DE2621276A1 - Hepatitis-b-vaccine - Google Patents
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Description
Dr. Dieter F. Morf 15 767
Dr. Hans-A. Brauns 2621276
8 Münchsa ββ, Pliiuenauerrtr. 28
MERCK & CO., INC.
126 East Lincoln Avenue, Rahway, N.J.O7O65
V.St.A.
Hepatitis-B-Vaccine
Die Erfindung betrifft die Hepatitis B, insbesondere eine Hepatitis-
B-Vaccine und ein Verfahren zum Eeinigen von Hepatitis-B-Antigen
für den Einsatz als Vaccine.
Die Hepatitis B ist eine der beiden Arten viraler Hepatitis, die eine systemische Infektion ergibt, wobei sich die hauptsächlichen
pathologischen Veränderungen in der Leber einstellen.
Die Erkrankung tritt hauptsächlich beim Erwachsenen auf und hat Bestand hauptsächlich durch Infektionsübertragung
von Langzeitträgern des Virus. Die üblichen Ausbreitungswege sind die Bluttransfusion, verunreinigte Nadeln und Spritzen,
ein Eindringen durch schnitt- oder kratzerbedingte Hautrisse, nicht-sterilisierte zahnärztliche Instrumente wie auch Speichel,
geschlechtlicher Kontakt oder aerosolisiertes infiziertes
Blut.
Die Inkubationszeit der Hepatitis des Typs B ist relativ lang. Zwischen der Infektion und dem Einsetzen klinischer Symptome
können 6 Wochen bis 6 Honate verstreichen. Gewöhnlich beginnt die Krankheit mit Mattigkeit und Appetitlosigkeit, manchmal
- 1 6098 4 8/0897
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begleitet von Muskelschmerzen und Abdominalbeschwerden. Später
können Gelbsucht, dunkler Urin, heller Stuhl und leichte Leberschwellung
mit Druckempfindlichkeit auftreten. In dem einen oder anderen Fall kann das Einsetzen rasch ablaufen unter
frühem Auftreten von Gelbsucht in Verbindung mit Fieber, Kältegefühl und Leukozytose. In anderen Fällen mag Gelbsucht
nie erkennbar werden und der Patient sich nur "grippeartig" krank fühlen. Der Schätzung nach führt die Mehrzahl von Hepatitis-Infektionen
zu einer leichten anikterischen Erkrankung.
Die Erkrankung ähnelt qualitativ der viralen Hepatitis A, ist aber leicht diagnostizierbar am Auftreten von Partikeln des
Australia-Antigens - heute mit HB Ag bezeichnet (Oberflächenantigen) - im Blut oder in anderen klinischen Proben (Speichel,
Urin, Gallenflüssigkeit, Faeces). Im Blut der Infizierten findet sich eine relativ grosse Population kugelförmiger Partikel
(10 bis 10 Vml). Die Partikel haben einen Durchmesser von
18 bis 22 nm und die gleichen Antigendeterminanten wie die
Oberfläche des 42-nm-Dane-Partikels, welches das Hepatitis-B-Virus
- heute als HBV bezeichnet - sein kann.
Wie in US-PS 3 735 004 beschrieben, wurden Kinder mit aufgekochtem,
infektiösem Serum unter Auftreten von HBAg-Antikörpern
(Anti-EB ) geimpft, wobei mit diesem Serum Schutz vor Infektion erhalten wurde. Die angewandte Dosis des aufgekoch-
1?
ten Serums war etwa 1 χ 10 HB„-Partikeln äquivalent. Bei den
ten Serums war etwa 1 χ 10 HB„-Partikeln äquivalent. Bei den
Serumempfängern entwickelte sich keine klinische oder biochemische
Erkrankung. Dieses Serum ist aber auf Grund seiner unreinen Natur, der mangelnden Reproduzierbarkeit und seiner
Nichtquantifizierbarkeit zur Verwendung als Vaccine nicht geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Hepatitis-B-Vaccine zur
Verfügung. Sie ermöglicht die Reinigung von Hepatitis-B-Antigen durch Entfernen unerwünschter Fremdproteine und/oder -antigene
und macht ein Verfahren zum Entfernen von unerwünschten Fremdproteinen oder .-antigenen aus Hepatitis-B-Antigen verfügbar.
