CH629668A5 - Verfahren zum reinigen von hepatitis-b-antigen. - Google Patents
Verfahren zum reinigen von hepatitis-b-antigen. Download PDFInfo
- Publication number
- CH629668A5 CH629668A5 CH607776A CH607776A CH629668A5 CH 629668 A5 CH629668 A5 CH 629668A5 CH 607776 A CH607776 A CH 607776A CH 607776 A CH607776 A CH 607776A CH 629668 A5 CH629668 A5 CH 629668A5
- Authority
- CH
- Switzerland
- Prior art keywords
- pepsin
- hepatitis
- antigen
- concentrate
- urea
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 title description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 title description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 title description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 17
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 16
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 16
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 13
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 claims 2
- 229920001807 Urea-formaldehyde Polymers 0.000 claims 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims 1
- ODGAOXROABLFNM-UHFFFAOYSA-N polynoxylin Chemical compound O=C.NC(N)=O ODGAOXROABLFNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 4
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 2
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 0 *=CC1CCCC1 Chemical compound *=CC1CCCC1 0.000 description 1
- 241000867607 Chlorocebus sabaeus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010016326 Feeling cold Diseases 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 206010000059 abdominal discomfort Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000019017 loss of appetite Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L potassium L-tartrate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O AVTYONGGKAJVTE-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 239000001472 potassium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229940111695 potassium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011005 potassium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Reinigen von Hepatitis-B-Antigen aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat.
Die Hepatitis B ist eine der beiden Arten viraler Hepatitis, die eine systemische Infektion ergibt, wobei sich die hauptsächlichen pathologischen Veränderungen in der Leber einstellen. Die Erkrankung tritt hauptsächlich beim Erwachsenen auf und hat Bestand hauptsächlich durch Infektionsübertragung von Langzeitträgern des Virus. Die üblichen Ausbreitungswege sind die Bluttransfusion, verunreinigte Nadeln und Spritzen, ein Eindringen durch schnitt- oder kratzerbedingte Hautrisse, nichtsterilisierte zahnärztliche Instrumente wie auch Speichel, geschlechtlicher Kontakt oder aerosolisiertes infiziertes Blut.
Die Inkubationszeit der Hepatitis des Typs B ist relativ lang. Zwischen der Infektion und dem Einsetzen klinischer Symptome können 6 Wochen bis 6 Monate verstreichen. Ge-' wohnlich beginnt die Krankheit mit Mattigkeit und Appetit- ■ losigkeit, manchmal begleitet von Muskelschmerzen und Abdominalbeschwerden. Später können Gelbsucht, dunkler Urin, heller Stuhl und leichte Leberschwellung mit Druckempfindlichkeit auftreten. In dem einen oder anderen Fall kann das Einsetzen rasch ablaufen unter frühem Auftreten von Gelbsucht in Verbindung mit Fieber, Kältegefühl und Leukozytose. In anderen Fällen mag Gelbsucht nie erkennbar werden und der Patient sich nur «grippeartig» krank fühlen. Der Schätzung nach führt die Mehrzahl von Hepati-tis-Infektionen zu einer leichten anikterischen Erkrankung.
Die Erkrankung ähnelt qualitativ der viralen Hepatitis A, ist aber leicht diagnostizierbar am Auftreten von Partikeln des Australia-Antigens - heute mit HBsAg bezeichnet (Oberflächenantigen) - im Blut oder in anderen klinischen Proben (Speichel, Urin, Gallenflüssigkeit, Fae-ces). Im Blut der Infizierten findet sich eine relativ grosse Population kugelförmiger Partikel (1014 bis 1015/ml). Die Partikel haben einen Durchmesser von 18 bis 22 nm und die gleichen Antigendeterminanten wie die Oberfläche des 42-nm-Dane-Partikels, welches das Hepatitis-B-Virus - heute als HB V bezeichnet - sein kann.
