CH636269A5 - Process for the concentration of hepatitis B antigen and process for its purification - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein chemisches Verfahren zur Aufkonzentrierung von Hepatitis-B-Antigen (HBsAg) aus dem geklärten Plasma eines menschlichen Hepatitis-B-Donors. Bei diesem Verfahren wird ein Natrium-bromid-Dichtegradient angewandt, und es bildet sich dabei das Natriumsalz des HBsAg.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von gereinigtem Hepatitis-B-Antigen (HBsAg). Bei diesem Verfahren wird das zunächst gewonnene aufkonzentrierte HBsAg einem Zonalultrazentrifuga-tionsschritt unterworfen. Dabei bildet sich ein Salz des HBsAg, falls der verwendete Dichtegradient ein Salzgradient ist, und ein Komplex des HBsAg, falls der verwendete Dichtegradient ein Nichtsalz-Dichtegradient ist.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte aufkonzentrierte Hepatitis-B-Antigen ist als vorbeugender Impfstoff zur Behandlung von Hepatitis B geeignet. Auch das nach dem erfindungsgemässen Verfahren gereinigte He-patitis-B-Antigen ist zur Verwendung in einem entsprechenden Impfstoff geeignet.

Hepatitis B ist einer der Typen von Virus-Hepatitis, die zu Systeminfektionen führen, welche die hauptsächlichen pathologischen Veränderungen bewirken, die in der Leber auftreten. Diese Krankheit trifft hauptsächlich Erwachsene und wird vorzugsweise durch Übertragung von Langzeitvirusträgern weiterverbreitet. Übliche Methoden der Infektion sind Bluttransfusionen, verschmutzte Injektionsnadeln und Spritzen, das Übertragen durch Schnitte in der Haut oder Kratzstellen in der Haut, durch unsterilisierte zahnärztliche Instrumente wie auch durch Speichel, Genitalkontakt oder Exposition gegenüber infiziertem Blut in Aerosolform.

Die Inkubationszeit des Typ-B-Hepatitis-Virus ist relativ lang und zwar im Bereich von etwa 6 Wochen bis etwa 6 Monaten, welche nach der Infektion verstreichen können, bis klinische Symptome auftreten. Üblicherweise beginnt die Krankheit mit Müdigkeit und Appetitlosigkeit und wird manchmal von Muskelschmerzen (Myalgie) und Bauch- sowie Unterleibsschmerzen begleitet. Später können Gelbsucht, dunkler Urin, hellgefarbte Stühle und leichte Leber-vergrösserung auftreten. In manchen Fällen kann der Einsatz der Krankheit schnell vor sich gehen, wobei frühzeitig Gelbsucht zusammen mit Fieber, Schüttelfrost und Leukozytose eintritt. In anderen Fällen kann die Gelbsucht überhaupt nicht nachgewiesen werden, und der Patient wird sich nur eines leichten Krankheitsanfluges bzw. einer schleichenden Infektion bewusst. Es wird angenommen, dass die Mehrzahl der Hepatitis-Infektionen zu einer leichten Erkrankung ohne Auftreten von Ikterus (Gelbsucht) führen.

Das Ausgangsmaterial für das gereinigte Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) ist nach dem erfindungsgemässen Verfahren geklärtes Plasma, welches von Hepatitis-B-Spendern, wie beispielsweise durch Plasmophorese (Plasmaelektrophorese), gewonnen wird. Der Titer des Antigens kann in bekannter Weise festgestellt werden, wie zum Beispiel mittels radioimmunologischer Testverfahren, durch passive Hämagglutination oder Komplementärfixation. Das Plasma wird gewöhnlich gekühlt, und der in der Kälte ausfallende Niederschlag, welcher sich bildet, kann mittels leichter Zentrifugation gewonnen werden. Das HBsAg, das im so erhaltenen, geklärten Plasma enthalten ist, wird mittels Ultrazentrifugation unter isopycnischer Bandenbildung und anschliessend mittels schrittweiser zonaler Bandenbildung isoliert.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Aufkonzentrierung von Hepatitis-B-Antigen aus geklärtem Plasma ist dadurch gekennzeichnet, dass man das geklärte Plasma der Ultrazentrifugation unter isopycnischer Bandenbildung in einem Natriümbromid-Dichtegradienten unterwirft, wobei sich das Natriumsalz des HBsAg bildet, und dass man dann eine Fraktion gewinnt, welche HBsAg angereichert enthält.