— 2 —
609848/0897
Sie schafft pharmazeutische Zubereitungen, mit denen das gereinigte
Hepatitis-B-Antigen als Vaccine verabreicht werden kann. Weitere Vorteile und Zweckangaben der Erfindung ergeben
sich aus der folgenden Beschreibung.
Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird partiell gereinigtes
Konzentrat geklärten Plasmas, das Hepatitis-B-Antigen enthält, einer Folge von Arbeitsschritten unterworfen:
1. Das Konzentrat wird mit Pepsin bei einem pH-Wert in dem Bereich
behandelt, in dem Pepsin aktiv ist.
2. Das Konzentrat wird mit Harnstoff behandelt.
3· Das Konzentrat wird, wenn gewünscht, mit Formaldehyd behandelt.
Das anfallende Produkt, ein hochgereinigtes, reproduzierbares, kennzeichenbares, von unerwünschten Fremdproteinen und/oder
-antigenen getrenntes Hepatitis-B-Antigen, eignet sich als Vaccine.
Die Zeichnung zeigt ein UV-Spektrum des Antigens gemäss der
Erfindung.
Die Erfindung ist nachfolgend im einzelnen beschrieben.
Das Ausgangsmaterial für das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen
(HB Ag) gemäss der Erfindung ist Plasma, das von Spendern z.B. durch Plasmapherese erhalten wird. Der Antigentiter
lässt sich in bekannter Weise im radioimmunologischen Versuch, durch Passivhämagglutination oder Komplementbindung
messen. Man kühlt das Plasma und entfernt das sich bildende Kryopräzipitat durch leichtes Schleudern. Das verbleibende,
geklärte HB Ag enthaltende Plasma wird nach einer oder mehreren Techniken konzentriert, z. B. nach der Isopycnic-Banding-Technik
oder Rate-Zonal-Banding-Technik oder durch
Fällung, z. B. mit Polyäthylenglykol, Ammoniumsulfat, Natriumsulfat
und dergleichen. Dieses partiell gereinigte Konzentrat
■609848/0837
-V
ist das Ausgangsmaterial für die vorliegende Erfindung.
Bei der Isopycnic-Bandenbildung wird das partiell gereinigte
Konzentrat mit einem flüssigen Medium zusammengebracht, das in sich einen Dichtegradienten aufweist, der die Dichte des
benötigten, speziellen Antigens umfasst. Das flüssige Medium wird dann auf der Ultrazentrifuge behandelt, um eine Gleichgewicht
sverteilung der Serum-Komponenten über den Dichtegra— dienten entsprechend ihren Einzeldichten zu erhalten. Man
verdrängt dann aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums und trennt die das gewünschte Antigen enthaltenden ab. Die Anwendung
dieser Technik auf die Reinigung des Australia-Antigens ist in DT-OS 2 049 515 und US-PS J 6J6 191
beschrieben.
Bei der Rate-Zonen-Bandenbildung wird das partiell gereinigte Konzentrat auf der Ultrazentrifuge im Kontakt mit einem
flüssigen Medium behandelt, in dem ein Dichtegradient vorliegt,
wobei aber hier die Rate-Zonentechnik Anwendung findet, d. h.
man arbeitet bei einer solchen Geschwindigkeit und solchen Behandlungszeit, dass das Gleichgewicht nicht erreicht vxird,
wobei das HB Ag und andere Serum-Restkomponenten in dem Medium
entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten in dem Medium verteilt werden.
Die bei dem Verfahren eingesetzten, flüssigen Medien können jeglichen Dichtegradienten in den geeigneten Bereichen aufweisen.
Zu den bei der Bildung solcher Lösungen einzusetzenden, zu lösenden Stoffen gehören z. B. Rohrzucker, Kaliumbromid,
Cäsiumchlorid, Natriumbromid, Kaliumtartrat und dergleichen. Die Stufe des Isopycnic-Banding wird bequemerweise auf einer
Zentrifuge, z. B. der Bauart Electronucleonics-K, durchgeführt,
indem man den stehenden Rotor mit Kochsalzlösung füllt und dann aufeinanderfolgend die Salzlösung mit aliquoten Anteilen
einer Flüssigmediumlösung zunehmender Dichte nach oben verdrängt, bis ein Stufengradient gebildet ist.
