DE2709581C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Konzentrieren von HB_sAg und Dichtegradienten mit einem Gehalt an HB_sAg.

Hepatitis B ist eine virale Hepatitis, die eine systemische Infektion bewirkt, bei der die hauptsächlichen pathologischen Veränderungen in der Leber auftreten. Von dieser Krankheit werden hauptsächlich Erwachsene befallen. Die Übertragung der Infektion erfolgt hauptsächlich durch Langzeitträger des Virus. Im allgemeinen erfolgt die Verbreitung dieser Krankheit durch Bluttransfusionen, verunreinigte Nadeln und Spritzen, bei Hautverletzungen durch Schnitte oder Kratzer, durch nicht sterilisierte zahnärztliche Instrumente sowie durch Speichel, venerischen Kontakt oder durch Einwirkung von aerosolisiertem infiziertem Blut.

Die Inkubationszeit von Hepatitis B ist relativ lang. Zwischen der Infektion und dem Auftreten von klinischen Symptomen können 6 Wochen bis 6 Monate verstreichen. Im allgemeinen beginnt die Krankheit mit Müdigkeit und Appetitlosigkeit, gelegentlich verbunden mit Muskelschmerzen und Bauchbeschwerden. Später können Gelbsucht, dunkler Urin, heller Stuhl und eine leichte Leberschwellung auftreten. In manchen Fällen erfolgt der Krankheitsausbruch rasch, wobei früh Gelbsucht zusammen mit Fieber, Schüttelfrost und Leukozytose auftreten. In anderen Fällen ist es möglich, daß die Gelbsucht nie erkannt wird und der Patient nur eine grippeartige Erkrankung bemerkt. Man nimmt an, daß die Mehrzahl von Hepatitisinfektionen zu einer leichten, anikterischen Erkrankung führt.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Konzentrieren von HB_sAg aus geklärtem Plasma bereitzustellen.

Der Gegenstand der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert.

Als Ausgangsmaterial für das zu konzentrierende Hepatitis B-Oberflächenantigen (HB_sAg) wird Plasma von Hepatitis B-Spendern verwendet, das beispielsweise durch Plasmaphorese gewonnen wird. Die Antigenkonzentration kann auf übliche Weise durch Radioimmunbestimmung, passive Hämagglutinierung oder Komplementfixierung gewonnen werden. Das Plasma wird gekühlt und das gebildete Kryopräzipitat durch leichte Zentrifugation entfernt. Das im erhaltenen geklärten Plasma befindliche HB_sAg wird vorzugsweise durch eine bestimmte isopyknische Bandenbildung, gefolgt von einer bestimmten Geschwindigkeitszonen-Bandenbildung, isoliert.

Bei der isopyknischen Bandenbildung wird das teilweise gereinigte Konzentrat mit einem flüssigen Medium, das einen Dichtegradienten aufweist, der die Dichte des zu isolierenden speziellen Antigens einschließt, in Kontakt gebracht. Das flüssige Medium wird anschließend der Ultrazentrifugation unterworfen, um eine Gleichgewichtsverteilung der Serumbestandteile im Dichtegradienten je nach deren individueller Dichte zu erreichen. Nacheinander werden Fraktionen des Mediums verdrängt und die Fraktionen, die das gewünschte Antigen, d. h. Fraktionen mit einer Dichte von 1,21 bis 1,24 g/cm³, enthalten, werden abgetrennt. Die Anwendung dieser Technik auf die Reinigung von HB_sAg ist in der DE-OS 20 49 515 und in der US-PS 36 36 191 beschrieben. Die Konzentrationen der den Gradienten bildenden Lösungen werden so gewählt, daß eine Dichte von 1,0 bis 1,41 g/cm³ umfaßt wird. Das flüssige Medium kann in Form eines linearen Gradienten oder eines Stufengradienten verwendet werden. Vorzugsweise wird wegen seiner höheren Fraktionierungskapazität ein Stufengradient verwendet.

