DE2058645A1

DE2058645A1 - Verfahren zur Herstellung von abgeschwaechter Newcastle-Disease-Virus-Lebendvaccine

Info

Publication number: DE2058645A1
Application number: DE19702058645
Authority: DE
Inventors: Homu Ito
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1969-11-29
Filing date: 1970-11-28
Publication date: 1971-06-09
Also published as: ES385968A1; NL7017334A; GB1274820A; NL170595C; NL170595B; CA962593A; DK124340B; FR2073436A1; FR2073436B1; DE2058645C2

Description

Köln,den 26.11.1970 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries,Ltd♦,

27, Doshomachi 2-chome, Hif?ashi-ku, Osaka (Japan).

Verfahren^zur Herstellung von abgeschwächter Newcastle-Disease-Virus-Lebendvaccine

Die Erfindung betrifft eine stark abgeschwächte Newcastle Disease-Virus-Lebendvaccine, die nicht nur neu und wirksam, sondern auch weiter abgeschwächt ist, d.h. weit weniger Nebenwirkungen hat als die bisher er- !probten Vaeeinen, und ein Verfahren zur Herstellung dieser Vaccine.

Die Newcastle Disease, die eine akute febrile Infektionskrankheit bei Geflügel ist, stellt eine der ernstesten Ursachen von wirtschaftlichen Verlusten in d er Geflügel- I Industrie dar. Zwar steht die virale Natur dieser Infektionskrankheit fest, und viele Stämme des Newcastle Disease-Virus sind isoliert worden (aiehe beispielsweise "Southwestern Veterinarian¹', Band 5 (1951), Seite 19 bis 21, und "American Journal of Veterinary Research", Band (1955), Seite 450 bis 457), jedoch sind weder wirksame chemotherapeutische Mittel noch wirksame cheraoprophylaktische Mittel gegen diese Krankheit gefunden worden. Die Prophylaxe gegen.diesf Krankheit "besteht daher nur in der Immunisierung von Geflügel rait einer inaktivierten oder Lebendvaccine des Newcastle Diseaäe-Virua (nachstehend ale "NDV¹¹ bezeichnet). In den letzten Jahren iat die

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Verwendung von NDV-Lebendvaccinen stark gesteigert worden, da sich gezeigt hat, daß diese Lebendvaccinen einfach und bequem dem Geflügel durch Aufsprühen oder als Gemisch mit dem Trinkwasser verabreicht werden können, und daß sie antigen wirksamer sind.

Die Verwendung von NDV-Lebendvaccinen ist jedoch mit Gefahren verbunden. Wenn eine Lebendvaccine nicht genügend abgeschwächt ist, pflegt sie eine gemischte Infektion mit NDV und Mycoplasma gallisepticus (PPLO) zu verursachen und auf diese Weise ernste Erkrankungen der Atemwege zu t verursachen, während eine zu stark abgeschwächte Vaccine nicht zu einer genügenden Antikörperbildung führt, um NDV-Infektionen und den Ausbruch der Krankheit zu verhindern. Die wesentlichen Voraussetzungen für eine praktisch brauchbare NDV-Lebendvaccine sind somit, daß sie so weit abgeschwächt ist, daß ihre Verabreichung nicht die charakteristischen Anzeichen der Newcastle Disease bei Geflügel hervorruft, und daß ihre Antikörperbildung genügt, um dem Angriff einer großen Menge eines wilden NDV wirksam zu begegnen.

Einige Methoden zur Abschwächung von NDV sind bereits für die Herstellung von NDV-Lebendvaccinen vorgeschlagen fc worden, jedoch gelang es mit keinem dieser Verfahren, eine NDV-Lebendvaccine herzustellen, die die beiden vorstehend genannten wesentlichen Voraussetzungen erfüllt.

Hauptgegenstand der Erfindung ist eine stark abgeschwächte NDV-Lebendvaccine, die die beiden oben genannten wesentlichen Voraussetzungen erfüllt, d.h. eine ausreichende Antikörperbildung hervorruft, um NDV-Infektionen und den Ausbruch der Krankheit zu verhindern, aber nach der Vaccination nicht die Symptome der Newcastle Disease hervorruft.

Die Erfindung betrifft ferner ein leichtes und einfaches Verfahren zur Herstellung der oben genannten wirksamen

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und stark abgeschwächten NDV-Lebendvaccine mit wirtschaftlich vertretbaren Kosten.