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-5 *
Das Plasma wird am Kopf des Rotors unter Verdrängung eines Teils der die höchste Dichte aufweinenden Lösung vom Boden eingeführt.
Mit einem programmierten Geschwindigkeitsregelsystem, das ein Mischen während der Eeorientierungs-Anfangsphase verhindert,
wird die Zentrifuge auf die Arbeitsgeschwindigkeit gebracht. Wenn das Gleichgewicht erreicht ist und das Produkt sich in
seiner richtigen Dichte-Position befindet, erfolgt die Herabsetzung der Rotordrehzahl unter Anwendung des gleichen Systems,
um ein Mischen bei der Reorientierung zur ursprünglichen Konfiguration
zu vermeiden. Dann wird das Gradient-Medium von unten ablaufen gelassen und der richtige Dichte-Schnitt gesammelt.
Eine ähnliche Technik findet beim Rate-Zonal-Banding Anwendung. Der bei dieser Bandenbildung zu sammelnde richtige Dichte-Schnitt
ist das partiell gereinigte Konzentrat des Hepatitis-B-Antigens.
Hierauf wird durch Zusatz keimfreier, pyrogenfreier, phosphatgepufferter
Kochsalzlösung (PBS) die Protein-Konzentration des partiell gereinigten Konzentrats auf etwa 40 bis 200 yUg/ml
eingestellt. Dann wird die Lösung auf einen pH-Vert von etwa 2 bis 4- angesäuert, vorzugsweise mit HGl bei etwa 25° C.
Eine Lösung von gereinigtem Pepsin in Wasser (vorzugsweise angesetzt mit kristallinem Pepsin) wird so hinzugegeben, dass
die Lösung etwa 1 Hg Pepsin pro etwa 40 bis 500 /Ug Protein
enthält. Die Lösung wird inkubiert, bis die Digestion des Eremd-· proteins durch das Pepsin vollständig ist, was typischerweise
in etwa 8 bis 24 h bei einer Temperatur von etwa 30 "bis 38° C
der Fall ist. Die Lösung wird nun durch Zusatz einer Base, z. B. NaOH, auf etwa pH 7 gebracht. Man konzentriert das pepsinaufgeschlossene
Material durch Ultrafiltration bei etwa 5° C und gibt Harnstoff (vorzugsweise eine hochgereinigte,
kristalline Sorte) bis auf eine Endkonzentration mit der Wirksamkeit zur Dissoziation proteinartiger Substanz, typischerweise
etwa 4- .bis 8molar, hinzu. Die Mischung wird dann bei
erhöhter Temperatur inkubiert, typischerweise etwa 16 bis 24 h bei etwa 30 bis 38° C, um eine weitere Reinigung zu bewirken.
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Die inkubierte Mischung wird durch Filtration geklärt und auf
einer Säule chromatographiert, um Harnstoff, Pepsin und Reste
von der Pepsindigestion her zu entfernen. Die Säule wird mit einem keimfreien, pyrogenfreien, physiologisch akzeptablen Puffer
eluiert, der mit der Säule verträglich ist, z. B. PBS, eine Mischung von BaHgPO^ und Na2HP0^ oder eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Lösung
(Tris). Fraktionen, deren Bestimmung nach bekannten Methoden, z. B. im radioimmunologischen Versuch und
durch Komplementbindung und UV-Spektrophotometrie, einen Gehalt an HB0Ag ergibt, werden zusammengegeben und mit keimfreiem,
pyrogenfreiem, physiologisch akzeptablem Puffer (einige Beispiele
für solche Puffer sind oben schon genannt) auf einen Titer von etwa 20 iig HB Ag/ml verdünnt. Die verdünnten, vereinigten
Fraktionen werden keimfrei filtriert. Wenn gewünscht, wird das filtrierte Gut mit Formaldehyd auf eine Viren inaktivierende
Konzentration, z. B. etwa 50 bis 200 ag/ml, versetzt. Die Mischung
wird dann etwa 50 bis 100 h bei etwa 30 bis 38° C inkubiert.
Zur im wesentlichen Neutralisation des zugesetzten Formaldehyds gibt man eine keimfreie Lösung eines physiologisch
akzeptablen Neutralisationsmittels, z. B. NaHSO,, hinzu. Das
anfallende Material wird keimfrei in Glasfläschchen oder
-ampullen abgefüllt und für den Einsatz aufbewahrt.