Bei der Geschwindigkeitszonen-Bandenbildung wird das teilweise gereinigte Konzentrat im Kontakt mit einem flüssigen Medium, das einen Dichtegradienten aufweist, ultrazentrifugiert, wobei aber in diesem Fall das Geschwindigkeitszonen-Verfahren angewendet wird, d. h. die Geschwindigkeit und die Dauer der Zentrifugation wird so gewählt, daß sich kein Gleichgewicht einstellt, während sich HB_sAg und die anderen restlichen Serumbestandteile gleichmäßig im Medium je nach ihren Sedimentationskoeffizienten im Medium verteilen. Die Konzentrationen der den Stufengradienten bildenden Lösungen werden so gewählt, daß ein Dichtebereich von 1,0 bis 1,28 g/cm³ umfaßt wird. Die Geschwindigkeitszonen-Stufe wird so lange durchgeführt, bis sich das HB_sAg im Dichtebereich von 1,13 bis 1,16 g/cm³ befindet. Dann wird das HB_sAg vom Großteil der rohen Plasmaproteine und, was besonders wichtig ist, auch vom Makroglobulin-Komplement des Plasmas getrennt. Wird die Geschwindigkeitszonen-Stufe so durchgeführt, daß das gewünschte HB_sAg-Antigen seine Gleichgewichtslage, d. h. 1,18 bis etwa 1,20 g/cm³, erreicht, so läßt sich feststellen, daß in der gewünschten HB_sAg-Antigenfraktion eine Plasma-Makroglobulinfraktion als Verunreinigung auftritt.

Die isopyknische Bandenbildungsstufe wird zweckmäßigerweise in einer Zentrifuge (z. B. Electronucleonics-K) durchgeführt, indem man den stationären Rotor mit einer Kochsalzlösung füllt und anschließend die Kochsalzlösung nach oben mit Aliquotmengen eines flüssigen Mediums von ansteigender Dichte verdrängt, bis ein Gradient gebildet ist. Das Plasma wird am Rotorkopf eingeführt, wobei ein Teil der Lösung mit der höchsten Dichte am Rotorfuß verdrängt wird. Typischerweise beträgt das Plasmavolumen etwa 15 bis etwa 40 Prozent des Stufengradienten.

Anschließend wird die Zentrifuge mittels eines programmierten Geschwindigkeitssteuersystems, das ein Vermischen während der anfänglichen Reorientierungsphase verhindert, auf die erforderliche Geschwindigkeit gebracht. Wenn Gleichgewicht erreicht ist und sich das Produkt an der Stelle entsprechender Dichte befindet, wird der Rotor mittels des gleichen Systems verlangsamt, um ein Vermischen bei der Reorientierung auf die ursprüngliche Konfiguration zu verhindern. Anschließend wird der Gradient von unten abgenommen und die Fraktion entsprechender Dichte aufgefangen. Ein ähnliches Verfahren wird bei der Geschwindigkeitszonen-Bandenbildung angewendet. Die Fraktion der entsprechenden Dichte bei der Geschwindigkeitszonen-Bandenbildung ist das gewünschte Konzentrat vom Hepatitis B-Antigen.

Aufgrund der geringen Größe von HB_sAg (etwa 20 nm) ist die isopyknische Bandenbildungsstufe sehr zeitraubend und erfordert eine Zentrifugationszeit von etwa 18 Stunden. Somit kann man innerhalb von 7 Tagen bei einem Betrieb rund um die Uhr nur etwa 4 Chargen geklärtes Plasma pro Zentrifuge herstellen. Die Produktivität läßt sich natürlich durch Verwendung von zusätzlichen Zentrifugen steigern. Dies erfordert aber einen außerordentlich hohen Kapitaleinsatz, da jede Zentrifuge etwa 250 000,- DM kostet.

