DE2165401C3

DE2165401C3 - Inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der Atmungsorgane

Info

Publication number: DE2165401C3
Application number: DE2165401A
Authority: DE
Inventors: Yoshikazu Koga Shiga Iritani; Koichi Tottori Otsuki
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1970-12-29
Filing date: 1971-12-29
Publication date: 1979-10-31
Also published as: DK135853C; DK135853B; GB1324619A; FI48480C; NL7117873A; GB1324618A; FI48480B; JPS4823893B1; FR2120078A1; DE2165401B2; FR2120078B1; DE2165401A1; SE398514B; BE777498A

Description

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Infektiöse Coryza, Infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit sind als Erkrankungen der Atmungsorgane bei Geflügel von Bedeutung. Die Infektiöse Coryza wird von Haemophilus gallinarum verursacht; die Infektiöse Bronchitis und die Newcastle-Krankheit sind durch Viren verursachte Krankheiten. Das Geflügel wird durch solche Seuchen schwer geschädigt Solche Seuchen brechen häufig bei Hühnern, Truthühnern, Perlhühnern, Enten, Gänsen, Tauben, Fasanen und Rebhühnern aus.

Die Infektiöse Bronchitis bewirkt bei jungem Geflügel eine hohe Sterblichkeit; bei ausgewachsenem Geflügel sind hingegen die Wirkungen dieser Krankheit weniger ernst Die Infektiöse Coryza bewirkt nur eine geringe Sterblichkeit; ihre Hauptwirkungen bestehen in der Wachstumshemmung und im plötzlichen Rückgang der Produktion von Eiern, wodurch schwere wirtschaftliche Schäden entstehen. Die Newcastle-Krankheit ist die schwerste der vorgenannten Krankheiten; die durch diese Krankheit bewirkte hohe Sterblichkeitsrate ist unabhängig vom Alter des infizierten Geflügels.

Bisher wurden zur Bekämpfung· der Newcastle-Krankheit und der Infektiösen Bronchitis sowohl inaktivierte Impfstoffe als auch Lebendimpfstoffe verwendet. Diese Impfstoffe lagen jedoch als Einzelimpfstoffe und nicht als Kombinationsimpfstoffe vor. Ferner hat der im Handel erhältliche inaktivierte Impfstoff zur Bekämpfung der Infektiösen Bronchitis nur eine geringe Wirkung. Lebendimpfstoffe ergeben zwar eine relativ langanhaltende Immunität, aber ihre Anwendung ist im allgemeinen nicht ungefährlich. Normales, gesundes Geflügel wird häufig durch Impfung mit Lebendimpfstoffen getötet, wobei diese Gefahr besonders groß bei Geflügel mit einem Alter unter 3 Wochen ist. Ferner werden die Krankheiten durch Verwendung von Lebendimpfstoffen manchmal von dem geimpften Geflügel auf anfälliges oder nicht-immunes Geflügel übertragen. Aus diesen Gründen werden inaktivierte Impfstoffe bevorzugt.

Bekanntlich treten Infektionen der Atmungsorgane bei Geflügel gewöhnlich in Form eines sogenannten »respiratorischen Krankheitskomplexes« auf, der durch mehrere Erreger, wie Haemophilus gallinarum, Newcastlevirus und Infektiöse Bronchitis-Virus, hervorgeru- t>o fen wird. Der bei der Geflügelzüchtung auftretende wirtschaftliche Verlust, der durch Mehrfachinfektion hervorgerufen wird, ist viel größer als der auf einer Einzelinfektion beruhende Verlust. Ferner ist zur Behandlung einer großen Zahl von Geflügel bei trf wiederholter Anwendung zweier oder mehrerer Einzelimpfstoffe eine beträchtliche lange Zeit erforderlich, wodurch die Impfung sehr kostspielig wird. Aus diesen Gründen ist die Verwendung eines Kombinationsimpfstoffes in der Geflügelzüchtung sehr wünschenswert, bisher wurden jedoch auf diesem Anwendungsgebiet keine inaktivierten Kombinationsimpfstoffe eingesetzt

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen inaktivierten Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der Atmungsorgane zur Verfugung zu stellen, mit denen die vorgenannten Krankheiten wirksam bekämpft werden können. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst

Gegenstand der Erfindung ist somit ein inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der Atmungsorgane, der gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an inaktiviertem, in einem natürlichen Nährmedium gezüchteten Haemophilus gallinarum Stamm 221, inaktiviertem Newcastlevirus Sato Stamm und inaktiviertem Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm.

