CN1646684B - 重组副流感病毒表达系统以及包含源自间质肺病毒的异种抗原的疫苗 - Google Patents

重组副流感病毒表达系统以及包含源自间质肺病毒的异种抗原的疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组牛副流感病毒(bPIV)cDNA或RNA，所述cDNA或RNA可用于在适当的宿主细胞系统中表达异源基因产物，和/或拯救表达、包装和/或呈递异源基因产物的负链RNA重组病毒。特别是，异源基因产物包括另一PIV物种的或源自另一负链RNA病毒的基因产物，所述另一负链RNA病毒包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒、人间质肺病毒和禽类肺病毒。本发明的嵌合病毒和表达产物可有利地用于疫苗制剂，包括抗多种病原体和抗原的疫苗。

Description

重组副流感病毒表达系统以及包含源自间质肺病毒的异种抗原的疫苗
本申请要求于2002年2月21日提交的第60/358,934号美国临时专利申请的优先权，该申请全文引入本文以供参考。
与本申请在同一天申请，列出Ronaldus Fouchier，Bernadetta vanden Hoogen，Albertus Osterhaus，Aurelia Haller，和Roderick Tang作为发明人，题为“间质肺病毒株及其在疫苗制剂中的应用和作为表达抗原性序列的载体的应用”的未决、共同转让的美国专利申请全文引入本文以供参考。
1.介绍
本发明涉及重组副流感病毒(PIV)cDNA或RNA，所述cDNA或RNA可用于在适当的宿主细胞系统中表达异源基因产物，和/或拯救表达、包装和/或呈递异源基因产物的负链RNA重组病毒。具体来说，本发明包括疫苗制剂，其中包含表达异源基因产物的嵌合PIV，其中所述异源基因产物优选是抗原肽或多肽。在一个实施方案中，本发明的PIV载体表达可由相同或不同病毒编码的1、2或3种异源基因产物。在优选的实施方案中，所述异源序列编码异源基因产物，该异源基因产物为得自其它PIV物种或得自其它负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、哺乳动物间质肺病毒(metapneumovirus)和禽类肺病毒的的抗原多肽。本发明疫苗制剂包括多价疫苗，包括二价和三价疫苗制剂。本发明多价疫苗可以以表达每一异种抗原序列的一种PIV载体，或分别编码不同异种抗原序列的两种或多种PIV载体的形式施用。本发明疫苗制剂可单独施用，或者与其它疫苗、预防剂或治疗剂联合施用。
2.发明背景
副流感病毒感染在婴幼儿和儿童中导致严重的呼吸道疾病(Tao等人，1999，Vaccine 17：1100-08)。传染性副流感病毒感染占全世界所有因呼吸道感染而住院治疗的小儿科患者的大约20％。出处同上。对于治疗PIV相关疾病，没有可利用的有效抗病毒治疗，预防PIV感染的疫苗也还未得到批准。
PIV是副粘病毒科的呼吸道病毒属(respiroVirus)(PIV1、PIV3)或麻疹病毒属(rubulavirus)(PIV2、PIV4)属的成员。PIV由两个结构组件构成：(1)含有病毒基因组的内部核糖核蛋白核心或核壳，和(2)外部粗略为球状的脂蛋白被膜。其基因组由单链负义RNA组成，长度约为15,456个核苷酸，编码至少8个多肽。这些蛋白包括核壳结构蛋白(根据属为NP、NC或N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)、大聚合酶蛋白(L)以及未知功能的C和D蛋白。出处同上。
副流感病毒核壳蛋白(NP、NC或N)在每个蛋白单元内含有两个结构域。这些结构域包括：氨基末端结构域，其几乎占分子的三分之二，并直接与RNA相互作用，以及羧基末端结构域，其位于装配好的核壳的表面上。认为在这两个结构域的连接处存有绞链，由此给予该蛋白一些弹性(参见Fields等人(编辑)，1991，FUNDAMENTALVIROLOGY，第2版，Raven Press，NewYork，将其全文引入本文以供参考)。基质蛋白(M)显然涉及病毒装配，且其与病毒膜和核壳蛋白相互作用。磷蛋白(P)经历磷酸化，并且据表明参与转录调节、甲基化、磷酸化和聚腺苷酸化。融合糖蛋白(F)一开始以无活性前体的形式产生，在翻译时将裂解，产生两个二硫键连接的多肽。活性F蛋白与病毒膜相互作用，在病毒膜上其通过促进病毒被膜与宿主细胞质膜的融合，而使副流感病毒颗粒更容易穿入宿主细胞内。出处同上。糖蛋白，血凝素-神经氨酸酶糖蛋白(HN)从被膜中伸出，并给予病毒血凝素和神经氨酸酶活性。HN具有强疏水性的氨基末端，其功能为将HN蛋白固定在脂双层内。出处同上。最后，大聚合酶蛋白(L)在转录和复制中均起重要作用。出处同上。
牛流感病毒是在1959年首先从表现出航运热症状的小牛中分离出来的。从那时起，已经从正常的牛、流产胎儿和表现出呼吸疾病症状的牛中分离出了该病毒(Breker-K1assen等人，1996，Can.J.Vet，Res，60：228-236，亦参见Shibuta，1977，Microbiol.Immunol，23(7)，617-628)。人和牛PIV3共享中和表位，但显示出不同的抗原特性。在人和牛病毒株之间，在HN蛋白中存在显著差异。事实上，牛病毒株诱导一些抗hPIV感染的中和抗体，而人病毒株似乎诱导更大范围的抗人PIV3的中和抗体(Van WykeCoelingh等人，1990，J.Virol.64：3833-3843)。
所有负链RNA，包括PIV的复制，均由于缺少复制RNA所需的细胞结构而变得很复杂。此外，必须在可发生翻译之前将负链基因组转录到正链(mRNA)拷贝内。因此，在进入细胞内时，单独的基因组RNA不能合成所需的RNA-依赖性RNA聚合酶。L、P和N蛋白必须与基因组RNA一起进入宿主细胞。
据假设，转录PIV mRNA的大多数或全部病毒蛋白也进行基因组复制。还未清楚地确认调节蛋白的相同补体的另一用途(即转录或复制)的机制，但该过程似乎涉及一种或多种核壳蛋白的自由形式的丰度。在病毒侵入后，就通过L蛋白，使用核壳中的负义RNA作为模板，立即开始转录。调节病毒的RNA合成，使得它在转录期间产生单顺反子mRNA。
在转录之后，在被负链RNA病毒感染时，病毒基因组复制是第二个必要事件。象其它负链RNA病毒一样，在PIV中，由病毒特异性蛋白调节病毒基因组复制。复制RNA合成的第一个产物是PIV基因组RNA的互补拷贝(即正极性)(cRNA)。这些正链拷贝(反基因组)在其末端的结构上与正链mRNA转录物不同。不象mRNA转录物，反基因组cRNA在5，端未被加帽或甲基化，且它们在3，端没有被截短也没有被聚腺苷酸化。cRNA与其负链模板是同末端的，并含有互补形式的所有遗传信息。cRNA担任合成PIV负链病毒基因组(vRNA)的模板。
通过核壳蛋白将bPIV负链基因组(vRNA)和反基因组(cRNA)衣壳化；只有未衣壳化的RNA物种是病毒mRNA。BPIV RNA的复制和转录在宿主细胞的细胞质中发生。病毒组分的装配似乎在宿主细胞质膜上发生，在质膜上通过出芽殖释放出成熟病毒。
2.1.副粘病毒
一般而言，作为一种破坏力很强的致病因子，副粘病毒每年会导致大量动物及人类的死亡。副粘病毒科是属于单负链病毒(Mononegavirales)(负链单链RNA病毒)目中的一个科，包括副粘病毒和肺病毒两个亚科。后一亚科目前在分类学上分为肺病毒属和间质肺病毒属(Pringle，1999，Arch.Virol.144/2，2065-2070)。人呼吸道合胞病毒(hRSV)，为肺病毒属中的一个种，是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染的最重要的单一致病因子(Domachowske，& Rosenberg，1999，Clin.Microbio.Rev.12(2)：298-309)。肺病毒属的其它成员包括牛及绵羊呼吸道合胞病毒以及小鼠肺炎病毒(PVM)。
在过去的几十年中，几种哺乳动物疾病，具体是呼吸道疾病(RTI)，具体为人的呼吸道疾病的病原因子，已经鉴定出来(Evans，In：ViralInfections of Humans，Epidemiology and Control.3th edn.(ed.Evans，A.S)22-28(Plenum Publishing Corporation，New York，1989))。哺乳动物RTI的常见致病因子是在人(hRSV)及反刍动物如牛或绵羊(bRSV和/或oRSV)中发现的属于肺病毒属的呼吸道合胞病毒。就人RSV而言，根据正反交中和试验差异、免疫学测定中G蛋白的反应性以及G基因的核苷酸序列，分为两个hRSV抗原性亚组。在亚组内，氨基酸序列呈现出94％(A亚组)或98％(B亚组)的同一性，而亚组之间表现出仅53％的氨基酸序列同一性。根据单克隆抗体、RT-PCR试验及RNA酶保护试验，还发现了亚组内的其它变异。两亚组的病毒都在全世界范围内分布，可以发生在单一季节。感染既可以发生于预先存在免疫性的情况，抗原性变异也不是发生再感染所必需的。参见，例如，Sullender，2000，Clinical Microbiology Reviews 13(1)：1-15；Collins等人Fields Virology，ed.B.N.Knipe，Howley，P.M.1996，Philadelphia：Lippencott-Raven.1313-1351；Johnson等人，1987，(ProcNatl Acad Sci USA，84(16)：5625-9；Collins，in The paramyxoviruses，D.W.Kingsbury，Editor.1991，Plenum Press：New York.p.103-153。