Das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen gemäss der Erfindung
ist ein hochgereinigtes, reproduzierbares Produkt und kennzeichnet sich durch einen Teilchendurchmesser von etwa 18
1έ
bis 22 nm, ein E^8 nm von typischerweise etwa 52 bis 54- und
ein UV-Spektrum wie in der Zeichnung gezeigt.
Die Zeichnung zeigt ein UV-Spektrum des gereinigten Hepatitis B-Antigens gemäss der Erfindung.
Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, ohne dass diese auf sie beschränkt ist.
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15 767
Beispiel 1
Beispiel 1
Der Rotor einer Zentrifuge (Bauart Electronucleonics-K) wurde
mit 8400 ml Phosphatpuff er gefüllt. Nachdem der Rotor zur Entgasung
des Systems auf 10 000 U/min hochgefahren war, wurde in den Boden des stehenden. Rotors durch Pumpen folgender Stufengradient
eingeführt:
1. 2400 ml 10%ige NaBr, fm 1,08
2. 1000 ml 20%ige NaBr, £ » 1,17
3. 1500 ml 30%ige NaBr, Γ « 1,28
4·. 3500 ml 40%ige NaBr, S ' Λ »41
Unter Verdrängung von 1750 ml der 40%igen NaBr vom Rotorboden
wurden in den Kopf des stehenden Rotors 1750 ml Plasma eingepumpt, welches das Australia-Antigen enthielt. Der Rotor wurde
auf 30 000 U/min hochgefahren und 4 h mit dieser Geschwindigkeit
laufen gelassen. Dann wurde der Rotor stillgesetzt und in den Boden des Rotors 40%ige NaBr in einer Menge von 1750 ml
eingepumpt, wobei das Plasma am Rotorkopf herausgedrückt wurde. In den Rotorkopf wurden nun weitere 1750 ml frisches, Australia-Antigen
enthaltendes Plasma unter Verdrängung eines gleichen Volumens an 40%iger NaBr aus dem Rotorboden eingepumpt.
Der Rotor wurde dann 18 h mit 30 000 U/min laufen gelassen.
Nach Stillsetzung des Rotors wurde das an HB5Ag reiche Material
im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 (1000 ml) gesammelt und gegen Phosphatpuffer dialysiert. Der Rotor wurde hierauf mit
Phosphatpuffer gefüllt und dieser wie oben entgast, worauf
in den Boden des stehenden Rotors durch Pumpen der folgende Stufengradient eingeführt wurde:
1. 2400 ml 5%ige Rohrzuckerlösung, S » 1»02
2. 1750 ml 15%ige " , §>
- 1,06
3. 175O ml 25%ige " , £>
« 1,10
4. 2500 ml 50%ige " , S' « 1,23
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Unter Verdrängung von 1OOO ml der 50%igen Rohrzuckerlösung aus
dem Rotorboden wurde in den Rotorkopf das bei der HaBr-Isopycnic-Banding-Stufe
erhaltene, an HB0Ag reiche Material (1000 ml) eingepumpt. Der Rotor wurde dann 18 h bei 28 000 U/min
laufen gelassen. Nach Stillsetzen des Rotors wurde das an
HB0Ag reiche Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165
(1000 ml) gesammelt. Dieses Produkt wurde mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel unter Anfall von 56 1 Material auf einen Proteingehalt von 40 Ug/ml verdünnt.
Durch Einrühren von 1 η Salzsäure wurde der 56-1-Ansatz des durch die Zonenzentrifugiertechnik partiell gereinigten Hepatitis-B-Antig
ens (HBgAg) von 40/ug/ml bei Raumtemperatur auf
pH 2 angesäuert. Zu dem Gut wurden 56 ml einer Lösung von
kristallinem Pepsin in destilliertem Wasser (1 mg/ml) zugesetzt. Die Pepsin-Endkonzentration betrug 1 ug/ml. Der HB Ag-Ansatz
wurde 16 h bei 37 G inkubiert und durch Zusatz von 1 η Natronlauge
auf pH 7 neutralisiert.