Entgegen der naheliegenden Annahme, daß sich die Kombination mehrerer Impfstoffe nachteilig auf das Geflügel auswirken könnte, wurde erfindungsgemäß überraschenderweise festgestellt daß der inaktivierte Kombinationsimpfstoff der Erfindung eine sichere Anwendung erlaubt und keine nachteiligen Wirkungen hervorruft Es ist bekannt daß die einzelnen Komponenten eines Gemisches verschiedener Impfstoffe leicht ihre Aktivität durch Wechselwirkung oder gegenseitige Hemmung verlieren; vergl. Michael A. Bratt and Harry Rubin, Virology Bd. 33 (19Ö7), S. 598 bis 608. Erfindungsgemäß wurde jedoch festgestellt daß bei dem inaktivierten Kombinationsimpfstoff der Erfindung keine solchen Unverträglichkeiten auftreten.

Die bisher bekannten inaktivierten Impfstoffe zur Bekämpfung der Infektiösen Coryza wurden durch Züchten von Haemophilus gallinarum Stamm 221 in halbsynthetischen Nährmedien hergestellt Wegen ihrer zu niedrigen immunologischen Wirkungen sind diese Impfstoffe in der Praxis ungeeignet (Clark and Godfrey, Avian Dis., Bd. 5 (1961), S. 37 und Page et aU Avian Dis. Bd. 7 (1963), S. 239). Erfindungsgemäß wurde jedoch überraschend festgestellt, daß ein inaktivierter Impfstoff, der durch Züchten des vorgenannten Mikroorganismus in natürlichen Nährmedien anstelle von synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedien erhalten wird, eine beträchtlich höhere immunologische Wirkung zeigt, als die bekannten Impfstoffe. Ferner wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß der aus Infektiöse Bronchitis-Virus hergestellte Einzelimpfstoff, der besonders im Frühstadium nach der Impfung nur eine geringe Aktivität zeigt, als Gemisch mit dem aus Newcastlevirus Sato Stamm hergestellten inaktivierten Impfstoff und den aus Haemophilus gallinarum Stamm 221 — gezüchtet in natürlichem Nährmedium — hergestellten inaktivierten Impfstoff eine beträchtlich erhöhte immunologische Wirkung gegen die Infektiöse Bronchitis aufweist. Die beiden zuletzt genannten Impfstoffe verstärken also synergistisch die immunologische Wirkung des Impfstoffes aus inaktiviertem Infektiöse Bronchitis-Virus. Die vorstehenden Ausführungen zeigen somit deutlich die beträchtlichen Vorteile des erfindungsgemäßen Kombinationsimpfstoffs.

Zur Herstellung eines inaktivierten Impfstoffes zur Bekämpfung der Infektiösen Coryza werden natürliche Nährmedien verwendet, die im allgemeinen zur Züchtung von Bakterien der Gattung Haemophilus eingesetzt werden. Wie vorstehend erwähnt, wurde festgestellt, daß ein durch Züchten von Haemophilus

gallinarum Stamm 221 in natürlichen Nährmedien hergestellter Impfstoff eine höhere Aktivität hat als der bei Verwendung synthetischer oder halbsynthetischer Nährmedien erhaltene Impfstoff. Ferner wurde festgestellt, daß der in einem natürlichen Nährmedium s gezüchtete Haemophilus gallinarum Stamm 221 eine andere Morphologie aufweist als der in einem synthetischen oder halbsynthetischen Nährmedium gezüchtete Stamm. Als natürliches Nährmedium kann z. B. ein im wesentlichen aus 1000 ml Hühnerfleischbouillon, 5 g Natriumchlorid, 10 g Polypepton und 0,5% Hühnerserum bestehendes Medium, dessen pH-Wert auf 7,0 bis 7,4 eingestellt wird, verwendet werden. Obwohl das Nährmedium zahlreiche natürliche Nährstoffe enthalten kann, ist die Verwendung von is Rindfleischextrakt oder Kartoffeln anstelle von Hühnerfleiscbbouillon, Caseinhydrolysat cder Hefeextrakt anstelle von Polypepton und Schafserum oder Diphosphopyridinnucleotiden anstelle von Hühnerserum bevorzugt Als natürliches Nährmedium können auch bebrütete Hühnereier verwendet werden.