s Wie in der US-PS 3 735 004 beschrieben, wurden Kinder mit aufgekochtem, infektiösem Serum unter Auftreten von HBsAg-Antikörpern (Anti-HBS) geimpft, wobei mit diesem Serum Schutz vor Infektion erhalten wurde. Die angewandte Dosis des aufgekochten Serums war etwa 1 x 1012 HBS-lo Partikeln äquivalent. Bei den Serumempfängern entwickelte sich keine klinische oder biochemische Erkrankung. Dieses Serum ist aber auf Grund seiner unreinen Natur, der mangelnden Reproduzierbarkeit und seiner Nichtquantifizier-barkeit zur Verwendung als Impfstoff nicht geeignet. 15 Es ist Aufgabe der vorhegenden Erfindung, ein Verfahren zur Reinigung von Hepatitis-B-Antigen durch Entfernen unerwünschter Fremdproteine und/oder -antigene zu schaffen, so dass das erhaltene gereinigte Hepatitis-B-Antigen als Impfstoff eingesetzt werden kann.
2o Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemässe, im Patentanspruch 1 definierte Verfahren gelöst.
Das im erfindungsgemässen Verfahren anfallende Produkt, ein hochgereinigtes, reproduzierbares, kennzeichenbares, von unerwünschten Fremdproteinen und/oder -an-25 tigenen getrenntes Hepatitis-B-Antigen, eignet sich für die Verwendung als Impfstoff.
Die Zeichnung zeigt ein UV-Spektrum des nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigten Antigens.
Die Erfindung ist nachfolgend im einzelnen beschrieben. 30 Das Ausgangsmaterial zur Herstellung von gereinigtem Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) ist Plasma, das von Spendern, z.B. durch Plasmaphorese erhalten wird. Der Antigentiter lässt sich in bekannter Weise im radioimmunologischen Versuch, durch Passivhämagglutination oder 35 Komplementbindung messen. Man kühlt das Plasma und entfernt das sich bildende Kryopräzipitat durch leichtes Schleudern. Das verbleibende, geklärte HBsAg enthaltende Plasma kann nach einer oder mehreren Techniken konzentriert werden, z.B. nach der Isopycnic-Banding-Tech-40 nik oder Rate-Zonal-Banding-Technik oder durch Fällung, z.B. mit Polyäthylenglykol, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat und dergleichen. Dieses partiell gereinigte Konzentrat kann als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren verwendet werden.
45 Bei der Isopycnic-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat mit einem flüssigen Medium zusammengebracht, das in sich einen Dichtegradienten aufweist, der die Dichte des benötigten, speziellen Antigens umfasst. Das flüssige Medium wird dann auf der Ultrazentrifuge behan-50 delt, um eine Gleichgewichtsverteilung der Serum-Kom-ponenten über den Dichtegradienten entsprechend ihren Einzeldichten zu erhalten. Man verdrängt dann aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums und trennt die das gewünschte Antigen enthaltenden ab. Die Anwendung dieser 55 Technik auf die Reinigung des Australia-Antigens ist in den DE-OS 2 049 515 und US-PS 3 636 191 beschrieben.
Bei der Rate-Zonen-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat auf der Ultrazentrifuge im Kontakt mit einem flüssigen Medium behandelt, in dem ein Dichte-60 gradient vorliegt, wobei aber hier die Rate-Zonentechnik Anwendung findet, d.h. man arbeitet bei einer solchen Geschwindigkeit und solchen Behandlungszeit, dass das Gleichgewicht nicht erreicht wird, wobei das HBsAg und andere Serum-Restkomponenten in dem Medium entsprechend ih-65 ren SedimentationskoefBzienten in dem Medium verteilt werden.
Die bei diesem Verfahren eingesetzten, flüssigen Medien können jeglichen Dichtegradienten in den geeigneten Berei
chen aufweisen. Zu den bei der Bildung solcher Lösungen einzusetzenden, zu lösenden Stoffen gehören z.B. Rohrzuk-ker, Kaliumbromid, Cäsiumchlorid, Natriumbromid, Kaliumtartrat und dergleichen. Die Stufe des Isopycnic-Banding wird bequemerweise auf einer Zentrifuge, z.B. der Bauart Electronucleonics-K, durchgeführt, indem man den stehenden Rotor mit Kochsalzlösung füllt und dann aufeinanderfolgend die Salzlösung mit aliquoten Anteilen einer Flüssigmediumlösung zunehmender Dichte nach oben verdrängt, bis ein Stufengradient gebildet ist.