Die Erfindung umfaßt außerdem eine wirksame und sichere immunologische Methode zur Verhinderung der WDV-Infektion von Geflügel ohne ungünstige Nebenreaktionen.

Gemäß der Erfindung wird NDV einer bestimmten Aufeinanderfolge von Stufen unterworfen: NDV wird entweder in einer Schweinegewebekultur über eine Reihe von wenigstens 20 Passagen oder in stabilen Schweinezellreihen (porcine stable cell lines) wenigstens etwa 2 Monate gezüchtet (Stufe 1). Die erhaltenen Schweinezellen, die das abgeschwächte NDV enthalten, werden auf die Choriallantois- ( membran von Hühnerembryonen inoculiert, worauf das Hühnerembryo kultiviert wird (Stufe 2). Das aus dem erhaltenen Komplex von Chorioallantoismembran und Schweinezellen gewonnene NDV wird über eine R_eihe von wenigstens zwei Passagen in der Allantoishöhle von Hühnerembryonen kultiviert (Stufe 3).

Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann jeder Stamm des Newcastle Disease-Virus als Ausgangs-NDV verwendet werden.

Die Kultivierung in der Stufe Ϊ des Verfahrens gemäß der Erfindung kann vorgenommen werden, indem man das Ausgangs-NDV über eine Reihe von Passagen in einer Schweine- a gewebekultur züchtet oder stabile Schweinezellreihen der Dauerinfektion mit dem NDV unterwirft.

Die Schweinegewebekultur, die für die Züchtung des Ausgangs-HDV über eine Reihe von Passagen verwendet wird, kann primäre 3_chweinezellen, z.B. primäre Schweinenierenzellen, primäre 3_chweinehodenzellen und primäre Zellen von Schweineembryonen oder stabile Schweinezellreihen (porcine stable cell lines) enthalten, die in bekannter Weise von den vorstehend genannten primären Schweine- ' zellen abgeleitet sind. Das Ausgangs-NDV wird in die

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Gewebekultur geimpft, die die Zellen zusammen mit ρ ,em geeigneten Gewebekulturmedium enthält. , Hier wird das NDV stationär oder mit Rotation bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 38⁰C (gewöhnlich etwa 32 bis 36⁰C) etwa 2 bis 10 Tage gezüchtet. Pas proliferierte Virus wird dann in eine frische Gewebekultur inoeuliert, die Schweinezellen für die anschließende Passage der Kultivierung enthält. Mit aufeinanderfolgender Wiederholung dieser Passage geht die Abschwächung glatt vonstatten. Die Passagen der Kultivierung werden wenigstens zwanzigmal, vorteilhaft etwa fünfzig-bis hundertmal fortgesetzt, wodurch das NDV genügend abgeschwächt worden ist. Für W die. neuen Passagen der Kultivierung mit der Schweinegewebekultur wird bis zur 20.Passage das Kulturmedium der vorhergehenden Passage auf ungefähr das 10 - bis 10 fache Volumen verdünnt, und dieses verdünnte Medium wird als Impfvirua verwendet, das für die anschließende Kultivierungspassage inoeuliert wird. Bei einer Reihe von mehr als 20 Kultivierungspassagen ist es vorteilhaft, die aus der vorhergehenden Passage erhaltene Kulturbrühe wiederholt (zweckmäßig dreimal) einzufrieren und als Impfvirus die obenstehende Flüssigkeit der aufgetauten Brühe so, wie sie anfällt, oder nach Verdünnung auf ungefähr das 10- bis 100-fache Volumen zu verwenden.

P Es ist auch möglich, stabile Schweinezellreihen einer Dauerinfektion mit dem Ausgangs-NDV zu unterwerfen. Als stabile Schweinezellreihen werden vorzugsweise z.B. stabile Schweinenierenzellreihen, 3tabile Schweinehodenzellreihen u.dgl. verwendet. Die in einem geeigneten Gewebekulturmedium gezüchteten stabilen Schweinezellreihen werden mit dem NDV infiziert.