Es wurde nun festgestellt, daß sich die Produktivität wesentlich steigern und die Kosten beträchtlich verringern lassen, wenn man eine Mehrfachbeladung des Gradienten zur isopyknischen Bandenbildung vornimmt. Unter Mehrfachbeladung ist der Vorgang zu verstehen, wenn man eine Probe geklärtes Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg den Bedingungen zur isopyknischen Bandenbildung so lange aussetzt, daß im wesentlichen das gesamte HB_sAg im geklärten Plasma in den Gradienten gelangt, wobei aber die Zeit nicht ausreicht, um den Gleichgewichtszustand zu erreichen. Diese Stufe wird mindestens 1mal mit einer zusätzlichen Probe geklärten Plasmas mit einem Gehalt an HB_sAg wiederholt, bevor die Bedingungen zur isopyknischen Bandenbildung so lange eingehalten werden, daß der Gleichgewichtszustand erreicht wird. Gegebenenfalls kann der Gradient mit bis zu 6 Proben geklärten Plasmas beladen werden. Da die Zeit, die erforderlich ist, bis das HB_sAg im geklärten Plasma in den Gradienten gelangt, nur einen Bruchteil der zum Erreichen des Gleichgewichtszustands erforderlichen Zeit ausmacht und da die nachher zum Einstellen des Gleichgewichtszustands erforderliche Zeit unabhängig davon, ob eine Einfach- oder Mehrfachbeladung des Gradienten vorgenommen wird, immer gleich ist, ergeben sich eine wesentliche Zeitersparnis und eine wesentliche Verringerung der Verfahrenskosten.

Die isopyknische Bandenbildung wird bis zum Gleichgewichtszustand durchgeführt, indem man etwa 10 Stunden oder darüber bei etwa 40 000 bis etwa 80 000 g zentrifugiert. Es wurde jedoch festgestellt, daß bei einem etwa 4stündigen Zentrifugieren des Plasmas das gesamte HB_sAg in den isopyknischen Bandengradienten wandert. Anschließend wird die Probe des verbrauchten Plasmas entfernt und eine frische Plasmaprobe, deren Volumen dem der ersten Probe entspricht, auf den Gradienten geschichtet. Anschließend kann die Zentrifugation wie vorher etwa 10 Stunden oder mehr durchgeführt werden, um das HB_sAg in beiden Proben in den Gleichgewichts-Dichtebereich des Gradienten (1,21 bis 1,24 g/cm³) wandern zu lassen und die Bandenbildung zu vervollständigen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, wieder 4 Stunden zu zentrifugieren, das verbrauchte Plasma zu entfernen und eine dritte Probe frischen Plasmas auf den Gradienten zu schichten. Dieses Verfahren der Mehrfachbeladung kann 6mal oder noch öfter wiederholt werden, bevor die Bandenbildung durch etwa 18stündiges Zentrifugieren vollendet wird.

Das Volumenverhältnis von Beschickung (Plasma) zu Gradienten beträgt etwa 1 : 3 bis etwa 1 : 6. Bei einer einzigen Beschickung des Gradienten mit Plasma und anschließender Zentrifugation unter den Bedingungen zur Bildung von isopyknischen Banden (etwa 16 bis etwa 20 Stunden bei 30 000 U/min in der K-II-Zentrifuge) weist das erhaltene Produkt im allgemeinen einen Proteingehalt von etwa 4 bis 10 mg/ml in einem Volumen von etwa 1,0 Liter auf, je nach der Proteinmenge im ursprünglichen Plasma.

Bei einer Zweifachbeschickung des Gradienten mit Plasma und Zentrifugation unter Bedingungen zur Bildung von isopyknischen Banden (etwa 16 bis etwa 20 Stunden bei 30 000 U/min) weist das erhaltene Produkt einen Proteingehalt auf, der sich additiv aus den eingesetzten Chargen ergibt, d. h. etwa 8 bis 20 mg/ml in einem Volumen von etwa 1,0 Liter, je nach der Proteinmenge im ursprünglichen Plasma. Die Proteinkonzentration steigt auf diese Weise bei jeder zusätzlichen Beschickung des Gradienten mit Plasma.

Das Produkt wird anschließend einer Geschwindigkeitszonen-Bandenbildung unterworfen, die so lange ausgeführt wird, bis das HB_sAg sich im Dichtebereich von etwa 1,13 bis etwa 1,16 g/cm³ befindet. Im allgemeinen dauert dies etwa 16 bis etwa 20 Stunden, vorzugsweise etwa 17 bis etwa 18 Stunden, bei etwa 30 000 bis etwa 60 000 g.