Das Plasma wird am Kopf des Rotors unter Verdrängung eines Teils der die höchste Dichte aufweisenden Lösung vom Boden eingeführt. Mit einem programmierten Geschwindigkeitsregelsystem, das ein Mischen während der Reorientierungs-Anfangsphase verhindert, wird die Zentrifuge auf die Arbeitsgeschwindigkeit gebracht. Wenn das Gleichgewicht erreicht ist und das Produkt sich in seiner richtigen Dichte-Position befindet, erfolgt die Herabsetzung der Rotordrehzahl unter Anwendung des gleichen Systems, um ein Mischen bei der Reorientierung zur ursprünglichen Konfiguration zu vermeiden. Dann wird das Gradient-Me-dium von unten ablaufen gelassen und der richtige Dichte-Schnitt gesammelt. Eine ähnliche Technik findet beim Rate-Zonal-Banding Anwendung. Der bei dieser Bandenbildung zu sammelnde richtige Dichte-Schnitt ist das partiell gereinigte Konzentrat des Hepatitis-B-Antigens.
Hierauf wird durch Zusatz keimfreier, pyrogenfreier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) die Protein-Konzentration des partiell gereinigten Konzentrats auf 40 bis 200 |ig/ml eingestellt. Dann wird die Lösung auf einen pH-Wert von 2 bis 4 angesäuert, vorzugsweise mit HCl bei etwa 25 °C.
Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird nun eine Lösung von gereinigtem Pepsin in Wasser (vorzugsweise angesetzt mit kristallinem Pepsin) so hinzugegeben, dass die Lösung etwa 1 (ig Pepsin pro etwa 40 bis 500 (ig Protein enthält. Die Lösung wird inkubiert, bis die Digestion des Fremdproteins durch das Pepsin vollständig ist, was typischerweise in 8 bis 24 h bei einer Temperatur von 30 bis 38 °C der Fall ist. Die Lösung wird nun durch Zusatz einer Base, z.B. NaOH, auf etwa pH-Wert 7 gebracht. Man konzentriert das pepsinaufgeschlossene Material durch Ultrafiltration bei etwa 5 °C und gibt Harnstoff (vorzugsweise eine hochgereinigte, kristalline Sorte) bis auf eine Endkonzentration mit der Wirksamkeit zur Dissoziation proteinartiger Substanz, typischerweise 4- bis 8molar, hinzu. Die Mischung wird dann bei erhöhter Temperatur inkubiert, typischerweise 16 bis 24 h lang bei 30 bis 38 °C, um eine weitere Reinigung zu bewirken.
Die inkubierte Mischung wird durch Filtration geklärt und auf einer Säule chromatographiert, um Harnstoff, Pepsin und Reste von der Pepsindigestion her zu entfernen. Die Säule wird mit einem keimfreien, pyrogenfreien, physiologisch akzeptablen Puffer eluiert, der mit der Säule verträglich ist, z.B. PBS, eine Mischung von NaH2P04 und Na2HP04 oder eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung (Tris). Fraktionen, deren Bestimmung nach bekannten Methoden, z.B. im radioimmunologischen Versuch und durch Komplementbindung und UV-Spektrophotometrie, einen Gehalt an HBsAg ergibt, werden zusammengegeben und mit keimfreiem, pyrogenfreiem, physiologisch akzeptablem Puffer (einige Beispiele für solche Puffer sind oben schon genannt) auf einen Titer von etwa 20 |ig HBsAg/ml verdünnt. Die verdünnten, vereinigten Fraktionen werden keimfrei filtriert. Wenn gewünscht, wird das filtrierte Gut mit Formaldehyd auf eine Viren inaktivierende Konzentration, z. B. 50 bis 200 ng/ml, versetzt. Die Mischung wird dann 50 bis 100 h lang bei 30 bis 38 °C inkubiert. Zur prakti-
629 668
sehen Neutralisation des zugesetzten Formaldehyds gibt man eine keimfreie Lösung eines physiologisch akzeptablen Neutralisationsmittels, z. B. NaHS03, hinzu. Das anfallende Material wird keimfrei in Glasfläschchen oder -ampullen abgefüllt und für den Einsatz aufbewahrt.
