DE60012042T2

DE60012042T2 - Entepneumovirus und entsprechendes impfstoff

Info

Publication number: DE60012042T2
Application number: DE60012042T
Authority: DE
Inventors: Gabriel Sylvain GOUTEBROZE
Original assignee: Merial SAS
Current assignee: Boehringer Ingelheim Animal Health France SAS
Priority date: 1999-11-26
Filing date: 2000-11-22
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2020-11-23
Also published as: EP1232249B1; US20020192234A1; FR2801607B1; US6919084B2; ATE270707T1; EP1232249A1; FR2801607A1; DE60012042D1; WO2001038497A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Pneumovirusstamm, abgeschwächte Lebendvakzine, inaktivierte Vakzine, Verfahren zum Impfen von Vögeln und insbesondere von Enten gegen ein Pneumovirus und Verfahren zum Diagnostizieren einer Infektion durch ein Pneumovirus.
Die Infektion des Huhns und der Pute durch Vogel-Pneumoviren (oder APV für aviäres Pneumovirus) ist bekannt. Die Pneumoviren rufen bei diesen Arten schwere Atemwegssymptome, die die oberen Atemwege erfassen, Gewichtsverlust, ja sogar den Tod dieser Tiere hervor. Diese Pneumovirose wird auch als Putenrhinotracheitis (oder Truthahnrhinotracheitis – TRT) und Dickkopfsyndrom des Hühnchens (oder swollen head syndrome – SHS) bezeichnet, wobei das letzte auch durch das Auftreten subkutaner Ödeme am Kopf des Tieres gekennzeichnet ist. Die Vogel-Pneumoviren können auch eine verminderte Legeleistung bei den Legetieren hervorrufen. Die ökonomischen Folgen dieser Krankheiten sind bedeutsam.
Es handelt sich um dasselbe Virus wie das Virus der Truthahnrhinotracheitis (oder TRTV) genannte, das die beiden Krankheiten hervorruft.
Die Gattung Pneumovirus gehört zur Familie der Paramyxoviridae, eine Familie, die auch die Gattungen Paramyxovirus, Morbillivirus und Rubulavirus umfaßt. Pneumorivus sind Viren mit nicht-segmentierter, einsträngiger DNA negativer Polarität. Sie sind umhüllt und ihr Capsid ist schraubenförmig. Im Gegensatz zu anderen Paramyxoviridae (insbesondere das Virus der Newcastle-Krankheit oder NDV) besitzt das Pneumovirus weder Hämagglutinin noch Neuraminidase (Alexander D. J., Vet. Microbiol., 1990, 23, 103–114).
Vogel-Pneumoviren sind aus dem Hühnchen oder der Pute in Frankreich, Großbritannien, Italien, Spanien, Ungarn, Deutschland, Niederlande, Griechenland, Brasilien, Mexiko, Marokko, Südafrika, Taiwan und Israel isoliert worden. Ein zu den bisher bekannten Viren antigen und genetisch verschiedenes Virus ist auch zu Beginn des Jahres 1997 aus der Pute der Vereinigten Staaten isoliert worden.
Dieses Virus wird oft Colorado-Virus genannt (Seal B. S., Virus Research, 1998, 58, 45–52; Ali et al., Avian Disease, 1999, 43, 600–603).
Die verschiedenen Isolate dieser Vogel-Pneumoviren zeigen eine genetische und antigene Vielfalt, die eine Klassifizierung der Stämme in mindestens zwei A und B genannte Untergruppen gestattet (Juhasz et al., J. Gen. Virol., 1994, 75, 2873-2880). Dieser Artikel zitiert einige Vogel-Pneumovirusstämme, insbesondere die Stämme APV 2119 (der Untergruppe B, Herkunft Italien), 657/4 (der Untergruppe B, Herkunft Ungarn), 872S (der Untergruppe B, Herkunft Spanien), CVL 14/1 (der Untergruppe A, Herkunft Großbritannien).
Der APV-Stamm Colorado gehört weder der Untergruppe A noch der Untergruppe B an (Seal B. S., Virus Research, 1998, 58, 45–52).
Die Impfung gegen Vogel-Pneumoviren gestattet die Prophylaxe der Krankheit bei der Pute und dem Hühnchen. Es stehen Lebendvakzine und inaktivierte Vakzine zur Verfügung. Die Vakzinstämme können aus der Untergruppe A oder der Untergruppe B stammen und wurden aus der Pute oder dem Hühnchen isoliert. Die Lebendvakzine wurden in Zellkulturen abgeschwächt. Die Lebendvakzine werden bei den Fleischvögeln und den Zuchttieren im allgemeinen in jungem Alter verwendet. Die inaktivierten Vakzine enthalten ein Adjuvans und sind bei einer Wiederholungsimpfung bei Zuchttieren oder Legetieren angezeigt.
Bis heute wurden nur das Hühnchen und die Pute als natürliche Wirte von Vogel-Pneumoviren beschrieben. Erfahrungen mit Versuchsinfektionen mit einem Vogel-Pneumovirus aus der Pute (Stamm CVL 14/1 der bei Wyeth et al., Vet. Rec., 1986, 119, 139, beschriebenen Untergruppe A) haben die Sensibilität auf die Krankheit und eine Antikörperantwort bei der Pute, dem Hühnchen und dem Fasan gezeigt. Die Hühnchen und die Puten zeigten Infektionssymptome der oberen Atemwege (Nasenlaufen, Niesen...) und die Fasane leichte Konjunktivitis.