Durch Ultrafiltration (mit einer Vorrichtung der Bauart Amicon, die mit einer Membran XMIOOa versehen war) wurde der pepsinaufgeschlossene
Ansatz auf das 295fache konzentriert. Dabei
tritt pepsinabgebautes Mchtantigen-Protein durch die Membran in das Ultrafiltrat über, während HBgAg-Partikel zurückgehalten
werden.
Durch Zusatz von festem Harnstoff zu dem Konzentrat wurde eine 4— bis 8molare Harnstofflösung gebildet, die dann weiter 16 h
bei 37° C inkubiert wurde. Das harnstoffbehandelte HB Ag-Konzentrat
wurde durch Filtrieren durch ein Glasfaser-Filter geklärt und auf Sephadex G-150 chromatographiert. Das Antigen
wurde beim Hohlraum-Volumen eluiert und war von Harnstoff,
Pepsin und anderen Proteinverunreinigungen frei. Die gereinigtes HBgAg enthaltende Fraktion wurde auf Gebrauchskonzentration
verdünnt und keimfrei filtriert. Zur weiteren Absicherung gegen die Möglichkeit des Vorliegens infektiöser Viren wurde Formalin
auf eine Konzentration von 90 bis 100/Ug/ml 72 h bei 36° C zugesetzt.
Am Ende der Formalinbehandlung wurde überschüssiger
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Formaldehyd mit Natriumbisulfit neutralisiert. ΈΛ>
des gereinigten Produkts betrug 52,3 im Vergleich mit 2358 bei dem
Zonenzentrifuge-Ausgangsmaterial. Das gereinigte Produkt bestand aus kugelförmigen Partikeln mit einem Durchmesser von
bis 22 nm und einem UV-Spektrum entsprechend der Zeichnung.
Eine Zusammenfassung von Beinigungs- und biologischen und
physikalischen Eigenschaften gibt die folgende Tabelle. In der Tabelle bedeutet OD die optische Dichte oder Absorbanz,
KB die Komplementbindung und EIV den radioimmunologischen Versucht.
| Zonenzentrifuge- produkt |
- | 2 000 | Endprodukt | |
| 0D280nm 0D260nm Volumen, ml |
0,095 0,085 56 000 |
1,6 | 112 000 000 | 0,115 0,082 23 300 |
| Gesamt-0D280nm | 5 320 | 2 680 | ||
| Lowry-Protein, u.g/ml | 40,0 | 22,0 | ||
| Gesamtprotein, mg | 2 240 | 513 | ||
| Protein-Entfernung, % | — | 77 | ||
| KB-Einhei t en/ml | 64 | 128 | ||
| KB-Einheiten insgesamt | 3 584 000 | 2 982 000 | ||
| KB-Ausbeute, % | 83 | |||
| KB-Einheiten je lag/ml Protein ' |
5,8 | |||
| EIV-Einheiten/ ml | 8 000 | |||
| EIV-Einheiten insgesamt | 180 000 000 | |||
| EIV-Ausbeute, % | 160 |
EIV-Einheiten je ng Protein ' 50 364
Bei subkutaner Injektion mit einer Einzeldosis (1,0 ml) mit einem Gehalt von 20 iig an dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen
gemäss der Erfindung zeigt bei einer Gruppe von 6 Schimpansen 4 der Tiere Antikörper-Bildung. Nach zwei zusätzlichen, in
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4-Wochen-Abständen gegebenen entsprechenden Dosen lag bei
5 der 6 Tiere Antikörper-BiIdung vor.
Beispiel 5
Ί6 Schimpansen wurden in drei Gruppen unterteilt. Die Schimpansen
der Gruppe A(6 Tiere) wurden intravenös mit 1,0 ml BOB-Hepatitiε-B-Virus geimpft und diejenigen der Gruppe B
(4 Tiere) mit 1,0 ml des Hepatitis-B-Oberflächen-Antigens gemäss
der Erfindung, während die Gruppe C (6 Schimpansen) als Kontrollgruppe diente, bei der nicht geimpft wurde. Alle
Schimpansen von Gruppe A zeigten Anzeichen einer klinischen Hepatitis-B-Infektion (Antigenemia, d. h. Auftreten von Hepatitis-B-Oberflächenantigen
im Plasma des Infizierten, Enzymerhöhungen und/oder Antikörper-Ansprechen) innerhalb von 40
Wochen. Während des gleichen Zeitraums von 40 Wochen zeigte keiner der Schimpansen der Gruppen B oder C Anzeigen für eine
klinische Hepatitis-B-Infektion.
