CH629668A5 - Verfahren zum reinigen von hepatitis-b-antigen. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von Hepatitis-B-Antigen aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat.
Die Hepatitis B ist eine der beiden Arten viraler Hepatitis, die eine systemische Infektion ergibt, wobei sich die hauptsächlichen pathologischen Veränderungen in der Leber einstellen. Die Erkrankung tritt hauptsächlich beim Erwachsenen auf und hat Bestand hauptsächlich durch Infektionsübertragung von Langzeitträgern des Virus. Die üblichen Ausbreitungswege sind die Bluttransfusion, verunreinigte Nadeln und Spritzen, ein Eindringen durch schnitt- oder kratzerbedingte Hautrisse, nichtsterilisierte zahnärztliche Instrumente wie auch Speichel, geschlechtlicher Kontakt oder aerosolisiertes infiziertes Blut.
Die Inkubationszeit der Hepatitis des Typs B ist relativ lang. Zwischen der Infektion und dem Einsetzen klinischer Symptome können 6 Wochen bis 6 Monate verstreichen. Ge-' wohnlich beginnt die Krankheit mit Mattigkeit und Appetit- ■ losigkeit, manchmal begleitet von Muskelschmerzen und Abdominalbeschwerden. Später können Gelbsucht, dunkler Urin, heller Stuhl und leichte Leberschwellung mit Druckempfindlichkeit auftreten. In dem einen oder anderen Fall kann das Einsetzen rasch ablaufen unter frühem Auftreten von Gelbsucht in Verbindung mit Fieber, Kältegefühl und Leukozytose. In anderen Fällen mag Gelbsucht nie erkennbar werden und der Patient sich nur «grippeartig» krank fühlen. Der Schätzung nach führt die Mehrzahl von Hepati-tis-Infektionen zu einer leichten anikterischen Erkrankung.
Die Erkrankung ähnelt qualitativ der viralen Hepatitis A, ist aber leicht diagnostizierbar am Auftreten von Partikeln des Australia-Antigens - heute mit HBsAg bezeichnet (Oberflächenantigen) - im Blut oder in anderen klinischen Proben (Speichel, Urin, Gallenflüssigkeit, Fae-ces). Im Blut der Infizierten findet sich eine relativ grosse Population kugelförmiger Partikel (1014 bis 1015/ml). Die Partikel haben einen Durchmesser von 18 bis 22 nm und die gleichen Antigendeterminanten wie die Oberfläche des 42-nm-Dane-Partikels, welches das Hepatitis-B-Virus - heute als HB V bezeichnet - sein kann.
s Wie in der US-PS 3 735 004 beschrieben, wurden Kinder mit aufgekochtem, infektiösem Serum unter Auftreten von HBsAg-Antikörpern (Anti-HBS) geimpft, wobei mit diesem Serum Schutz vor Infektion erhalten wurde. Die angewandte Dosis des aufgekochten Serums war etwa 1 x 1012 HBS-lo Partikeln äquivalent. Bei den Serumempfängern entwickelte sich keine klinische oder biochemische Erkrankung. Dieses Serum ist aber auf Grund seiner unreinen Natur, der mangelnden Reproduzierbarkeit und seiner Nichtquantifizier-barkeit zur Verwendung als Impfstoff nicht geeignet. 15 Es ist Aufgabe der vorhegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis-B-Antigen durch Entfernen unerwünschter Fremdproteine und/oder -antigene zu schaffen, so dass das erhaltene gereinigte Hepatitis-B-Antigen als Impfstoff eingesetzt werden kann.
2o Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe, im Patentanspruch 1 definierte Verfahren gelöst.
Das im erfindungsgemässen Verfahren anfallende Produkt, ein hochgereinigtes, reproduzierbares, kennzeichenbares, von unerwünschten Fremdproteinen und/oder -an-25 tigenen getrenntes Hepatitis-B-Antigen, eignet sich für die Verwendung als Impfstoff.
Die Zeichnung zeigt ein UV-Spektrum des nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigten Antigens.
Die Erfindung ist nachfolgend im einzelnen beschrieben. 30 Das Ausgangsmaterial zur Herstellung von gereinigtem Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) ist Plasma, das von Spendern, z.B. durch Plasmaphorese erhalten wird. Der Antigentiter lässt sich in bekannter Weise im radioimmunologischen Versuch, durch Passivhämagglutination oder 35 Komplementbindung messen. Man kühlt das Plasma und entfernt das sich bildende Kryopräzipitat durch leichtes Schleudern. Das verbleibende, geklärte HBsAg enthaltende Plasma kann nach einer oder mehreren Techniken konzentriert werden, z.B. nach der Isopycnic-Banding-Tech-40 nik oder Rate-Zonal-Banding-Technik oder durch Fällung, z.B. mit Polyäthylenglykol, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und dergleichen. Dieses partiell gereinigte Konzentrat kann als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden.