Die Reinigung von Hepatitis-B-Antigen aus Plasma wird erfindungsgemäss durchgeführt, indem man zuerst, wie weiter oben beschrieben, Plasma aufkonzentriert und die Fraktion, welche HBaAg angereichert enthält, die einen Dichtebereich von 1,21 g/cm3 bis 1,24 g/cm3 aufweist, anschliessend einem Zonalultrazentrifugationsschritt entweder in einem Salzdichtegradienten unterwirft, wobei sich ein Salz des HBsAg bildet, oder in einem Nichtsalz-Dichtegradienten unterwirft, der einen Komplex mit dem HBsAg bildet, und dass man den Zonalultrazentrifugationsschritt so lange ausführt, bis das HBaAg in einem Dichtebereich von 1,13 g/cm3 bis 1,16 g/cm3 vorliegt.

Bei Durchführung der beschriebenen Verfahren wird vorzugsweise folgendermassen vorgegangen:

Bei der isopycnischen Bandenbildung wird das teilweise gereinigte Konzentrat mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht, welches einen Dichtegradienten aufweist, welcher die Dichte des spezifischen Antigens, welches isoliert wird, enthält. Das flüssige Medium wird sodann der Ultrazentrifugation unterworfen, wodurch man eine Gleichgewichtsverteilung der Serumkomponenten über den Dichte5

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gradienten erhält, wie sie deren individuellen Dichten entspricht. Aufeinanderfolgende Fraktionen des Mediums werden sodann ersetzt, und diejenigen, welche das erwünschte Antigen enthalten, nämlich die Fraktionen, welche eine Dichte im Bereich von etwa 1,21 bis etwa 1,24 g/cm3 aufweisen, werden abgetrennt. Die Anwendung dieser Technik auf die Reinigung von HBsAg wird in der deutschen Patentschrift Nr. 2 049 515 und in der US-Patentschrift Nr. 3 636 191 beschrieben. Die Konzentrationen der Lösungen, welche den Gradienten bilden, werden derart ausgewählt, dass ein Dichtebereich des Gradienten von etwa 1,0 bis etwa 1,41 g/cm3 hergestellt werden. Das flüssige Medium kann in Form eines linearen Gradienten oder eines Stufengradienten angewandt werden. Vorzugsweise wird ein Stufengradient angewandt, weil er eine höhere Kapazität für die Fraktionenbildung aufweist.

Beim schrittweisen Zonalbanden-Verfahren wird das teilweise gereinigte Konzentrat der Ultrazentrifugation unterworfen, wobei das Konzentrat mit einem flüssigen Medium in Kontakt steht, welches einen Dichtegradienten aufweist, wobei man jedoch diesmal eine schrittweise Technik unter Anwendung eines Zonalrotors anwendet, d.h. bei einer Geschwindigkeit und während einer Zeitspanne, bei welcher das Gleichgewicht noch nicht erreicht wird, und wobei das Hepatitis-Bs-Antigen und andere restliche Serumkomponenten über das Medium, entsprechend ihren Sedimentationskoeffizienten, im Medium verteilt werden. Die Konzentrationen der Lösungen, welche den Stufengradienten aufbauen, werden in der Weise ausgewählt, dass man einen Dichtebereich von etwa 1,0 bis etwa 1,28 g/cm3 aufbaut. Die stufenweise Zonalultrazentrifugierung wird ausgeführt, bis das HBsAg im Dichtebereich von 1,13 bis 1,16 g/cm3 vorhanden ist.