Bei den Versuchen sind die Taube, die Gans und die gemeine Ente (Anas platyrhynchos) für das Puten-Pneumovirus (Cough et al., Vet. Rec. 1988, 123, 58-59) nicht empfänglich.
Die Anmelderin hat ein neues Vogel-Pneumovirus nachgewiesen, dessen bevorzugter Wirt die Ente ist.
Dieses Virus wurde in Frankreich aus Organentnahmen isoliert, die aus einer Schar gemeiner Zuchtenten des Typs Peking (Anas platyrhynchos) stammten. Die Tiere dieser Schar zeigten Symptome einer verminderten Legeleistung und der Sterblichkeit.
Zerkleinertes Organmaterial wurde in Zellkulturen von Hühnchenembryonen (CEP) eingeimpft, die frei von spezifischen Pathogenen waren. Beim 10. Durchgang in den CEP wurde ein Pneumovirus durch Immunfluoreszenz mit einem gegen APV des Coloradostamms gerichteten Serum nachgewiesen. Die Immunfluoreszenztests, die mit Seren durchgeführt wurden, die auf andere Enten- oder Hühnerviren spezifisch waren, blieben negativ (Enten-Parvovirus, Entenpestvirus, Entenreovirus, Vogeladenovirus der Gruppe I, Virus der infektiösen Bronchitis, Virus der Newcastle-Krankheit, Adenovirus 76 des Syndroms der verminderten Legeleistung, Vogelgrippevirus, Paramyxovirus des Typs 3, Virus der Gumborokrankheit, Virus der Vogel-Enzephalomyelitis). Ein Immunfluoreszenztest, der mit spezifischen Antiseren verschiedener Stämme des Vogel-Pneumovirus der Untergruppe A und der Untergruppe B durchgeführt wurde, erwies sich ebenfalls als negativ. Darüber hinaus ist das durch die Anmelderin isolierte Virus nicht hämagglutinierend.
Ein Paramyxovirus wurde durch das Elektronenmikroskop in durch das Virus infizierten CEP- und Vero-Zellkulturen sichtbar gemacht. Diese Elemente zeigen, daß ein neues, die Ente infizierendes Vogel-Pneumovirus isoliert worden ist. Dieses Virus ist zu anderen, zuvor bekannten Vogel-Pneumoviren der Untergruppen A und B der Pute und des Hühnchens verschieden und unterscheidet sich von dem AVP-Stamm Colorado durch seine Wirtsspezifität.
Das Virus wurde aus einer CEP-Kultur isoliert und darin kultiviert, anschließend wurde es auf Vero-Zellkulturen umgestellt. Die Durchgänge in Vero-Zellkulturen können zum Abschwächen des Virus verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung hat eine Kultur dieses neuen Virus (C990427 genannt) zum Gegenstand, die am 25.11.99 bei der Collection Nationale de Culture des Microorganismes (oder CNCM) des Pasteur-Instituts, Paris, Frankreich, unter der Zugangsnummer I-2353 hinterlegt wurde.
Die vorliegende Erfindung hat auch immunogene Zubereitungen und Vakzine gegen die Vogel-Pneumovirose zum Gegenstand, die mindestens ein Antigen oder Immunogen des Stamms APV C990427 in einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls in Gegenwart eines Arzneimittelhilfsstoffs umfassen.
Der Begriff immunogene Zubereitung umfaßt hier jede Zubereitung, die, sobald sie Vögeln verabreicht wird, eine gegen das betreffende Vogelpathogen gerichtete Immunantwort auslösen kann. Unter Vakzin versteht man eine Zubereitung, die einen wirksamen Schutz auslösen kann. Die erfindungsgemäßen Vakzine gestatten die Prophylaxe und/oder Behandlung der Infektion.
Wie die anderen bereits bekannten Vogel-Pneumoviren kann dieses Virus zum Immunisieren oder Impfen von Vögeln, insbesondere Hühnervögel, z. B. Puten, Hühner und Hühnchen und genauer Enten, insbesondere die gemeine Ente (Anas platyrhynchos) und die Barberie-Ente (Cairina moschata), gegen die durch Vogel-Pneumoviren verursachte Infektion und insbesondere gegen die durch Enten-Pneumoviren verursachte Infektion verwendet werden.
Gemäß einer ersten Form hat die Erfindung eine abgeschwächte Lebendimmunogenzubereitung oder ein abgeschwächtes Lebendvakzin zum Gegenstand.
Das neue Virus kann durch die üblichen, dem Fachmann bekannten Verfahren, insbesondere durch 10 bis 150 Durchgänge in Primärzellkulturen, zum Beispiel einer CEP-Kultur, oder in Zellinien, zum Beispiel Vero-Zellen, oder in embryonierten Eiern abgeschwächt werden. Man vermehrt die Anzahl der Durchgänge bis zur Abwesenheit bedeutender Symptome bei den Tieren.
