DE2950004C2 - Verfahren zur Herstellung von Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus(FSME-Virus)-Vakzinen - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus)-Vakzinen durch Züchtung des Virus in Gewebekulturen oder in Suspensionen von Vogelembryonalzellen, insbesondere in Suspensionen von Hühnerembryonalzellen, Abtrennen der Zellen und Zellbruchstücke durch Zentrifugieren, Inaktivieren, Konzentrieren und Reinigen des Virus und Aufarbeiten der gereinigten Suspension zu Vakzinen.

Bei einer bekannten derartigen Methode zur Herstellung von FSME-Virus-Vakzinen, wie in der GB-PS 53 035 beschrieben, erhält man nach dem Zentrifugieren der Suspension eine virushältige Suspension, in der noch unerwünschte Verunreinigungen vorhanden sind, welche bei Applikation der Vakzine Nebenreaktionen zur Folge haben können. Deshalb ist es erforderlich, die Virus enthaltende Suspension einem Reinigungsverfahren, z. B. einer Hydroxylapatitchromatographie, zu unterwerfen. Das bekannte Verfahren arbeitet mit erheblichen Verlusten. Trotzdem ist es nicht gelungen, den erwünschten Reinigungsgrad zu erreichen.

Die Erfindung bezweckt die Vermeidung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, Frühsommer-Meningoenzephalitis- Virus-Vakzine mit verbesserter Reinheit und verbesserter Ausbeute zu erhalten, bei deren Verwendung das Auftreten von Nebenreaktionen stark vermindert ist.

Diese Aufgabe wird bei einem Verfahren der eingangs definierten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß aus der das Virus enthaltenden Suspension schneller als FSME-Virus sedimentierende Bestandteile abgetrennt werden und die verbleibende Suspension in einem Dichtegradienten, der Saccharose von 0 bis 50% enthält, einer kontinuierlichen Dichtegradientenultrazentrifugation unterworden wird, der Gradienteninhalt in Fraktionen zerlegt und die bei 260 nm eine erhöhte Extinktion aufweisenden Fraktionen, die Teilchen mit einer Sedimentationskonstante im Bereich von 200S enthalten, gesammelt werden.

Die Methode der Dichtegradientenultrazentrifugation (DGUZ) zur Reinigung von Virus-hältigen Suspensionen ist aus »Virologische Arbeitsmethoden«, Band II, 1977, Seiten 122 bis 130, bekannt, jedoch wird die dort beschriebene isopyknische bzw. Gleichgewichtsgradientenzentrifugatioii diskontinuierlich durchgeführt Eine kontinuierliche Dichtegradientenultrazentrifugation ist für die Aufarbeitung einer Influenza-Virus-Suspension bekannt geworden (vgl. Reimer et al, »Purification of large quantities of influenza virus by density gradient centrifugation«. Journal of Virology 1967, 1: 1207—1216), welches Virus einen wesentlich größeren Durchmesser aufweist als FSME-Viren; jedoch ist es dabei nicht gelungen, nebenwirkungsfreie Ganzvirus-Vakzine zu gewinnen, sondern es war notwendig, das mittels der kontinuierlichen Dichtegradientenultrazentrifugation gereinigte Influenza-Virus einer anschließenden Spaltung zu unterwerfen, um die durch das Virus verursachten Nebenreaktionen zu reduzieren (vgl. diesbezüglich Harry M. Meyer et al. »Review of Existing Vaccines for Influenza«, American Journal of Clinical Pathology, Vol. 70, No. 1, July 1978, Seiten 146-152, sowie P. F. Wright et al. »Inactivated Influenza Vaccines in Children: Results of a Multi-Center Trial«, International Symposium on Influenza Immunization (II), Geneva

1977, Develop. Biol. Standard, Vol. 39, p. 309-313, Basel 1977).

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung der schneller als FSME sedimentierenden Bestandteile durch Fällung mit Protaminsulfat. Eine solche Maßnahme ist an sich bekannt aus Rolle-Mayr, »Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre«, Verlag Erike, Stuttgart

1978, Seiten 414/415, jedoch wurde sie ausschließlich für infektiöse Viren angewendet.

