DE3150935A1 - Verfahren zur herstellung eines hepatitis-b impfstoffes - Google Patents

Description

• "Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis-B ImpfstoffesN
• Beschreibung: Gebiet: Es wird ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen Infektionen mit dem Hepatitis-B Virus aus dem Blut von Virusträgern beschrieben.
• Zweck: Infektionen mit dem Hepatitis-B Virus verursachen in der Bundesrepublik jährlich viele zehntausend Fälle schwerer akuter Leberentzündungen, von denen 5-10 % chronisch werden und zur Leberzirrhose oder zum Leberkarzinom führen können. Weltweit gibt es mehrere hundert Millionen chronischer Virusträger. Gegen Infektionen mit diesem Virus schützt die aktive Schutzimpfung gegen Hepatitis B.
• Stand der Technik: Es ist bekannt, daß Antikörper gegen das Oberflächenantigen des Hepatitis-B Virus (Kurzbezeichnung HBsAg) vor einer Infektion mit diesem Virus schützen. Die Bildung solcher schützender Antikörper kann durch mehrfache lokale Injektion von gereinigtem HBsAg in der Mehrzahl der geimpften Personen induziert werden. Das HBsAg befindet sich nicht nur auf der Oberfläche des Virus, sondern auch auf etwa 20 nm großen Partikeln, die selbst nicht infektiös sind.
• Diese Partikel werden in größerer Menge als das Virus selbst im Blutplasma von Personen gefunden, die chronisch infiziert sind. Die Verwendung von gereinigtem 20 nm-HBsAg als Hepatitis-B Impfstoff ist von verschiedenen Arbeitsgruppen beschrieben worden. An das Herstellungsverfahren für das HBsAg aus dem Blutplasma der virusinfizierten Personen werden mehrere Ansprüche gestellt: a) Komplette Hepatitis-B Viren, die im Ausgangsmaterial vorliegen können, müssen möglichst vollständig entfernt werden, um eine möglichst geringe Restinfektiosität vor Anwendung eines Inaktivierungsmittels zu erzielen. Außerdem könnte nach Abtötung des Virus seine DNA eine onkogene Wirkung haben.
• b) Serumproteine, die in etwa 1000 bis 5000-fachem Uberschuß vorliegen, sollen ebenfalls möglichst vollständig entfernt werden, um unerwünschte Immunisierungen u.a. Autoimmunisierungsprozesse zu vermeiden.
• c) Die Ausbeute an 20 nm-Partikeln soll möglichst nahe an 100 % liegen, da das Rohmaterial nur in begrenzter Menge erhältlich ist.
• d) Die immunologische Aktivität des HBsAg soll möglichst gut erhalten bleiben, da hiervon die Wirksamkeit abhängt.
• e) Das Reinigungsverfahren muß für große Ansätze geeignet sein. Es darf technisch nicht zu schwierig sein und es soll keine teuren Reagenzien benötigen, da in Zukunft die Impfung in breitem Maßstab durchgeführt werden soll.
• f) Mögliche Restinfektiosität im gereinigten HBsAg muß durch wirksame virusabtötende Maßnahmen beseitigt werden.
• Kritik des Standes der Technik Neben zahlreichen Verfahren für die Herstellung kleiner Mengen an HBsAg wurden im wesentlichen drei Verfahren für die Herstellung eines Hepatitis-B Impfstoffes beschrieben, die ein qualitativ annehmbares Produkt liefern. Das erste Verfahren verwendet ein vierstufiqes Präzipitationsverfahren, eine Verdauung mit Pepsin, eine Behandlung mit Harnstoff sowie zwei zonale Zentrifugationsschritte. Die Behandlung mit Pepsin erlaubt zwar die Entfernung von Serumproteinen auf einfache Weise, sie dürfte der Immunogenität des Impfstoffes aber nicht förderlich sein (Am,J.Sc. 270, 401, 1975). Das zweite Verfahren benötigt mehrere zonale Zentrifugationsschritte, um eine noch ausreichende Reinheit zu erzielen, ohne daß Serumalbumin vollständig entfernt werden konnte.