Zum Herstellen des Vakzinvirus kann das abgeschwächte Virus anschließend in Primärzellen, zum Beispiel CEP, oder Zellinien, zum Beispiel in Vero-Zellen, oder in Zellinien vermehrt werden. Die immunogene Zubereitung oder das Vakzin, das eine entsprechende Menge des so vermehrten Virus enthält, kann eingefroren oder mit einem Stabilisator, insbesondere SPGA (EP-B1-0 008 255), lyophilisiert werden. Jede Vakzindosis kann 10² bis 10⁶ und bevorzugt 10² bis 10⁴ auf einer Zellkultur (DICC50) zu 50% infektiöse Dosen je Dosis enthalten.
Die abgeschwächte immunogene Zubereitung oder das abgeschwächte Vakzin gemäß der Erfindung kann auch ein Gemisch mit anderen Virus- oder Bakterienvalenzen sein, um multivalente immunogene Zubereitungen oder multivalente Vakzine darzustellen. Die Virus- oder Bakterienvalenzen sind aus Vogel-Pathogenen ausgewählt, die für die zu impfende Vogelart kennzeichnend sind. Sie werden normalerweise aus der Gruppe ausgewählt, die das Virus der Newcastle-Krankheit (NDV), das Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), das Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV), das Enten-Parvovirus und andere Vogel-Pneumoviren, darunter TRTV umfaßt. Diese anderen Valenzen können insbesondere klassische abgeschwächte Valenzen oder rekombinierte Valenzen sein.
Die abgeschwächten immunogenen Zubereitungen und abgeschwächten Vakzine können an Vögel individuell durch Impfen entweder in ovo, insbesondere zwischen 4 bis 1 Tagen) vor dem Schlüpfen und bevorzugt 3 Tage vor dem Schlüpfen, oder als Augentropfen, durch Einträufeln in den Schnabel oder durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabfolgt werden.
Die abgeschwächten immunogenen Zubereitungen und abgeschwächten Vakzine können zusammen mit dem Trinkwasser oder durch Vernebeln verabfolgt werden. Die immunogene Zubereitung oder das Vakzin können nach dem Aufnehmen in einem zugesetzten Verdünnungsmittel, zum Beispiel mit einem wäßrigen Arzneimittelhilfsstoff wie etwa Aluminiumhydroxid verabfolgt werden.
Einer zweiten Weise zufolge hat die Erfindung eine inaktivierte immunogene Zubereitung oder ein inaktiviertes Vakzin zum Gegenstand.
Das Virus kann in Primärzellen, zum Beispiel CEP, oder Zellinien, zum Beispiel in Vero-Zellen, oder in embryonierten Eiern vermehrt werden. Vor oder nach der Inaktivierung kann das so hergestellte Virus insbesondere durch Filtration oder durch Zentrifugieren geklärt werden und/oder kann insbesondere durch Ultrafiltration oder Fällung konzentriert werden und/oder kann insbesondere durch selektive Fällung oder durch Chromatographie gereinigt werden. Die Inaktivierung kann durch dem Fachmann bekannte, übliche Verfahren, insbesondere durch eine chemische Behandlung (z. B. Formaldehyd, β-Propiolacton, Ethylenimin, binäres Ethylenimin (BEI) und/oder thermisch durchgeführt werden. Das inaktivierte Virus kann anschließend mit einem vorzugsweise wäßrigen Arzneimittelhilfsstoff, zum Beispiel auf der Grundlage von Aluminiumhydroxid, gemischt werden oder in Emulsionsform, insbesondere einer aus Mineralöl oder Speiseöl und einem oder mehr nicht-ionischen Tensiden zusammengesetzten Wasser-in-Öl-Emulsion formuliert werden. Die Wasser-in-Öl-Emulsion umfaßt zum Beispiel Polysorbat 80 (z. B. Tween^® 80) in der wäßrigen Phase und Mineralöl (z. B. Drakeol^® 6-VR) und Sorbitanmonooleat (z. B. Span^® 80) in der Ölphase (Stone et al., Avian Dis., 1978, 22, 666–674).
Jede Vakzindosis kann vor der Inaktivierung das Äquivalent von 10³ bis 10⁸ und bevorzugt 10⁵ bis 10⁷ DICC50 je Dosis enthalten. Die Antigenmenge je Dosis kann auch durch andere Verfahren bestimmt werden, bei denen Antigen/Antikörperreaktionen, zum Beispiel das ELISA-Verfahren, eingesetzt werden.
Das inaktivierte Antigen kann auch mit anderen Virus- oder Bakterienvalenzen gemischt werden, um multivalente immunogene Zubereitungen oder multivalente Vakzine darzustellen. Die Virus- oder Bakterienvalenzen sind aus den für die zu impfenden Vogelarten kennzeichnenden Vogelpathogenen ausgewählt. Sie sind insbesondere aus der Gruppe ausgewählt, die das Virus der Newcastle-Krankheit (NDV), das Virus der infektiösen Bronchitis (IBV), das Virus der Gumboro-Krankheit (IBDV), das Adenovirus des Syndroms der verminderten Legeleistung, das Enten-Parvovirus, das Paramyxovirus des Typs 3 und andere Vogel-Pneumoviren, darunter TRTV umfaßt. Diese Valenzen können insbesondere klassische inaktivierte Valenzen, rekombinierte Valenzen und Valenzen auf der Grundlage von Untereinheiten sein.
Bevorzugt werden inaktivierte immunogene Zubereitungen und inaktivierte Vakzine Vögeln durch intramuskuläre oder subkutane Injektion verabfolgt. Das inak tivierte Antigen kann auch aus fraktionierten Antigenen oder Untereinheiten bestehen oder diese umfassen.