另一种常见的肺病毒是小鼠肺炎病毒(PVM)，通常仅发现于实验小鼠。但是，哺乳动物中发现的疾病一部分还不能归结于已知病原体。
2.2.RSV感染
呼吸道合胞体病毒(RSV)是婴幼儿严重下呼吸道疾病的主要致病因子(Feigen等人，eds.，1987，In：Textbook of Pediatric InfectiousDiseases，WB Saunders，Philadelphia，p.1653-1675；New VaccineDevelopment，Establishing Priorities，Vol.1，1985，National AcademyPress，Washington DC，p.397-409；和Ruuskanen等人，1993，Curr.Probl.Pediatr.23：50-79)。RSV感染的每年流行特点都明显为全球性，但是RSV在特定季节中的发生及强度因地区而变化(Hall，1993，Contemp.Pediatr.10：92-110)。在北半球的温带地区，它通常开始于深秋结束于晚春。原发性RSV感染最多见于6周至两岁的儿童，不常见出生后前4周的婴儿医院感染(Hall等人，1979，New Engl.J.Med.300：393-396)。RSV感染的高发儿童包括但不限于早产婴儿(Hall等人，1979，New Engl.J.Med.300：393-396)和患有下列病症的儿童：支气管肺发育异常(Groothuis等人，1988，Pediatrics 82：199-203)、先天性心脏病(MacDonald等人，New Engl.J.Med.307：397-400)，先天性或获得性免疫缺陷(Ogra等人，1988，Pediatr.Infect.Dis.J.7：246-249；和Pohl等人，1992，J.Infect.Dis.165：166-169)和囊性纤维化(Abman等人，1988，J.Pediatr.113：826-830)。患有心和肺病以RSV感染就诊婴儿的死亡率为3％-4％(Navas等人，1992，J.Pediatr.121：348-354)。
RSV感染成人以及婴儿和儿童。在健康成人中，RSV可导致占主导地位的上呼吸道疾病。近来，已经发现一些症状性RSV感染的成人，特别是老年人，出现RSV感染症状的几率比先前的报道更高(Evans，A.S.，eds.，1989，Viral Infections of Humans.Epidemiology andControl，3rd ed.，Plenum Medical Book，New York，p.525-544)。另外还报道了发生于家庭护理患者及专门机构护理的年轻患者中的几个流行病例(Falsey，A.R.，1991，Infect.Control Hosp.Epidemiol.12：602-608；和Garvie等人，1980，Br.Med.J.281：1253-1254)。最后，RSV可引发免疫抑制人群，特别是骨髓移植患者的严重疾病(Hertz等人，1989，Medicine 68：269-281)。
已有RSV疾病的治疗措施还很有限。下呼吸道严重RSV疾病通常需要相当的支持性护理，包括施用湿化氧气和呼吸辅助(Fields等人，eds，1990，Fields Virology，2nd ed.，Vol.1，Raven Press，New York，P.1045-1072)。
尽管疫苗能防止RSV感染和/或RSV-相关疾病，但是现在还没有一种疫苗获得许可。发展疫苗最大的障碍是安全性。一种福尔马林灭活疫苗尽管具有免疫原性，但是被免疫婴儿中的RSV出人意料的引发了比用类似方法制备的三价副流感疫苗免疫婴儿更高发且更严重的下呼吸道疾病(Kim等人，1969，Am.J.Epidemiol.89：422-434；andKapikian等人，1969，Am.J.Epidemiol.89：405-421)。几种候选RSV疫苗已经被放弃，其它的则还在开发中(Murphy等人，1994，Virus Res.32：13-36)，但是即使安全性问题得到解决，疫苗的效果还必须提高。大量问题有待解决。新生儿期就需要马上免疫，因为下呼吸道感染的高峰发生于2-5月龄。预计新生儿免疫应答的不完备和高滴度母源获得RSV抗体一起可以降低新生儿期疫苗的免疫原性(Murphy等人，1988，J.Virol.62：3907-3910；and Murphy等人，1991，Vaccine 9：185-189)。最后，原发性RSV感染及疾病不能很好地保护继发性RSV疾病(Henderson等人，1979，New Engl.J.Med.300：530-534)。
目前，预防RSV疾病的最有效方法是被动免疫。起初的证据表明IgG的保护作用来自雪貂(ferret)(Prince，G.A.，Ph.D.diss.，Universityof California，Los Angeles，1975)和人(Lambrecht等人，1976，J.Infect.Dis.134：211-217；和Glezen等人，1981，J.Pediatr.98：708-715)母源抗体试验结果。Hemming等人(Morell等人，eds.，1986，Clinical Use ofIntravenous Immunoglobulins，Academic Press，London，P.285-294)发现：在疑似患有新生儿脓毒血症新生儿体内静脉内免疫球蛋白(IVIG)药动学研究中，RSV抗体可用来治疗或防止RSV感染。在该试验中，值得注意的是一个呼吸道分泌物含RSV的婴儿在IVIG输注后迅速康复。IVIG曲线的后续分析发现异常高滴度的RSV中和抗体。同一组研究者然后测定了富含RSV中和抗体的超免疫血清或免疫球蛋白保护棉鼠和灵长类免受RSV感染(Prince等人，1985，Virus Res.3：193-206；Prince等人，1990，J.Virol.64：3091-3092；Hemming等人，1985，J.Infect.Dis.152：1083-1087；Prince等人，1983，Infect.Immun.42：81-87；和Prince等人，1985，J.Virol.55：517-520)。这些试验的结果表明IVIG除了能治疗或防止RSV相关病症，还可用于防止RSV感染。
最近临床试验表明这种被动施用RSV超免疫球蛋白(RSV IVIG)能够保护易感儿童免受RSV引发的严重下呼吸道感染(Groothius等人，1993，New Engl.J.Med.329：1524-1530；和The PREVENT StudyGroup，1997，Pediatrics 99：93-99)。尽管这是防止RSV感染的一大进步，但是这种治疗方法在广泛使用上存在某些局限。首先，RSV IVIG必须在几小时内静脉内输注达到有效剂量，其次，超免疫球蛋白中活性物质的浓度不足以治疗易感成人或大部分心肺病易感儿童。第三，静脉内输注需要再RSV季节住院数月。最后，选择足够提供者制备RSV高免球蛋白满足该产品的需要也是一大难题。目前，只有约8％正常提供者的RSV中和抗体滴度足够高能够定量超免疫球蛋白的产量。
提高免疫球蛋白特异性活性的一种方法是制备一种或多种高效RSV中和单克隆抗体(MAbs)。这类MAbs应该是人的或人源化的从而保留有利的药动学并且避免人抗鼠抗体应答，由于重复剂量需要贯穿RSV季节。现已证实RSV表面的两种糖蛋白F和G是中和抗体的靶标(Fields等人，1990，同上；和Murphy等人，1994，同上)。针对RSV F蛋白的A抗原位点中的表位的人源化抗体SYNAGIS
Figure S03808914919950506D000071
，要求在整个RSV季节(北半球从11月至4月)按推荐的每月15mg/kg体重的剂量，肌肉内施用给儿童患者防止RSV引发的严重下呼吸道感染。SYNAGIS
Figure S03808914919950506D000072
是人抗体(95％)与鼠(5％)抗体序列的结合体。参见，Johnson等人，1997，J.Infect.Diseases 176：1215-1224和美国专利No.5,824,307，文献全文在此引入作为参考。人重链序列源自人IgG1恒定区以及Cor(Press等人，1970，Biochem.J.117：641-660)和Cess(Takashi等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：194-198)的VH基因的可变框架区域。人轻链序列源自C的恒定区和VL基因K104 J-4的可变框架区域(Bentley等人，1980，Nature 288：5194-5198)。鼠序列源自鼠单克隆抗体Mab 1129(Beeler等人，1989，J.Virology 63：2941-2950)，该方法是将鼠互补决定区移植入人抗体框架。
