coli-Grupgs hervorgerufen und sind heute die Hauptursache der Säuglingssterblichkeit in den Kulturland erno
Verfahi-en zur Anreicherung sowie zur medizinischen Applikation von Immunoglobulinen sind bereits bekannte So können z.B0 dein gefährdeten Patienten die Immunoglobuline dureh Transfusion von Blut von Spendern oder durch Injektion tos Blutserum zugeführt v/erden« Nachteilig ist jedoch, dass zur erfolgreichen Durchführung dieser bekannten Verfahren der Kreislauf des Patienten durch die zahlreichen, mit den Blut oder Serum zugeführten, immunologisch unwirksamen Proteine sowie durch das hohe Infusionsvolumen gefährdet v/ircL
Um dem abzuhelfen, wurde bereits versucht* Blutserum aufs«- trennen, Z0B0 mit Hilfe der als sogenannte Cohn-Fraktioiiierung bekannten Fällungsmethode (vgl. J0Am0Chem0Soc0 68 (1946)s So 459), um auf diese V/eise die wirksamen Bestandteile ansurel· ehern,, Diese bekannte Methode kann zwar in vergleichsweise grossem Maßstabe durchgeführt werden, hat jedoch äem Nachteil-■ dass sie zu
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einem grossen Aktiv!tätsverlust, insbesondere bei den sogenannten H-Immunoglobulinen, führt. Die auf diese Weise gewonnenen« handelsüblichen Präparate sind daher, in der Regel «war gegen gewisse Virusinfektionen, nicht jedoch gegen bakterielle Infektionen wirksam.
Es sind ferner bereits relativ schonende Verfahren zur Trennung Ton Serurabestandteilen bekannt· So wird e.B. in der deutschen Patentschrift 1 172 648 sowie der UiU-Patentsohrift 3 125 500 eine sogenannte tragerfreie Elektrophoreseapparatur beschrieben, mit deren Hilfe eine kontinuierliche elektrophoretische Fraktionierung von Serum möglich ist. Die Durohsatzraenge und -geschwindigkeit des Serums ist jedoch bei Verwendung derartiger Elektrophoreseapparaturen insofern beschränkt« als die bei der elektrophoretischen Trennung freiwerdenden beträchtlichen Wärmenengen in zufriedenstellender Weise abgeführt werden mtieeen.
Eb let ferner bekannt, Serumproteine mit Hilfe der sogenannten steriechen Chromatogrphie, die auch unter der Bezeichnung "Gelfiltration","Gelchromatographie", "Exclusion Chromatography·1 oder "Gel Permeation Chromatography" bekannt ist, au trennen. Diese bekannte Trennmethode beruht auf der Verwendung einer porösen Hilfesubetanz, deren Porengrösee so beneesen 1st, dass die zu trennenden KolekUle mit verschiedener Geschwindigkeit in die Poren diffundieren bzw. von der Diffusion in die Poren ausgeschlossen v.-erden. Zur Durchführung dieses bekannten Verfahrens bedient rian sich einer ähnlichen apparativen Vorrichtung, wie sie auch in der klassischen adsorptlven Chromatographie verwendet wird, obwohl der Trennmechanisraus der sterischen Chromatographie von demjenigen der Aösorptionschromatographie vollkommen verschieden ist. Als poröee Hilfesubstanzen werden in der Regel vernetzte Dextrene und Polyacrylanidgele verwendet. "Gele" dieses Typs, wie sie z.B.v unter der Bezeichnung
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"Sephadex" bekannt sind, eignen sich zwar zur laboratorium«- massigen fraktionierung von Serumproteinen, sind Jedoch zur kontinuierlichen Serumtrennung in grösserem Maßstabe ungeeignet, insbesondere, wenn die getrennten, biologisch aktiven Proteine medizinische Verwendung finden sollen.