Das nach dem beschriebenen Verfahren gereinigte Hepa-titis-B-Oberflächenantigen ist ein hochgereinigtes, reproduzierbares Produkt und kennzeichnet sich durch einen Teilchendurchmesser von 18 bis 22 nm, ein E^snm von typischerweise 52 bis 54 und ein UV-Spektrum wie in der Zeichnung gezeigt.
Die Zeichnung zeigt ein UV-Spektrum des nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigten Hepatitis-B-An-tigens.
Das folgende Beispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die prozentualen Konzentrationsangaben sind gewichtsmässig.
Beispiel
Der Rotor einer Zentrifuge (Bauart Electronucleonics-K) wurde mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nachdem der Rotor zur Entgasung des Systems auf 10 000 U./min hochgefahren war, wurde in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen folgender Stufengradient eingeführt:
1. 2400 ml 10%ige NaBr, p = 1,08
2. 1000 ml 20%ige NaBr, p = 1,17
3. 1500 ml 30%ige NaBr, p = 1,28
4. 3500 ml 40%ige NaBr, p = 1,41
Unter Verdrängung von 1750 ml der 40%igen NaBr vom Rotorboden wurden in den Kopf des stehenden Rotors 1750 ml Plasma eingepumpt, welches das Australia-Antigen enthielt. Der Rotor wurde auf 30 000 U./min hochgefahren und 4 h lang mit dieser Tourenzahl laufen gelassen. Dann wurde der Rotor stillgesetzt und in den Boden des Rotors 40%ige NaBr in einer Menge von 1750 ml eingepumpt, wobei das Plasma am Rotorkopf herausgedrückt wurde. In den Rotorkopf wurden nun weitere 1750 ml frisches, Australia-Antigen enthaltendes Plasma unter Verdrängung eines gleichen Volumens an 40%iger NaBr aus dem Rotorboden eingepumpt. Der Rotor wurde dann 10 h lang mit 30 000 U./min laufen gelassen. Nach Stillsetzung des Rotors wurde das an HBsAg reiche Material im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 g/ cm3 (1000 ml) gesammelt und gegen Phosphatpuffer dialy-siert. Der Rotor wurde hierauf mit Phosphatpuffer gefüllt und dieser wie oben entgast, worauf in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen der folgende Stufengradient eingeführt wurde:
1. 2400 ml 5%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,02
2. 1750 ml 15%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,06
3. 1750 ml 25%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,10
4. 2500 ml 50%ige Rohrzuckerlösung, p = 1,23
Unter Verdrängung von 1000 ml der 50%igen Rohrzuk-
kerlösung aus dem Rotorboden wurde in den Rotorkopf das bei der NaBr-Isopycnic-Banding-Stufe erhaltene, an HBsAg reiche Material (1000 ml) eingepumpt. Der Rotor wurde dann 18 h lang bei 28 000 U./min laufen gelassen. Nach Stillsetzen des Rotors wurde das an HBsAg reiche Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 g/cm3 (1000 ml) gesammelt. Dieses Produkt wurde mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel unter Anfall von 561 Material auf einen Proteingehalt von 40 ng/ml verdünnt. Durch Einrühren von In Salzsäure wurde der 56-1-Ansatz des durch die Zonenzentrifugiertechnik partiell gereinigten Hepatitis-B-Antigens (HBSAg) von 40 ng/ml bei Zimmertemperatur auf pH-Wert 2 angesäuert. Zu dem Gut wurden 56 ml einer Lösung von kristallinem Pepsin in destilliertem Wasser (1 mg/ml) zugesetzt. Die Pepsin-Endkonzentration betrug 1 ng/ml. Der HBsAg-Ansatz wurde 16 h lang bei
3
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
629668
37 °C inkubiert und durch Zusatz von In Natronlauge auf pH-Wert 7 neutralisiert.
Durch Ultrafiltration (mit einer Vorrichtung der Bauart »Amicon«, die mit einer Membran XMlOOa versehen war) wurde der pepsinaufgeschlossene Ansatz auf das 295fache konzentriert. Dabei tritt pepsinabgebautes Nichtantigen-Protein durch die Membran in das Ultrafiltrat über, während HBsAg-Partikel zurückgehalten werden.