2.3.禽类肺病毒
禽类肺病毒(APV)引发的呼吸道疾病在20世纪70年代后期首次报道于南非(Buys等人，1980，Turkey 28：36-46)，给火鸡养殖业造成毁灭性打击。这种火鸡疾病的特征为窦炎和鼻炎，称为火鸡鼻气管炎(TRT)。现已有强有力证据表明APV的欧洲分离株是鸡头肿胀综合征(swollen head syndrome)(SHS)的病因(O′Brien，1985，Vet.Rec.117：619-620)。起初，该疾病出现于已感染新城疫病毒(NDV)的产蛋母鸡群，被认为是与新城疫(ND)相关的继发问题，在爆发SHS后的感染鸡群中检测到了抗欧洲APV抗体(Cook等人，1988，Avian Pathol.17：403-410)，因而认为APV为致病因子。
禽类肺病毒(APV)又称火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)，是禽类鼻气管炎，一种火鸡上呼吸道感染(Giraud等人，1986，Vet.Res.119：606-607)的致病因子，该病毒是新近命名的间质肺病毒属的唯一成员，迄今为止还未与哺乳动物感染相关，或者更进一步说还未与哺乳动物的疾病有关。APV的血清学亚组可以根据G糖蛋白的核苷酸或氨基酸序列以及使用也识别G糖蛋白的单克隆抗体的中和试验来划分。但是，核苷酸及氨基酸序列中的其它差异也可用于区别APV的血清学亚组。对于亚组A、B和D，亚组内的G蛋白表现出98.5～99.7％的aa序列同一性，而亚组之间仅31.2～38％的aa同一性。参见，例如，Collins等人，1993，Avian Pathology，22：p.469-479；Cook等人，1993，AvianPathology，22：257-273；Bayon-Auboyer等人，J Gen Virol，81(Pt11)：2723-33；Seal，1998，Virus Res，58(1-2)：45-52；Bayon-Auboyer等人，1999，Arch Virol，144(6)：91-109；Juhasz，等人，1994，J Gen Virol，75(Pt11)：2873-80。
APV的另一血清型提供于WO00/20600，在此引入作为参考，该文献描述了APV科罗拉多(Colorado)分离株，并用体外血清中和试验将其与已知的APV或TRT株进行了比较。首先，用识别TRT分离株的单特异性多克隆抗血清测试上述科罗拉多分离株。科罗拉多分离株未被抗任一株TRT的单特异性抗血清所中和。但是，其被抗A亚组的一病毒株的超免疫血清中和，这种血清中和同源病毒的滴度为1∶400，中和科罗拉多分离株的滴度为1∶80。使用上述方法，然后用抗TRT的单克隆抗体测定科罗拉多分离株。在每一种情况下，交互中和滴度都＜10。另外，还用抗科罗拉多分离株的单特异性抗血清测试两个亚组的TRT分离株。被测的TRT中无一株被抗科罗拉多分离株的抗血清中和。
APV科罗拉多分离株不能保护SPF鸡免受TRT病毒的A亚组和B亚组毒株的感染。这些结果表明科罗拉多分离株可能是禽类肺病毒另一血清型的第一个实例(参见，Bayon-Auboyer等人，2000，J.Gen.Vir.81：2723-2733)。
禽类肺病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科间质肺病毒属(Cavanagh和Barrett，1988，Virus Res.11：241-256；Ling等人，1992，J.Gen.Virol.73：1709-1715；Yu等人，1992，J.Gen.Virol.73：1355-1363)。副粘病毒科分为两个亚科：副粘病毒亚科和肺病毒亚科。副粘病毒亚科包括但不限于副粘病毒属、Rubulavirus和麻疹病毒属。最近，肺炎病毒亚科根据基因次序和序列同源性分为两个属，即肺病毒属和间质肺病毒属(Naylor等人，1998，J.Gen.Virol.，79：1393-1398；Pringle，1998，Arch.Virol.143：1449-1159)。肺病毒属包括但不限于，人呼吸道合胞病毒(hRSV)、牛呼吸道合胞病毒(bRSV)、绵羊呼吸道合胞病毒和小鼠肺病毒。间质肺病毒属包括但不限于，欧洲禽类肺病毒(亚组A和B)，有别于肺病毒属的hRSV种型(Naylor等人，1998，J.Gen.Virol.，79：1393-1398；Pringle，1998，Arch.Virol.143：1449-1159)。APV的美国分离株是间质肺病毒属中的第三亚组(亚组C)，因为已经发现它在抗原性和遗传学上不同于欧洲分离株(Seal，1998，Virus Res.58：45-52；Senne等人，1998，In：Proc.47th WPDC，California，pp.67-68)。
负链APV电镜检测显示为多形的(pleomorphic)，有时呈球形的病毒颗粒，直径为80～200nm，带有长为1000～2000的长丝(Collinsand Gough，1988，J.Gen.Virol.69：909-916)。被膜是一层布满着长度为13-15nm纤突的膜。核壳为螺旋形，直径14nm，螺距7nm。核壳蛋白的直径小于副粘病毒属及麻疹病毒属，副粘病毒属及麻疹病毒属核壳的直径通常约为18nm。
尽管禽类肺病毒感染在世界其它地方的禽类中已经存在多年，但是对于美国来说其是一种突发性疾病。在1996年5月，一种高度传染性的火鸡呼吸道疾病出现于科罗拉多，随后在美国衣阿华州埃姆斯市国立兽医服务实验室(NVSL)中分离出了APV(Senne等人，1997，Proc.134th Ann.Mtg.，AVMA，pp.190)。此前，美国和加拿大被认为没有禽类肺病毒(Pearson等人，1993，In：Newly Emerging and Re-emerging Avian Diseases：Applied Research and PracticalApplications for Diagnosis and Control，pp.78-83；Hecker和Myers，1993，Vet.Rec.132：172).1997年初，在明尼苏达用血清学方法从火鸡中检测到了APV。在第一例确诊时，APV感染已经扩散到了许多农场。与该疾病相关的上呼吸道临床症状有：眼睛水泡肿，鼻腔有分泌物以及眶下窦肿胀。二次感染会使症状加剧。感染禽类的发病率可高达100％。死亡率为1～90％，且6-12周龄的幼禽类死亡率最高。
禽类肺病毒通过接触传播。鼻腔分泌物、感染禽类的流动、污染的水、污染的设备；受到污染的饲料运输车辆以及运载行为都能造成病毒的传播。康复后的火鸡被认为是携带者。由于证明该病毒感染产蛋火鸡输卵管的上皮细胞，而且APV已经在幼禽类中检测到，所以卵传播也是可能的传播途径。
大部分人呼吸道疾病是由病毒亚科副粘病毒亚科和肺病毒亚科的成员所引起的，仍然需要有效疫苗提供抗导致呼吸道感染的多种病毒的保护作用。
本申请中引述和讨论的文献不应被理解为是本发明的现有技术。
3.发明概述
本发明涉及重组副流感病毒cDNA和RNA，所述cDNA和RNA可经工程改造而表达异源或非天然的基因产物，特别是表达抗原多肽和肽。在一个实施方案中，本发明涉及重组牛或人副流感病毒，所述副流感病毒经工程改造而能表达异种抗原，或异种抗原的免疫原性和/或抗原片段。在另一本发明实施方案中，所述重组牛或人副流感病毒经工程改造而能表达相对于PIV基因组是非天然的序列，包括突变的PIV核替酸序列。本发明特别涉及重组Kansas株3型牛副流感病毒，以及编码所述病毒的cDNA和RNA分子。本发明还涉及含有修饰的重组PIV，所述修饰产生具有更适合用于疫苗制剂的表型的嵌合病毒。
本发明首次提供了能够赋予抗各种病毒感染，特别是导致呼吸道感染的病毒的保护作用的配制成疫苗的嵌合PIV。在具体的实施方案中，本发明提供了能够赋予抗副流感病毒、流感病毒或呼吸道合胞病毒感染的保护作用的疫苗。本发明首次提供了能够赋予抗哺乳动物宿主中间质肺病毒感染的保护作用的疫苗。
根据本发明，重组病毒是一种源自牛副流感病毒或人副流感病毒的，由内源或天然基因组序列或非天然基因组序列编码的病毒。根据本发明，非天然序列是指由于一处或多处突变而有别于天然或内源基因组序列的序列，所述突变包括但不限于基因组序列中能或不会导致表型改变的点突变、重排、插入、缺失等。
根据本发明，本发明的嵌合病毒是重组bPIV或hPIV，其还包含一个或多个异源核苷酸序列。根据本发明，嵌合病毒可由具有下述特性的核苷酸序列编码：基因组中添加了异源核苷酸序列或者基因组中的核苷酸序列被异源核苷酸序列替代。
本发明还涉及工程改造的重组副流感病毒和病毒载体，其编码异源序列的组合，该异源序列组合编码基因产物，包括但不限于得自不同PIV株、流感病毒、呼吸道合胞病毒、哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒)、禽类肺病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、其它病毒、病原体的基因、细胞基因、肿瘤抗原或其组合。此外，本发明涉及工程改造的重组副流感病毒，其含有与源自呼吸道合胞病毒的核苷酸序列组合、并进一步与源自人副流感病毒的核苷酸序列组合的源自间质肺病毒的核苷酸序列。本发明还包括重组副流感病毒载体和病毒，所述病毒载体和病毒经工程改造而能编码源自副流感病毒的不同物种和株的基因，包括人PIV3的F和HN基因。