In der Praxis ist es vorteilhaft, die stabilen Schweinezellreihen mit dem NDV bei etwa 1:0,0001 bis 1:10 M.O.I. (Multiplicity of Infection), insbesondere bei etwa 1:1 M.O.Io zu infizieren. Die so infizierten stabilen S_ohwei-

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~ 5 ■ —

nezellreihen werden dann stationär oder mit Rotation bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 38⁰C (gewöhnlich etwa 32 bis 36⁰C) kultiviert, wodurch das NDV proliferiert, während die stabilen Schweinezellreihen sich selbst ebenfalls fortpflanzen. Bei dieser Dauerinfektion ist es zweckmäßig, das Kulturmedium in Abständen von etwa 2 bis 7 Tagen, vorzugsweise von etwa 3 Tagen, zu erneuern. Ferner ist es zur Abkürzung der .Gesamtdauer der Dauerinfektion zweckmäßig, die durch die Dauerinfektion erhaltene Flüssigkeit in frische stabile Schweinezellreihen oder Priraärzellen von Hühnerembryonen zu inoculieren, dann kleine Plaques (kleiner als etwa 1mm Durchmesser) (

von' NDV aus der erhaltenen Kultur nach dem bekannten Plaque -Bildungstest unter Verwendung stabiler Schweinezellreihen oder primärer Zellen von Hühnererabryonen auszuwählen (beschrieben beispielsweise in "Method in Virology", Band 3, Seite 289, herausgegeben von Academic Press, New York 1967) auszuwählen und frische stabile" Schweinezellreihen einer weiteren Dauerinfektion mit dem so isolierten, kleine Plaques bildenden NDV zu unterwerfen. ·

Die Dauerinfektion wird wenigstens 2 Monate, vorteilhaft etwa 15 bis 50 Monate fortgesetzt, wodurch das NDV genügend abgeschwächt worden ist. "

Als Gewebekulturmedien für die Stufe 1 des Verfahrens gemäß der Erfindung eignen sich beispielsweise Hanks-Lösung, Earle-Lösung und Gey-Lösung. Diese Medien können nach Bedarf mit geeigneten Bestandteilen, z.B. Lactalbuminhydrolysat und inaktiviertes Kalbsserum, ergänzt werden. Ferner kann dem Medium ein Antibiotikum oder Antibiotikumgemiech, z.B. Penicillin, Streptomycin, Dihydrostreptogjycin, Neomycin und Kanamycin, zugesetzt werden, um die Fortpflanzung von Fremdmikroorganismen, die durch zufällige Verunreinigung in das Medium gelangt sind, zn verhindern.

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Für die Herstellung einer NDV-Lebendvaccine wird da3 NDV in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies gezüchtet. Das abgeschwächte NDV ist jedoch nicht in der Lage, in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies zu proliferieren, so daß bei direkter Inoculierung des abgeschwächten NDV in die Allantoishb'hle des Hühnerembryos praktisch keine Proliferation des Virus stattfindet.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung kann dem in der Stufe 1 genügend abgeschwächten HDV die Fähigkeit verliehen werden, in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies zu proliferieren, indem die Schweinezellen, | die das in der Stufe 1 erhaltene abgeschwächte NDV enthalten, auf die Chorioallantoismembran des bebrüteten Hühnereies inoculiert werden und anschließend das Hühnerembryo kultiviert wird (Stufe 2). Als Hühnerembryo können vorteilhaft etwa 10 bis 11 Tage bebrütete Hühnereier ver-

5 wendet werden. Vorzugsweise werden pro Ei etwa 10 bis

10 Zellen, die das abgeschwächte NDV enthalten, auf die

Chorioallantoismembran der Hühnerembryonen inoculiert. Die Kultivierung der Hühnerembryonen, auf deren Chorioallantoismembran das abgeschwächte NDV in di-eser Weise geimpft worden ist, wird vorzugsweise stationär bei einer Temperatur zwischen etwa 35 und 4O°C, vorzugsweise etwa 36 bis 38⁰C, durchgeführt. Im allgemeinen wird die ™ Züchtung des abgeschwächten NDV auf der Chorioallantoismembran etwa 5 bis 10 Tage fortgesetzt, wodurch das Virus die Fähigkeit erwirbt, in der Allantoishöhle des bebrüteten Hühnereies zu proliferieren.