Haemophilus gallinarum Stamm 221 ist im National Institute of Animal Health (NIAH)₁ Ministerium für Landwirtschaft und Forsten, das in Verbindung mit der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms steht, hinterlegt

Ein natürliches Nährmedium wird mit Haemophilus gallinarum Stamm 221 beimpft, und das beimpfte Nährmedium wird in einer Standkultur mit großem Volumen bei üblichen Temperaturen, z. B. 30 bis 40° C, bebrütet Die Züchtung kann auch unter aeroben Bedingungen in Submerskultur durchgeführt werden. Nach beendeter Züchtung wird die Kulturbrühe mit einem Inaktivierungsmiitel zur Inaktivierung des Mikroorganismus versetzt Als Jnaktivierungsmittel können z. B. das Natriumsdz der Äthylmercurithiosalicylsäure, ß-Propiolacton, Tylosin, Salicylsäure, Kristallviolett Benzoesäure, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin und Gramicidin eingesetzt werden. Nach der Zugabe einer geeigneten Menge eines Adjuvans wird die Kulturbrühe in einer Durchlaufzentrifuge zentrifugiert Als Adjuvans kann z. B. Aluminiumhydroxidgel, Ahiminiumphosphatgel,

Calciumphosphatgel oder ein Alaun eingesetzt » ei den. Der bei der Zentrifugation erhaltene Rückstand wird zur Herstellung einer Suspension mit einer Zellkonzentration von 10* bis 10⁸ Zellen/ml in einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung suspendiert Die Suspension wird zur Lagerung mit einem antiseptischen Mittel versetzt Als so antiseptisches Mittel kann z.B. das Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure, Tylosin, /?-Propiolacton, Benzoesäure, Formaldehyd, Salicylsäure, Kristallviolett, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin oder Gramicidin verwendet werden. Der so hergestellte inaktivierte Impfstoff gegen Infektiöse Coryza wird nachstehend als Hg-Impfstoff bezeichnet.

Die Herstellung von inak· i zierten Impfstoffen gegen Newcastle-Krankheit und .nfektiöse Bronchitis kann nach üblichen Methoden erfolgen, z. B. durch Vermehren der Viren im bebrüteten Hühnerei, Isolieren, Inaktivieren und Suspendieren des Virus in einer Pufferlösung und anschließendes Versetzen der Suspension mit einem Adjuvans.

Das Newcastlevirus Sato Stamm ist ebenfalls im b5 NIAH hinterlegt. Der hergestellte inaktivierte Impfstoff gegen Newcastle-Krankheit wird nachstehend als N D- ImDfstoff bezeichnet.

Das Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm ist ebenfalls im NIAH hinterlegt

Der hergestellte inaktivierte Impfstoff gegen Infektiöse Bronchitis wird nachstehend als IB-Impfstoff bezeichnet

Zur Herstellung von Kombinationsimpfstoffen werden der Hg-Impfstoff, der ND-Impfstoff und der IB-Impfstoff in solchen Mengen vermischt daß jeder Impfstoff im Endprodukt in einer wirksamen Konzentration enthalten ist Ein bevorzugter Kombinationsimpfstoff enthält 5 bis 30 Volumteile inaktivierte Haemophilus gallinarum Stamm 221-Suspension in einer Konzentration von 33 χ 10⁷ bis 3,3XlO⁹ Zellen/ml, 5 bis 30 Volumteile einer Suspension des inaktivierten Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm in einer Konzentration von 10⁴ bis 10⁷ EIDso/ml und 5 bis 30 Volumteile einer Suspension des inaktivierten Newcastlevirus Sato Stamm in einer Konzentration von 10« bis ΙΟ⁹·⁵ EIDüo/ml pro 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff. Die vorgenannten Mengenverhältnisse sind jedoch nicht erfindungswesentlich.