Die vorliegende Erfindung hat auch noch Zusammensetzungen zum Gegenstand, die das neue Pneumovirus C990427 in abgeschwächter Lebendform oder in inaktivierter Form, gegebenenfalls einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls einen Arzneimittelhilfsstoff umfassen.
Der Gehalt an C990427 und die Wahl des Arzneimittelhilfsstoffs sind weiter oben beschrieben.
Die vorliegende Erfindung hat auch noch Zusammensetzungen zum Gegenstand, die fraktionierte Antigene von C990427 oder Untereinheiten, gegebenenfalls einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls einen Arzneimittelhilfsstoff umfassen.
Die vorliegende Erfindung hat auch noch Immunisierungs- oder Impfverfahren von Vögeln, insbesondere von Enten und Hühnervögeln wie etwa Hühner, Hühnchen und Puten gegen auf Vogel-Pneumoviren zurückzuführende Krankheiten und insbesondere gegen auf Enten-Pneumoviren zurückzuführende Krankheiten und Verfahren zum Gegenstand, bei denen einem Tier eine immunogene Zubereitung oder ein Vakzin gemäß der Erfindung verabfolgt wird.
Die Immunisierungs- oder Impfprogramme für Fleischenten können insbesondere eine oder zwei Verabfolgung(en) eines abgeschwächten Vakzins an zwischen ungefähr 1 bis ungefähr 3 Wochen alte Tiere auf intramuskulärem oder subkutanem Weg, bevorzugt mit einem Arzneimittelhilfsstoff, insbesondere ein wäßriges Arzneimittelhilfsmittel wie etwa Aluminiumhydroxid oder über das Auge bevorzugt ohne ein Arzneimittelhilfsmittel umfassen. Eine Wiederholungsverabfolgung kann zwischen 2 und 4 Wochen nach der ersten Verabfolgung stattfinden. Wenn die Enten zur Zucht bestimmt sind, verabfolgt man ihnen bevorzugt außerdem im Alter von etwa 10 Wochen eine neue Dosis Lebendvakzin und vor dem Legezeitraum ein inaktiviertes, mit einem Arzneimittelhilfsstoff versehenes inaktiviertes Vakzin in Form einer Emulsion auf intramuskulärem Weg oder auf subkutanem Weg.
Bei den anderen Fleischvogelarten, insbesondere Puten und Hühnchen, führt man bevorzugt eine oder zwei Verabfolgung(en) an die Jungen eines abgeschwächten Lebendvakzins, bevorzugt ohne Arzneimittelhilfsstoff, im Trinkwasser oder durch Versprühen durch. Die erste Verabfolgung kann bei ungefähr 14 Tage alten Tieren durchgeführt werden. Eine Wiederholungsverabfolgung kann zwischen 2 und 4 Wochen nach der ersten Verabfolgung stattfinden.
Wenn die anderen Vogelarten, insbesondere die Puten und Hühnchen, zur Zucht oder zum Eierlegen bestimmt sind, verabfolgt man ihnen darüber hinaus vor dem Legezeitraum ein inaktiviertes Vakzin mit einem Arzneimittelhilfsstoff, bevorzugt in Emulsionsform, auf intramuskulärem Weg oder auf subkutanem Weg.
Der Fachmann besitzt die notwendige Sachkenntnis, um die Anzahl der Injektionen und die Dosen jedes Vakzins zur Verwendung bei jedem Impfprotokoll zu definieren.
Die Dosisvolumina können insbesondere zwischen 0,1 bis 0,8 ml, bevorzugt in der Größenordnung von 0,3 bis 0,5 ml betragen.
Die vorliegende Erfindung hat weiter die Verwendung des Pneumovirus C990427 zum Bilden einer immunogenen Zubereitung oder eines Vakzins zum Gegenstand, die zum erfindungsgemäßen Verabfolgen an einen Vogel, insbesondere eine Ente bestimmt sind, wobei die Zubereitung oder das Vakzin außerdem einen auf veterinärmedizinischem Gebiet annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls einen Arzneimittelhilfsstoff umfassen.
Die vorliegende Erfindung hat auch die Verwendung eines Antigens oder Immunogens des Pneumovirus C990427 zur Herstellung einer immunogenen Zubereitung oder eines Vakzins zum Gegenstand, die zum erfindungsgemäßen Verabfolgen an einen Vogel, insbesondere eine Ente bestimmt sind, wobei die Zubereitung oder das Vakzin außerdem einen auf veterinärmedizinischem Gebiet annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls einen Arzneimittelhilfsstoff umfassen.
Die Erfindung zielt auch auf eine solche Verwendung im Rahmen des Bildens einer damit verbundenen immunogenen Zubereitung oder eines damit verbundenen Vakzins oder im Rahmen eines damit verbundenen Impfprogramms ab.
Die Erfindung betrifft auch zur Diagnose einer Infektion durch das Vogel-Pneumovirus C990427 verwendete Reagenzien.
Dieses Virus kann auch zum einen als rohes oder gereinigtes Antigen oder in Form einer Untereinheit, zum anderen in roher oder gereinigter Form oder als Untereinheit zum Immunisieren von Tieren zum Erhalt polyklonaler und monoklonaler Antikörper verwendet werden. Die Antigene und Antikörper sind bei dem erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren und zum Aufstellen von Diagnosekits, insbesondere des Typs ELISA verwendbar.