Das NDV wird aus dem in den Hühnerembryonen gebildeten Komplex der Chorioallantoismembran und der Schweinezellen gewonnen und dann einer Reihe von Züchtungspassagen in der Allantoishöhle von Hühnerembryonen unterworfen (Stufe 3). Die Gewinnung des NDV aus diesem Komplex und die Inoculation des Virus in die Allantoishöhle der HUhnererabryonen kann in der Praxis durchgeführt werden,

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indem man die Chorioallantoisnienibran, auf und in der die Schweinezellen proliferiert haben, nach der Kultivierung der Stufe 2 aus den Hühnerembryonen extrahiert, den Komplex aus Ohorioallantoismembran und Schweinezellen in einem geeigneten Medium, z.B. Hanks-Lösung, homogenisiert und die obenstehende Flüssigkeit oder das vom erhaltenen Gemisch abgetrennte Piltrat in die Allantoishöhle von Hühnerembryonen mit etwa 1 bis 1000 BIDc₀ (50$ Egg Infective Dose) pro Ei inoculiert. Als Hühnerembryonen für die Stufe 3 können vorteilhaft 10 bis 11 Tage bebrütete Hühnereier verwendet werden. Die Züchtung des NDV in der Allatoishöhle des Bruteies erfolgt im allgemeinen stationär etwa 2 bis 4 Sage bei einer T_empera~ ( tür zwischen etwa 35 und 40⁰C, vorzugsweise etwa 36 bis 38⁰C. Das proliferierte Virus wird dann für die anschlies~ sende Passage der Züchtung in die Allantoishchle von frischen Bruteiern inoculiert. Durch wenigstens zweimalige, vorzugsweise drei- bis zehnmalige Widerholung der Serienpassagen der Züchtung auf diese Weise proliferiert das ITDV in der Allantoishöhle des Bruteies häufig genug, um eine NDV-Yaceine zu bilden.

Die von den Bruteiern nach der letzten Passage der Züchtung gewonnene Allantoisflüssigkeit kann in Abhängigkeit von ihrem Virustiter als solche oder nach Verdünnung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wie physiologischer Kochsalzlösung oder destilliertem Wasser als NDV-Vaccine gemäß der Erfindung verwendet werden.

Die auf diese Weise hergestellte stark abgeschwächte NDV-Vaccine ist gebrauchsfertig, kann jedoch in eingefrorener Form mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer stabilisierender Mittel wie Saccharose, Lactose, Glutamate und Phosphate konserviert werden.'Sie kann auch mit oder ohne Zusatz eines oder mehrerer der vorstehend genannten stabilisierenden Mittel gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Produkt wird bei Gebrauch in einem

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geeigneten Verdünnungsmittel, z.B. physiologischer Kochsalzlösung oder sterilem destilliertem Wasser, gelöst.

Falls erforderlich, kann das NDV, das aus der Allantoisflüssigkeit nach der letzten Passage der Züchtung in St.ufe 3 gewonnen worden ist, in einem geeigneten Gewebekultursystem, z.B. in einer Kultur, die Primärzellen von Hühnerembryonen enthält, zur Herstellung von NDV-Vaccine weiter gezüchtet werden. In diesem Pail werden Feststoffe-, z.B. Zellen und Zellfragmente, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugieren entfernt. Das Filtrat oder die obenstehende Flüssigkeit kann in Abhängigkeit von ihrem Virustiter als solche oder nach Verdünnung mit einem der oben genannten geeigneten Verdünnungsmittel als NDV-Vaccine gemäß der Erfindung verwendet werden.

Die auf diese Weise hergestellte NDV-Lebendvaccine zeichnet sich dadurch aus, daß sie im wesentlichen keine Virulenz hat und in hohem Maße die Fähigkeit zur Antikörperbildung besitzt. Wenn beispielsweise 10 Tage alte Küken mit etwa 10 EID₁-Q pro Küken geimpft werden, so zeigen diese Tiere keinerlei Symptom der Newcastle Diseas. 10 Tage alte Küken, die mit etwa 10 EID₁-Q pro Küken geimpft werden, zeigen keinerlei Anzeichen der Newcastle Disease, auch wenn sie 14 Tage nach der Impfung mit NDV in einer Dosis von etwa 10 LD,-q (50$-Letaldosis) infiziert werden. Ferner werden durch die Impfung mit der NDV-Lebendvaccine gemäß der Erfindung beträchtlich verlängerte Immunisierungseffekte im Vergleich zu den bisher bekannten Vaccinen erreicht.