So ist z.B. von Nachteil, dass die Steuerung der Porengrösse der Trenneubstanzen durch Einstellen der Konzentration der bei der Gelherstellung verwendeten Monomeren und Vernetzer erfolgt, weshalb sich Porengrösae und Porenvolumen zwangeläufig entsprechen· "Gele" rait groseen Poren, wie sie zur
" Trennung von höhermolekularen Verbindungen, z.B. der Immunoglobuline notwendig sind, haben demnach ein hohes Porenvolumen und sind deshalb mechanisch nur wenig stabil. Aus derartigen "Gelen" hergestellte Körper deformieren sich daher unter dem Gev;icht des Hilfssubetanzbettes sowie unter dem hydraulischen Druck des Elutionsmittels, weshalb nur Chromatographiesäulen von beschränkter Länge verwendbar und die Durohflu@8geschwindigkeit für das Klutionaraittel unbefriedigend langsam aowit schwer steuerbar 1st, was die grosstechnisohe Durchführung dieser bekannten Verfahren stark erschwert, wenn nicht gar verhindert. Ein weiterer Nachteil von "Gelen" ist deren Hitzeempfindlichkeit, die eine in ein-
. fächer Weis· durchzuführende Hitzesterilisation unmöglich nacht. Da aber die Sterilität der Trennsubstanzen eine Grundvoraussetzung für deren Verwendbarkeit zur Herstellung von für die Infusion bestimmten Präparaten ist, müssen die bekannten "Gele" durch eine umständlich durchzuführende chemische Sterilisation sterilisiert werden«, Nachteilig ist ferner, dass "Gele" nur beschränkt haltbar, durch Mikroorganismen, 2.Bo Pilze, angreifbar sowie unter Abspaltung organischer Stoffe spaltbar sind. Verunreinigte "Gele" müssen in der Regel verworfen werden, da deren Reinigung mit Hilfe drastischer Reinigungsmittel, z,B. durch starke Säuren, Basen oder Oxydationsmittel, ohne völlige Zerstörung
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der organischen Struktur unmöglich ist. Schlieaelich weisen Gele den entscheidenden Nachteil einer weit streuenden Porenverteilung auf, welche zu breiten Elutionespektren und nur geringer Auflösung führte Pur präparative Trennungen in groesem Maßstab ist jedoch eine hohe Auflösung der zn trennenden Stoffe in bezüglich Molekulargewicht und Molekülform genau kontrollierbare Bereiche vorteilhaft.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein einfach und rasch durchzuführendes Verfahren anzugeben, nach dem Blutkomponenten, insbesondere die antibakteriell wirksamen, hochempfindlichen Immunoglobuline M (19s), von anderen Komponenten, bei hohen, auch über lange Zeiten konstanten Durchsatzgeschwindigkeiten unter sterilen Bedingungen sowie unter Erhaltung der immunologischen Aktivität in besonders vorteilhafter r.'eise auch in technischem Maßstab getrennt werden können.
Der Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass die angegebene Aufgabe dadurch in besonders vorteilhafter Weiee lösbar ist, dass Plasma oder Serum mit Hilfe der sogenannten steriechen Chromatographie unter Verwendung speziell hergestellter anorganischer, poröser Borosilikatgläser mit eng begrenzter, genau definierter Forenweite getrennt wird»
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Trennung von Blutkoaponenten, Insbesondere von immunologisch aktiven GIobulinen, von anderen Komponenten mit Hilfe der sogenannten steriechen Chromatographie, bei dem das zu trennende Plasma oder Serum in ursprünglicher oder bereits grob vorfraktionierter Form in eine mit einer porösen Hilfssubstanz gefüllte Chroraatographiesäule eingebracht und mit einen* wäßrigen Lösungsmittel eluiert sowie das aus der Chroraatographieeäule austretende Eluat fraktionsweise gesammelt wird, worauf die einzelnen Fraktionen gegebenenfalls konzen-
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triert und/oder noch weiter gereinigt werden, dae dadurch gekennzeichnet ist» dass nan ale poröse Hilfssubstanz ein duroh Aufβohmeisen von B2O,, SiO2 Sowie RO, wobei R ein Alkali-, Erdalkali- oder Schwermetall bedeutet, durch Nacherhitzen dor erstarrten Schmelzmasse sowie durch aufeinanderfolgende Behandlung der wieder erstarrten und anschliessend sserkleinerten Schmelzmasse mit Säuren und Laugen gewonnenes, poröses Glas mit Poren eines nach der von Winslow und Shapiro in ASTM Bull. 22. (Februar 1959) beschriebenen Quecksilberintrueionemethode bestimmten cowie in "Nature n Bd. 206, Seiten ψ 693 bis 696, definierten mittleren PorendurchmeBeers von 100 - 250 R rerwendet.
Zur !Durchführung des Verfahrene der Erfindung werden in besonders vorteilhafter Weise poröse Gläser verwendet, die nach dem z.B. in der Zeitschrift "Joura. of Chem. Physics'1, Bd. 42, Hr. 2 O965)t S. 686-693, beschriebenen Verfahren hergestellt sind. Danach werden B2O., SlO2 sowie RO, wobei R ein Alkali-, Brdalkali- oder Schwermetall, beispielsweise Ha2, Zn oder Fb, bedeutet, in bestimmten Gewichtsverhältniesen zu einen Borosilikatglas aufgeschmolzen, die erhaltene Schaelzaasse wird erkalten gelassen, danach erneut erhitzt und anschllessend in die gewunechte Teilchengröße ' »erkleinert und ausgesiebt, worauf die borreiche Hikrophase alt Hilfe von Säure entfernt und die mit Säure extrahierte, sllislumrelche Phase mit Hilfe von Lauge oder PIuSsäure von abgelagertem, kolloidalem Siliziumdioxyd befreit wird.