在一个实施方案中，本发明的PIV载体经工程改造而能表达一个或多个异源序列，其中所述异源序列编码优选是抗原性基因产物的基因产物。在优选的实施方案中，本发明的PIV载体表达一种、二种或三种编码抗原多肽和肽的异源序列。在某些实施方案中，所述异源序列源自相同病毒或不同病毒。在优选的实施方案中，所述异源序列编码异源基因产物，所述异源基因产物是得自另一PIV物种例如人PIV、PIV的突变株，或得自另一负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒(hMPV))和禽类肺病毒的抗原多肽。在一个实施方案中，该异源序列编码异源基因产物的免疫原性和/或抗原片段。
在优选的实施方案中，该重组PIV为3型牛PIV或减毒的3型人PIV。在一个实施方案中，将编码融合(F)蛋白、血凝素(HN)糖蛋白或PIV基因组的其它非必需基因的序列删除，并用异种抗原序列替代。在另一个实施方案中，除了异源核苷酸序列以外，PIV基因组还含有突变或修饰，所述突变或修饰使嵌合病毒具有更适合用于疫苗制剂的表型，例如减毒表型或具有增强的抗原性的表型。
在具体实施方案中，欲插入PIV基因组内的异源核苷酸序列源自编码F蛋白、G蛋白或HN蛋白的核苷酸序列。在某些实施方案中，欲插入的核苷酸序列编码嵌合F蛋白、嵌合G蛋白或嵌合HN蛋白。在具体实施方案中，F蛋白包含间质肺病毒的F蛋白的胞外结构域、副流感病毒的F蛋白的跨膜结构域和副流感病毒的F蛋白的鲁米那(luminal)结构域。在某些实施方案中，欲插入的核苷酸序列编码F蛋白，其中该F蛋白的跨膜结构域被删除而得以表达可溶的F蛋白。
在另一具体实施方案中，本发明提供了包含PIV基因组的嵌合病毒，该PIV基因组包含源自间质肺病毒的异源核苷酸序列。在具体实施方案中，该PIV病毒是Kansas株3型牛副流感病毒。在其它实施方案中，该PIV病毒是具有减毒表型的人副流感病毒。在其它实施方案中，本发明提供了嵌合3型牛副流感病毒/人副流感病毒，其经过工程改造而在牛副流感病毒主链中含有人副流感病毒F和HN基因。该嵌合病毒可进一步包含源自间质肺病毒的异源核苷酸序列，和/或进一步包含源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列。
在一些实施方案中，本发明病毒包含源自至少两种不同的间质肺病毒基因的异源核苷酸序列。在具体的实施方案中，所述异源序列源自间质肺病毒，例如禽类肺病毒和人间质肺病毒。更具体来说，所述异源序列源自禽类肺病毒，包括A、B、C或D型禽类肺病毒，优选C型禽类肺病毒。
本发明还提供了包含表达一个或多个异种抗原序列的嵌合PIV的疫苗制剂和免疫原性组合物。在具体实施方案中，本发明提供了多价疫苗，包括二价和三价疫苗。本发明多价疫苗可以以表达每一异种抗原序列的一种PIV载体，或分别编码不同异种抗原序列的两种或多种PIV载体的形式施用。在一个实施方案中，本发明疫苗制剂包含表达一种、二种或三种异源多肽的嵌合PIV，其中所述异源多肽可由源自相同病毒的一个株、相同病毒的不同株或不同病毒的序列编码。所述异种抗原序列优选源自负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒(hMPV))和禽类肺病毒(APV)。所述异种抗原序列包括但不限于编码人副流感病毒的F或HN蛋白，RSV的F蛋白，A、B和C型流感病毒的HA蛋白以及人MPV和禽类肺病毒的F蛋白的序列。本发明疫苗制剂更优选包含可存活并有感染性的减毒嵌合病毒。在优选的实施方案中，重组PIV为3型牛PIV或人PIV的减毒株。
在一个实施方案中，疫苗制剂包含本发明的嵌合病毒，其中PIV基因组的F、HN或一些其它非必需基因已经被替代或删除。在优选的实施方案中，通过工程改造在预定宿主中具有减毒表型的PIV株，来制备本发明的疫苗制剂。在另一优选的实施方案中，通过工程改造PIV的减毒株，来制备本发明的疫苗制剂。
在另一个实施方案中，将异源核苷酸序列加到完整的PIV基因组内。在某些实施方案中，将PIV基因组工程改造，以便在位置1、2、3、4、5或6插入所述异源序列，从而使得所述异源序列作为病毒基因组的第1、2、3、4、5或6个基因来表达。在具体实施方案中，在病毒基因组的位置1、2或3插入异源序列。在某些实施方案中，将在插入的异源基因的编码序列末端与下游基因的编码序列的起点之间的基因间隔区变更为所需长度，结果提高了该异源序列的表达或促进了该嵌合病毒的生长。或者，将基因间隔区变更为所需长度，有可能改变该异源序列的表达或重组或嵌合病毒，例如减毒表型的生长。在一些实施方案中，将在该异源核苷酸序列的旁侧的基因间隔区的插入位置和长度进行工程改造，以选择具有所需水平的异源序列表达和所需病毒生长特性的重组或嵌合病毒。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明的重组或嵌合病毒以及可药用赋形剂的疫苗制剂。在具体的实施方案中，使用本发明的疫苗制剂来调节个体例如人、灵长类动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、啮齿动物或禽类个体的免疫应答。在更具体的实施方案中，使用本发明疫苗来调节人婴幼儿或儿童的免疫应答。在另一实施方案中，本发明涉及兽医用途的疫苗制剂。本发明疫苗制剂可单独施用，或者与其它疫苗或其它预防剂或治疗剂联合施用。
3.1习惯命名及缩写
cDNA互补DNA
CPE细胞病变效应
L大蛋白
M基质蛋白(排列于被膜内)
F融合糖蛋白
HN血凝素-神经氨酸酶糖蛋白
N，NP或NC核蛋白(与RNA结合并且是聚合酶活性必需的)
P磷蛋白
MOI感染复数
NA神经氨酸酶(被膜糖蛋白)
PIV副流感病毒
hPIV人副流感病毒
hPIV3 3型人副流感病毒
bPIV牛副流感病毒
bPIV3 3型牛副流感病毒
bPIV/hPIV具有hPIV序列的重组bPIV
或b/h PIV
b/h PIV3具有3型hPIV序列的重组3型bPIV
或bPIV3/hPIV3
nt核苷酸
RNP核糖核蛋白
rRNP重组RNP
vRNA基因组病毒RNA
cRNA反基因组病毒RNA
hMPV人间质肺病毒
APV禽类肺病毒
位置    当在工程改造任何病毒方面使用位置时，它是指欲转录的病毒基因组的基因位置。例如，如果基因位于位置1，则它是欲转录的病毒基因组的第一个基因，如果基因位于位置2，则它是欲转录的病毒基因组的第二个基因。
bPIV3，b/h PIV3及其衍生病毒的位置1    基因组的核苷酸位置104，或者是欲转录的病毒基因组的第一个基因位置bPIV3，b/h PIV3及其衍生病毒的位置2    基因组的核苷酸位置1774，或者是在天然副流感病毒基因组第一与第二个开放阅读框之间的位置，或者是欲转录的病毒基因组的第二个基因位置
bPIV3，b/h PIV3及其衍生病毒的位置3    基因组的核苷酸位置3724，或者是在天然副流感病毒基因组第二与第三个开放阅读框之间的位置，或者是欲转录的病毒基因组的第三个基因位置
bPIV3，b/h PIV3及其衍生病毒的位置4    基因组的核苷酸位置5042，或者是在天然副流感病毒基因组第三与第四个开放阅读框之间的位置，或者是欲转录的病毒基因组的第四个基因位置
bPIV3，b/h PIV3及其衍生病毒的位置5    基因组的核苷酸位置6790，或者是在天然副流感病毒基因组第四与第五个开放阅读框之间的位置，或者是欲转录的病毒基因组的第五个基因位置
bPIV3，b/h PIV3及其衍生病毒的位置6    基因组的核苷酸位置8631，或者是在天然副流感病毒基因组第五与第六个开放阅读框之间的位置，或者是欲转录的病毒基因组的第六个基因位置
4.附图说明
图1.人间质肺病毒的F蛋白与得自不同禽类肺病毒的不同F蛋白的氨基酸序列的成对比对。通过氨基酸的单字母符号表示在两个序列之间的相同氨基酸。以“+”符号表示在两个氨基酸序列之间的保守氨基酸交换，而空格表示非保守氨基酸交换。A)人间质肺病毒F蛋白与分离自Mallard鸭的禽类肺病毒的F蛋白的比对(在胞外结构域中有85.6％同一性)。B)人间质肺病毒F蛋白与分离自火鸡的禽类肺病毒的F蛋白的比对(B亚组：在胞外结构域中有75％同一性)。
图2.扩增源自b/h PIV3嵌合病毒的三个不同分离株的从核苷酸5255至核苷酸6255的PCR片段。用对人PIV3的F基因有特异性的酶消化所得1kb DNA片段。这些酶不能裂解牛PIV3的相应片段。1％琼脂糖凝胶显示未消化的片段(泳道2、5和6)以及经Sac1或BgIII消化的片段(分别为泳道4、6与泳道9、10和11)。在泳道10中的样本是未经消化的，然而，当用BgIII重复消化时，该样本被裂解(数据未显示)。泳道1和8显示DNA尺寸标记。
图3.扩增源自b/h PIV3嵌合病毒的三种不同分离株的从核苷酸9075至核苷酸10469的PCR片段。用对牛PIV3的L基因有特异性的酶消化所得的1.4 kb DNA片段。这些酶不能裂解人PIV3的相应片段。1％琼脂糖凝胶显示未消化的1.4kb片段(泳道2、5和8)。在泳道3、4、6、7、9和10中，显示通过用BamH1和PvuII消化所产生的较小的DNA片段。泳道1显示DNA尺寸标记。