Beispiel 4
Drei Gruppen von Grünaffen (zu je 6 Tieren) erhielten subkutan in 4-Wochen-Abständen drei Injektionen mit 1,O-ml-Dosen, die
verschiedene Mengen an dem Antigen gemäss der Erfindung enthielten.
Die jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und die Zahl der Tiere jeder Gruppe, die vor der nächsten
Injektion oder innerhalb von 4 Wochen nach der letzten Injektion Antikörper-Bildung zeigten, nennt die folgende
Tabelle.
- 10 -
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Truppe Vaccinedosis, Zahl der Antikörper-Ansprechen zeigenden
ug/ml Tiere
Woche 0 Woche 4 Woche 8
A 20 2/6 2/6 5/6
B 2 0/6 1/6 4/6
C 0,5 0/6 1/6 2/6
Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Vaccine-Dosen bei einer
Dosierung von 2 ng mehr als 50 % der Tiere Antikörper-Ansprechen.
Beispiel 5
Drei Gruppen von Meerschweinchen (zu je 14- Tieren) erhielten subkutan
zu Anfang und in Abständen von 14 und 56 Tagen Injektionen
in Form von 1,O-ml-Dosen, die verschiedene Mengen an dem Antigen
gemäss der Erfindung enthielten. Die folgende Tabelle nennt die bei jeder Gruppe bei jeder Injektion verabreichte Dosis und
die Zahl der Tiere jeder Gruppe, die bei Prüfung bei O, 28,
und 84- Tagen Antikörper—Bildung zeigten.
Gruppe Vaccinedosis Zahl der Antikörper-Ansprechen zeigenden
/ig/ml Tiere
' Tag O Tag 28 Tag 56 Tag
A 20 0/14 12/14 10/11 10/10
B 2 0/14 7/14 4/11 10/10
C 0,5 0/14 2/14 3/14- 10/12
Bemerkenswerterweise zeigten nach drei Vaccine-Dosen bei einer
Dosierung mit 0,5 /ag mehr als 80 % der Meerschweinchen Antikörp
er-Bildung.
- 11 60984 8/0897
Claims (10)
1. Verfahren zum Reinigen von Hepatitis-B-Antigen aus einem partiell gereinigten, aus geklärtem Plasma mit Gehalt an
Hepatitis-B-Antigen gewonnenen Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, dass man das Konzentrat mit Pepsin in einer
zum Abbau proteinartiger Substanz wirksamen Menge bei einem pH-Wert in dem Bereich behandelt, in dem Pepsin enzymatisch
aktiv ist, das Konzentrat mit Harnstoff in einer zur Dissoziation proteinartiger Substanz wirksamen Menge
behandelt und Pepsin, Pepsinabbauprodukte und Harnstoff entfernt und, wenn gewünscht, Formaldehyd in einer zur
Vireninaktivierung wirksamen Konzentration hinzugibt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den pH-Wert des Konzentrats mit HCl auf etwa 2 einstellt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Pepsin auf eine Konzentration von etwa 1 ug/ml
pro etwa 40 bis 500 ng Protein hinzugibt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man den Harnstoff auf eine etwa 4- bis 8molare Konzentration
hinzugibt.
5- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass
man nach der Entfernung von Pepsin, Pepsinabbauprodukten und Harnstoff Formaldehyd hinzugibt.
6. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, dass
man den Formaldehyd auf eine Konzentration von etwa 50 bis
200yug/ml hinzugibt.
7. Verfahren nach Αώsorusk 5? dadurch gekennzeichnet, dass
Her. die Ezrbfernemg iiir-sb. Filtrieren und chromatographisch
8. Gereinigtes Hepatitis-B-Oberflächenantigen mit einem Par-
A% tikeldurchmesser von etwa 18 bis 22 nm, einem E078 nm
von etwa 52 bis 54- und einem UV-Spektrum im wesentliehen
wie in der Zeichnung dargestellt.
9· Antigen nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch ein Εοήα
von etwa 52.
10. Zum Schutz gegen Hepatitis B wirksame Vaccine, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Antigen gemäss Anspruch 8 in
einem physiologisch akzeptablen, keimfreien und pyrogenfreien
Puffer.
- 13 -
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ι Η ■
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