Die NDV-Lebendvaccine gemäß der Erfindung kann allen Arten von Vögeln, die von der Newcastle Disease befallen v/erden, z.B. Küken, Putern, Tauben und Perlhühnern, zur Prophylaxe verabreicht werden. Zur ausreichenden Impfunp; ist eine Dosis von etwa 10"-1O^ ΕΙ.ϋ_Γ() pro Tier vorteilhaft. Auch I:c5 noch höheren Dosen besteht keinerlei Gefahr unervsünschter Nebenwirkungen auf Grund der hohen sicherheit der erfin-

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dungsgemäßen Vaccine, jedoch ist es unzweckmäßig, diese hohen Dosierungen anzuwenden, da keine besondere Steigerung des gewünschten Vaccinationseffekts zu erwarten ist.

Die NDV-Lebendvaccine gemäß der Erfindung kann dem Geflügel beispielsweise oral, intranasal, als Augenlotion, durch Aufsprühen oder durch subkutane oder intramuskuläre Injektion verabreicht werden.

Die Sicherheit und Wirksamkeit der stark abgeschwächten NDV-Vaccine gemäß der Erfindung wird durch die nachstehend beschriebenen Versuche weiter veranschaulicht«

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in den folgenden Beispielen beschrieben.

Die Versuche 1 und 2 veranschaulichen die typische Vorbereitung der primären Schweinenierenzellen und die Herstellung der stabilen Schweinezellreihen. Die Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht/Volumen, falls nicht anders angegeben.

Versuch 1

Einem gesunden jungen Schwein wird die Niere aseptisch entnommen und dekapsuMert, um das Nierenbecken zu entfernen. Die erhaltene Nierenrinde wird aseptisch zu Fragmenten von 3 bis 5 mm Größe geschnitten. Die Gewebsfragmente werden dreimal jeweils mit etwa dem 10-fachen Volumen der von zweiwertigen Calcium- und Magnesiumionen freien basischen Phosphatlösung von Dulbecco der nachstehend genannten Zusammensetzung (pj, 1_fZ) gewaschen und in ungefähr dem 10-fachen Volumen dieser Lösung, die durch 0,£5$ trypsin (Difco 1i250) ergänzt iet, suspendiert. Die Suspension wird 1 Stunde geröhrt und 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Die erhaltenen Zellen werden in einer solchen Menge einer Hanks-lÄctalbuminlöaung der nachstehend genannten Zusammensetzung* der vorher 5$ inaktiviertes Kaltifiiaerus, 200 Binheitec Pfnicillin pro ml

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und 200 ng Streptomycin pro ml zugesetzt worden waren, suspendiert, daß die erhaltene Zellauspension etwa 2 χ Iu Zellen/ml enthält. Die Suspension wird stationär in Roux-Flaschen 96 Stunden bei etwa 37°C bebrütet, wobei Monoschichtzellen der Schweineniere erhalten werden.

Die oben genannte, von zweiwertigen Calcium- und Magnesiuraionen freie basische Phosphatlösung nach Dulbecco hat folgende Zusammensetzung:

NaCl . 8,0 g

KCl 0,2 g

Na₂HPO₄ 1,15 g

KH₂PO. 0,2 g

Wasser 800 ml

Die oben genannte Hanks-Lactalbuminlö'sung wird hergestellt, indem 5 g Lactalbuminhydrolysat in Hanks-Lösung in einer Menge, die insgesamt 1000 ml ergibt, gelöst werden. Die Hanks-Lösung hat folgende Zusammensetzungί

NaCl 8,0 g

KCl 0,4 £

CaCl₂ 0,2 g

MgSO₄.7H₂O 0,2 g

Na₂HPO₄.2H₂O 0,06 g

KH₂PO₄ 0,06 g

NaHCO₃ 0,25 g

d-Glucose 1,0 g

Phenolrot 0,02 g Desttilliertes Wasser (dreifach destilliert) a.d. 1 1

Versuch 2

Die gemäß Versuch 1 erhaltenen Monoschichtzellen der Schweineniere werden in an sich bekannter Weise einer Reihe von 50 Züchtungspässagen in der Hanks-Lactalbuminlösung unterworfen, die die gleiche Zusammensetzung wie die im Versuch 1 verwendete Lösung hat, wobei stabile

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Schweinezellreihen erhalten werden.