图4.证实六个构建体，包括bPIV3/hPIV3载体，和载有RSV F或G cDNA的b/h PIV3。牛PIV3 F基因和HN基因被删除，并分别以人PIV3 F和HN基因代替。将RSV F或G基因克隆到位置1或位置2内。除了RSV F1＊(N-N)以外，所有的RSV基因都与bPIV3 N-P基因间隔区连接，RSV F1＊(N-N)后面是较短的bPIV3 N基因终止/N基因起始序列。
图5.载有RSV F或G cDNA的b/h PIV3表现出位置效应。(A)是嵌合病毒感染的细胞的溶胞产物的Western印迹分析。使用抗RSV F蛋白的单克隆抗体(MAbs)检测F蛋白，使用抗RSV G蛋白的多克隆抗体(PAbs)检测G蛋白。在用所有嵌合病毒和野生型RSV感染的细胞中检测到了代表F1片段的50kDa谱带。与野生型RSV相比，在嵌合病毒感染细胞的溶胞产物中，有更多的20kDa F片段积聚。以0.1的MOI进行实验，除了在泳道1中是以1.0的较高MOI重复进行载有RSV F1＊N-N的b/h PIV3感染。检测到RSV G蛋白的不成熟和糖基化形式，二者分别移动至大约50 kDa和90 kDa。(B)为Northern印迹分析，其显示与在图5A中证实的蛋白表达结果有关的mRNA转录。在含有1％甲醛的1％琼脂糖凝胶上，分离出等量的总RNA，并转移到尼龙膜上。使印迹与洋地黄毒苷(DIG)-UTP-标记的核糖核酸探针杂交，该探针是用DIG RNA标记试剂盒通过体外转录作用合成的。(C)为包含载有RSV F或G蛋白的b/h PIV3的嵌合病毒在Vero细胞中的生长曲线。使Vero细胞生长至90％铺满，并以0.01的MOI感染。在37℃培养被感染的单层。通过TCID50试验来测定在每个时间点收获的病毒滴度，其是通过在37℃培养6天之后，以肉眼检查CPE来进行的。
图6.载有增强绿萤光蛋白(eGFP)的b/h PIV3构建体。依次在PIV3的所有基因(在本文中仅显示位置1、2、3和4)之间，将eGFP基因导入b/h PIV3载体内。将eGFP基因连接到bPIV3 N-P基因间隔区内。b/h GFP 1构建体在3’最接近b/h PIV3基因组的位置具有eGFP基因弹夹。b/h GFP 2构建体在N和P基因之间含有eGFP基因弹夹。b/hGFP 3构建体在P和M基因之间含有eGFP基因弹夹，而b/h GFP 4构建体在b/h PIV3的M和F之间含有eGFP基因。
图7.在b/h PIV3基因组中插入增强绿萤光蛋白(eGFP)的位置效应。(A)显示当使用载有eGFP 1、2和3的b/h PIV3以MOI 0.1和MOI0.01感染Vero细胞20小时时，所产生的绿细胞的量。通过使用萤光显微镜来以肉眼检查绿细胞。(B)为被感染细胞的溶胞产物的Western印迹分析。利用GFP MAb和PIV3 PAb探测该印迹。还使用PIV3抗体来显示有相同体积负荷的印迹。(C)为载有GFP的b/h PIV3构建体(在位置1、2和3处)在Vero细胞中的生长曲线。
图8.载有具有不同基因间隔区的RSV F基因的b/h PIV3的构建体。三个构建体RSV F1＊N-N、RSV F2 N-P和RSV F1 N-P分别与图4中的RSV F＊(N-N)、RSV F2和RSV F1相同。在RSV F1＊N-N中，在N基因起始序列与N基因翻译起始密码子之间的距离仅为10个核苷酸(nts)长。相反，在RSV F2构建体中，该距离为86个核苷酸长。RSV F1＊N-N也使用N基因起始序列，而不是在RSV F2构建体中使用的P基因起始序列。
图9.在插入的RSV基因下游的基因间隔区的长度和性质对病毒复制有影响。(A)在嵌合病毒中RSV F蛋白表达的Western印迹分析。使用抗RSV F蛋白的单克隆抗体来探测印迹。由RSV F1构建体表达，并在感染后24和48小时测定的F1蛋白水平接近在RSV F2构建体中所观察到的水平，但比RSV F1＊N-N构建体高很多。(B)为比较RSVF1、RSV F1＊N-N和RSV F2构建体以0.1的MOI在Vero细胞中的病毒复制动力学的多循环生长曲线。通过噬斑测定来确定每个时间点收获的病毒滴度，该测定是通过在培养5天之后用RSV多克隆抗血清进行定量免疫染色来进行的.
图10.载有RSV F和hMPV F的三价b/h PIV3的构建体。在该图中显示了两个病毒基因组，分别包括嵌合b/h PIV3载体和源自间质肺病毒F基因的第一个异源序列以及源自呼吸道合胞病毒F基因的第二个异源序列。已经在Vero细胞中扩增了具有任一构建体的病毒。可使用所述工程改造病毒作为三价疫苗，以抗副流感病毒感染、间质肺病毒感染和呼吸道合胞病毒感染。
图11.具有两个RSV F基因的构建体。该构建体可用于测定有关RSV F蛋白生成和复制以及在仓鼠中的免疫原性的病毒生长动力学。
图12.载有hMPVF的嵌合b/h PIV3的构建体。将人间质肺病毒(hMPV)的F基因插入b/h PIV3基因组的位置1或位置2内。HMPV F基因弹夹具有bPIV3 N-P基因间隔区。
图13.载有hMPV F基因(在位置2)的b/h PIV3的免疫沉淀和复制测定。(A)显示使用豚鼠或人抗-hMPV抗血清的hMPV F蛋白的免疫沉淀。在载有hMPV F2的b/h PIV3的溶胞产物中，观察到大约80kDa的特异谱带移动。该尺寸相当于F前体蛋白F0。在b/h PIV3和模拟品对照泳道中，也观察到了不同尺寸的非特异性谱带。(B)显示生长曲线，其可用来确定b/h PIV3/hMPV F2的病毒复制动力学，并将其与所观察到的在Vero细胞中以0.1的MOI复制的b/h PIV3和b/hPIV3/RSV F2的结果进行比较。(C)为生长曲线，其可用来确定b/hPIV3/hMPV F1的病毒复制动力学，并将其与所观察到的在Vero细胞中以0.01的MOI复制的b/h PIV3/hMPV F2和b/h PIV3的结果进行比较。
图14.载有可溶性RSV F基因的嵌合b/h PIV3的构建体。该构建体包括可溶性RSV F基因的单一拷贝，这是缺乏跨膜和胞质结构域的RSV F基因的版本。该构建体的优点是可溶性RSV F不能被引入病毒颗粒基因组内。
图15.免疫染色的b/h PIV3/hMPV F1和b/h PIV3/hMPV F2。(A)将b/h PIV3/hMPV F1病毒稀释，并用于感染亚铺满的Vero细胞。用含有庆大霉素的optiMEM培养基覆盖被感染的细胞，并在35℃培养5天。将细胞固定，并用豚鼠抗-hMPV血清进行免疫染色。在AEC底物系统存在下，通过特异显色肉眼检查hMPV F的表达。(B)将b/hPIV3/hMPV F2病毒稀释，并用来感染Vero细胞。用在EMEM/L-15培养基中的1％甲基纤维素(JRHBiosciences：Lenexa，KS)覆盖被感染的细胞。培养细胞，固定，然后用抗-hMPV豚鼠血清进行免疫染色。抗-hMPV豚鼠血清对hMPV 001蛋白有特异性。
图16.在蔗糖梯度上的载有RSV基因的b/h PIV3的病毒颗粒分级分离。这些系列实验确定RSV蛋白是否被引入b/hPI V3病毒颗粒中。(A)显示游离RSV F(在杆状病毒中产生，并且C-末端被截短)的对照梯度。大多数的游离RSV F存在于级分3、4、5和6中。(B)显示在级分10、11和12中观察到的RSV病毒颗粒的最大浓度。利用RSV多克隆抗血清以及RSV F MAb探测RSV级分。含有最大量RSV病毒颗粒的级分也表现出关于RSV F的最强信号，这意味着RSV F蛋白一起移动，并与RSV病毒颗粒结合。在(B)中最后的图还显示，通过噬斑测定，级分10、11和12表现出最高病毒滴度。(C)b/h PIV3病毒颗粒可更具多型性，因此含有b/h PIV3病毒颗粒的峰级分的散布是更广泛的。(D)用PIV多克隆抗血清和RSV F MAb分析b/hPIV3/RSV F2的蔗糖梯度级分。如使用PIV3抗血清的Western法所示，含有大部分病毒颗粒的级分是级分11、12、13和14。同样地，这些也是表现出最高量RSV F蛋白的级分。在级分5和6中，也存在一些游离RSV F。级分11、12、13和14表现出峰值病毒滴度。(E)含有大部分b/h PIV3/RSV G2病毒颗粒的级分(9、10、11和12)也表现出关于RSV G蛋白的最强信号。这些也是具有最高病毒滴度的级分。
5.发明描述
本发明涉及重组副流感cDNA和RNA构建体，包括但不限于重组牛和人PIV cDNA和RNA构建体，所述构建体可用来表达异源或非天然序列。
根据本发明，重组病毒是一种源自牛副流感病毒或人副流感病毒的，由内源或天然基因组序列或非天然基因组序列编码的病毒。根据本发明，非天然序列是指由于一处或多处突变而有别于天然或内源基因组序列的序列，所述突变包括但不限于基因组序列中能或不会导致表型改变的点突变、重排、插入、缺失等。
根据本发明，本发明的嵌合病毒是重组bPIV或hPIV，其还包含一个或多个异源核苷酸序列。根据本发明，嵌合病毒可由具有下述特性的核苷酸序列编码：基因组中添加了异源核苷酸序列或者基因组中的核苷酸序列被异源核苷酸序列替代。这些重组和嵌合病毒以及表达产物可用作适于施用给人或动物的疫苗。例如，可在疫苗制剂中使用本发明的嵌合病毒，以提供抗肺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒或流感病毒感染的保护作用。