Erfindungsgemäß wird der Gradient aus Natriumbromid gebildet. Im Gegensatz zu den bisher eingesetzten Materialien weist Natriumbromid bestimmte Vorteile auf. Die Löslichkeit von Natriumbromid erlaubt die Verwendung von Lösungen hoher Dichte bei der Gradientenbildung unter Kühlschranktemperaturen (2 bis 6°C). Gegenüber Salzen, wie Cäsiumchlorid, weist Natriumbromid erhebliche wirtschaftliche Vorteile auf. Zudem treten bei Verwendung von Natriumbromid keine Toxizitätsprobleme beim Menschen auf, die von verbleibenden oder an HB_sAg gebundenen Cäsiumionen verursacht werden. Beim Natriumbromid-Gradienten sind alle Ionen, die an das HB_sAg gebunden sind, aufgrund der biophysikalischen Eigenschaften, Natriumionen, die mit dem menschlichen biologischen System gut verträglich sind und keine Toxizitätsprobleme mit sich bringen.

Die biophysikalischen Eigenschaften von HB_sAg sind gut bekannt (vgl. J. Clinical Investigation, Bd. 52 (1973), S. 1176 und J. of Virology, Bd. 10 (1972), S. 469). Es handelt sich um ein negativ geladenes Teilchen. In Anwesenheit von sehr hohen Konzentrationen von positiv geladenen Natriumionen bildet sich ein Natrium-HB_sAg-Salzmolekül. Diese Molekülart ist mit dem menschlichen biologischen System verträglich. Im Gegensatz zu herkömmlichen Produkten ist das erfindungsgemäß erhältliche HB_sAg im wesentlichen frei von anderen Kationen, insbesondere frei von Cäsium- und Kaliumionen.

Die bessere Löslichkeit von NaBr bei tieferen Temperaturen im Vergleich zu KBr erlaubt die Anwendung von derartigen tieferen Temperaturen, was für die Stabilität von biologischen Materialien von Vorteil ist. Die Verwendung eines Stufengradienten wird gegenüber der Verwendung eines linearen Gradienten bevorzugt, da dabei die Verunreinigungen in den Stufenrändern angereichert werden und somit die Verarbeitung eines größeren Plasmavolumens in einem einzigen Gradienten möglich ist.

Das erfindungsgemäß erhältliche Antigen ist als solches als Antigen für Hepatitis B wertvoll und kann gemäß den Angaben in der US-PS 36 36 191 verwendet werden. Das erfindungsgemäß erhältliche HB_sAg-Antigen ist ein hochgereinigtes Produkt. Durch die isopyknische Bandenbildung ergibt sich eine etwa 100fache Reinigung von HB_sAg in bezug auf das normale Plasmaprotein. Die Geschwindigkeitszonen-Bandenbildung erlaubt eine weitere etwa 20fache Reinigung von HB_sAg in bezug auf das normale Plasmaprotein. Die Kombination dieser beiden Stufen ergibt eine etwa 2000fache Reinigung von HB_sAg in bezug auf das normale Plasmaprotein. Das erhaltene Produkt erweist sich als im wesentlichen frei von den Blutgruppensubstanzen A und B, wie sich durch serologische und elektrophoretische Messungen zeigen läßt. Außerdem läßt sich das erfindungsgemäß erhältliche Antigen als Ausgangsmaterial für das Hepatitis B-Antigen der DE-OS 26 21 276 verwenden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der Rotor einer Zentrifuge (Electronucleonics K) wird mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nach einem Rotorlauf bis 10 000 U/min, um das System zu entgasen, wird der folgende Stufengradient in den Boden des stationären Rotors gepumpt:

• 1. 2400 ml 10prozentiges NaBr, ρ = 1,08
  2. 1000 ml 20prozentiges NaBr, ρ = 1,17
  3. 1500 ml 30prozentiges NaBr, ρ = 1,28
  4. 3500 ml 40prozentiges NaBr, ρ = 1,41

1750 ml Plasma mit einem Gehalt an Australia-Antigen (HB_sAg) werden von oben in den stationären Rotor gepumpt, wobei 1750 ml 40prozentiges NaBr am Rotorfuß verdrängt werden. Anschließend wird der Rotor auf 30 000 U/min beschleunigt und 18 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Nach dem Abstoppen des Rotors werden 500 ml von an HB_sAg reichem Material im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 g/cm³ gewonnen und gegen Phosphatpuffer dialysiert.