Aus Roux-Flaschen, die die stabilen Schweinezellreihen enthalten, wird die Kulturflüssigkeit abgegossen, wobei die stabilen Schweinezellreihen auf der Innenwand der Flaschen zurückbleiben. Die Zellen werden zweimal -mit jeweils ungefähr dem 100-fachen Volumen der von zweiwertigen Calcium- und Magnesiumionen freien basichen Phosphatlösung nach Dulbecco gewaschen und 20 Minuten bei etwa 37⁰C unter ungefähr dem 100-fachen Volumen dieser Lösung gehalten, die 0,005$" Trypsin(Difco 1:200) und 0,02$ Äthylendiamintetraessigsäure enthält, wobei Exfoliation der stabilen Schweinezellreihen eintritt. {

Die stabilen Schweinezellreihen werden in der- Hanks-Laet— albuminlösung der gleichen Zusammensetzung wie im Versuch suspendiert, wobei die Lösung in einer solchen'Menge verwendet wird, daß die-Zellsuspension etwa 2 χ 10 Zellen/ml enthält.

Die Zellsuspension wird in Roux-Flaschen 72 Stunden bei 37⁰C stationär bebrütet, wobei die stabilen Schweine-„zellreihen erhalten werden, die für die Proliferation von NDV verwendet werden können.

Beispiel 1

Ein Impfvirus von NDV, der Stamm "Tokyo" ATCC VR-623 ("Virus", Band 7; Seite 109-110, herausgegeben von The Society of Japanese Virologists, 1957), wird bei etwa 1:1 M.O.I, in Monoschichtzellen einer Schweineniere in Hanks-Lactalbuminlcsung (hergestellt gemäß Versuch 1) inoculiert und 7 Tage stationär bei etwa 35⁰C gezüchtet. Die Kulturflüssigkeit wird 10 Minuten bei 3000 UpM zentrifugiert, um eine obenstehende Flüssigkeit abzutrennen, die nach Verdünnung mit dem 100-fachen Volumen der Hanks-Lösung als Impfvirus in der nächsten Passage verwendet · wird. Von der 21.Passage der Züchtung ab wird die Kultur-

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trühe, die? aus der vorhergehenden Passage erhalten worden ist, dreimal eingefroren. Die obenstehende Flüssigkeit der aufgetauten Brühe wird nach Verdünnung mit dem 10-fachen Volumen von Hanks-Lösung als Impfvirus in der nächsten Passage verwendet. Auf diese Weise werden die Schweinenierenzellen über 50 Passagen gezüchtet.

Die primären Nierenzellen aus der 50.Passage der Züchtung werden in einer Menge von etwa 10 Zellen pro Ei auf die Chorioallantoismembran von 11 Tage bebrüteten Hühnereiern inokuliert. Die Hühnerembryonen werden 8 Tage "bei etwa 37⁰C stationär gezüchtet.

Der Komplex aus Chorioallantoismembran und Schweinezellen wird von den Eiern gewonnen, mit Hanks-Lösung in einer Menge von 2 ml pro Ei gemischt und dann homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wird 5 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert. Die erhaltene obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 100 EID₅₀ (50$ Egg Infective Dose) pro 0,2 ml. Der EID^Q-V/ert wird unter Anwendung des Systems der 10-fachen Verdünnung nach der bekannten Methode bestimmt, die beispielsweise in "Virology", Band 2, Seite 57 bis 68 (1956) beschrieben wird.

Die obenstehende Flüssigkeit wird in einer Menge von B| 0,2 ml pro Ei in die Allantoishöhle von etwa 11 Tagen bebrüteten Hühnereiern inoculiert und 5 Tage stationär bei etwa 36⁰C bebrütet. Die von den Eiern gewonnene Allantoisflüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem 10-fachen Volumen von Hanks-Lösung in die Allantoishöhle von frischen Hühnerembryonen inoculiert und in der oben beschriebenen Weise bebrütet. Auf diese V/eise wird die Passage von NDV in der Allantoishöhle der Hühnerembryonen dreimal wiederholt. Der obenstehende Teil der Allantoisflüssigkeit, die bei der dritten Passage erhalten wird, zeigt etwa 10 EID₅₀ pro 0,2 ml.