An diesem Punkt wird das HBsAg vom Rest des rohen Plasmaproteins abgetrennt, und insbesondere wird es auch von der Makroglobulinfraktion des Plasmas abgetrennt. Wenn die Stufenzonalultrazentrifugation in der Weise ausgeführt wird, dass das erwünschte Hepatitis-Bs-Antigen seine Gleichgewichtsposition erreicht, d.h. im Bereich von einer Dichte von etwa 1,18 bis etwa 1,20 g/cm3, hat es sich herausgestellt, dass die Plasma-Makroglobulinfraktion als Verunreinigung der erwünschten HBsAg-Antigenfraktion auftritt.

Die flüssigen Medien, die bei der isopycnischen Bandenbildung und bei der Stufenzonalultrazentrifugation angewandt werden, können irgendwelche Dichtegradienten im geeigneten Bereich sein. Bisher bekannte Inhaltsstoffe für derartige Lösungen sind beispielsweise Saccharose, Kalium-bromid, Cäsiumchlorid, Kaliumtartrat und ähnliche.

Die Ultrazentrifugation zur Herstellung von isopycnischen Banden wird geeigneterweise beispielsweise unter Anwendung einer Zentrifuge vom Typ Electronucleonics-K ausgeführt, indem man den stationären Rotor mit einer Kochsalzlösung füllt, und sodann die Kochsalzlösung durch Aliquote einer Lösung des flüssigen Mediums steigender Dichte ersetzt, bis ein Stufengradient gebildet wird. Das Plasma wird am Kopf des Rotors eingebracht, wobei etwas von der Lösung der höchsten Dichte am Boden des Rotors verdrängt wird. Üblicherweise liegt das Volumen des Plasmas im Bereich von etwa 15 bis etwa 40% des Volumens des Stufengradienten. Die Zentrifuge wird auf ihre Sollgeschwindigkeit beschleunigt, indem man ein programmiertes Geschwindigkeitsregelsystem anwendet, welches eine Mischung während der anfanglichen Einstellungsphase verhindert. Sobald das Gleichgewicht erreicht ist und das Produkt in der geeigneten Dichteposition angelangt ist, wird der Rotor mittels des gleichen programmierten Geschwindigkeitsregelsystems abgebremst, wodurch eine Mischung verhindert wird, während sich die Anfangskonfiguration einstellt. Sodann wird der Gradient am Boden des Rotors abgezogen und der geeignete Dichtenbereich abgezogen und gesammelt. Eine ähnliche Technik wird bei der Zonal ultrazentrifugation mit Stufenbandenbildung angewandt. Der geeignete Dichtebereichsausschnitt aus den Zonalstufenbanden ist das erwünschte Konzentrat des Hepatitis-B-Antigens.

Aufgrund der kleinen Grösse (etwa 20 nm) der HBsAg-Bande beim isopycnischen Bandenbildungsschritt ist dieser ziemlich zeitraubend, da etwa 18-stündiges Zentrifugieren notwendig ist. Dementsprechend ist selbst bei 24stündigem täglichem Betrieb während 7 Tagen in der Woche nur eine Herstellung von etwa 4 Ansätzen geklärten Plasmas pro Zentrifuge und Woche möglich. Die Produktivität kann natürlich erhöht werden, indem man zusätzliche Zentrifugen anwendet. Dies jedoch bedeutet enorme Kapitalinvestitionen, weil jede Zentrifuge etwa Va Million Schweizer Franken (etwa 100 000 US-Dollar) kostet.