在一个实施方案中，本发明涉及PIV cDNA和RNA构建体，其源自人或牛PIV变种，并经工程改造而表达一、二或三种异源序列，优选是编码外源抗原和得自各种病原体、细胞基因、肿瘤抗原和病毒的其它产物的异源基因。具体来说，所述异源序列源自负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒变种A1、A2、B1和B2)，以及禽类肺病毒亚组A、B、C和D。哺乳动物MPV可以是哺乳动物MPV变种A1、A2、B1或B2。然而，本发明的哺乳动物MPV包括待鉴定的其它变种，而不仅限于A1、A2、B1或B2变种。在本发明的另一实施方案中，该异源序列是非天然PIV序列，包括突变的PIV序列。在一些实施方案中，该异源序列源自相同或源自不同的病毒。
在具体实施方案中，本发明的病毒是重组PIV，其中包含源自人间质肺病毒或禽类肺病毒的异源核苷酸序列。欲插入PIV基因组内的异源序列包括但不限于编码人间质肺病毒A1、A2、B1或B2变种的F、G和HN基因的序列，编码A、B或C型禽类肺病毒的F、G和HN基因的序列，及其免疫原性和/或抗原片段。
在某些实施方案中，将异源核苷酸序列加到病毒基因组内。在另外的实施方案中，用异源核苷酸序列交换内源核苷酸序列。可将异源核苷酸序列在PIV基因组的各个不同位置，例如在位置1、2、3、4、5或6加入或插入。在优选的实施方案中，在位置1加入或插入异源核苷酸序列。在另一个优选的实施方案中，在位置2加入或插入异源核苷酸序列。在另一个优选的实施方案中，在位置3加入或插入异源核苷酸序列。与在较高编号的位置插入相比，在病毒的较低编号的位置插入或加入异源核苷酸序列通常产生更强的异源核苷酸序列表达。这是因为跨越病毒基因组存在转录梯度。然而，也必须考虑病毒复制效率。例如，在本发明的b/h PIV3嵌合病毒中，在位置1插入异源基因在体外延迟了复制动力学，而在体内也达到较低的程度(参见第8章节，实例3和图5，以及第26章节，实例21)。因此，如果需要异源核苷酸序列的强表达，则在较低编号的位置插入异源核苷酸序列是本发明优选的实施方案。如果需要异源序列的强表达，最优选是将异源序列在b/h PIV3基因组的位置2插入(参见下文第5.1.2章节和第8章节，实例3)。
在一些其它实施方案中，将重组或嵌合PIV基因组工程改造，而使得在异源基因的编码序列末端与下游基因的编码序列起点之间的基因间隔区改变。在另外一些其它的具体实施例中，本发明的病毒包含重组或嵌合PIV基因组，所述基因组经工程改造而使得异源核苷酸序列在选自位置1、2、3、4、5和6的位置插入，并改变了在该异源核苷酸序列与下一个下游基因之间的基因间隔区。可使用适当测定来确定最佳插入方式(即插入的位置，以及基因间隔区的长度)，以达到适当程度的基因表达和病毒生长特征。关于细节，参见下文第5.1.2章节。
在某些实施方案中，本发明的嵌合病毒含有两个不同的异源核苷酸序列。可在PIV基因组的各个不同位置插入不同的异源核苷酸序列。在优选的实施方案中，在位置1插入一个异源核苷酸序列，并在位置2或3处加入或插入另一个异源核苷酸序列。在本发明其它的实施方案中，将另外的异源核苷酸序列在PIV基因组的较高编号的位置插入。根据本发明，异源序列的位置意指从病毒基因组中转录的序列的顺序，例如在位置1的异源序列是欲从基因组中转录的第一个基因序列。
在本发明的某些实施方案中，欲插入本发明病毒的基因组内的异源核苷酸序列源自负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、哺乳动物间质肺病毒和禽类肺病毒。在本发明的特定实施方案中，该异源核苷酸序列源自人间质肺病毒。在另一个特定的实施方案中，该异源核苷酸序列源自禽类肺病毒。更具体来说，本发明的异源核苷酸序列编码人或禽类间质肺病毒的F、G或SH基因或其一部分。在具体实施方案中，该异源核苷酸序列可以是SEQID NO：1至SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中的任一个序列(参见表16)。在某些特定的实施方案中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17中的任一个的蛋白(参见表16)。在某些特定的实施方案中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：314至389中的任一个蛋白。
在本发明特定的实施方案中，本发明的异源核苷酸序列源自A型禽类肺病毒。在本发明其它特定的实施方案中，本发明的异源核苷酸序列源自B型禽类肺病毒。在本发明其它特定的实施方案中，本发明的异源核苷酸序列源自C型禽类肺病毒。系统发育分析显示，A型和B型彼此的相关性比它们与C型的相关性更密切(Seal，2000，AnimalHealth ResRev.1(1)：67-72)。A型和B型是在欧洲发现的，而C型则首先在美国发现。
在本发明另一个实施方案中，该异源核苷酸序列编码嵌合多肽，其中胞外结构域含有源自与从其中衍生出载体主链的PIV株不同的病毒的抗原序列，并且跨膜和鲁米那结构域源自PIV序列。所得嵌合病毒给予所选择的负链RNA病毒抗原性，并将具有减毒的表型。
在本发明特定的实施方案中，该异源核苷酸序列编码嵌合F蛋白。具体来说，该嵌合F蛋白的胞外结构域是间质肺病毒例如人间质肺病毒或禽类肺病毒的胞外结构域，而跨膜结构域和鲁米那结构域是副流感病毒例如人或牛副流感病毒的跨膜和鲁米那结构域。不受缚于任何理论，嵌合F蛋白的插入可进一步在预定宿主中将病毒减毒，但保留由其胞外结构域三赋予的F蛋白的抗原性。
可在疫苗制剂中使用本发明的嵌合病毒，以提供抗各种感染的保护作用，所述感染包括但不限于肺病毒感染、呼吸道合胞病毒感染、副流感病毒感染、流感病毒感染或其组合。本发明提供了包含表达一个或多个异种抗原序列的嵌合PIV的疫苗制剂，包括二价和三价的疫苗。本发明二价和三价疫苗可以以表达每一异种抗原序列的一种PIV载体，或分别编码不同异种抗原序列的两种或多种PIV载体的形式施用。该异种抗原序列优选源自负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒)和禽类肺病毒。因此，可将本发明的嵌合病毒进行工程改造以产生例如抗-人流感疫苗、抗-人副流感疫苗、抗-人RSV疫苗和抗-人间质肺病毒疫苗。本发明的疫苗制剂优选包含减毒的嵌合病毒，其为可存活并有感染性。本发明疫苗制剂可单独施用，或者与其它疫苗或其它预防剂或治疗剂联合施用。
本发明还涉及使用病毒载体以及嵌合病毒来配制抗多种病毒和/或抗原，包括肿瘤抗原的疫苗。本发明的病毒载体及嵌合病毒可用于调节个体免疫系统，这是通过刺激体液免疫应答、细胞免疫应答或者通过激发对抗原的耐受来实现的。在本发明中，个体是指人、灵长类动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、啮齿类和禽类动物。在递送肿瘤抗原时，本发明可用于治疗患有顺从免疫应答介导的排斥的疾病，例如非实体瘤或小尺寸的实体瘤的个体。也包括，通过在本文中描述的病毒载体和嵌合病毒来递送肿瘤抗原，这可用于在除去大固体肿瘤之后进行治疗。本发明还可用于治疗被怀疑患有癌症的个体。
仅为了解释的目的，而不是限制，将本发明分成以下部分来进行描述：(a)构建重组cDNA和RNA模板；(b)使用重组cDNA和RAN模板来表达异源基因产物；和(c)在重组的病毒颗粒中拯救该异源基因。
5.1.构建重组cDNA和RNA
本发明包括由源自副流感病毒，包括牛副流感病毒和哺乳动物副流感病毒的基因组的病毒载体编码的重组或嵌合病毒。根据本发明，重组病毒是一种源自牛副流感病毒或人副流感病毒的，由内源或天然基因组序列或非天然基因组序列编码的病毒。根据本发明，非天然序列是指由于一处或多处突变而有别于天然或内源基因组序列的序列，所述突变包括但不限于基因组序列中能或不会导致表型改变的点突变、重排、插入、缺失等。本发明的重组病毒包括由源自副流感病毒，包括牛和哺乳动物副流感病毒的基因组的病毒载体编码的那些病毒，并且可以或不可以包括对该病毒基因组而言为非天然的核酸。根据本发明，源自副流感病毒的基因组的病毒载体含有编码至少一部分副流感病毒的一个ORF的核酸序列。
本发明还包括重组病毒，所述病毒包含源自牛和/或哺乳动物PIV基因组的病毒载体，所述基因组含有导致病毒具有更适合用于疫苗制剂的表型，例如减毒表型或抗原性增强的表型的序列。突变和修饰可在病毒的编码区域、基因间隔区、前导序列和尾随序列中。
根据本发明，本发明的病毒载体源自哺乳动物副流感病毒，特别是人副流感病毒(hPIV)的基因组。在本发明特定的实施方案中，该病毒载体源自3型人副流感病毒的基因组。根据本发明，这些病毒载体可以或不可以包含对该病毒基因组而言为非天然的核酸。
根据本发明，本发明的病毒载体源自牛副流感病毒(bPIV)的基因组。在本发明特定的实施方案中，该病毒载体源自3型牛副流感病毒的基因组。根据本发明，这些病毒载体可以或不可以包含对该病毒基因组而言为非天然的核酸。
根据本发明，嵌合病毒为重组bNV或hPIV，其进一步包含异源核苷酸序列。根据本发明，嵌合病毒可由具有下述特性的核苷酸序列编码：基因组中添加了异源核苷酸序列或者基因组中的核苷酸序列被异源核苷酸序列替代。根据本发明，该嵌合病毒由本发明的病毒载体编码，所述病毒载体进一步包括异源核苷酸序列。根据本发明，该嵌合病毒由可以或不可以包含对该病毒基因组而言为非天然的核酸的病毒载体编码。根据本发明，该嵌合病毒由其中已经加入、插入或取代天然或非天然序列的异源核苷酸序列的病毒载体编码。