45 Bei der Isopycnic-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat mit einem flüssigen Medium zusammengebracht, das in sich einen Dichtegradienten aufweist, der die Dichte des benötigten, speziellen Antigens umfasst. Das flüssige Medium wird dann auf der Ultrazentrifuge behan-50 delt, um eine Gleichgewichtsverteilung der Serum-Kom-ponenten über den Dichtegradienten entsprechend ihren Einzeldichten zu erhalten. Man verdrängt dann aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums und trennt die das gewünschte Antigen enthaltenden ab. Die Anwendung dieser 55 Technik auf die Reinigung des Australia-Antigens ist in den DE-OS 2 049 515 und US-PS 3 636 191 beschrieben.
Bei der Rate-Zonen-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat auf der Ultrazentrifuge im Kontakt mit einem flüssigen Medium behandelt, in dem ein Dichte-60 gradient vorliegt, wobei aber hier die Rate-Zonentechnik Anwendung findet, d.h. man arbeitet bei einer solchen Geschwindigkeit und solchen Behandlungszeit, dass das Gleichgewicht nicht erreicht wird, wobei das HBsAg und andere Serum-Restkomponenten in dem Medium entsprechend ih-65 ren SedimentationskoefBzienten in dem Medium verteilt werden.
Die bei diesem Verfahren eingesetzten, flüssigen Medien können jeglichen Dichtegradienten in den geeigneten Berei
chen aufweisen. Zu den bei der Bildung solcher Lösungen einzusetzenden, zu lösenden Stoffen gehören z.B. Rohrzuk-ker, Kaliumbromid, Cäsiumchlorid, Natriumbromid, Kaliumtartrat und dergleichen. Die Stufe des Isopycnic-Banding wird bequemerweise auf einer Zentrifuge, z.B. der Bauart Electronucleonics-K, durchgeführt, indem man den stehenden Rotor mit Kochsalzlösung füllt und dann aufeinanderfolgend die Salzlösung mit aliquoten Anteilen einer Flüssigmediumlösung zunehmender Dichte nach oben verdrängt, bis ein Stufengradient gebildet ist.
Das Plasma wird am Kopf des Rotors unter Verdrängung eines Teils der die höchste Dichte aufweisenden Lösung vom Boden eingeführt. Mit einem programmierten Geschwindigkeitsregelsystem, das ein Mischen während der Reorientierungs-Anfangsphase verhindert, wird die Zentrifuge auf die Arbeitsgeschwindigkeit gebracht. Wenn das Gleichgewicht erreicht ist und das Produkt sich in seiner richtigen Dichte-Position befindet, erfolgt die Herabsetzung der Rotordrehzahl unter Anwendung des gleichen Systems, um ein Mischen bei der Reorientierung zur ursprünglichen Konfiguration zu vermeiden. Dann wird das Gradient-Me-dium von unten ablaufen gelassen und der richtige Dichte-Schnitt gesammelt. Eine ähnliche Technik findet beim Rate-Zonal-Banding Anwendung. Der bei dieser Bandenbildung zu sammelnde richtige Dichte-Schnitt ist das partiell gereinigte Konzentrat des Hepatitis-B-Antigens.
Hierauf wird durch Zusatz keimfreier, pyrogenfreier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) die Protein-Konzentration des partiell gereinigten Konzentrats auf 40 bis 200 |ig/ml eingestellt. Dann wird die Lösung auf einen pH-Wert von 2 bis 4 angesäuert, vorzugsweise mit HCl bei etwa 25 °C.
Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird nun eine Lösung von gereinigtem Pepsin in Wasser (vorzugsweise angesetzt mit kristallinem Pepsin) so hinzugegeben, dass die Lösung etwa 1 (ig Pepsin pro etwa 40 bis 500 (ig Protein enthält. Die Lösung wird inkubiert, bis die Digestion des Fremdproteins durch das Pepsin vollständig ist, was typischerweise in 8 bis 24 h bei einer Temperatur von 30 bis 38 °C der Fall ist. Die Lösung wird nun durch Zusatz einer Base, z.B. NaOH, auf etwa pH-Wert 7 gebracht. Man konzentriert das pepsinaufgeschlossene Material durch Ultrafiltration bei etwa 5 °C und gibt Harnstoff (vorzugsweise eine hochgereinigte, kristalline Sorte) bis auf eine Endkonzentration mit der Wirksamkeit zur Dissoziation proteinartiger Substanz, typischerweise 4- bis 8molar, hinzu. Die Mischung wird dann bei erhöhter Temperatur inkubiert, typischerweise 16 bis 24 h lang bei 30 bis 38 °C, um eine weitere Reinigung zu bewirken.
Die inkubierte Mischung wird durch Filtration geklärt und auf einer Säule chromatographiert, um Harnstoff, Pepsin und Reste von der Pepsindigestion her zu entfernen. Die Säule wird mit einem keimfreien, pyrogenfreien, physiologisch akzeptablen Puffer eluiert, der mit der Säule verträglich ist, z.B. PBS, eine Mischung von NaH2P04 und Na2HP04 oder eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung (Tris). Fraktionen, deren Bestimmung nach bekannten Methoden, z.B. im radioimmunologischen Versuch und durch Komplementbindung und UV-Spektrophotometrie, einen Gehalt an HBsAg ergibt, werden zusammengegeben und mit keimfreiem, pyrogenfreiem, physiologisch akzeptablem Puffer (einige Beispiele für solche Puffer sind oben schon genannt) auf einen Titer von etwa 20 |ig HBsAg/ml verdünnt. Die verdünnten, vereinigten Fraktionen werden keimfrei filtriert. Wenn gewünscht, wird das filtrierte Gut mit Formaldehyd auf eine Viren inaktivierende Konzentration, z. B. 50 bis 200 ng/ml, versetzt. Die Mischung wird dann 50 bis 100 h lang bei 30 bis 38 °C inkubiert. Zur prakti-
629 668
sehen Neutralisation des zugesetzten Formaldehyds gibt man eine keimfreie Lösung eines physiologisch akzeptablen Neutralisationsmittels, z. B. NaHS03, hinzu. Das anfallende Material wird keimfrei in Glasfläschchen oder -ampullen abgefüllt und für den Einsatz aufbewahrt.
Das nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Hepa-titis-B-Oberflächenantigen ist ein hochgereinigtes, reproduzierbares Produkt und kennzeichnet sich durch einen Teilchendurchmesser von 18 bis 22 nm, ein E^snm von typischerweise 52 bis 54 und ein UV-Spektrum wie in der Zeichnung gezeigt.
Die Zeichnung zeigt ein UV-Spektrum des nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigten Hepatitis-B-An-tigens.
Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig.
Beispiel
Der Rotor einer Zentrifuge (Bauart Electronucleonics-K) wurde mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nachdem der Rotor zur Entgasung des Systems auf 10 000 U./min hochgefahren war, wurde in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen folgender Stufengradient eingeführt:
1. 2400 ml 10%ige NaBr, p = 1,08
2. 1000 ml 20%ige NaBr, p = 1,17
3. 1500 ml 30%ige NaBr, p = 1,28
4. 3500 ml 40%ige NaBr, p = 1,41
Unter Verdrängung von 1750 ml der 40%igen NaBr vom Rotorboden wurden in den Kopf des stehenden Rotors 1750 ml Plasma eingepumpt, welches das Australia-Antigen enthielt. Der Rotor wurde auf 30 000 U./min hochgefahren und 4 h lang mit dieser Tourenzahl laufen gelassen. Dann wurde der Rotor stillgesetzt und in den Boden des Rotors 40%ige NaBr in einer Menge von 1750 ml eingepumpt, wobei das Plasma am Rotorkopf herausgedrückt wurde. In den Rotorkopf wurden nun weitere 1750 ml frisches, Australia-Antigen enthaltendes Plasma unter Verdrängung eines gleichen Volumens an 40%iger NaBr aus dem Rotorboden eingepumpt. Der Rotor wurde dann 10 h lang mit 30 000 U./min laufen gelassen. Nach Stillsetzung des Rotors wurde das an HBsAg reiche Material im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 g/ cm3 (1000 ml) gesammelt und gegen Phosphatpuffer dialy-siert. Der Rotor wurde hierauf mit Phosphatpuffer gefüllt und dieser wie oben entgast, worauf in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen der folgende Stufengradient eingeführt wurde:
1. 2400 ml 5%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,02
2. 1750 ml 15%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,06
3. 1750 ml 25%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,10
4. 2500 ml 50%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,23
Unter Verdrängung von 1000 ml der 50%igen Rohrzuk-
kerlösung aus dem Rotorboden wurde in den Rotorkopf das bei der NaBr-Isopycnic-Banding-Stufe erhaltene, an HBsAg reiche Material (1000 ml) eingepumpt. Der Rotor wurde dann 18 h lang bei 28 000 U./min laufen gelassen. Nach Stillsetzen des Rotors wurde das an HBsAg reiche Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 g/cm3 (1000 ml) gesammelt. Dieses Produkt wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel unter Anfall von 561 Material auf einen Proteingehalt von 40 ng/ml verdünnt. Durch Einrühren von In Salzsäure wurde der 56-1-Ansatz des durch die Zonenzentrifugiertechnik partiell gereinigten Hepatitis-B-Antigens (HBSAg) von 40 ng/ml bei Zimmertemperatur auf pH-Wert 2 angesäuert. Zu dem Gut wurden 56 ml einer Lösung von kristallinem Pepsin in destilliertem Wasser (1 mg/ml) zugesetzt. Die Pepsin-Endkonzentration betrug 1 ng/ml. Der HBsAg-Ansatz wurde 16 h lang bei
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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37 °C inkubiert und durch Zusatz von In Natronlauge auf pH-Wert 7 neutralisiert.
Durch Ultrafiltration (mit einer Vorrichtung der Bauart »Amicon«, die mit einer Membran XMlOOa versehen war) wurde der pepsinaufgeschlossene Ansatz auf das 295fache konzentriert. Dabei tritt pepsinabgebautes Nichtantigen-Protein durch die Membran in das Ultrafiltrat über, während HBsAg-Partikel zurückgehalten werden.
Durch Zusatz von festem Harnstoff zu dem Konzentrat wurde eine 4- bis 8molare Harnstofflösung gebildet, die dann weiter 16 h lang bei 37 °C inkubiert wurde. Das harnstoffbehandelte HBsAg-Konzentrat wurde durch Filtrieren durch ein Glasfaser-Filter geklärt und auf »Sephadex« G-150 chro-matographiert. Das Antigen wurde beim Hohlraum-Volu-men eluiert und war von Harnstoff, Pepsin und anderen Proteinverunreinigungen frei. Die gereinigtes HBsAg enthaltende Fraktion wurde auf Gebrauchskonzentration verdünnt und keimfrei filtriert. Zur weiteren Absicherung gegen die Möglichkeit des Vorliegens infektiöser Viren wurde mit Formalin bei einer Konzentration von 90 bis 100 (ig/ml 72 h s lang bei 36 °C behandelt. An Ende der Formalinbehandlung wurde überschüssiger Formaldehyd mit Natriumbisulfit neutralisiert. E^/o des gereinigten Produkts betrug 52,3 im Vergleich mit 23,8 bei dem Zonenzentrifuge-Ausgangsmaterial. Das gereinigte Produkt bestand aus kugelförmigen Partikeln io mit einem Durchmesser von 18 bis 22 nm und einem UV-Spektrum entsprechend der Zeichnung.
Eine Zusammenfassung von Reinigungs- und biologischen und physikalischen Eigenschaften gibt die folgende Tabelle. In der Tabelle bedeutet OD die optische Dichte 15 oder Absorbanz, KB die Komplementbindung und RIV den radioimmunologischen Wert.
Zonenzentrifuge-Ausgangsprodukt
Endprodukt
OD280nm
0,095
0,115
OD^fionm
0,085
0,082
Volumen, ml
56 000
23 300
Gesamt-OD280nm
5 320
2 680
Lowry-Protein, |ig/ml
40,0
22,0
Gesamtprotein, mg
2 240
513
Protein-Entfernung, %
. -
77
KB-Einheiten/ml
64
128
KB-Einheiten insgesamt
3 584000
2 982 000
KB-Ausbeute, %
83
KB-Einheiten je ng/ml Protein
1.6
5,8
RIV-Einheiten/ml
2 000
8 000
RIV-Einheiten insgesamt
112 000 000
180 000 000
RIV-Ausbeute, %
—
160
RIV-Einheiten je |xg Protein
50
364
Versuch a)
Bei subkutaner Injektion mit einer Einzeldosis (1,0 ml) mit einem Gehalt von 20 jxg von erfindungsgemäss gereinigten Hepatitis-B-Oberflächenantigen zeigen bei einer Gruppe von 6 Schimpansen 4 der Tiere Antikörper-Bildung. Nach 40 zwei zusätzlichen, in 4-Wochen-Abständen gegebenen entsprechenden Dosen lag bei 5 der 6 Tiere Antikörper-Bildung vor.