Obwohl der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff in den meisten Fällen eine ausreichende immunologische Wirkung ohne einen Zusatz eines Adjuvans aufweist wird der Kombinationsimpfstoff vorzugsweise zur Verstärkung seiner Wirkung mit einem Adjuvans versetzt Ein bevorzugter Anteil des Adjuvans beträgt 1 bis 50 Vo'umteile pro 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff; dieses Mengenverhältnis ist jedoch nicht erfindungswesentlich. Als Adjuvans kann Aluminiumhydroxidgel, Aluminiumphosphatgel, Calciumphosphatgel oder ein Alaun verwendet werden. Dem Kombinationsimpfstoff kann, falls notwendig, ein antiseptisches Mittel, wie das Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure, /J-Propiolacton, Tylosin, Salicylsäure, Kristallviolett Benzoesäure, oberflächenaktive Mittel, wie Benzethoniumchlorid, Polymyxin oder Gramicidin zugesetzt werden. Der Kombinationsimpfstoff kann dem Geflügel intramuskulär, subcutan oder intracutan injiziert werden.

Der erfindungsgemäße Kombinationsimpfstoff hat eine ausgezeichnete immunologische Wirkung. Durch eine einzige Anwendung kann eine Immunisierung gegen sämtliche vorgenannten drei Krankheiten d. h. gegen Infektiöse Coryza, Infektiöse Bronchitis und Newcastle-Krankheit, bewirkt werden. Ferner treten bei Gefügel, das mit einem erfindungsgemäßen Impfstoff behandelt wurde, keine merklichen Nebenwirkungen auf. Der erfindungsgemäße Kombinationsimpistoff eignet sich somit vorzüglich zur Immunisierung von Geflügel gegen Infektionen der Atmungsorgane.

Herstellung der Einzelimpfstoffe:

A) Zur Herstellung des inaktivierten Hg-Impfstoffes wird ein Medium mit der nachstehenden Zusammensetzung verwendet:

*Hühnerfleischbouillon)**	1000 ml
Natriumchlorid	5g
Polypepton	10g
Hühnerserum	0,5 Prozent
pH 7,0 bis 7,4

1 kg zerkleinertes Hühnerfleisch wird unter Rühren mit ¹ Liter Wasser versetzt. Das Gemisch wird etwa 24 Stunden bei 0"C stehengelassen, dann 30 bis 60 Minuten mit Wasserdampf behandelt und nitriert. Das erhaltene Filtrat wird als Hühnerfleischbouillon eingesetzt.

Die Hühnerflehchbouillon wird zusammen mit Natriumchlorid und Polypepton in einem Autoklav 20 Minuten bei 121°C sterilisiert. Das Hühnerserum wird getrennt mittels eines Seitz-Filters sterilisiert. Das sterilisierte Hühnerserum wird zu dem sterilisierten Gemisch der übrigen Komponenten gegeben.

Das aus einer gefriergetrockneten Vorratskultur erhaltene Bakterium Haemophilus gallinarum Stamm 221 wird in den Dottersack eines 4 Tage bebrüteten Hühnereis in einer Konzentration von etwa 10* lebenden Zellen/ml eingeimpft Nach etwa 24stündiger Inkubation ist der Embryo abgestorben; der Eidotter wird auf einem Blutagar-Nährboden ausgestrichen, und Haemophilis gallinarum Stamm 221 wird 24 Stunden in einer 5 bis 10 Prozent Kohlendioxid enthaltenden Atmosphäre bei 37° C gezüchtet Die aus einer Kolonie auf dem Blutagar-Nährboden erhaltenen Zellen werden in 1 Liter des in einem 2 Liter fassenden Kolben befindlichen vorstehend hergestellten Mediums in einer Konzentration von 10⁴ bis 10⁵ lebende Zellen/ml eingeimpft Die Züchtung wird in einer Standkultur bei 37° C so lange durchgeführt, bis eine stationäre Phase mit einer Zellkonzentration von 10* bis 10⁸ Zellen/ml erreicht ist Die Zellen werden dann durch Zugabe von 0,1 Prozent Natriumsalz der Äthylmercurithiosalicylsäure inaktiviert, und die Kulturbrühe wird etwa 24 Stunden bei 4° C stehengelassen. Dann wird die Kulturbrühe mit etwa 1 Volumteil des nachstehend beschriebenen Aluminiumhydroxidgels pro 50 Volumteile Kulturbrühe versetzt. Das Gemisch wird etwa 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 6000 bis 12 000UpM mit einer Ausflußgeschwindigkeit von 100 ml/Minute in der Durchlaufzentrifuge zentrifugiert. Der Zentrifugationsrückstand wird mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) versetzt; es wird eine Suspension hergestellt, die etwa die 33fache Konzentration der ursprünglichen Kulturbrühe aufweist. Diese Suspension wird mit soviel Tylosin als antiseptischem Mittel versetzt, daß dessen Endkonzentration 5 Prozent ausmacht.