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Die oben genannte obenstehende Flüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem 10 -fachen Volumen von Hanks-Lösung aseptisch in die Allantoishöhle von 10 Tage bebrüteten Hühnereiern inoculiert und 2 Tage aseptisch bei 36 C kultiviert. Nachdem die Eier 12 Stunden bei etwa 4 C gehalten worden sind, wird die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern gewonnen. Sie wird 5 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert, wobei als obenstehende Flüssigkeit eine stark abgeschwächte NDV-Lebendvaccine abgetrennt wird.

Die obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 10 EIDcq pro ml.

Das Produkt wird für die Lagerung bei -70⁰C eingefroren. Nach einjähriger Lagerung wird sie aufgetaut und mit dem 10 -fachen Volumen an physiologischer Kochsalzlösung verdünnt. Mit der verdünnten Vaccine werden Küken durch Besprühen geimpft, wodurch die gewünschte Wirkung der Immunisierung der Küken eintritt.

Beispiel 2

Stabile Schweinezellreihen in Hanks-Lacalbuminlösung (hergestellt gemäß Versuch 2) werden mit einem Impfvirus von NDV, Stamm "Tokyo", ATTC VR-623, bei etwa 1:1 M.O.I. infiziert und 15 Monate stationär bei etwa 36⁰C kultiviert. Während dieser Zeit wird das Kulturmedium in Abständen von etwa 5 Tagen erneuert.

Die auf diese Weise mit NDV dauerinfizierten stabilen Schweinezellreihen werden in einer Menge von etwa 10 Zellen pro Ei auf die Chorioallantoismembran von 10 Tage bebrüteten Hühnereiern inoculiert. Die Hühnerembryonen werden 7 Tage stationär bei etwa 37⁰C kultiviert.

Der Komplex aus Chorioallantoismembran und SchweinezeIlen wird aus den Eiern gewonnen, mit Hanks-Lösung in einer Menge von 2 ml pro Ei gemischt und dann homogenisiert. Das homogenisierte Gemisch wird 5 Minuten bei 3000 U/Min. zentrifugiert. Die erhaltene obenstehende flüssigkeit zeigt etwa 100 EIILq pro 0,2 ml.

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Die obenstehende Flüssigkeit wird in die Allantoishöhle von etwa 11 Tage bebrüteten Hühnereiern in einer Menge von 0,2 ml pro Ei inoculiert und 5 Tage stationär bei 36⁰C kultiviert. Die aus dem Ei gewonnene Allantoisflüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem 10-fachen Volumen Hanks-Lösung in die Allantoishöhle von frischen Hühnerembryonen inoculiert und in der oben beschriebenen Weise kultiviert. Auf diese Weise wird die Passage von NDV in der Allantoishöhle der bebrüteten Hühnereier zweimal wiederholt. Der aus der zweiten Passage erhaltene obenstehende Teil der Allantoisflüssigkeit zeigt etwa · 10⁷ EID₅₀ pro 0,2 ml.

Die obenstehende Flüssigkeit wird nach Verdünnung mit dem 10 -fachen Volumen an Hanks-Lösung aseptisch in die Allantoishöhle von 10 Tage bebrüteten Hühnereiern inocu™ liert und 2 Tage Tage stationär bei 36⁰C kultiviert. Nachdem die Eier 12 Stunden bei etwa 4⁰C gehalten worden sind, wird die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern gewonnen. Sie wird 5 Minuten bei 3000 U/Minute zentrifugiert, wobei als obenstehende Flüssigkeit eine stark abgeschwächte NDV-Lebendvaccine abgetrennt-wird. Die obenstehende Flüssigkeit zeigt etwa 10 EID₁-Q pro ml.

Test 1

Mit je etwa 1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten NBV-Lebendvaccine mit 10 EID™ pro ml wurden 15 Tage alte Küken intravenös geimpft. Der klinische Zustand jedes Tiers würde beobachtet, jedoch zeigten sich keinerlei Symptome der Newcastle Disease. Außerdem hatte eine Untersuchung des Bluts der Küken auf NDV am zweiten Tag nach der Impfung übereinstimmend negative Ergebnisse.

Fünf Küken wurden in der gleichen Weise mit dem Ausgangsstamm von NDV, d.h. dem Stamm "Tokyo" ATCC VR-623, geimpft . Die Untersuchung von Blutproben, die am zweiten und vierten Tag nach der Inoculation genommen und auf

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1/10 ihres ursprünglichen Volumens verdünnt waren, ergab 10² EiD₅₀ des Virus pro 0,2 ml.