Es hat sich nun herausgestellt, dass wesentliche Produktivitätsverbesserungen und Produktivitätserhöhungen bei wesentlich verminderten Betriebskosten erhalten werden, indem man den isopycnischen Gradienten zur Bandenbildung mehrfach belädt. Mehrfache Beladung bedeutet, dass man eine Probe des geklärten Plasmas, welches HBsAg enthält, den Bedingungen der isopycnischen Bandenbildung während einer Zeit unterwirft, welche ausreichend ist, dass im wesentlichen das gesamte HBsAg im geklärten Plasma in den Gradienten eindringt, aber wobei die Zeitspanne nicht ausreichend ist, um ein Gleichgewicht zu erreichen, und man diesen Schritt mindestens einmal mit einer weiteren Probe des geklärten Plasmas wiederholt, welches HBsAg enthält, bevor man die Bedingungen zur isopycnischen Bandenbildung weiterführt, und zwar während einer Zeit, die ausreichend ist, um ein Gleichgewicht zu erreichen. Wenn dies erwünscht ist, kann ein Gradient mit bis zu etwa 6 Proben geklärten Plasmas beladen werden. Da die Zeit, welche das HBsAg, welches im geklärten Plasma enthalten ist, zum Eindringen in den Gradienten benötigt, nur ein Bruchteil der Zeit ist, welche benötigt wird, um ein Gleichgewicht zu erreichen, und weil die folgende Zeit, welche zur Erreichung des Gleichgewichtes notwendig ist, immer die gleiche ist, unabhängig davon, ob der Gradient einmal oder mehrfach mit Plasma beladen wurde, ergeben sich wesentliche Zeitersparnisse, und dementsprechend wird eine wesentliche Reduktion der Herstellungskosten erreicht.

Während die erhöhte Produktivität und die verminderten Kosten des erfindungsgemässen Mehrfachbandenverfahrens mit irgendeinem geeigneten Gradienten erreicht werden können, wird Natriumbromid als Gradient angewandt.

Bei dieser bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens dringen die Plasmabestandteile in den Gradienten ein, und das Hepatitis-B-Antigen reagiert mit dem Gradienten unter Salzbildung, wenn der Gradient ein Salz ist, oder unter Komplexbildung, wenn der Gradient kein Salz ist, wie zum Beispiel Saccharose.

Die isopycnische Bandenbildung wird bis zum Gleichgewichtszustand geführt, indem man bei etwa 40 000 bis etwa 80 000 g (g = normale Erdbeschleunigung) während etwa 10 Stunden oder mehr zentrifugiert. Es hat sich herausgestellt, dass jedoch nach etwa 4stündigem Zentrifugieren des Plasmas im wesentlichen das gesamte HBsAg in den isopycnischen Bandenbildungsgradienten eingedrungen ist. Sodann wird die Probe des ausgelaugten Plasmas entfernt, und es wird eine neue Plasmaprobe mit gleichem Volumen wie die erste Probe auf den Gradienten geschichtet. Sodann kann das Zentrifugieren wie nach dem Stand der Technik während etwa 10 Stunden oder mehr weitergeführt werden, wodurch das HBsAg, welches in beiden Proben enthalten war, in die Gleichgewichtsdichten-Region des Gradienten (1,21

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bis 1,24 g/cm3) einwandert, wodurch die Bandenbildung beendet wird. Alternativerweise kann die Zentrifugierung nur während 4 Stunden weitergeführt werden und das ausgelaugte Plasma der zweiten Probe durch eine dritte Probe frisches Plasma ersetzt werden, welche auf den Gradienten geschichtet wird. Dieses mehrfache Beladungsverfahren kann 6mal oder öfter wiederholt werden, bevor man die Bandenbildung beendet, indem man während etwa 18 Stunden zen-trifugiert.

Das Verhältnis von Probenvolumen (Plasmavolumen) zu Gradientenvolumen liegt im Bereich von etwa 1:3 bis etwa 1:6. Wenn eine einzige Plasmaprobe auf dem Gradienten aufgebracht wird und unter isopycnischen Bandenbildungsbedingungen zentrifugiert wird (beispielsweise während etwa 16 bis etwa 20 Stunden bei etwa 30 000 rpms in der K-II-Zentrifuge) enthält das erhaltene Produkt einen Proteingehalt von etwa 4-10 mg/ml in einem Volumen von 1,0 Liter, das von der Menge Protein im Originalplasma abhängt.

Wenn eine doppelte Beladung des Gradienten mit Plasma angewandt wird und man unter isopycnischen Bandenbedingungen zentrifugiert (während etwa 16 bis etwa 20 Std. bei 30 000 rpms), enthält das Produkt einen Proteingehalt, welcher bezüglich der angewandten Beladungen additiv ist und typisch im Bereich von 8-20 mg/ml in einem Volumen von 1,0 Liter liegt, was von der Menge des Proteins im Ausgangsplasma abhängt. Der Proteinspiegel steigt in dieser Weise für jede folgende Plasmabeladung des Gradienten an.