Herstellung von 15prozentigem Hg-Impfstoff:

15 Volumteile der vorstehend hergestellten Suspension werden mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) und Aluminiumhydroxidgel in solchen Mengen vermischt, daß 100 Volumteile Hg-Impfstoff erhalten werden, der 50 Voiumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.

Herstellung des Aluminiumhydroxidgels:

Ein geringer Überschuß einer lprozentigen wäßrigen Lösung von Ammoniumaluminiumsulfat wird mit Iprozentiger wäßriger Ammoniaklösung umgesetzt. Der Überstand wird dekantiert. Der Niederschlag wird so lange mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser keine Ammoniumionen mehr enthält. Der Niederschlag wird 30 Minuten bei 120⁰C in einem Autoklav sterilisiert. Das so erhaltene Aluminiumhydroxidgel wird als Adjuvans verwendet.

B) Etwa 10⁵ Zellen von Newcastlevirus Sato Stamm werden in die Allantoishöhle eines 9 bis 11 Tage bebrüteten Hühnereis eingeimpft und 26 bis 36 Stunden in einem Inkubator bei 37°C vermehrt. Die Allantoisflüssigkeit wird dann aus dem Ei entnommen und mit 0-Propiolacton als Inaktivierungsmittel bis zu einer Endkonzentration von 0,05% versetzt Dieses Gemisch wird dann 30 bis 60 Minuten bei 4° C stehengelassen und anschließend etwa 30 Minuten bei 300OUpM zur Entfernung des Niederschlags zentrifugiert

ίο Herstellung von lSprozentigemND-Impfstoff:

_ 15 Volumteile des bei der Zentrifugation erhaltenen Uberstands, der ΙΟ⁶·⁵ bis 10⁹·⁵ EI Dg/ml Newcastlevirus Sato Stamm enthält werden mit 50 Volumteilen von

Vj gemäß Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel versetzt Das Gemisch wird dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) auf 100 Volumteile verdünnt

C. Ein inaktivierter IB-Impfstoff wird gemäß dem in B) beschriebenen Verfahren hergestellt mit der Ausnahme, daß Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm anstelle von Newcastlevirus Sato Stamm eingesetzt wird.

Herstellung von 15prozentigem IB-Impfstoff:

15 Volumteile des erhaltenen Oberstands, der IO⁴ bis

jo 10⁷ EIDso/ml Beaudette 42 Stamm enthält werden mit 50 Volumteilen von gemäß Beispiel 1 hergestelltem Aluminiumhydroxidgel versetzt Das Gemisch wird dann mit einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 72 bis 7,5) auf 100 Volumteile verdünnt

Beispiel 1

Herstellung eines inaktivierten Kombinationsimpfstoffes, der 15% ND-Impfstoff, 15% IB-Impfstoff und 15% Hg-Impfstoff enthält:

Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10⁶·⁵ bis 10⁹·⁵ ElD₅OZmI Newcastlevirus Sato Stamm gemäß B enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 10⁴ bis 10⁷ EIDüo/ml Beaudette 42 Stamm gemäß Beispiel 3 enthält und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von Haemophilus gallinarum Stamm 221 gemäß A wird mit Aluminiumhydroxidgel gemäß A und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 72 bis 7,5) versetzt Es werden 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff hergestellt, der 50 Volumteile Aluminiumhydroxidgel enthält.