嵌合病毒对于产生可保护抗二种或多种病毒的重组疫苗具有特别的用途(Tao等人，J.Virol.72，2955-2961；Durbin等人，2000，J.Virol.74，6821-6831；Skiadopoulos等人，1998，J.Virol.72，1762-1768(1998)；Teng等人，2000，J.Virol，74，9317-9321)。例如，可以想象，表达另一负链RNA病毒例如MPV的一种或多种蛋白的hPIV或bPIV病毒载体，或表达MPV的一种或多种蛋白RSV载体将可保护接种这类疫苗的个体抗两种病毒感染。可对其它副粘病毒来采用类似方法。为了以活毒疫苗接种疫苗的目的，减毒和复制缺陷的病毒可能是有用的，如已经针对其它病毒所讨论的(参见PCT WO02/057302，在第6和23页，引入本文以供参考)。
根据本发明，欲引入编码本发明的重组或嵌合病毒的病毒载体内的异源序列包括得自或源自不同间质肺病毒株、禽类肺病毒株以及其它负链RNA病毒，包括但不限于RSV、PIV、流感病毒，及其它病毒，包括麻疹病毒的序列。
在本发明的某些实施方案中，本发明的嵌合或重组病毒由源自病毒基因组的病毒载体编码，其中一个或多个序列、基因间隔区、终止序列或一部分或整个ORF已经被异源或非天然序列替代。在本发明的某些实施方案中，本发明的嵌合病毒由源自病毒基因组的病毒载体编码，其中已将一个或多个异源序列加到该载体内。
本发明特定的实施方案是嵌合病毒，所述嵌合病毒包含由源自副流感病毒基因组的核苷酸序列编码的主链。在优选的实施方案中，该PIV基因组源自牛PIV，例如bPIV3的Kansas株或源自人PIV。在优选的实施方案中，该PIV基因组源自bPIV3的Kansas株，其中已经用异源序列替代牛副流感病毒核苷酸序列，或其中已经将异源序列加到全bPIV基因组中。本发明更进一步的特定实施方案为嵌合病毒，所述嵌合病毒包含由源自3型人副流感病毒基因组的核苷酸序列编码的主链，其中已经用异源序列取代人副流感病毒核苷酸序列，或其中已经将异源序列加到全bPIV基因组中。本发明另外特定的实施方案为嵌合病毒，所述嵌合病毒包含由源自牛副流感病毒基因组例如bPIV3的Kansas株的核苷酸序列编码的主链，其中(a)已经用人副流感病毒的F基因和HN基因替代牛副流感病毒F基因和HN基因(bPIV/hPIV)，且其中(b)已经将异源序列加到全bPIV基因组中。
本发明还包括嵌合病毒，所述嵌合病毒包含由源自bPIV、hPIV或bPIV/hPIV基因组的核苷酸序列编码的主链，其中除了异源序列以外，所述序列还含有突变或修饰，结果使该嵌合病毒具有更适于在疫苗制剂中使用的表型，例如减毒的表型或增强的抗原性。根据本发明该特定的实施方案，在牛PIV3主链上下文中所提及的异源序列，可以是对bPIV3而言为异源的任何序列。
本发明另一具体实施方案是嵌合病毒，所述嵌合病毒包含由源自人PIV1、2或3的核苷酸序列编码的主链，其中已经用异源序列替代hPIV核苷酸序列，或其中已经将异源序列加到全bPIV基因组中，其限制条件为所得嵌合病毒不是其中血凝素-神经氨酸酶和融合糖蛋白已经被hPIV1的那些替代的嵌合hPIV3。本发明还包括嵌合病毒，所述嵌合病毒包含由源自hPIV基因组的核苷酸序列编码的主链，其中除了异源序列以外，所述序列还含有突变或修饰，结果使该嵌合病毒具有更适于在疫苗制剂中使用的表型，例如减毒的表型或增强的抗原性。
可使用本领域中已知的技术，构建位于病毒聚合酶结合位点/启动子的互补序列，例如本发明的3’-PIV病毒末端的互补序列，或3’-和5’-PIV病毒末端的互补序列旁侧的异源基因编码序列。所得RNA模板可能具有负极性，并可含有能使病毒RNA-合成装置识别该模板的适当末端序列。或者，也可使用正-极性RNA模板，其含有能使病毒RNA-合成装置识别该模板的适当末端序列。可克隆含有这些杂交体序列的重组DNA分子，并通过DNA-指导的RNA聚合酶例如噬菌体T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶或真核生物聚合酶如聚合酶I等转录，以便在体外或在体内产生具有适当病毒序列，并给予病毒聚合酶识别和活性的重组RNA模板。
在一个实施方案中，本发明的PIV载体表达一、二或三个编码抗原多肽和肽的异源序列。在一些实施方案中，该异源序列源自相同病毒或源自不同病毒。在某些实施方案中，将一个以上相同异源核苷酸序列的拷贝插入牛副流感病毒、人副流感病毒或bPIV/hPIV嵌合载体的基因组中。在优选的实施方案中，将两个相同异源核苷酸序列的拷贝插入本发明的病毒的基因组中。在一些实施方案中，该异源核苷酸序列源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒或禽类肺病毒。在具体实施方案中，源自间质肺病毒的异源核苷酸序列是间质肺病毒的F基因。在其它具体实施方案中，源自间质肺病毒的异源核苷酸序列是间质肺病毒的G基因。在一些其它的实施方案中，该异源核苷酸序列源自呼吸道合胞病毒。在具体实施方案中，源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列是呼吸道合胞病毒的F基因。在其它特定的实施方案中，源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列是呼吸道合胞病毒的G基因。当插入一个或多个异源核苷酸序列时，可操纵每个插入的拷贝的插入位置和基因间隔区的长度，并可通过根据下文第5.1.2.章节的不同测定方法来确定。
在某些实施方案中，可通过反向遗传学，在其中用嵌合cDNA或RNA构建体转染宿主细胞的宿主细胞系统中，实现嵌合病毒或表达产物的拯救。通过用DNA-指导的RNA聚合酶转录适当的DNA序列，来制备本发明的RNA模板。可在体外或在体内，通过使用DNA-指导的RNA聚合酶例如噬菌体T7聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶或真核生物聚合酶如聚合酶I转录适当的DNA序列，来制备本发明的RNA模板。在某些实施方案中，可在体外或在体内，通过使用如在Hoffmann等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：6108-6113中描述的基于质粒的表达系统，或如在Hoffmann和Webster，2000，J.Gen.Virol，81：2843-2847中描述的单一方向的RNA聚合酶I-聚合酶II转录系统转录适当的DNA序列，来制备本发明的RNA模板。所得的带负极性的RNA模板将含有能使病毒RNA-合成装置识别该模板的适当末端序列。或者，也可使用正极性的RNA模板，其含有能使病毒RNA-合成装置识别该模板的适当末端序列。通过具有被DNA-依赖性RNA聚合酶识别的启动子的质粒的转染，可完成从正极性RNA模板中的表达。例如，在T7启动子控制下，编码正RNA模板的质粒DNA可与痘苗病毒或禽类痘T7系统联合使用。
可构建双顺反子的mRNA，容许从内部开始病毒序列的翻译，并容许从正常的末端起始位点表达外源蛋白编码序列，反之亦然。或者，可从内部转录单位表达外源蛋白，其中该转录单位具有起始位点和聚腺苷酸化作用位置。在另一个实施方案中，将外源基因插入PIV基因内，使得所得的表达蛋白是融合蛋白。
在某些实施方案中，本发明涉及包含本发明病毒的三价疫苗。在具体实施方案中，用于三价疫苗的病毒是嵌合3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒，其含有源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒或禽类肺病毒的第一个异源核苷酸序列，以及源自呼吸道合胞病毒的第二个异源核苷酸序列。在代表性的实施方案中，这类三价疫苗将是对下列有特异性的：(a)人副流感病毒的F基因和HN基因的基因产物；(b)由源自间质肺病毒的异源核苷酸序列编码的蛋白以及(c)由源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列编码的蛋白。在具体实施方案中，第一个异源核苷酸序列是呼吸道合胞病毒的F基因，并将其插入位置1中，而第二个异源核苷酸序列是人间质肺病毒的F基因，并将其插入位置3中。本发明包括多更多的组合，并在表1中举例说明一些。可使用禽类肺病毒的F或G基因的其它组合。此外，也可使用编码嵌合F蛋白的核苷酸序列(参见上文)。在一些较不优选的实施方案中，可将异源核苷酸序列插入病毒基因组的较高编号的位置中。
表1.三价疫苗中所使用病毒异源核苷酸序列排列实例。
在一些其它的实施方案中，可改变在异源序列与下游基因的编码序列起点之间的基因间隔区。例如，在表1中列举的每个基因可具有想要长度的基因间隔区。在代表性的实施方案中，三价疫苗包含b/h PIV3载体，其具有插入位置1处的呼吸道合胞病毒的F基因，改变了的177个核苷酸的基因间隔区(最初是75个核苷酸，至下游N基因起始密码子AUG)，以及插入位置3处的人间质肺病毒的F基因，具有其天然的基因间隔区。本发明包括多更多的组合，因为可根据下文的5.1.2节，操纵每个异源核苷酸序列的插入。