Das Produkt wird sodann der Zonalultrazentrifugation unter Stufenbandenbildung unterworfen. Die stufenweise Zonalbandenbildung wird ausgeführt, bis das HBsAg im Dichtebereich von 1,13 bis 1,16 g/cm3 angereichert ist. Typischerweise benötigt man für diesen Schritt etwa 16 Stunden bis etwa 20 Stunden, und vorzugsweise etwa 17 bis etwa 18 Stunden, bei etwa 30 000 bis etwa 60 OOOfacher Erdbeschleunigung.

Gemäss einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird der Salzdichtegradient durch Natriumbromid gebildet, wobei Mehrfachbeladungs-technik angewandt wird oder nicht. Im Gegensatz zu bisher benützten Materialien weist Natriumbromid wesentliche Vorteile auf. Die Löslichkeit des Natriumbromides erlaubt die Anwendung von Lösungen mit hoher Dichte bei der Herstellung des Gradienten selbst bei Kühlschranktemperaturen (2-6 °C). Es bestehen deutliche ökonomische Vorteile bei Anwendung von Natriumbromid gegenüber einem Salz, zum Beispiel Caesiumchlorid, weil man sich nicht mit dem Problem herumschlagen muss, welches auf restlichen Caesiumionen, welche an HBsAg gebunden sind, beruht. Wenn man Natriumbromid als Gradienten anwendet, sind irgendwelche Ionen, die an HBsAg aufgrund biophysikalischer Charakteristiken gebunden werden, wie Natriumsalze, sehr wohl mit dem menschlichen Biosystem verträglich und stellen kein toxikologisches Problem dar.

Die biochemischen Charakteristiken des Hepatitis-B-An-tigens (HBsAg) sind sehr ausführlich in den Zeitschriften [J. Clinical Investigation 52, 1176 (1973) und J. of Virology 10, 469 (1972)] beschrieben, und es wird geoffenbart, dass es sich um ein negativ geladenes Teilchen handelt. In Gegenwart einer sehr hohen Konzentration positiv geladener Natriumionen wird ein Natrium-HBsAg-Salzmolekül gebildet. Dieses Molekül ist mit dem humanbiologischen System verträglich. Im Gegensatz zu Produkten nach dem Stand der Technik ist das HBsAg, das nach der bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens hergestellt wird, im wesentlichen frei von anderen Kationen, insbesondere von Caesium-und Kaliumionen.

Die hervorragende Löslichkeit von Natriumbromid bei erniedrigten Temperaturen im Vergleich zu Kaliumbromid erlaubt die Anwendung erniedrigter Temperaturen, was zu einer verbesserten Stabilität des biologischen Material beiträgt. Die Verwendung eines Stufengradienten anstelle eines linearen Gradienten wird bevorzugt, weil Verunreinigungen an den Stufengrenzen angesammelt werden und grössere Plasmavolumen bei einem einzigen Gradienten angewandt werden können.

Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antigen ist als solches als Antigen für Hepatitis B nützlich und kann angewandt werden, wie dies in der US-Patent-schrift Nr. 3 636 191 beschrieben ist. Das HBsAg Antigen, das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellt wird, ist ein hochgereinigtes Produkt. Der isopycnische Bandenbildungsschritt bewirkt eine etwa lOOfache Anreicherung bzw. Reinigung des HBsAg relativ zum normalen Plasmaprotein. Der Zonalstufenschritt bewirkt eine weitere etwa 20fache Reinigung des HBsAg relativ gegen normales Plasmaprotein. Die Kombination der beiden Schritte bewirkt eine etwa 2000fache Reinigung des HBsAg relativ zu normalem Plasmaprotein. Das so erhaltene Produkt stellte sich im wesentlichen frei von Substanzen der Blutgruppen A und B heraus, wie dies mittels serologischer und elektrophoreti-scher Techniken nachgewiesen wurde. Darüber hinaus kann das nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellte Antigen als Ausgangsmaterial für das Hepatitis-B-Antigen gemäss dem Verfahren nach der US-Patentschrift Nr. 4 017 360 angewandt werden.