Beispiel 2

Herstellung eines inaktivierten Kombinationsimpfstoffes, der 15% ND-Impfstoff, !5% IB-Impfstoff und 15% Hg-Impfstoff enthält:

b5 Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10⁶·⁵ bis 10⁹⁵ EIDso/ml Newcastlevirus Sato Stamm gemäß B enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 10⁴ bis 10⁷ EIDso/ml Beaudette 42 Stamm gemäß C enthält, und 15

Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von Haemophilus gallinarum Stamm 221, die gemäß A hergestellt wurde, mit der Ausnahme, daß anstelle von Aluminiumhydroxidgel das nachstehend beschriebene Calciumphosphatgel eingesetzt wird, wird mit Calciumphosphatgel und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff hergestellt, der 50 Volumteile Caiciumphosphatgel enthält.

Herstellung des Calciumphosphatgels:

10 Liter einer 0,1 m wäßrigen Calciumchloridlösung werden mit 10 Liter einer 0,1 m wäßrigen Natriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Nach dem Dekantieren des Überstands wird der Niederschlag so lange mit Wasser gewaschen, bis im Waschwasser keine Ammoniumionen mehr enthalten sind. Der Niederschlag wird 30 Minuten bei 120^cC in einem Autoklav sterilisiert. Das sterilisierte Produkt wird als Calciumphosphatgel eingesetzt.

Beispiel 3

Ein Gemisch von 15 Volumteilen Überstand, der 10⁶·⁵ bis 10⁹·⁵ EIDso/ml Newcastlevirus Sato Stamm gemäß B enthält, 15 Volumteilen Überstand, der 10⁴ bis 10⁷ EIDso/ml Beaudette 42 Stamm gemäß C enthält, und 15 Volumteilen der 33fach konzentrierten Suspension von Haemophilus gallinarum Stamm 221, die gemäß A hergestellt wurde, mit der Ausnahme, daß anstelle des

Tabelle I

10

15

Aluminiumhydroxidgeis das nachstehend beschriebene Aluminiumphosphatgel eingesetzt wird, wird mit Aluminiumphosphatgel und einem sterilen Gemisch von Phosphatpuffer und physiologischer Kochsalzlösung (pH 7,2 bis 7,5) versetzt. Es werden 100 Volumteile Kombinationsimpfstoff hergestellt, der 50 Volumteile Aluminiumphosphatgel enthält.

Herstellung des Aluminiumphosphatgels:

Eine lprozentige wäßrige Natriumhydrogenphosphatlösung wird bei Raumtemperatur unter Rühren mit einer Iprozentigen wäßrigen Aluminiumchloridlösung versetzt. Nach Dekantieren des Überstands wird der Rückstand so lange mit Wasser gewaschen, bis im Waschwasser keine Chloridionen mehr enthalten sind. Der Niederschlag wird 30 Minuten bei 120⁰C in einem Autoklav sterilisiert. Das sterilisierte Produkt wird als Aluminiumphosphatgel eingesetzt.

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Vergleichsversuch 1

Männlichen, 4 Wochen alten Forsgate-Küken werden intramuskulär 0,5 ml des gemäß Beispiel A, B, C und Beispiel 1 hergestellten Einfach- oder Kombinationsimpfstoffes injiziert. Die Gruppen der immunisierten und der nicht immunisierten Küken werden 2 Wochen später durch Eintropfen von Haemophilus gallinarum Stamm 221 in die Nasenhöhle belastungsinfiziert. Die

3« Symptome der Infektiösen Coryza (Nasenabscheidung, Schwellungen in der Gesichtsgegend und Niesen) werden während der 7 auf die Infektion folgenden Tage täglich registriert. Die Zunahme des Körpergewichts wird 6 Tage lang bestimmt. Die Ergebnisse sind in

j5 Tabelle 1 zusammengestellt

Gruppe

Impfstoff

Anzahl

der

Küken

Symptome Infektiöser Coryza nach der Belastungsinfektion, %

Tage

3 4 5 6

Zunahme des Körpergewichts,
g/Küken

Belastungs	-
infektion
Desgl.
Desgl.	15% Hg
Desgl.	15% ND
Desgl.	15% IB
Desgl.	157o Hg
Desgl.	15% ND
15% IB



Nicht infiziert (Kontrolle]

100

100 100

100

31,6

5	0	0	0	0	0	0	0	67,0
5	100	100	100	100	100	100	100	4,0
5	100	100	100	100	100	100	100	33,0

0

Die mit 15prozentigem Hg-Impfstoff oder mit dem Kombinationsimpfstoff, der 15% Hg-Impfstoff, 15% ND-Impfstoff und 15% IB-Impfstoff enthält, immunisierten Küken zeigen keine Symptome der Infektiösen Coryza. Die nicht-immunisierten und die mit 15prozen-

0 123,0

0 90,0

tigern ND-Impfstoff oder mit 15prozentigem IB-Impfstoff immunisierten Küken zeigen Symptome der Infektiösen Coryza und eine verminderte Zunahme des Körpergewichts.