Die Erhitzungedauer (t) sowie die Erhitzungetemperatur (T) der Naoherhitzung der Schmelzmasse bestimmen sowohl die innere Oberfläche (A) des erhaltenen porösen Glases, als auch den dazu im reziproken Verhältnis stehenden mittleren Porendur ohme see r. Die genannten Grossen stehen miteinander in dem duroh die folgende Gleichung:
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1/Ant - k
in der η, k und π für eine bestimmte Glaszusamnensetzung charakteristische Konstanten darstellen» wiedergegebenen Verhältnis, wie in "J. of Chem. Physics" an der angegebenen Stelle näher beschrieben wird. Die Konstanten n, k und m können in bekannter Weise aus den Werten für die gemessenen inneren Oberflächen oder Porendurchraesser, welche auf Grund einiger sunächst arbiträr gewählter Hitzebehandlungsbedingungen gefunden werden, berechnet werden. Nach Kenntnis der Konstanten können die Wertepaare Temperatur (T) und Türhitzungszelt (t) ermittelt werden, welche zur Erzielung von Gläsern mit bestimmter Innerer Oberfläche, d.h. mit bestimmtem Porendurohmesser, nötig sind.
Auf diese Weise lassen sich poröse Gläser mit genau berechenbarer Porenweite sowie äusserst geringer Streuung des mittleren Pordendurohmessers herstellen, die gegenüber den als "Gelen" bezeichneten Hilfesubstanzen zahlreiche Vorteile besitzen« So sind derartige anorganische Gläser z.B. chemisch vollkommen inert, in beliebiger Weise, z.B. durch Hitze, sterilisierbar sowie in einfacher Weise, z.B. durch starke Säuren, beispielsweise helsse Salpetersäure, verdünnte Laugen und/oder durch Oxydationsmittel, zu reinigen. Ferner ermöglichen daraus hergestellte Säulenpackungen eine sehr hohe und völlig konstante Durchlaufgeschwindigkeit des zur Elution verwendeten Lösungsmittels oder Lösungsmlttelgeroisches, führen zu gut reproduzierbaren Trennergebnissen und sind zur Auftrennung von Plasma oder Serum in grossem Maßstab in besondere vorteilhafter Weise geeignet.
Zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung haben sich, wie bereits erwähnt, Gläser mit einem mittleren Porendurchmesser von 100 - 250 % als besondere vorteilhaft erwiesen.
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Der Porendurchmeeser der zur Durchführung des Verfahrene der Erfindung verwendeten, poröeen Gläser kann z.B, duroh etatieche Auewertung von elektronenmikroBkopiechen Aufnahmen "be β timrat werden» Zur Bestimmung des Porendurchmeesere hat eich auch, wie bereite erwähnt, die in ASTM Bull. 251 (Februar 1959) beschriebene QueeksilberintruBionemethode ale beeondera vorteilhaft erwiesen, Sie angegebenen Porenwelten ba.sieren daher auf mit Hilfe dieser Bestimmungemethode erhaltenen sowie in "Nature", Ed. 206, Seiten 693~ 696, definierten Messwerten»
Dae folgende Beispiel eoll die Erfindung näher erläutern.
Beiepiel
Eine e.uß Glae bestehende Chromatograph!eeäule von 100 cm Länge und 1,1 om inneren Durchmesser wurde mit einem aus 6,9 Gew.# Na2O, 25,7 Gew„# B2O^ sowie 67,4 Gew.^S SiO2 in der angegebenen Weise hergestellten, porösen Glas mit einen mittleren Porendurchmeseer von 175 Ä in Form von Körnern der Siebfra.ktion, die Siebe mit 0,149 bis 0,074 mm lichter Btaechenweite passiert (100 bis 200 mesh nach ASTM), gefüllt. Das Porenvolumen des verwendeten Glasee betrug 0,77 ml/g» i)ie Kolonne fasete 61 g poröses Glas, bezogen auf Trockengewioht. Durch die gefüllte Säule wurde sodann mittels einer Schlauchpumpe eine wäßrige Pufferlösung, die pro Liter 0,05 M Tris(hydroxymethyl)-aminoraethan sowie 0,1 U NaCl enthielt und deren pH-Y.'ert mit HCl auf 9 eingestellt worden war, geschickt, wobei eine Durchlaufgeschwindigkeit von 2 ml/Hin, aufrechterhalten wurde» Nach dem Spülen mit Pufferlösung wurden in Abständen von jeweils 40 Minuten an Kopf der Kolonne jeweils 3 ml Humanserum mit einem nach der sogenannten Lowry-Methode, die z„Bc von