Anschließend wird der Rotor mit Phosphatpuffer gefüllt und auf vorstehend beschriebene Weise entgast. Sodann wird in den stationären Rotor von unten der folgende Stufengradient gepumpt:

• 1. 2400 ml  5prozentige Saccharose, ρ = 1,02
  2. 1750 ml 15prozentige Saccharose, ρ = 1,06
  3. 1750 ml 25prozentige Saccharose, ρ = 1,10
  4. 2500 ml 50prozentige Saccharose, ρ = 1,23

Das durch die isopyknische Bandenbildung mit NaBr gewonnene, an HB_sAg reiche Material (500 ml) wird in den Rotor gepumpt, wobei 500 ml 50prozentige Saccharose am Rotorfuß verdrängt werden. Sodann wird der Rotor 18 Stunden bei 28 000 U/min betrieben. Nach dem Abstoppen des Rotors werden 500 ml von an HB_sAg reichem Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 g/cm³ gewonnen.

Beispiel 2

Der Rotor einer Zentrifuge (Electronucleonics K) wird mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nach dem Entgasen des Systems durch einen Betrieb des Rotors bis 10 000 U/min wird von unten in den Rotor der folgende Stufengradient gepumpt:

• 1. 2400 ml 10prozentiges NaBr, ρ = 1,08
  2. 1000 ml 20prozentiges NaBr, ρ = 1,17
  3. 1500 ml 30prozentiges NaBr, ρ = 1,28
  4. 3500 ml 40prozentiges NaBr, ρ = 1,41

Sodann werden 1750 ml Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg von oben in den stationären Rotor gepumpt, wodurch 1750 ml 40prozentiges NaBr am Rotorfuß verdrängt werden. Sodann wird der Rotor auf 30 000 U/min beschleunigt und 4 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Hierauf wird der Rotor abgestoppt und 1750 ml 40prozentiges NaBr werden in den Rotorfuß gepumpt, wodurch das Plasma am Rotorkopf verdrängt wird. Sodann werden weitere 1750 ml frisches Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg in den Rotorkopf gepumpt, wobei ein entsprechendes Volumen an 40prozentigem NaBr am Rotorfuß verdrängt wird. Der Rotor wird sodann 18 Stunden bei 30 000 U/min betrieben. Nach dem Abstoppen des Rotors werden 1000 ml von an HB_sAg reichem Material im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 g/cm³ gewonnen, die dann gegen Phosphatpuffer dialysiert werden.

Der Rotor wird anschließend mit Phosphatpuffer gefüllt und auf die vorstehend beschriebene Weise entgast. Anschließend wird von unten in den stationären Rotor der folgende Stufengradient gepumpt:

• 1. 2400 ml  5prozentige Saccharose, ρ = 1,02
  2. 1750 ml 15prozentige Saccharose, ρ = 1,06
  3. 1750 ml 25prozentige Saccharose, ρ = 1,10
  4. 2500 ml 50prozentige Saccharose, ρ = 1,23

Das an HB_sAg reiche Material aus der isopyknischen Bandenbildungsstufe mit NaBr (1000 ml) wird in den Rotorkopf gepumpt, wobei 1000 ml 50prozentige Saccharose am Rotorfuß verdrängt werden. Anschließend wird der Rotor 18 Stunden bei 28 000 U/min betrieben. Nach dem Abstoppen des Rotors werden 1000 ml von an HB_sAg reichem Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 g/cm³ gewonnen.

Beispiel 3

Der Rotor einer Zentrifuge (Electronucleonics K) wird mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nach einem Rotorlauf bis 10 000 U/min zur Entgasung des Systems wird der folgende Dichtegradient von unten in den stationären Rotor gepumpt:

• 1. 2400 ml 10prozentiges NaBr, ρ = 1,08
  2. 1000 ml 20prozentiges NaBr, ρ = 1,17
  3. 1500 ml 30prozentiges NaBr, ρ = 1,28
  4. 3500 ml 40prozentiges NaBr, ρ = 1,41