Die Erfindung wird nun mit Hilfe der Ausführungsformen, die als nicht begrenzende Beispiele aufgetaßt werden, genauer beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Isolierung des Virus
Organe (zum einen ein Gemisch aus Leber, Herz, Eileiter, Luftröhre und Milz, zum anderen der Darm) wurden gemeinen Zuchtenten des Peking-Typs (Anas platorhynchos) entnommen, die Symptome einer verminderten Legeleistung und der Sterblichkeit zeigten. Die zwei Teile Organe wurden getrennt in mit einem Antibiotikum (Gentamycin 1/10000) ergänztem Phosphatpuffer (PB5) zerkleinert, gefroren, aufgetaut und dann durch Zentrifugieren geklärt. Der Zentrifugationsüberstand wurde erneut verdünnt, um eine Endverdünnung der Organe von ungefähr 1/10 (Gew./Vol.) bei dem Gemisch aus Leber, Herz, Eileiter, Luftröhre und Milz und ungefähr 1/50 (Gew./Vol.) bei dem Darm zu erhalten. Das zerkleinerte Material wurde filtriert (0,22 μm).
Eine Primärzellkultur von Hühnerembryonen EOPS – frei von pathogenen Organismen – (CEP1) wurde durch Impfen von 3 × 10⁶ Zellen je Kolben mit 25 cm² in mit 5% fetalem Rinderserum (SVF) ergänztem F10-199-Medium, pH 6,9 bis 7,1, hergestellt. Die Zellen wurden bei 38°C mit 5% CO₂ inkubiert.
Die Zusammensetzung des F10-199-Mediums ist wie folgt: 60 ml F10 (10fach konzentriert), 40 ml 199 Hanks (10fach konzentriert), 40 ml TPB, 20 ml 5,6%iges Bicarbonat, 1 ml Vitamine, Wasser qsp 1000 ml.
Nach 24 Stunden Kultur wurde das Medium verworfen und ein Gemisch aus gleichen Teilen der beiden zerkleinerten Materialien wurde in CEP1-Zellen zu 0,8 ml je Kolben mit 25 cm² eingeimpft. Nach 30 min Kontakt bei 38°C wurden die Zellen mit Kulturmedium gespült. Mit 1% SVF ergänztes Kulturmedium wurde anschließend zugefügt und die Kulturen wurden erneut wie zuvor inkubiert (1. Durchgang).
Nach drei Tagen Kultur wurden die Zellen mit Pronase behandelt und 3 × 10⁶ Zellen wurden erneut je Kolben mit 25 cm² in mit 3% SVF ergänztem F10-199-Medium eingeimpft, um eine CEP-Sekundärkultur (CEP2) zu erhalten. Die Kulturen wurden erneut wie zuvor sieben Tage lang inkubiert (2. Durchgang), anschließend wurden die Kulturen gefroren, aufgetaut und die so erhaltene Suspension wurde durch Zentrifugieren geklärt.
1 ml Überstand wurde in einen neuen CEP1-Rasen eingeimpft und die Kultur wurde wie zuvor fortgesetzt (3. Durchgang).
Man führt anschließend zusätzliche Durchgänge, wahlweise in CEP2 und in CEP1 aus.
Beim 4. Durchgang wurden einige Anhäufungen runder Zellen und Streuherde nach vier Tagen Kultur beobachtet. Beim 5. Durchgang wurden Bereiche runder Zellen und Streuherde und Synzytien beobachtet. Beim 10. Durchgang wurde nach 3 Tagen Kultur eine flächendeckende zytopathische Wirkung beobachtet.
Beispiel 2: Einbau des Virus in Vero-Zellen
Eine nach Beispiel 1 beim 11. Durchgang in CEP hergestellte Viruskultur wurde gefroren, aufgetaut und durch Zentrifugieren geklärt.
Eine Kultur von Vero-Zellen wurde durch Impfen von 10⁶ Zellen je Kolben mit 25 cm² in mit 5% SVF ergänztes modifiziertes Eagle-Medium (MEM), pH 6,9 bis 7,1, hergestellt. Die Zellen wurden bei 38°C mit 5% CO₂ inkubiert.
Die Zusammensetzung des MEM-Mediums ist wie folgt: 200 ml MEM-Salze von Earle (5fach konzentriert), 0,1 ml 1%iges Biotin, 10 ml 200 mM Glutamin, 1,5 ml Phenolrot, 10 ml 10%ige Glucose, 30 ml 5,6%iges Bicarbonat, Wasser qsp 1000 ml.
Nach 24 h Kultur wurde das Medium verworfen und das aus dem 11. Durchgang in CEP stammende Virus wurde zu 1 ml vorstehend beschriebenem Zentrifugierüberstand je Kolben mit 25 cm² eingeimpft. Die Zellen wurden wieder wie vorstehend beschrieben inkubiert. Nach 6 Tagen Kultur wurden Anhäufungen runder Zellen und Streuherde und Synzytien beobachtet und auf dem Zellrasen begannen Bereiche einer Lysis aufzutreten.
Die folgenden Durchgänge auf Vero-Zellen wurden durch Gefrieren, Auftauen und Klären der Kulturen, anschließend Einimpfen des Überstandes in eine neue Vero-Zellkultur zu 0,5 ml Überstand je Kolben mit 25 cm² ausgeführt. Die Zellen wurden wieder wie vorstehend inkubiert.