Durch Zusatz von festem Harnstoff zu dem Konzentrat wurde eine 4- bis 8molare Harnstofflösung gebildet, die dann weiter 16 h lang bei 37 °C inkubiert wurde. Das harnstoffbehandelte HBsAg-Konzentrat wurde durch Filtrieren durch ein Glasfaser-Filter geklärt und auf »Sephadex« G-150 chro-matographiert. Das Antigen wurde beim Hohlraum-Volu-men eluiert und war von Harnstoff, Pepsin und anderen Proteinverunreinigungen frei. Die gereinigtes HBsAg enthaltende Fraktion wurde auf Gebrauchskonzentration verdünnt und keimfrei filtriert. Zur weiteren Absicherung gegen die Möglichkeit des Vorliegens infektiöser Viren wurde mit Formalin bei einer Konzentration von 90 bis 100 (ig/ml 72 h s lang bei 36 °C behandelt. An Ende der Formalinbehandlung wurde überschüssiger Formaldehyd mit Natriumbisulfit neutralisiert. E^/o des gereinigten Produkts betrug 52,3 im Vergleich mit 23,8 bei dem Zonenzentrifuge-Ausgangsmaterial. Das gereinigte Produkt bestand aus kugelförmigen Partikeln io mit einem Durchmesser von 18 bis 22 nm und einem UV-Spektrum entsprechend der Zeichnung.
Eine Zusammenfassung von Reinigungs- und biologischen und physikalischen Eigenschaften gibt die folgende Tabelle. In der Tabelle bedeutet OD die optische Dichte 15 oder Absorbanz, KB die Komplementbindung und RIV den radioimmunologischen Wert.
Zonenzentrifuge-Ausgangsprodukt
Endprodukt
OD280nm
0,095
0,115
OD^fionm
0,085
0,082
Volumen, ml
56 000
23 300
Gesamt-OD280nm
5 320
2 680
Lowry-Protein, |ig/ml
40,0
22,0
Gesamtprotein, mg
2 240
513
Protein-Entfernung, %
. -
77
KB-Einheiten/ml
64
128
KB-Einheiten insgesamt
3 584000
2 982 000
KB-Ausbeute, %
83
KB-Einheiten je ng/ml Protein
1.6
5,8
RIV-Einheiten/ml
2 000
8 000
RIV-Einheiten insgesamt
112 000 000
180 000 000
RIV-Ausbeute, %
—
160
RIV-Einheiten je |xg Protein
50
364
Versuch a)
Bei subkutaner Injektion mit einer Einzeldosis (1,0 ml) mit einem Gehalt von 20 jxg von erfindungsgemäss gereinigten Hepatitis-B-Oberflächenantigen zeigen bei einer Gruppe von 6 Schimpansen 4 der Tiere Antikörper-Bildung. Nach 40 zwei zusätzlichen, in 4-Wochen-Abständen gegebenen entsprechenden Dosen lag bei 5 der 6 Tiere Antikörper-Bildung vor.
Versuch b)
16 Schimpansen wurden in drei Gruppen unterteilt. Die Schimpansen der Gruppe A(6 Tiere) wurden intravenös mit 1,0 ml BOB-Hepatitis-B-Virus geimpft und diejenigen der Gruppe B (4 Tiere) mit 1,0 ml des erfindungsgemäss gereinigten Hepatitis-B-Oberflächen-Antigens, während die Gruppe C (6 Schimpansen) als Kontrollgruppe diente, bei der nicht geimpft wurde. Alle Schimpansen von Gruppe A zeigten Anzeichen einer klinischen Hepatitis-B-Infektion (Antigenemia, d.h. Auftreten von Hepatitis-B-Oberflächenantigen im Plasma des Infizierten, Enzymerhöhungen und/oder Antikörper-Ansprechen) innerhalb von 40 Wochen. Während des gleichen Zeitraums von 40 Wochen zeigte keiner der Schimpansen der Gruppen B oder C Anzeichen für eine klinische Hepatitis-B-Infektion.
Versuch c) 6o
Drei Gruppen von Grünaffen (zu je 6 Tieren) erhielten subkutan in 4-Wochen-Abständen drei Injektionen mit 1,0-ml-Dosen, die verschiedene Mengen von erfindungsgemäss gereinigtem Antigen enthielten. Die jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl der Tiere jeder Gruppe, die vor der nächsten Injektion oder innerhalb von 4 Wochen nach der letzten Injektion Antikörper-Bildung zeigten, nennt die folgende Tabelle.