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Der Rotor einer Electronucleonics-K- Ultrazentrifuge wird mit 4800 ml PhosphatpufFer gefüllt. Nachdem man den Rotor bis auf 10 000 Umdrehungen pro Minute beschleunigt hatte, um das System zu entgasen, wurde der folgende Stufengradient in den Boden des stationären Rotors eingepumpt:

1.2400 ml 10%ige NaBr-Lösung, p = 1,08 g/cm3 2.1000 ml 20%ige NaBr-Lösung, p = 1,17 g/cm3 3.1500 ml 30%ige NaBr-Lösung, p = 1,28 g/cm3 4. 3500 ml 40%ige NaBr-Lösung, p = 1,41 g/cm3

Sodann wurde Plasma, welches australisches Antigen (HBsAg) enthielt, in einer Menge von 1750 ml am Kopf des stationären Rotors aufgebracht, wodurch 1750 ml der 40%igen Natriumbromid-Lösung am Boden des Rotors verdrängt wurden. Der Rotor wurde sodann auf 30 000 Umdrehungen pro Minute beschleunigt, und man zentrifugierte bei dieser Geschwindigkeit während 18 Stunden. Nach Abbremsen des Rotors wurden 500 ml HBsAg reichen Materials im Dichtenbereich von etwa 1,21 bis etwa 1,24 g/cm3 gesammelt, und man dialysierte gegen einen PhosphatpufFer.

Der Rotor wurde sodann mit Phosphatpuffer gefüllt und wie oben entgast, und sodann wurde der folgende Stufengradient am Boden des stationären Rotors eingepumpt: 1. 2400 ml 5 %ige Saccharoselösung, p = 1,02 g/cm3 2.1750 ml 15 %ige Saccharoselösung, p = 1,06 g/cm3 3.1750 ml 25 %ige Saccharoselösung, p = 1,10 g/cm3 4.2500 ml 50 %ige Saccharoselösung, p = 1,23 g/cm3 Das an HBsAg angereicherte Material aus dem isopycnischen Bandenbildungsschritt unter Anwendung von Natriumbromid mit einem Volumen von 500 ml wird in den Rotorkopf eingepumpt, wodurch 500 ml der 50%igen Saccharoselösung aus dem Rotorboden verdrängt werden. Der Rotor wird sodann bei 28 000 Umdrehungen pro Minute während 18 Stunden betrieben. Nachdem man den Rotor abgestoppt hatte, wurden 500 ml HBsAg-reiches Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 isoliert.

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Beispiel 2

Der Rotor einer Electronucleonics-K-Zentrifuge wird mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nachdem man den Rotor auf eine Geschwindigkeit von 10 000 Umdrehungen pro Minute, zum Entgasen des Systems, beschleunigt hatte, wurde der folgende Stufengradient in den Boden des stationären Rotors eingepumpt:

1.2400 ml 10 %ige NaBr-Lösung, p = 1,08 g/cm3 2.1000 ml 20 %ige NaBr-Lösung, p = 1,17 g/cm3 3.1500 ml 30 %ige NaBr-Lösung, p = 1,28 g/cm3 4. 3500 ml 40 %ige NaBr-Lösung, p = 1,41 g/cm3 Das Plasma, welches HBsAg enthält, wird in einer Menge von 1750 ml in den Kopf des stationären Rotors eingepumpt, wodurch 1750 ml 40 %ige Natriumbromidlösung aus dem Boden des Rotors verdrängt werden. Der Rotor wird sodann auf 30 000 Umdrehungen pro Minute beschleunigt, und man betreibt ihn bei dieser Geschwindigkeit während 4 Stunden. Sodann wird der Rotor abgestoppt, und es werden 1750 ml 40%ige Natriumbromidlösung in den Boden des Rotors eingepumpt, wodurch das Plasma aus dem Rotorkopf verdrängt wird. Sodann werden 1750 ml frisches Plasma, welches HBsAg enthält, in den Rotorkopf eingepumpt, wodurch ein gleiches Volumen 40%iger Natriumbromidlösung aus dem Boden des Rotors verdrängt wird. Der Rotor wird sodann während 18 Stunden bei 30 000 Umdrehungen pro Minute betrieben. Nach Abstoppen des Rotors werden 1000 ml HBsAg-reichen Materials im Dichtenbereich von etwa 1,21 bis etwa 1,24 gesammelt, und man dia-lysiert gegen einen Phosphatpuffer.