Jede Kultur wurde geerntet, als die ECP ungefähr 3 bis 6 Tage nach Kulturbeginn überall vorhanden war.
Die Virussuspension kann vor ihrer endgültigen Verwendung bei einer Temperatur unter oder gleich –40°C aufbewahrt werden.
Beispiel 3: Charakterisierung des Virus durch Immunfluoreszenz
Das gemäß Beispiel 1 isolierte Virus wurde durch Immunfluoreszenz in Zellkulturen identifiziert. Vero-Zellkulturen auf Mikroplatten mit 96 Näpfchen wurde zu 1,8 × 10⁴ Zellen in 0,2 ml mit 3% SVF ergänztem MEM-Medium, pH 6,9 bis 7,1, je Näpfchen hergestellt.
Nach 24 h Inkubation bei 38°C mit 5% CO₂ wurde das Medium verworfen und das Virus wurde zu ungefähr 200 DICC50 in 0,2 ml mit 1% SVF ergänztem MEM- Medium, pH 6,9 bis 7,1, geimpft. Die Platten wurden wie zuvor während 48 bis 72 h inkubiert. Als auf dem Zellrasen Lysisbereiche aufzutreten begannen, wurden die Kulturen durch eine Waschung mit PBS gespült. Eine Acetonlösung (100 ml reines Aceton + 15 ml destilliertes Wasser) wurde jedem Näpfchen zum Fixieren der Zellen zugefügt. Die Platten wurden 20 Minuten bei –20°C gehalten. Das Aceton wurde anschließend verworfen und die Platten wurden getrocknet. Die auf diese Weise fixierten Platten können bei –20°C aufbewahrt werden.
Die auf das Vogel-Pneumovirus der Untergruppe A, das Vogel-Pneumovirus der Untergruppe B, das Vogel-Pneumovirus des Stamms Colorado, das Enten-Parvovirus, das Virus der Entenpest, das Vogel-Reovirus, das Adenovirus der Gruppe I, das Virus der infektiösen Bronchitis, das Virus der Newcastle-Krankheit, das Adenovirus 76 des Syndroms der verminderten Legeleistung, das Vogelgrippevirus, das Paramyxovirus des Typs 3, das Virus der Gumboro-Krankheit und das Virus der Vogelenzephalomyelitis monospezifischen Seren wurden getrennt 1/20 in physiologischem Wasser verdünnt. Jedes Serum wurde getrennt mit den infizierten Vero-Zellen zu 100 μl verdünntes Serum je Näpfchen in Kontakt gebracht.
Die Platten wurden während 60 Minuten bei 38°C in einen Inkubator verbracht, anschließend wurden die Seren entfernt und die Platten wurden 3 Mal mit physiologischem Wasser und 3 Mal mit entmineralisiertem Wasser gespült.
Ein fluoreszierendes Anti-Hühnchen-Konjugat des Handels wurde auf die vom Hersteller (Konjugat RACH FITC, Nordic) empfohlene Konzentration verdünnt und anschließend zu 50 μl je einen Hühnchenvirus enthaltendem Näpfchen zugefügt. Ein fluoreszierendes Anti-Ente-Konjugat des Handels wurde auf die vom Hersteller (Konjugat RADU FITC, Nordic) empfohlene Konzentration verdünnt und anschließend zu 50 μl je einen Entenvirus enthaltendem Näpfchen zugefügt.
Die Platten wurden 30 Minuten bei 38°C inkubiert, anschließend wurde das Konjugat entfernt und die Platten wurden 3 Mal mit physiologischem Wasser und 3 Mal mit entmineralisiertem Wasser gespült.
Die auf diese Weise erhaltenen Platten wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Mit dem auf das Vogel-Pneumovirus des Stamms Colorado spezifischen Serum wurde eine intensive intrazytoplasmatische Fluoreszenz beobachtet, während mit den anderen Seren keine Reaktion beobachtet wurde.
Beispiel 4: Elektronenmikroskop
CEP- (Beispiel 1) oder Verozellen-Kulturen (Beispiel 2) wurden mit dem Virus beimpft. Als die ECP sichtbar wurde, wurden die Zellrasen mit Glutaraldehyd vorfixiert, einer Osmiumoxidfixierung unterzogen und mit Ethylalkohol entwässert.
Die interessierenden, eine ECP aufweisenden Zonen wurden anschließend in Epoxyharz eingeschlossen und es wurden ultradünne Schnittproben angefertigt und angefärbt.
Die Beobachtungen wurden unter einem Transmissionselektronenmikroskop durchgeführt. Es wurde ein Eindringen der Viren durch Fusion der Virushülle mit der Zellmembran, die intrazytoplasmatische Anreicherung von Nukleoproteinsubstanzen und das Ansetzen von Virusteilchen an der Zytoplasmamembran beobachtet. Polymorphe, reife Virushüllenteilchen wurden im extrazellulären Raum beobachtet. Gewisse Teilchen sind abgerundet und von einem Durchmesser von mindestens 130 nm. Andere Teilchen sind fadenförmig mit einer Größe von über 1000 nm. Es wurden auch Verdickungen beobachtet, die manchmal Nadeln aufwiesen. Diese Bilder sind für die Struktur und die Morphogenese der Paramyxoviridae kennzeichnend.