Test 2

Je 1 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten verdünnten NDV-Vaccine mit 10 EID₁-Q pro ml wurde intravenös drei Küken, die ein Alter von 1.0 Tagen hatten, verabreicht. 14 Tage nach der Impfung wurden die Küken mit dem Ursprungsstamra von NDV, d.h. dem Stamm "Tokyo". AI¹TC VR-623 intravenös in einer Dosis von etwa 10 ÜOj-q pro Tier geimpft.

Die mit der Lebendvaccine geimpften Tiere zeigten während einer Zeit von 1 Monat nach der Zufuhr des Ursprungsstamme keine Anzeichen der Newcastle Disease, während Kontrollküken, die nicht geimpft worden waren,· "bereits am zweiten Tag nach der Zufuhr des Ursprungs-NDV den Ausbruch der typischen Newcastle Disease seilten, verbunden mit ernsten Symptomen wie Diarrhöe, Dyspnöe, Unfähigkeit aufzustehen u.dgl. Schließlich gingen diese Tiere in 5 bis 7 Tagen ein. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

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Gruppe von Küken

Zahl Virämie (NDV der in 0,2 ml Küken Blut 2 Tage

nach Infizierung) Newcastle Disease-Symptome bei den Küken nach
_j der Infizierung '

1.Tag 2.Tag 3.Tag 4.Tag 5.Tag 6.Tag 7.Tag 3O.Tag

Geimpfte
Gruppe

1 2 3

•ν.
"O

Nicht geimpfte
Gruppe

4 5 6

1Cr EID 10² EID 10² EID

'5O 50 50 +++ tot

+ = Anorexie
++ = Diarrhöe

+++ = ausgestreckt, mit Dyspnöe

++++ = Augen geschlossen, Kopf unter den Flügel gesteckt +++++ = ausgestreckt.

cn oo cn

Die LD50 ^w^^r^ nach der "bekannten Methode bestimmt, die beispielsweise in "American Journal of Hygiene", Band 27» (1938), Seite 493-497, beschrieben wird.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von stark abgeschwächter Newcastle Disease-Virus-Vaccine, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) Newcastle Disease-Virus entweder in einer Schweinegewebekultur in einer Reihe von wenigstens 20 Passagen oder in stabilen Schweinezellreihen (porcine stable cell lines) wenigstens 2 Monate züchtet,

b) die erhaltenen Schweinezellen, die den abgeschwächten Newcastle Disease-Virus enthalten, auf die Chorioallantoismembran von Hühnerembryonen inoculiert und die Hühnerembryonen kultiviert und

.c) den Newcastle Disease-Virus, der vom erhaltenen Komplex aus Chorioallantoismernbran und Schweinezellen gewonnen worden ist, über eine Reihe von wenigstens 2 Passagen in der Allantoishöhle von Hühnerembryonen kultiviert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in der Stufe (a) bei einer Temperatur zwischen etwa 30 und 38⁰C durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in der Stufe (a) unter Verwendung einer Gewebekultur durchgeführt wird, die primäre Schweinenierenzellen enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung der Stufe (a) durch Dauerinfektion von stabilen Schweinenierenzellreihen mit Newcastle Disease-Virus durchgeführt wird.

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5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Inoculation und die Züchtung der Stufe (b) unter Verwendung von etwa IO bis 11 Tage bebrüteten Hühnereiern bei einer Temperatur zwischen etwa 35 und "40°G durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung in der Stufe (b) etwa 5 bis 10 Tage durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnefc, daß die Züchtung in Stufe (c) über mehrere Passagen unter Verwendung von etwa 10 bis 11 Tage bebrüteten Hühnereiern bei einer Temperatur zwischen etwa 35 und 40°C durchgeführt wird.

Stark abgeschwächte Newcastle Disease-Virus-Vaccine, die bei 10 Tage alten Küken, die mit etwa 10^ EXD₁-Q pro Küken geimpft werden, keine Symptome der Newcastle Disease hervorruft, und die bei 10 Tage alten Küken, die mit etwa 10-⁵ EID₁-Q pro Küken geimpft werden, das Auftreten der Symptome der Newcastle Disease verhindert,

wenn den Küken 14 Tage nach der Impfung der· Newcastle

Diseai wird.

Disease-Virus in einer Dosis von etwa 10 LDc₀ zugeführt

1QS324/3C58

BAD ORIGINAL