Truppe
Vakzine
Zahl der Antikörper-Ansprechen
dosis,
zeigenden Tiere
Hg/ml
Woche 0
Woche 4
Woche 8
A
20
2/6
2/6
5/6
B
2
0/6
1/6
4/6
C
0,5
0/6
1/6
2/6
Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Vakzine-Dosen 45 bei einer Dosierung von 2 \ig mehr als 50% der Tiere An-tikörper-Ansprechen.
Versuch d)
Drei Gruppen von Meerschweinchen (zu je 14 Tieren) er-50 hielten subkutan zu Anfang und in Abständen von 14 und 56 Tagen Injektionen in Form von 1,0-ml-Dosen, die verschiedene Mengen von erfindungsgemäss gereinigtem Antigen enthielten. Die folgende Tabelle nennt die bei jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl 55 der Tiere jeder Gruppe, die bei Prüfung bei 0, 28, 56 und 84 Tagen Antikörper-Bildung zeigten.
Gruppe Vakzine- Zahl der Antikörper-Ansprechen zeigenden
dosis, Hg/ml
Tiere TagO
Tag 28
Tag 56
Tag 84
A
20
0/14
12/14
10/11
10/10
B
2
0/14
7/14
4/11
10/10
C
0,5
0/14
2/14
3/14
10/12
Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Vakzine-Dosen bei einer Dosierung mit 0,5 jag mehr als 80% der Meerschweinchen Antikörper-Bildung.
s
1 Blatt Zeichnungen
Claims (7)
1. Verfahren zum Reinigen von Hepatitis-B-Antigen aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, dass man das Konzentrat mit Pepsin in einer zum Abbau proteinartiger Substanz wirksamen Menge bei einem pH-Wert in dem Bereich behandelt, in dem Pepsin enzymatisch aktiv ist, das Konzentrat mit Harnstoff in einer zur Dissoziation proteinartiger Substanz wirksamen Menge behandelt und Pepsin, Pepsinabbauprodukte und Harnstoff entfernt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert des Konzentrats mit HCl auf etwa 2 einstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Pepsin auf eine Konzentration von 1 (ig/ml pro 40 bis 500 jag Protein hinzugibt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Harnstoff auf eine 4- bis 8molare Konzentration hinzugibt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der Entfernung von Pepsin, Pepsinabbauprodukten und Harnstoff Formaldehyd in einer zur Viren-inaktivierung wirksamen Konzentration hinzugibt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man den Formaldehyd auf eine Konzentration von 50 bis 200 ng/ml hinzugibt.
7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die Entfernung durch Filtrieren und Chromatographie bewirkt.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US05/577,483 US4017360A (en) | 1975-05-14 | 1975-05-14 | Method for purifying hepatitis B antigen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CH629668A5 true CH629668A5 (de) | 1982-05-14 |
Family
ID=24308922
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CH607776A CH629668A5 (de) | 1975-05-14 | 1976-05-14 | Verfahren zum reinigen von hepatitis-b-antigen. |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4017360A (de) |
JP (2) | JPS51139619A (de) |
AU (1) | AU504454B2 (de) |
BE (1) | BE841811A (de) |
CA (1) | CA1066191A (de) |
CH (1) | CH629668A5 (de) |
CY (1) | CY1034A (de) |
DE (1) | DE2621276A1 (de) |
DK (1) | DK145347C (de) |
ES (1) | ES447858A1 (de) |
FR (1) | FR2315947A1 (de) |
GB (1) | GB1488774A (de) |
HK (1) | HK86779A (de) |
NL (1) | NL188621C (de) |
SE (1) | SE431161B (de) |
Families Citing this family (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SE437329B (sv) * | 1975-03-14 | 1985-02-25 | Community Blood Council | Sett att ur blodserum framstella vaccin mot virushepatit |
US4129646A (en) * | 1976-11-02 | 1978-12-12 | Merck & Co., Inc. | Isolating hepatitis B Dane particles |