1750 ml Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg werden sodann von oben in den stationären Rotor gepumpt, wodurch 1750 ml 40prozentiges NaBr am Rotorfuß verdrängt werden. Sodann wird der Rotor auf 30 000 U/min beschleunigt und 4 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Anschließend wird der Rotor abgestoppt und 1750 ml 40prozentiges NaBr werden von unten in den Rotor gepumpt, wodurch das Plasma durch den Rotorkopf verdrängt wird. Sodann werden weitere 1750 ml frisches Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg in den Rotorkopf gepumpt, wodurch das gleiche Volumen an 40prozentigem NaBr am Rotorfuß verdrängt wird. Hierauf wird der Rotor auf 30 000 U/min beschleunigt und 4 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Anschließend wird der Rotor abgestoppt und eine dritte Charge von 1750 ml frischem Plasma mit einem Gehalt an HB_sAg wird in den Plasmakopf gepumpt, wobei das gleiche Volumen an 40prozentigem NaBr am Rotorfuß verdrängt werden. Hierauf wird der Rotor 18 Stunden bei 30 000 U/min betrieben. Nach dem Abstoppen des Rotors werden 1500 ml von an HB_sAg reichem Material im Dichtebereich von 1,21 bis 1,24 g/cm³ gewonnen, die gegen Phosphatpuffer dialysiert werden.

Sodann wird der Rotor mit Phosphatpuffer gefüllt und auf die vorstehend beschriebene Weise entgast. Der folgende Dichtegradient wird in den Fuß des stationären Rotors gepumpt:

• 1. 2400 ml  5prozentige Saccharose, ρ = 1,02
  2. 1750 ml 15prozentige Saccharose, ρ = 1,06
  3. 1750 ml 25prozentige Saccharose, ρ = 1,10
  4. 2500 ml 50prozentige Saccharose, ρ = 1,23

Das bei der isopyknischen Bandenbildungsstufe mit NaBr erhaltene, an HB_sAg reiche Material (1500 ml) wird in den Rotorkopf gepumpt, wobei am Rotorfuß 1500 ml 50prozentige Saccharose verdrängt werden. Anschließend wird der Rotor 18 Stunden bei 28 000 U/min betrieben. Nach dem Abstoppen des Rotors werden 1500 ml von an HB_sAg reichem Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 g/cm³ gewonnen.

Beispiel 4

Aus der nachstehenden Tabelle ergibt sich der deutliche Ausbeuteanstieg pro Zeiteinheit bei Anwendung der erfindungsgemäßen Mehrfachbeladung (Beispiele 2 und 3) im Vergleich mit einer Einfachbeladung (Beispiel 1).

Claims (8)

1. Verfahren zum Konzentrieren von HB_sAg aus geklärtem Plasma von menschlichen Hepatitis B-Spendern, wobei man das geklärte Plasma der isopyknischen Bandenbildung in einem Dichtegradienten unterwirft und eine an HB_sAg reiche Fraktion gewinnt, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dichtegradienten einen Natriumbromid-Dichtegradienten einsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Dichtegradienten einen Stufengradienten verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das durch isopyknische Bandenbildung mit einem Dichtebereich von 1,21 g/cm³ bis 1,24 g/cm³ erhaltene Produkt mit einem Gehalt an HB_sAg einer zusätzlichen Geschwindigkeitszonen-Fraktionierung unterwirft, bis HB_sAg im Dichtebereich von 1,13 g/cm³ bis 1,16 g/cm³ zu finden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Charge von geklärtem Plasma unter partiellen isopyknischen Bandenbildungsbedingungen in einen Dichtegradienten überführt, das verbrauchte geklärte Plasma entfernt, HB_sAg aus mindestens einer weiteren Charge von geklärtem Plasma unter partiellen isopyknischen Bandenbildungsbedingungen in den Dichtegradienten überführt und die isopyknische Bandenbildung vollendet.

5. Dichtegradient, bestehend aus HB_sAg in einer wässerigen Lösung von Natriumbromid.

6. Dichtegradient nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumbromidlösung eine Dichte von 1,21 g/cm³ bis 1,24 g/cm³ hat.

7. Dichtegradient nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Natriumbromidlösung eine Dichte von 1,13 g/cm³ bis etwa 1,16 g/cm³ aufweist.

8. Dichtegradient, erhalten nach dem Verfahren von Anspruch 4.