Vergleichsversuch 2

Männlichen, 4 Wochen alten Forsgate-Küken werden intramuskulär 0,5 ml des gemäß Beispiel 3 hergestellten Kombinationsimpfstoffs injiziert Die Wirksamkeit des Kombinationsimpfstoffs wird gemäß den nachstehend beschriebenen Methoden bestimmt:

1) Belastungsinfektionstest

Immunisierte bzw. nicht-immunisierte Küken werden durch Eintropfen von Haemophilus gallinarum Stamm 221 in einer Konzentration von 5 χ 10⁷ Zellen/ml in die ^r> Nasenhöhle oder durch intramuskuläre Injektion von Newcastlevirus Sato Stamm in der lOOOfachen Konzentration der minimalen Letaldosis belastet. Die Symptome der Infektiösen Coryza (Nasenabscheidung und Schwellungen in der Gesichtsgegend) werden während ι ο 10 Tagen täglich registriert. Es wird die Anzahl der Küken bestimmt, die 10 Tage nach der Belastungsinfektion überleben.

2) Hemmung der Hämagglutination (H I) ^v'

2 Wochen nach der Impfung hergestelltes Kükenserum wird reihenmäßig verdünnt 0,2 ml eines Antigens, das 4 HA-Einheiten Newcastlevirus Ishii Stamm (NDV) enthält, werden mit 0,2 ml des verdünnten Serums versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit 0,4 ml einer 0,5 % rote Blutkörperchen von Küken enthaltenden Suspension versetzt Es wird die höchste Verdünnungsstufe (Endtiter) des Serums bestimmt, bei dem die Hämagglutination vollständig gehemmt wird. Dieser Endtiter stellt den HI-Titer gegen NDV dar; vgl. Kawashima u. Mitarb., Report of Gov. Exp. Sta. Anim, Hyg., Bd., 29 (1959), S. 19.

3) Virusneutralisation

2 Wochen nach der Impfung werden den Küken 0,2 ml Serum entnommen. Dieses Serum wird mit 0,2 ml geeignet verdünntem Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm (IBV) geschüttelt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 0 bis 4° C inkubiert. Anschließend werden 0,1 ml dieses Gemisches in die Allantoishöhle eines 11 Tage bebrüteten Hühnereis eingeimpft. Nach lwöchiger Inkubation werden die beimpften Eier auf eine aufgetretene Infektion untersucht. Der 50%-Endpunkt der Mortalität der Embryonen wird in jeder Versuchsserie nach Behrens-Kärber (Arch. Exp. Path. Pharm, Bd. 162 (1931), S. 480) bestimmt Die Differenz zwischen den Mortalitätsendpunkten der Virustitration und der Titration des Serum-Virus-Gemisches stellt die Neutralisationskapazität des Serums dar. Wenn z. B. die Mortalitätsendpunkte der Virustitration bzw. der Titration des Serum-Virus-Gemisches in 10⁶facher bzw. lOTacher Verdünnung erreicht werden, beträgt der Neutralisationstiter des Serums 2,00 Neutralisationsdosen in 0,05 ml Serum (Biester und Schwarte, Diseases of Poultry, 5. Auflage (1965), The Iowa State University Press, Ames, Iowa, V. St A, S. 605 bis 619). Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Claims

Patentanspruch:

Inaktivierter Kombinationsimpfstoff zum Immunisieren von Geflügel gegen Infektion der Atmungs- organe, gekennzeichnet durch einen Gehalt an inaktiviertem, in einem natürlichen Nährmedium gezüchteten Haemophilus gallinarum Stamm 221, inaktiviertem Newcastlevirus Sato Stamm und inaktiviertem Infektiöse Bronchitis-Virus Beaudette 42 Stamm.