Beispiel 5: Herstellung des Virus in Vero-Zellen
Nach dem Auftauen kann das aus dem in Beispiel 2 beschriebenen Bestand stammende Virus in Rollflaschen kultiviert werden.
Vero-Zellen wurden in mit 5% SVF ergänztem MEM-Medium, pH 6,9 bis 7,1, hergestellt. Das Virus wurde mit Zellen mit einer Mehrfachinfektion (MOI) von 1 bis 0,01 gemischt und das Gemisch wurde auf Rollflaschen zu 120 × 10⁶ Zellen je Rollflasche verteilt. Die Flaschen wurden bei 38°C inkubiert. Als die durch das Virus verursachte ECP das Optimum war (mehr als 50% des Zellrasens zerstört), wurde die Virussuspension nach heftigem Schütteln der Flaschen geerntet.
Die Ernte kann zu 50% mit einem Stabilisator, zum Beispiel einer Pufferlösung gemischt werden. Die Virussuspension kann bei einer Temperatur unter oder gleich –40°C bis zu ihrer endgültigen Verwendung aufbewahrt werden.
Beispiel 6: Titration des Virus in Vero-Zellen
Die Titration wurde in 96-Näpfchen-Mikroplatten in mit 3% SVF ergänztem MEM-Medium, pH 6,9 bis 7,1, durchgeführt. Verdünnungen des Virus in der Größenordnung von 10 wurden mit einer Vero-Zellsuspension in der Mikroplatte zu 0,1 ml Virusverdünnung auf 1,8 × 10⁴ Zellen in 0,15 ml je Näpfchen gemischt. Nach 6 bis 9 Stunden Inkubierung bei 38°C mit 5% CO₂ wurden die eine verbreitete ECP aufweisenden Näpfchen ausgezählt und der Titer an infektiösen Dosen für 50% der Zellkulturen (DICC50) wurde durch das Kärber-Verfahren berechnet.
Beispiel 7: Herstellung eines Lebendvirus
Nach dem Auftauen des in Beispiel 5 erhaltenen Virus wurde die Virusmenge als Funktion des gewünschten Titers eingestellt.
Der Virussuspension wurde ein Stabilisator SPGA (Saccharose, Phosphat, Glutamat und Albumin, EP-B1-0 008 255) zugefügt und sie wurde auf Glasfläschchen verteilt und lyophilisiert. Das Virusvakzin wurde wie in Beispiel 6 titriert. Der Vakzintiter wurde auf 10², 10³ und 10⁴ DICC50 je Dosis eingestellt.
Vor seiner Verabfolgung kann das Virusvakzin in einem Aluminiumhydroxid enthaltenden, mit einem Arzneimittelhilfsstoff versehenen Verdünnungsmittel aufgenommen werden. Der Arzneimittelhilfsstoff setzt sich aus einem isotonen Phosphatpuffer zusammen, der 2,1 Gramm Aluminiumhydroxid je Liter enthält. Das lyophilisierte Vakzin wird in dem Verdünnungsmittel auf diese Weise aufgenommen, daß 0,5 ml Verdünnungsmittel eine Virusvakzindosis enthalten.
Beispiel 8: Herstellung eines inaktivierten Virus
Das Virus wurde gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren kultiviert. Die Virussuspension wurde durch Zentrifugieren geklärt. Das Virus wurde durch Formaldehyd inaktiviert.
Eine 40%ige Formaldehydlösung wurde so zugefügt, daß eine Formaldehydendkonzentration von 0,1% in der Virussuspension erhalten wurde. Das Gemisch wurde 12 h unter mäßigem Rühren bei 37°C gehalten und anschließend auf 5°C gekühlt.
Die erhaltene Virussuspension kann durch Ultrafiltration 10- bis 50fach konzentriert werden. Die konzentrierte oder nicht konzentrierte inaktivierte Virussuspension kann vor ihrer Verwendung bei einer Temperatur von 5°C aufbewahrt werden.
Man stellt eine Wasser-in-Öl-Emulsion durch langsames Zufügen der wäßrigen Phase zur Ölphase unter mäßigem Rühren mit Hilfe einer Turbine in 15 min her. Man homogenisiert während 10 min bei 15 bis 25 m/sec, anschließend wird die so gebildete Emulsion auf 5°C gekühlt und bei dieser Temperatur aufbewahrt.
Die wäßrige Phase enthält das inaktivierte Virus und 3,2% Vol./Vol. Polysorbat 80 (Tween^® 80).
Die Ölphase enthält 10% Vol./Vol. Sorbitanmonooleat (Span^® 80) und 90% Vol./Vol. Mineralöl (Drakeol^® 6-VR).
Das Verhältnis wäßrige Phase zu Ölphase ist 1:4.
Die Virussuspensionen für das inaktivierte Vakzin umfassen 10^6,2, 10^7,2 und 10^8,2 DICC50 je ml.
Beispiel 9: Impfverfahren und -programm
Der jungen Ente wird das wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellte, mit einem Arzneimittelhilfsstoff versehene Lebendvakzin in einer Dosis von 0,5 ml in der ersten Lebenswoche und einer Wiederholungsdosis von 0,5 ml zwischen 2 und 4 Wochen nach der ersten Verabreichung auf subkutanem Weg verabfolgt.