GB1554811A (en) * | 1977-02-23 | 1979-10-31 | Merck & Co Inc | Purifying hepatitis b surface antigen |
US4217418A (en) * | 1978-05-08 | 1980-08-12 | Merck & Co., Inc. | Recovery of small particles by flow centrifugation |
EP0005408B1 (de) * | 1978-05-08 | 1982-12-01 | Merck & Co. Inc. | Ein Verfahren zur direkten Extraktion von kleinen Teilchen bis 50 nm aus einer proteinhaltigen Flüssigkeit |
ZA792485B (en) * | 1978-06-07 | 1980-06-25 | New York Blood Center Inc | Vaccine for active immunization containing hepatitis b surface and/or e-antigens |
US4181713A (en) * | 1978-10-30 | 1980-01-01 | Merck & Co., Inc. | Isolation of HBs Ag |
US4395395A (en) * | 1979-05-21 | 1983-07-26 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen |
DE2935634C2 (de) * | 1979-09-04 | 1981-12-10 | Battelle-Institut E.V., 6000 Frankfurt | Tiermodell zur Prüfung der Inaktivierung von Impfstoffen gegen Virushepatitis Typ B und zur Prüfung von Chemotherapeutika gegen Virushepatitis Typ A |
FR2470795A1 (fr) * | 1979-12-07 | 1981-06-12 | Pasteur Institut | Procede de purification de particules d'origine biologique, notamment de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b (aghbs) et les produits obtenus |
US4349539A (en) * | 1980-08-15 | 1982-09-14 | Merck & Co., Inc. | Separation of hepatitis B surface antigen |
PL133476B1 (en) * | 1981-06-10 | 1985-06-29 | Akad Medyczna | Method of obtaining pure antigen hba from human serum |
AU8746582A (en) * | 1981-09-02 | 1983-03-10 | Biogen N.V. | Hepatitis b virus e type antigen |
GB8321789D0 (en) * | 1983-08-12 | 1983-09-14 | Biogen Nv | Vaccines and compositions against hepatitis |
US4639371A (en) * | 1984-10-02 | 1987-01-27 | New York Blood Center, Inc. | Hepatitis B antigenic compositions and vaccines against hepatitis B derived therefrom |
JPS61158798A (ja) * | 1984-12-28 | 1986-07-18 | Japan Found Cancer Res | B型肝炎ウイルス表面抗原の製造法 |
US5026828A (en) * | 1987-02-27 | 1991-06-25 | Merck & Co., Inc. | Method of purifying recombinant pres-1/S-2/S/S hepatitis B antigen from yeast |
JPS63246335A (ja) * | 1987-09-17 | 1988-10-13 | メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド | 肝炎b抗原 |
US5030720A (en) * | 1988-09-01 | 1991-07-09 | Merck & Co., Inc. | Pres2+S hepatitis B vaccine derived from plasma |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3636191A (en) * | 1969-10-08 | 1972-01-18 | Cancer Res Inst | Vaccine against viral hepatitis and process |
JPS5523254B2 (de) * | 1974-01-28 | 1980-06-21 |
-
1975
- 1975-05-14 US US05/577,483 patent/US4017360A/en not_active Expired - Lifetime
-
1976
- 1976-04-26 NL NLAANVRAGE7604429,A patent/NL188621C/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-27 SE SE7604818A patent/SE431161B/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-04-28 DK DK190776A patent/DK145347C/da not_active IP Right Cessation
- 1976-05-04 CY CY1034A patent/CY1034A/xx unknown
- 1976-05-04 AU AU13619/76A patent/AU504454B2/en not_active Expired
- 1976-05-04 GB GB18194/76A patent/GB1488774A/en not_active Expired
- 1976-05-04 CA CA251,740A patent/CA1066191A/en not_active Expired
- 1976-05-11 FR FR7614109A patent/FR2315947A1/fr active Granted
- 1976-05-12 ES ES447858A patent/ES447858A1/es not_active Expired
- 1976-05-13 BE BE167016A patent/BE841811A/xx not_active IP Right Cessation
- 1976-05-13 DE DE19762621276 patent/DE2621276A1/de active Granted
- 1976-05-14 CH CH607776A patent/CH629668A5/de not_active IP Right Cessation