Der Rotor wird sodann mit PhosphatpufFer gefüllt, der wie oben entgast wurde, und es wird sodann folgender Stufengradient in den Boden des stationären Rotors eingepumpt:

1.2400 ml 5 %ige Saccharoselösung, p = 1,02 g/cm3 2.1750 ml 15 %ige Saccharoselösung, p = 1,06 g/cm3 3.1750 ml 25 %ige Saccharoselösung, p = 1,10 g/cm3 4.2500 ml 50 %ige Saccharoselösung, p = 1,23 g/cm3 Das an HBsAg angereicherte Material aus dem isopycnischen Bandenbildungsschritt unter Anwendung von Natriumbromid mit einem Volumen von 1000 ml wird in den Rotorkopf eingepumpt, wobei 1000 ml der 50%igen Saccharoselösung aus dem Rotorboden verdrängt werden. Der Rotor wird sodann auf 28 OOOUmdrehungen pro Minute beschleunigt und während 18 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Nachdem man den Rotor abstoppte, wurden 1000 ml HBsAg-reichen Materials im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 isoliert.

Beispiel 3

Der Rotor einer Electronucleonics-K-Ultrazentrifuge wird mit 8400 ml Phosphatpuffer gefüllt. Nachdem man den Rotor bis auf 10 000 Umdrehungen pro Minute, zum Entgasen des Systems, beschleunigt hatte, wurde der folgende Stufengradient in den Boden des stationären Rotors eingepumpt:

1. 2400 ml 10 %ige NaBr-Lösung, p = 1,08 g/cm3 2.1000 ml 20 %ige NaBr-Lösung, p = 1,17 g/cm3 3.1500 ml 30 %ige NaBr-Lösung, p = 1,28 g/cm3 4. 3500 ml 40 %ige NaBr-Lösung, p = 1,41 g/cm3

s 1750 ml Plasma, welches HBsAg enthält, werden in den Kopf des stationären Rotors eingepumpt, wodurch 1750 ml der 40%igen Natriumbromidlösung aus dem Boden des Rotors verdrängt werden. Der Rotor wird sodann auf 30 000 Umdrehungen pro Minute beschleunigt, und man betreibt io ihn während 4 Stunden bei dieser Geschwindigkeit. Der Rotor wird sodann abgestoppt, und es werden 1750 ml 40%ige Natriumbromidlösung in den Boden des Rotors eingepumpt, wodurch das Plasma aus dem Rotorkopf verdrängt wird. Sodann werden weitere 1750 ml frisches Plasma, wel-15 ches HBsAg enthält, in den Rotorkopf eingepumpt, wodurch man ein gleiches Volumen 40%iger Natriumbromidlösung aus dem Boden des Rotors verdrängt. Der Rotor wird sodann auf 30 000 Umdrehungen pro Minute beschleunigt und während 4 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. 20 Sodann wird der Rotor abgestoppt, und es werden 1750 ml einer 40%igen Natriumbromidlösung am Boden des Rotors eingepumpt, wobei dadurch das Plasma aus dem Rotorkopf verdrängt wird. Eine dritte Ladung von 1750 ml frischem Plasma, welches HBsAg enthält, wird dann in den Rotor-25 köpf eingepumpt, wobei ein gleiches Volumen 40%iger Natriumbromidlösung aus dem Boden des Rotors verdrängt wird. Der Rotor wird sodann während 18 Stunden bei 30 000 Umdrehungen pro Minute laufen gelassen. Nach Abstoppen des Rotors werden 1500 ml HBsAg-reichen Materi-30 als im Dichtebereich von etwa 1,21 bis etwa 1,24 gesammelt und gegen Phosphatpuffer dialysiert.