• Der Zentrifugationsschritt ist im allgemeinen technisch am aufwendigsten von allen Einzelschritten (Ann.Microbiol.Inst.Pasteur, 129 B, 87, 1978). Das dritte Verfahren schließt nach einer vierstufigen Präzipitation die Adsorption an AerosilR ein. Die Ablösung des HBsAg erfördert ein ionisches Detergens, das die Struktur der 20 nm-Partikel erheblich beeinflußt. Danach erfolgt eine Gelchromatographie und dann erst die zonale Zentrifugation im Dichtegradienten (Prog.med.Virol. 27, 163, 1981). Allen vorstehend beschriebenen drei Verfahren ist gemeinsam, daß das gereinigte HBsAg nach dem letzten Reinigungsschritt in konzentrierter Cäsiumchlorid- oder Natriumbromidlösung vorliegt, so daß noch ein weiterer Schritt für die Entfernung oder Verringerung des Salzgehaltes erforderlich wird. Das gereinigte HBsAg wird bei den bekannten Verfahren vor der Verwendung als Impfstoff zur Abtötung von Viren 4 Tage lang mit Formalin in der Verdünnung 1:2000 bis 1:4000 bei 370C behandelt-. Dieses Verfahren ist bei kleinen RNA-Viren -(z.B.
• Poliovirus) hochwirksam, jedoch werden kleine DNA-Viren (z.B. SV 40-Virus) nur durch geringer verdünntes Formalin vollständig ab getötet. Da das Hepatitis-B Virus ein kleines DNA-Virus ist und seine Infektiosität experimentell nur sehr schwierig durch Tierversuche im Schimpansen nachweisbar ist, wäre eine höhere Formalindosis aus Sicherheitsgründen dringend erwünscht. Das Formal in muß nach der Inaktivierung aus dem Impfstoff zum Abstoppen der Reaktion rasch, ferner möglichst vollständig entfernt Werden, da Formalin direkt topisch ist oder allergisierend wirkt.
• Dialyse oder Gelchromatographie sowie chemische Abbindung sind bekannte Verfahren, die jedoch in diesem Falle zu langsam, zu umständlich, mit Wirkungsverlust verbunden oder, pharmakologisch bedenklich sind.
• Aufgabe: Es sollte, \,Ufl,,, das HBsAg aus Blut auf möglichst einfache Weise so gereinigt un von infektiösen Viren befreit werden, daF bei guter Wirksamkeit und Verträglichkeit die Sicherheit des daraus hergestellten Hepatitis-B Impfstoffes verbessert wird, Lösung; Das Reinigungsuerfahren liefert mit nur drei übersichtlichen Schritten HBsAg in mehr als 99%iger Reinheit mit einer Ausbeute über 95 % bei guter Aktivitätserhaltung.
• Im ersten Schritt werden aus dem Blutplasma eventuell vorhandele Hepatitis-B Viren sqwie IgM und ß-Lipoprotein mit 6,0 * Polyethylenglykol (PE) bei pH 7,4 ausgefällt, während HBsAg - 29 nm Partikel in Lösung bleiben. Der Überstand wird danach auf 12,0 % PEG gebracht, wobei die 20 nm HBsAg-Partikel ausfallen, während Albumin in Lösung bleibt.
• Das Pellet kann in 1/20 des Ausgangsvolumens in Lösung gebracht werden, etwa 90 % der Serumproteine werden dabei entfernt. Diese Lösung wird nun mit Kaliumbromid auf eine Dichte von 1,30 g/ml eingestellt und dann in einem B 15 Zonalrotor mit KBr-Lösung der Dichte 1,28 bis 1,12 überschichtet, Bei hohen Drehzahlen 28.000 UpM, 2 Tage flotiert das HBsAg bis zu einer Schicht mit der Dichte 1,20 g/ml,, während alle anderen Proteine mit Ausnahme des α -Lipoproteins bei der Ausgangsposition von 1,30 verbleiben. Das HBsAg enthält nach dieser Stufe nur noch a -Lipo- protein und Kaliumbromid als wesentliche Verunreinigung.
• Diese Verunreinigungen werden dann nach einem Ultrafiltrationsschritt durch Gelchromatographie abgetrennt. Das Trennmedium (6 % Agarosegelperlen) wird dabei so gewählt, das eventuell verbliebene Viruspartikel noch einmal von den 20 nm HBsAg-Partikeln abgetrennt wurden. Nach dieser Behandlung ist das HBsAg elektrophoretisch rein und frei von störenden Bestandteilen.