Vorteilhaft wird die Virus enthaltende Suspension vor der kontinuierlichen Dichtegradientenultrazentrifugation inaktiviert, vorzugsweise mit Formalin oder beta-Propiolacton. Die Suspension kann durch Ultrafiltration konzentriert werden.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die nach der kontinuierlichen Dichtegradientenultrazentrifugation erhaltenen Virus-Peak-Fraktionen mit einem humanalbuminhältigen Puffer verdünnt, wodurch eine erhöhte Stabilität des Virus-Antigens bewirkt wird. Die erfindungsgemäß hergestellten Vakzine sollen maximal 20μg/ml Protein, ausgenommen Humanalbumin, enthalten.

Im einzelnen wird das Verfahren wie folgt durchgeführt:

Hühnerembryonalzellen werden in einem Zellkulturmedium (TCM 199) (Tissue Culture Medium 199) suspendiert, mit dem Virus infiziert und unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 25 und 38°C zwischen einem und fünf Tagen in Suspension gehalten. Dann werden Zellen und Zellbruchstücke durch Zentrifugation abgetrennt; die erhaltene Virussuspension wird

mittels Formalin oder ^-Propiolacton inaktiviert und sodann durch Ultrafiltration konzentriert Die Verfahrensschritte der Inaktivierung und Konzentrierung können auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden. Die Suspension enthält neben dem FSME-Virus verschiedene Verunreinigungen, die 'eilweise schneller bzw. langsamer sedimentieren als das FSME-Virus. Vorteilhaft werden die schneller sedimentierenden Anteile durch Fällung mit Protaminsulfat abgetrennt, bevor das eigentliche kontinuierliche Dichtegradienten-Ultrazentrifugationsverfahren durchgeführt wird.

Das Verfahren wird im einzelnen beispielsweise derart durchgeführt, daß in dem mit Pufferlösung, zweckmäßig mit Phosphatpufferlösung gefüllten Rotor der Ultrazentrifuge bei 3000 Umdrehungen pro Minute die Hälfte der Pufferlösung durch eine 50%ige Saccharoselösung verdrängt wird und sich dadurch ein Dichtegradient von 0—50% Saccharose ausbildet Dann wird die Virus enthaltende Suspension bei einer Rotordrehzahl von 35 000 Umdrehungen pro Minute mit einer Durchflußgeschwindigkeit von zweckmäßig 3 l/h durch den Rotor fließen gelassen. Unter den gewählten Bedingungen dringt der Großteil der Viruspartikel in den Dichtegradienten ein. Sobald das gesamte Material den Apparat passiert hat, wird noch eine Stunde lang zentrifugiert, während gleichzeitig eine Phosphatpufferlösung durchlaufen gelassen wird. Dann wird der Rotor vorsichtig zum Stillstand gebracht und der Rotorinhalt in einzelne Fraktionen aufgeteilt. Dann wird bei jeder Fraktion die Extinktion bei 260 nm bestimmt und ghichzeitig der Gehalt an Saccharose in der Fraktion ermittelt. Die Lokalisierung des Virus im Dichtegradienten wird durch dessen Extinktion bei 260 nm ermöglicht. Das Virus bandet im Bereich um 40% Saccharose und bewirkt hier eine deutliche Erhöhung der Extinktion bei 260 nm.

In dem beiliegenden Diagramm ist dieser Zusammenhang dargestel't, woraus die Extinktion der einzelnen Fraktionen in Relation zu dem Dichtegradienten ersichtlich ist. Der Dichtegradient der Saccharoselösung 40 reicht von 0-50%.

Die strichpunktierte Kurve gibt die Verteilung der Extinktion bei 260 nm in den einzelnen Fraktionen wieder. Im Bereich um 40% Saccharose haben die Fraktionen 10, 11 und 12 eine erhöhte, die Fraktion 11 die maximale Extinktion. In dieser Fraktion befinden sich fast ausschließlich 200 S Virus-Partikel ohne merkliche schneller oder langsamer als das Virus sedimentierende Verunreinigungen. Der Peak entspricht einer Saccharosekonzentration von 39%. Der weitere Peak bei der Fraktionsnummer 25, der einer Saccharosekonzentration von weniger als 10% entspricht, zeigt Verunreinigungen an, die verworfen werden. In dem Diagramm ist auch die relative protektive Wirksamkeit (ermittelt im direkten Mäuseschutzversuch) der einzelnen Fraktionen durch verschieden hohe Säulen veranschaulicht. Die Fraktion 11 hat demnach die höchste relative Schutzwirkung.