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Bartley E.T· und Poulik M.D. in "Automatation in Analysie. Teohnikon Syiapoeiura", Bd, 1 (1966), New York, Seiten 383 -387, beschrieben wird, bestimmten, durchschnittlichen Proteingehalt von 8,25 i> zugeführt, worauf die Säule mit der angegebenen. Pufferlösung eluiert wurde. Sie optische Dichte dee die Kolonne verlasBonden Eluatee wurde bei einer Wellenlänge von 280 ιψ gemessen. Das Eluat wurde in Fraktionen gesammelt*
Insgesamt wurden an der 1 Meter langen Kolonne mit 1,1 cm innerem Durchmesser innerhalb von 24 Stunden etwa 100 ml Serum fraktioniert. Die bei 280 nyu bestimmten Extinktionskurren des Eluatee waren für sämtliche 4er im Abstand von 40 Minuten getrennten Serumproben praktisoh identisch. Di« von der ersten Serumprobe erhaltene Trennkurve ist in der figur 1 wiedergegeben. Die neuerliche Aufbringung von Serum ist in figur 1 mit einem Pfeil angedeutet. Von sämtlichen getrennten Strumproben wurden die «loh entsprechenden, in der Fig. IaIt A, B und C bezeichneten, Fraktionen vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen A, B und C wurden mit Hilfe bekannter elektrephoretiaoher sowie immunologischer Methoden getestet. Bs wurde gefunden, das« Fraktion A die Immunoglobuline X (19 s), die a2-Makroglobuline und Immunoglobuline G (7s) enthielt. Die Fraktion war frei von Albumin. Der Proteingehalt der Fraktion betrug 0,4 £. Der sogenannte passive Haeraaglut!nationstiter (vgl. Baot. Rev. 20, (1956), S. 166 bis 1Θ8) für mit Collbakterien beladene Erythroziten betrug etwa ein Viertel desjenigen des Ausgangsseruras.
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Die Fraktion B enthielt Albumin, Immunoglobuline G (7s) und Transferrin und war frei von Immunoglobulinen M (19s) sowie <X2-Makroglobulinen. Die Fraktion G enthielt neben etwas Albumin grössere Mengen an Transferrin,
Zur weiteren Anreicherung an Imraunoglobulinen II (19s) wurde die Fraktion A durch Ultrafiltration gegenüber einer Tris-Pufferlösung der angegebenen Zusammensetzung mit Hilfe einer unter der Bezeichnung "Visking-Membran" bekannten Ultrafil~ tratlonsmembran bei einem Druck von 1 at ti auf den vierten Teil des Ausgangsvolumens eingeengt. Die eingeengte Fraktion hatte einen Haemaglutinationetiter, der demjenigen des Ausgangeserums gleich war, wies jedoch einen Proteingehalt von nur 1,6 #, gegenüber 8,25 $> des Ausgangsserums, auf„ Aus diesen Werten ergab eich, dass eine fünffache Anreicherung der immunologischen Aktivität erzielt worden war.
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Claims (1)

1. Verfahren sur Trennung von UutkoEponenten, insbesondere von immunologisch aktiven Cobulinen, von anderen Komponenten mit Hilfe der sogenannten starischen Chromatographie, bei dem daa zu trennende PXesma oder Serum in ursprünglicher oder1 bereite grob vorf rationierter Form in eine mit einer porb'een Hilfssubstanz gefüllte Chromatographiesäule eingebracht und mit einem wäßrigen Löeungsmittel eluiert eowie das aue der Ohromatograpliiesäule aus tretende Eluat frakti one weise gesammelt .wird, wo«* rauf die einzelnen Fraktionen gegebenenfalls konzentriert und/oder noch weiter-.gereinigt-werden, dadurch gekenneeiohneti dass man als poröse Hllfeeubetans ein durch Aufeohaelsen von B2O*, SiO2sowie RO, wobei R ein Alkali-, Erdalkali- oder Sahwenaetall bedeutet, durch Nacherhitzen der erstarrten SohiaeliBmaeee sowie durch aufeinanderfolgende Behandlung der wieder erstarrten und anschlieasend serkleinerten Sehmelsraasee mit Säuren und Laugen gewonnenes, poröses Glae mit Foren eines nach der von Winelow und Shapiro in ASTM Bull. ^ (Pebruer 1959) beschriebenen Queeksilberintrueionsmethode bestimmten sowie in "Nature" Bd. 206f Seiten 693 bis 696, definierten mittleren Forendurohmeseers von 100 - 250 % verv/endet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als poröee Trenneubstanz ein eus 6,9 Gew.^ HagO, 25,7 Gew.it B2O, sowie 67,4 Gew.$ SiO2 gewonnenes, poröses Glae verwendet»
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