- 1976-05-14 JP JP51054486A patent/JPS51139619A/ja active Granted
-
1979
- 1979-12-20 HK HK867/79A patent/HK86779A/xx unknown
-
1983
- 1983-02-24 JP JP58028652A patent/JPS58180432A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS6112894B2 (de) | 1986-04-10 |
FR2315947A1 (fr) | 1977-01-28 |
NL188621C (nl) | 1992-08-17 |
SE431161B (sv) | 1984-01-23 |
DE2621276C2 (de) | 1988-05-11 |
HK86779A (en) | 1979-12-28 |
JPS58180432A (ja) | 1983-10-21 |
JPS6345645B2 (de) | 1988-09-12 |
ES447858A1 (es) | 1977-07-16 |
CY1034A (en) | 1980-08-01 |
AU1361976A (en) | 1977-11-10 |
NL188621B (nl) | 1992-03-16 |
DK145347C (da) | 1983-05-02 |
AU504454B2 (en) | 1979-10-18 |
SE7604818L (sv) | 1976-11-15 |
DK190776A (da) | 1976-11-15 |
DE2621276A1 (de) | 1976-11-25 |
NL7604429A (nl) | 1976-11-16 |
BE841811A (fr) | 1976-11-16 |
US4017360A (en) | 1977-04-12 |
FR2315947B1 (de) | 1979-03-30 |
JPS51139619A (en) | 1976-12-02 |
GB1488774A (en) | 1977-10-12 |
DK145347B (da) | 1982-11-01 |
CA1066191A (en) | 1979-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2621276C2 (de) | ||
DE3227262C2 (de) | ||
DE2049515C3 (de) | Impfstoff gegen Vinishepatitis und Verfahren zu seiner Herstellung | |
WO2000047222A2 (de) | Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation | |
DE2902136A1 (de) | Interferon und es enthaltende zubereitungen | |
CH640140A5 (de) | Verfahren zur herstellung von intravenoes injizierbarem gamma-globulin. | |
CH664373A5 (de) | Verfahren zur inaktivierung von lipidhaltigen viren in einer proteinhaltigen zusammensetzung. | |
DE2606118A1 (de) | Gamma-globuline fuer intravenoese injektion und verfahren zur herstellung von solchem gamma-globulin | |
DE69127694T2 (de) | Herstellung und verwendung von transfer-faktor | |
DE3850433T2 (de) | Allergiebehandlung und Zusammensetzung dafür. | |
DE2817871A1 (de) | Verfahren und vorrichtung zur abtrennung und reinigung von proteinen durch chromatographie | |
Asher et al. | Pathogenesis of subacute spongiform encephalopathies | |
DE2658170C2 (de) | Arzneimittel auf der Basis von Human-Gammaglobulinen zur Behandlung der durch den Hepatitisvirus B ausgelösten akuten oder chronischen Infektionen | |
DE2555169C2 (de) | ||
DE2610717C3 (de) | Hepatitis-B-Impfstoff und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE2445819A1 (de) | Verfahren zur herstellung stabiler, gegen seruminhibitoren resistenter h tief 3 n tief 2 -influenzavirusstaemme und diese virusstaemme enthaltende vakzinen | |
EP0234405A2 (de) | Verwendung eines immunglobulinhaltigen Präparates zur Prophylaxe und Therapie von AIDS beim Menschen | |
CH616959A5 (de) | ||
DE60118409T2 (de) | Herstellungsverfahren von immunglobulinen, die gegen menschliche thymozyten gerichtet sind | |
DE68913932T2 (de) | Arzneimittel für die Behandlung oder die Verhütung von Infektionen mit HIV durch Immunisierung, und Verfahren zur Herstellung. | |
DE3877102T2 (de) | Methode fuer die behandlung von viraler gehirnentzuendung. | |
DE3750330T2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs gegen Hepatitis B. | |
EP0025116A1 (de) | Verfahren zur Prüfung auf Inaktivierung von Impfstoffen und Unschädlichkeit von Blutprodukten sowie der Wirksamkeit von Chemotherapeutika bzw. Desinfektionsmitteln gegen Virushepatit und Verfahren zur Gewinnung von Virushepatitis-Antigen | |
DE2225548A1 (de) | Intravenoes vertraegliche staupe- und hepatitisvaccine | |
DE3779444T2 (de) | Impfstoff gegen herpes simplex. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PL | Patent ceased |