Die gesammelten virushältigen Fraktionen werden nun vorteilhaft mit einem humanalbuminhältigen Puffer verdünnt, um die Stabilität des Virusantigens zu verbessern, und dann in üblicher Weise zu Vakzinen weiterverarbeitet.

Die gewonnenen Vakzinen haben eine höhere Reinheit und sind für den Menschen wesentlich verträglicher als die nach den herkömmlichen Verfahren erzeugten Präparate. Das kommt in der folgenden Tabelle zum Ausdruck, wcbei in der ersten Spalte — prozentual ausgewertet — Reaktionen mit Vakzinen nach herkömmlichen Verfahren und in der zweiten Spalte nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt, aufgegliedert sind. Bei Auffrischungsimpfungen mit erfindungsgemäß hergestellten Vakzinen konnten keinerlei unerwünschte Reaktionen, weder lokal noch systemisch, beobachtet werden.

	Hergestellte Präparate	erfindungs-
	herkömmlich	gemäß
		36%
Lokaler Schmerz	bis zu 72%	25%
Allgemeinreaktionen	bis zu 64%
Kopfschmerz, Müdigkeit		19%
Fieber (insgesamt)	bis zu 68%	14%
37,3 bis 38°C	bis zu 36%	4%
38 bis 39° C	bis zu 27%	1%
mehr als 39" C	bis zu 9%

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Vakzine zeichnen sich durch einen geringen Proteingehalt, abgesehen von zugesetztem Humanalbumin, aus. Dieser Proteingehalt ist bei gleicher antigener Wirksamkeit um ein Vielfaches, mindestens das 1Ofache, geringer als bei den bisher verwendeten Präparaten. Auch der spezifische Proteingehalt (= Proteingehalt (Humanalbumin nicht einbezogen) in Mikrogramm pro Immunisierungsdosis) ist bei den erfindungsgemäßen Vakzinen deutlich niedriger, wie sich aus den folgenden Vergleichen ergibt:

Erfindungsgemäß erhaltene
Chargen

spezifischer Proteingehalt in
μg pro Immunisierungsdosis

12
5
6
7

Demgegenüber liegen diese Werte bei herkömmlichen Präparaten im Bereich zwischen 250 und 500 μg Protein pro Immunisierungsdosis.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Frühsommer-Meningoenzephalitis-Virus (FSME-Virus)-Vakzinen durch Züchtung des Virus in Gewebekulturen oder in Suspensionen von Vogelembryonalzellen, insbesondere in Suspensionen von Hühnerembryonalzellen, Abtrennen der Zellen und Zellbruchstücke durch Zentrifugieren, Inaktivieren, Konzentrieren und Reinigen des Virus und Aufarbeiten der gereinigten Suspension zu Vakzinen, dadurch gekennzeichnet, daß aus der das Virus enhaltenden Suspension schneller als FSME-Virus sedimentierende Bestandteile abgetrennt werden und die is verbleibende Suspension in einem Dichtegradienten, der Saccharose von 0 bis 50% enthält, einer kontinuierlichen Dichtegradientenultrazentrifugation unterworfen wird, der Gradienteninhalt in Fraktionen zerlegt und die bei 260 nm eine erhöhte Extinktion aufweisenden Fraktionen, die Teilchen mit einer Sedimentationskonstante im Bereich von 200 S enthalten, gesammelt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennung der schneller als FSME sedimentierenden Bestandteile durch Fällung mit Protaminsulfat erfolgt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nach der kontinuierlichen Dichtegradientenultrazentrifugation erhaltenen Virus-Peak-Fraktionen mit einer humanalbuminhältigen Pufferlösung verdünnt werden.

4. Vakzine hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie maximal 20 μg/ml Protein, ausgenommen Humanalbumin, enthält.