Bei Zuchtenten wurde das vorstehende Programm angewendet und anschließend wurde eine Wiederholung mit dem Lebendvakzin um die 10. Lebenswoche herum durchgeführt. Eine Wiederholung mit einer Dosis von 0,3 ml öligem, inaktivierten Vakzin (Beispiel 8) wird anschließend vor jeder Legeperiode angewendet.
Beispiel 10: Diagnoseverfahren
Die Infektionsdiagnose wird durch Virusisolierung gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren oder durch Serologie durch ein Seroneutralisationsverfahren durchgeführt.
Die Seroneutralisation wird durch Kultur von Verozellen auf 96-Näpfchen-Mikroplatten durchgeführt. Die zu untersuchenden Seren werden in mit 1% SVF ergänztem MEM-Medium, pH 6,9 bis 7,1, direkt in Mikrotitrationsplatten vierfach seriell verdünnt. Man verwendet ein Näpfchen je Serum und je Verdünnung in einem Endvolumen von 0,1 ml verdünntem Serum je Näpfchen. Das in einer Konzentration von 200 DICC50 in 0,025 ml verwendete Virus wird jedem Näpfchen zugefügt. Es wird eine Kontaktzeit von 30 Minuten bei 38°C verwirklicht. Die VERO-Zellen werden jedem Näpfchen zu 1,8 × 10⁴ Zellen in 0,15 ml mit 1% SVF ergänztem MEM-Medium, pH 6,9 bis 7,1, zugefügt. Ein negatives Serum, ein positives Vergleichsserum sowie Vergleichszellen werden für jede Reaktion bereitgestellt. Das Auszählen wird 9 Stunden nach der Inkubation bei 38°C mit 5% CO₂ auf Kunststoffolie durchgeführt. Die ungefähre prozentuale Hemmung der ECP (0%, 50%, 100%) wird abgeschätzt. Die letzte Verdünnung, die eine vollständige Hemmung der ECP herbeiführt, stellt den Titer 100% des getesteten Serums dar. Die letzte Verdünnung, die eine Hemmung von 50% der ECP herbeiführt, stellt den Titer 50% des getesteten Serums dar.

Claims

Kultur des als C990427 bezeichneten und bei der CNCM unter der Zugangsnummer I-2353 hinterlegten Vogel-Pneumovirus.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gegen Vogel-Pneumovirose umfassend das Vogel-Pneumovirus C990427, wovon eine Probe bei der CNCM unter der Zugangsnummer I-2353 hinterlegt ist, in einem auf dem Veterinärgebiet annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls einen Arzneimittelhilfsstoff.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Antigen abgeschwächtes Lebendvirus umfassen.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen wäßrigen Arzneimittelhilfsstoff, vorzugsweise Aluminiumhydroxid umfassen.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10² bis 10⁶, vorzugsweise 10² bis 10⁴ DICC50 je Dosis umfassen.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem mindestens ein Antigen umfassen, das aus mindestens einem anderen pathogenen Vogel-Agens stammt und vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Virus der Newcastle-Krankheit, dem Virus der infektiösen Bronchitis, dem Virus der Gumboro-Krankheit, dem Enten-Parvovirus und dem Vogel-Pneumovirus besteht.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Antigen inaktiviertes Virus umfassen.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen wäßrigen Arzneimittelhilfsstoff, vorzugsweise Aluminium hydroxid umfassen oder in Form einer Emulsion, vorzugsweise einer Wasser-in-Öl-Emulsion formuliert sind.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Wasser-in-Öl-Emulsion formuliert sind, die Polysorbat 80 in der wäßrigen Phase und Mineralöl und Sorbitanmonooleat in der Ölphase enthält.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie vor der Inaktivierung 10³ bis 10⁸, vorzugsweise 10⁵ bis 10⁷ DICC50 je Dosis umfassen.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie außerdem mindestens ein Antigen umfassen, das aus einem anderen pathogenen Vogel-Agens stammt und vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem Virus der Newcastle-Krankheit, dem Virus der infektiösen Bronchitis, dem Virus der Gumboro-Krankheit, dem Adenovirus des Syndroms der verminderten Legeleistung, dem Enten-Parvovirus, dem Paramyxovirus Typ III und dem Vogel-Pneumovirus besteht.
Verwendung des bei der CNCM unter der Zugangsnummer I-2353 hinterlegten Pneumovirus C990427 zur Herstellung einer immunogenen Zubereitung oder eines Vakzins, die zum Verabfolgen an Vögel, insbesondere Geflügel wie etwa Enten und Hühner bestimmt sind.
Verwendung eines Antigens oder Immunogens des bei der CNCM unter der Zugangsnummer I-2353 hinterlegten Pneumovirus C990427 zur Herstellung einer immunogenen Zubereitung oder eines Vakzins, die zum Verabfolgen an Vögel, insbesondere Geflügel wie etwa Enten und Hühner bestimmt sind.
Verwendung gemäß Anspruch 12 oder 13, die zur Verabfolgung an Enten bestimmt ist.
Immunogene Zubereitung oder Vakzin gegen Vogel-Pneumovirose, die ein für das Vogel-Pneumovirus C990427, wovon eine Probe bei der CNCM unter der Zugangs nummer I-2353 hinterlegt ist, spezifisches Antigen in einem auf dem Veterinärgebiet annehmbaren Träger oder Arzneimittelträger und gegebenenfalls einen Arzneimittelhilfsstoff umfaßt.