• Die Inaktivierung hypothetisch vorhandener Restinfektiosität wird nun mit Formalin in der Verdünnung 1:450 4 Tage bei 37°C vorgenommen. Es wurde gefunden, daß hierbei etwa 40 % der Antigenaktivität verloren geht, jedoch scheint dieser Verlust zu Gunsten des erheblichen Sicherheitsgewinns akzeptabel. Weiterhin wurde gefunden, daß sich das HBsAg in physiologischer Kochsalzlösung an Aluminiumhydroxidgel binden läßt. Fügt man zur formalinhaltigen HBsAg-Lösung Aluminiumhydroxidgel zu, so kann das resultierende HBsAg-haltige Gel durch Sedimentation und Resuspendierung mit physiologischer Salzlösung auf einfache Weise gewaschen und so von Formaldehyd befreit-werden.
• Das HBsAg wird nun gebunden an das Gel als Impfstoff verwendet.
• Vorteile: Die Vorteile des Reinigungsverfahrens bestehen darin, daß insgesamt nur drei Schritte benötigt werden, um eine 5000-fache Anreicherung und eine mehr als 99%ige Reinheit zu erzielen. Zusätzlich wird der Gehalt an Hepatitisviren (sofern vorhanden) um mindestens den Faktor 104, wahrscheinlich um wesentlich mehr, gesenkt. Fällungen mit Ammonsulfat, mehrfache Ultrazentrifugationen, Behandlung mit Enzymen oder Detergentien und Dialysen werden unnötig, da speziell das Verfahren der Flotation des HBsAg durch schwere Salzlösungen eine hohe Kapazität hat und zugleich überaus effizient ist. Die vorausgehende Fäl-lung mit Polyethylenglykol und die nachfolgende Gelchromatographie ergänzen diesen Schritt optimal. Für die Inaktivierung konnte die Formalinkonzentration um den Faktor 4 bis 9 gegenüber bisherigen Verfahren gesteigert werden. Die Entfernung des Formalins durch Waschen eines Gels, an das HBsAg zur Steigerung der Wirksamkeit ohnehin gebunden wird, erspart den Schritt einer Dialyse, die unter sterilen Bedingungen recht schwierig ist und nicht rasch genug wirken würde.
• Anwendungsbeispiel: 1. 10,25 1 Blutplasma mit 8000 Einheiten HBsAg/ml (insgesamt 82 X: 1Q Einn.) werden mit 32 % PEG in 0,1 M Tris/ HCl pH 7,2 auf eine Konzentration ovn 6,0 % (w/v) PEG gebracht, 30 min bei Raumtemperatur gerührt und dann in einer Stock-Zentrifuge bei 3000 UpM für 30 min zentrifugiert. Der überstand wird danach auf 12,0 % PEG eingestellt und nach 30 min Rühren wieder zentrifugiert. Der Übertand nach dieser Zentrifugation wird verworfen, das Pellet mit etwa 400 ml Tris-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4 + 0,9 % NaCl) auf 500 ml aufgefüllt, homogenisiert und bis zur vollsätandigen Lösung gerührt.
• 2. Die Lösung wird mit festem Kaliumbromid auf eine Dichte von 1,30 g/ml eingestellt. I-n einem B. 15 Zonalrotor werden 180 ml KBr-Lsg. d = 1,34 g/ml gepumpt, dann die Probe (ca. 470 ml), dann 250 ml KBr-Lsg. d = 1,28 dann 500 ml KBr-Lsg. d = 1,26 und schließlich 250 ml Tris-Puffer. Nach 46 h bei 26 000 UpM und 10°C wird die Lösung ausgepumpt. In Abb. 1 sind die optische Dichte bei 280 nm in der Ausgepumplösung und die HBsAg-Aktivität dargestellt. Bereits in dieser Stufe zeigt das HBsAg einen eingenen O.D. - Gipfel.