Der Rotor wird sodann mit Phosphatpuffer gefüllt, wie oben entgast, und es wird der folgende Stufengradient in den Boden des stationären Rotors eingepumpt:

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2. 1750 ml 15 %ige Saccharoselösung, p = 1,06 g/cm3 3.1750 ml 25 %ige Saccharoselösung, p = 1,10 g/cm3 4.2500 ml 50 %ige Saccharoselösung, p = 1,23 g/cm3 Das an HBsAg angereicherte Material aus dem isopycni-

40 sehen Bandenbildungsschritt unter Anwendung von Natriumbromid, welches ein Volumen von 1500 ml aufweist, wird in den Rotorkopf eingepumpt, wodurch 1500 ml 50%iger Saccharoselösung aus dem Rotorboden verdrängt werden. Der Rotor wird sodann auf 28 000 Umdrehungen 45 pro Minute beschleunigt und während 18 Stunden bei dieser Geschwindigkeit betrieben. Nach Abstoppen des Rotors werden 1500 ml HBsAg-reiches Material im Dichtebereich von 1,135 bis 1,165 g/cm3 gesammelt.

so Beispiel 4

Die folgende Tabelle zeigt die wesentliche Erhöhung der Ausbeute pro Zeiteinheit, wenn die erfindungsgemässe mehrfache Beladungstechnik (Beispiele 2 und 3) angewandt wird, und zwar im Vergleich zur einfachen Beladungstechnik (Bei-55 spiel 1) nach dem Stand der Technik.

Beispiel

Ausbeute (ml) HBSAG-Material

Totalzeit für isopycnisches und Stufenzonalzentri-fugieren (Std.)

% Mehraufwand an Zeit im Vergleich zu Beispiel 1

% Ausbeuteerhöhung im Vergleich zu Beispiel 1

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1. Verfahren zur Aufkonzentrierung von Hepatitis-B-Antigen (HBsAg) aus geklärtem Plasma eines menschlichen Hepatitis-B-Donors, dadurch gekennzeichnet, dass man das geklärte Plasma der Ulfrazéntrifugation unter isopycnischer Bandenbildung in einem Natriümbromid-Dichtegradienten unterwirft, wobei sich das Natriumsalz des HBsAg bildet, und dass man dann eine Fraktion gewinnt, welche HBsAg angereichert enthält.

2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Dichtegradient ein Stufengradient ist.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fraktion aus der isopycnischen Bandenbildung einen Dichtebereich von 1,21 g/cm3 bis 1,24 g/cm3 aufweist.

4. Verfahren zur Reinigung von Hepatitis-B-Antigen (HBsAg ) aus einem Plasma, dadurch gekennzeichnet, dass das HBsAg aus geklärtem Plasma eines menschlichen Hepatitis-B-Donors aufkonzentriert wird, indem man das geklärte Plasma der Ultrazentrifugation unter isopycnischer Bandenbildung in einem Natriümbromid-Dichtegradienten unterwirft, wobei sich bei diesem Vorgang das Natriumsalz des HBsAg bildet und wobei man dadurch eine Fraktion aus der isopycnischen Bandenbildung erhält, die einen Dichtebereich von 1,21 g/cm3 bis 1,24 g/cm3 aufweist und dass man diese Fraktion anschliessend einem Zonalultrazentrifuga-tionsschritt entweder in einem Salzdichtegradienten unterwirft, wobei sich ein Salz des HBsAg bildet, oder in einem Nichtsalz-Dichtegradienten unterwirft, der einen Komplex mit dem HBsAg bildet, und dass man den Zonalultrazen-trifugationsschritt so lange ausführt, bis das HBsAg in einem Dichtebereich von 1,13 g/cm3 bis 1,16 g/cm3 vorliegt.

5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekenn-. zeichnet, dass der verwendete Nichtsalz-Gradient, der einen Komplex mit dem HBsAg bildet, ein Saccharosegradient ist.

6. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der verwendete Salzdichtegradient ein Natriumbromid-Dichtegradient ist, welcher das Natriumsalz des HBsAg bildet.