Versuch b)
16 Schimpansen wurden in drei Gruppen unterteilt. Die Schimpansen der Gruppe A(6 Tiere) wurden intravenös mit 1,0 ml BOB-Hepatitis-B-Virus geimpft und diejenigen der Gruppe B (4 Tiere) mit 1,0 ml des erfindungsgemäss gereinigten Hepatitis-B-Oberflächen-Antigens, während die Gruppe C (6 Schimpansen) als Kontrollgruppe diente, bei der nicht geimpft wurde. Alle Schimpansen von Gruppe A zeigten Anzeichen einer klinischen Hepatitis-B-Infektion (Antigenemia, d.h. Auftreten von Hepatitis-B-Oberflächenantigen im Plasma des Infizierten, Enzymerhöhungen und/oder Antikörper-Ansprechen) innerhalb von 40 Wochen. Während des gleichen Zeitraums von 40 Wochen zeigte keiner der Schimpansen der Gruppen B oder C Anzeichen für eine klinische Hepatitis-B-Infektion.
Versuch c) 6o
Drei Gruppen von Grünaffen (zu je 6 Tieren) erhielten subkutan in 4-Wochen-Abständen drei Injektionen mit 1,0-ml-Dosen, die verschiedene Mengen von erfindungsgemäss gereinigtem Antigen enthielten. Die jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl der Tiere jeder Gruppe, die vor der nächsten Injektion oder innerhalb von 4 Wochen nach der letzten Injektion Antikörper-Bildung zeigten, nennt die folgende Tabelle.
Truppe
Vakzine
Zahl der Antikörper-Ansprechen
dosis,
zeigenden Tiere
Hg/ml
Woche 0
Woche 4
Woche 8
A
20
2/6
2/6
5/6
B
2
0/6
1/6
4/6
C
0,5
0/6
1/6
2/6
Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Vakzine-Dosen 45 bei einer Dosierung von 2 \ig mehr als 50% der Tiere An-tikörper-Ansprechen.
Versuch d)
Drei Gruppen von Meerschweinchen (zu je 14 Tieren) er-50 hielten subkutan zu Anfang und in Abständen von 14 und 56 Tagen Injektionen in Form von 1,0-ml-Dosen, die verschiedene Mengen von erfindungsgemäss gereinigtem Antigen enthielten. Die folgende Tabelle nennt die bei jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl 55 der Tiere jeder Gruppe, die bei Prüfung bei 0, 28, 56 und 84 Tagen Antikörper-Bildung zeigten.
Gruppe Vakzine- Zahl der Antikörper-Ansprechen zeigenden
dosis, Hg/ml
Tiere TagO
Tag 28
Tag 56
Tag 84
A
20
0/14
12/14
10/11
10/10
B
2
0/14
7/14
4/11
10/10
C
0,5
0/14
2/14
3/14
10/12
Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Vakzine-Dosen bei einer Dosierung mit 0,5 jag mehr als 80% der Meerschweinchen Antikörper-Bildung.
s
1 Blatt Zeichnungen
Claims (7)
1. Verfahren zum Reinigen von Hepatitis-B-Antigen aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, dass man das Konzentrat mit Pepsin in einer zum Abbau proteinartiger Substanz wirksamen Menge bei einem pH-Wert in dem Bereich behandelt, in dem Pepsin enzymatisch aktiv ist, das Konzentrat mit Harnstoff in einer zur Dissoziation proteinartiger Substanz wirksamen Menge behandelt und Pepsin, Pepsinabbauprodukte und Harnstoff entfernt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert des Konzentrats mit HCl auf etwa 2 einstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Pepsin auf eine Konzentration von 1 (ig/ml pro 40 bis 500 jag Protein hinzugibt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Harnstoff auf eine 4- bis 8molare Konzentration hinzugibt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der Entfernung von Pepsin, Pepsinabbauprodukten und Harnstoff Formaldehyd in einer zur Viren-inaktivierung wirksamen Konzentration hinzugibt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den Formaldehyd auf eine Konzentration von 50 bis 200 ng/ml hinzugibt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Entfernung durch Filtrieren und Chromatographie bewirkt.
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| DE2225548A1 (de) | Intravenoes vertraegliche staupe- und hepatitisvaccine |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PL | Patent ceased |