• 3. Die zusammengefaßten positiven Fraktionen der isopyknischen Flotation werden in. einer Ultrafiltrationszelle auf etwa 50 ml ankonzentriert und dann auf eine Säule der Dimension 5 x 90 cm mit Biogei A5M 2QO-400 mesh gegeben und mit 0,13 M NaCl 0,001 MaPO4 pH 7,4 eluiert (Abb. 2). Der erste O.-D..Gipfel im Eluat entspricht reinen 20 nm-HBsAg Partikeln in physiologischer Salzlösung:. Die Frak-tionen mit einem Gehalt über 20 000 KE/ml werden. zusammengefaßt. Dabei wurden 350 ml einer Lösung von 310 µg HBsAg-Protein/ml, also insgesamt 108,5 mg, erhalten. Die immunologische Aktivität betrug 154.000 Einh./ml, insgesamt 53,9 x 106 Einh., dies sind 65,7 % der Anfangsaktivität.
• 4. Das HBsAg aus insgesamt sechs solchen Reinigungsgängen wurde vereinigt und mit 0,13 M NaCl, 0,002 M Na-P04, pH 7,4 auf 8,7 1 in einem geschlossenen sterilen Glasapparat aufgefüllt, dann mit 100 ml zeiger Formaldehydlösung vermischt und 4 Tage bei 370C inkubiert.
• die Lösung wird dann mit 500 ml einer 1 %igen Al (OH)3-Suspensioin verrührt, auf 4°C abgekühlt und stehengelassen. Nach dem vollständigen Absetzen des Gels wird der Uberstand abgehebert, und es werden 10 1 frische physiologische Salzlösung zugerührt. Nach erneutem Absetzen wird der Uberstand entfernt und das Gel noch zweimal auf die gleiche Weise gewaschen. Die'Formaldehydkonzentration wird dadurch von 0,79 mg/ml auf 0,001 mg/ml im Endprodukt herabgesetzt. Aus 55,1 1 Blutplasma mit der relativ niedrigen Ausgangsmenge von 584 x 106 Einheiten HBsAg konnten so etwa 10 000 Impfdosen mit 40 ßg HBsAg-Protein erhalten werden.
• 5. Qualitätskriterien: Abb. 2 zeigt die Elutionskurve der Gelchromatographie mit dem HBsAg-Gipfel. Die einzelnen Fraktionen der Chromatographie wurden in der SDS-Gelelektrophorese analysiert. Dabei wurden (abgesehen von P68) nur HBsAg spezifische Proteine gefunden. P68 ist adsorbiertes Serumalbumin, das jedoch nur in Spuren vorliegt. Andere Impf stoffe haben einen wesentlich stärkeren Gehalt an P68. Abb.3 zeigt das UV-Spektrogramm des gereinigten HBsAg.
• Im Gegensatz zu normalen Serumproteinen zeigt HBsAg eine ausgeprägte Schulter bei 290 nm, die auf seinen hohen Tryptophangehalt zurückzuführen ist. Die spezifische O.D. bei 280 nm ist 43 für eine 1% Lösung.
• Abb. 4 zeigt die Dosis-Wirkungskurve bei der Immunisierung von Meerschweinchen im Vergleich zu einer Referenzvakzine der National Institutes of Health, Bethesda, Md., USA.
• L e e r s e i t e

Claims (2)

1. PatentansprUche: 1. Verfahren zur Herstellung eines Hepatitis-B Impf stoffes aus 20 nm HBsAg-Partikeln aus dem Blut von HBsAg-Trägern, dadurch gekennzeichnet, daß die 20 nm-Partikel durch Fälung-mit 5-7 %, vorzugsweise 6 % PolyethylengLykol vorgereinigt, mit 11-14 % Polyethylenglykol, vorzugsweise 12 %, angereichert werden und durch Flotation in Salzlösung der-Dichte 1,34 bis 1,20 g/ml, danach durch Gelchromatographie, vorzugsweise mit 6 % Agarosegel, gereinigt werden.
2. 2. Verfahren zur Inaktivierung der Restinfektiosität eines Hepatitis-B Impfstoffes dadurch gekennzeichnet, daß das Inaktivierungsmittel, vorzugsweise Formaldehyd mit einer Konzentration über 0,4 mg/ml, durch Waschen des an eine unlösliche Substanz adsorbierten HBsAntigens entfernt wird, wobei vorzugsweise solche Adsorbentien eingesetzt werden, die zugleich als immunologisches Adjuvans Verwendung finden können, vorzugsweise Aluminiumhydroxidgel.