在更广泛的实施方案中，可设计本发明的表达产物和嵌合病毒颗粒，产生对抗各种病原，包括病毒抗原、肿瘤抗原和涉及自体免疫病症的自体抗原的疫苗。一种达成该目的的方式，涉及修饰现存的PIV基因，使其在它个别的外部结构域中，含有外源序列。在异源序列为抗原表位或病原体的抗原时，可使用这些嵌合病毒诱导保护性免疫应答，对抗从其中衍生出这些决定簇的病原。
一种构建这些杂交分子的方法，是将异源核苷酸序列插入PIV基因组，例如hPIV、bPIV或bPIV/hPIV的DNA互补链中，而得以使该异源序列位在病毒聚合酶活性所需的病毒序列，即病毒聚合酶结合位置/启动子的旁侧，在后文中称为病毒聚合酶结合位置，以及聚腺苷酸化作用位置。在优选的实施方案中，该异源编码序列系位在包括5’和3’末端的复制启动子、基因起点和基因结束序列，以及在5’和/或3’末端中发现的包装信号的病毒序列的旁侧。在另一种方法中，可将编码病毒聚合酶结合位置的寡核苷酸，例如病毒基因组断片的3’端或两端的补体，与该异源编码序列连接，构建杂交分子。在标靶序列中放置外源基因或外源基因的断片，从前是通过在标靶序列中出现的适当限制酶位点来指导。然而，最近在分子生物学上的进步，已经大大地减少了该问题。可经由使用指定位置的突变生成作用(例如，参见，例如由Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，82；488描述的技术)，迅速地将限制酶位点放在标靶序列中的任何地方。在下文中描述的在聚合酶链反应(PCR)技术上的改变，亦容许序列(即限制酶位点)的指定插入，并容许轻易地构建杂交分子。或者，可使用PCR反应，制备重组的模板，而不需要克隆。例如，可使用PCR反应，制备含有DNA-指导的RNA聚合酶启动子(例如噬菌体T3、T7或SP6)的双链DNA分子，以及含有异源基因和PIV聚合酶结合位置的杂交序列。然后可从该重组DNA中，直接转录RNA模板。在另一个实施方案中，可通过使用RNA连接酶，使指出异源基因的负极性的RNA与病毒聚合酶结合位置连接，来制备重组的RNA模板。
此外，可在未翻译区域中，在HN基因的3’端加入一或，多个核苷酸，但要遵守“六倍法则”(“Rule of Six”)，所述法则在成功的病毒拯救中可能是很重要的。“六倍法则”应用于许多副粘病毒中并规定RNA核苷酸基因组应被6整除才有功能。完成核苷酸的添加可通过使用本领域已知技术，如使用商品化的诱变试剂盒如QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)。在加入适当数目的核苷酸之后，可通过以适当限制酶消化，并以凝胶纯化，分离出正确的DNA片段，例如hP1 V3F和NH基因的DNA片段。对于可用于本发明的病毒聚合酶活性及构建体的序列要求将在下面章节中进行描述。
不受理论限制，一些参数影响重组病毒复制速率和异源序列表达水平。特别是，异源序列在bPIV、hPIV、b/h PIV中的位置和侧接异源序列的基因间隔区长度决定了复制速率和异源序列表达水平。
在一些实施方案中，相对于野生型病毒，病毒的前导和或尾随序列被修饰。在一些更特定实施方案中，前导和/或尾随序列的长度被改变。在其它实施方案中，相对于野生型病毒，前导和/或尾随序列被突变。
本发明重组病毒的产生依赖于负链病毒RNA(vRNA)基因组部分或全长拷贝或它的互补拷贝(cRNA)的复制。所述vRNA或cRNA能从有感染性的病毒中被分离，通过体外转录产生，或在细胞中通过转染核酸来产生。其次，重组负链病毒的产生依赖于功能聚合酶的复合物。典型地，但于此不受限制地，肺病毒聚合酶复合物由N、P、L和可能的M2蛋白组成。
聚合酶复合物或其组分能从病毒颗粒中分离、从表达一或多种组分的细胞中分离或通过特定表达的载体转染来产生。
当上述提及的vRNA、cRNA或表达这些RNA的载体通过上述提及的聚合酶复合物16被复制时，能获得MPV的有感染力的拷贝(Schnell等人，1994，EMBO J 13：4195-4203；Collins，等人，1995，PNAS92：11563-11567；Hoffmann，等人，2000，PNAS 97：6108-6113；Bridge，等人，1996，PNAS 93：15400-15404；Palese，等人，1996，PNAS 93：11354-11358；Peeters，等人，1999，J.Virol.73：5001-5009；Durbin，等人，1997，Virolo gy 235：323-332)。
本发明提供了一种包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。含有PIV聚合酶组分(但于此不受限制地，估计可能是N、P、L和M2)的质粒或病毒载体在原核细胞中产生，用于在相关细胞型(细菌、昆虫细胞、真核细胞)中表达上述组分。含有PIV基因组全长或部分拷贝的质粒或病毒载体可在原核细胞中产生，用于在体外或体内表达病毒核酸。后者的载体可含有其它的病毒序列，用于产生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可缺失部分的病毒基因组，用于产生复制缺损型病毒，和可含有用于产生减毒型病毒的突变，缺失或插入。
根据上述的本领域技术，通过聚合酶组分的共表达能产生PIV有感染力的拷贝(是野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型)。
此外，可使用短暂或稳定表达一种或多种全长或部分PIV蛋白的真核细胞。这样的细胞可通过转染(蛋白或核酸载体)、感染(病毒载体)或转导(病毒载体)来获得，并且可用于所述野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型病毒的互补。
5.1.1欲插入的异源基因序列
本发明包括设计重组的牛或人副流感病毒，表达一个或多个共源序列，其中该共源序列编码基因产物或基因产物多个异源序列，其中该异源序列编码基因产物或基因产物“片段，其优选是抗原性和/或免疫原性的。当在本文中使用时，术语“抗原性的”意指分子与抗体或MHc分子结合的能力。术语“免疫原性的”意指分子在宿主中产生免疫应答的能力。
在优选的实施方案中，欲插入的异源核苷酸序列源自负链RNA病毒，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒)和禽类肺病毒。在优选的实施方案中，欲插入的异源序列包括，但不限于编码人PIV的F或HN基因、RSV的F基因、A、B或C型流感病毒的HA基因、人MPV的F基因、禽类肺病毒的F基因或其免疫原性和/或抗原片段的序列。
在一些实施方案中，欲插入的异源核苷酸序列源自人间质肺病毒和/或禽类肺病毒。在某些实施方案中，欲插入的异源核苷酸序列源自(a)人间质肺病毒和呼吸道合胞病毒和/或(b)禽类肺病毒和呼吸道合胞病毒。
在本发明某些优选的实施方案中，欲插入的异源核苷酸序列源自得自人间质肺病毒和/或禽类肺病毒的F基因。在某些实施方案中，该F基因源自(a)人间质肺病毒和呼吸道合胞病毒和/或(b)禽类肺病毒和呼吸道合胞病毒。
在本发明的某些实施方案中，欲插入的异源核苷酸序列为源自人间质肺病毒和/或禽类肺病毒的G基因。在某些实施方案中，该G基因源自(a)人间质肺病毒和呼吸道合胞病毒和/或(b)禽类肺病毒和呼吸道合胞病毒。
在某些实施方案中，可将源自人间质肺病毒、禽类肺病毒和呼吸道合胞病毒的不同F基因和/或不同G基因的任何组合，插入本发明的病毒内，其限制条件为在所有的具体实施例中，至少有一个源自人间质肺病毒或禽类肺病毒的异源序列存在于本发明的重组副流感病毒中。
在某些实施方案中，欲插入的核苷酸序列是编码源自人间质肺病毒的F蛋白的核苷酸序列。在某些其它的实施方案中，欲插入的核苷酸序列是编码源自人间质肺病毒的G蛋白的核苷酸序列。在另外的实施方案中，欲插入的核苷酸序列是编码源自禽类肺病毒的F蛋白的核苷酸序列。在其它的实施方案中，欲插入的核苷酸序列是编码源自禽类肺病毒的G蛋白的核苷酸序列。其限制条件为在所有的实施方案中，至少有一个异源核苷酸序列是源自间质肺病毒，欲插入的异源核苷酸序列编码呼吸道合胞病毒的F蛋白或G蛋白。
在某些实施方案中，欲插入的核苷酸序列编码嵌合F蛋白或嵌合G蛋白。嵌合F蛋白包括一部分得自不同病毒的F蛋白，例如人。类间质肺病毒、禽类肺病毒和/或呼吸道合胞病毒。嵌合G蛋白包括一部分得自不同病毒例如人间质肺病毒、禽类肺病毒和/或呼吸道合胞病毒的G蛋白。在具体实施方案中，该F蛋白质包括间质肺病毒的F蛋白的胞外结构域，副流感病毒的F蛋白的跨膜结构域以及副流感病毒的F蛋白的鲁米那结构域。在一些实施方案中，欲插入的核酸编码F蛋白，其中F蛋白的跨膜结构域被删除以表达可溶性F蛋白。
在某些特定的实施方案中，本发明的异源核苷酸序列是SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15中的任一个(参见表16)。在某些特定的实施方案中，该核苷酸序列编码SEQ IDNO：6至SEQ ID NO：13号、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17中任一个的蛋白(参见表16)。在某些特定的实施方案中，该核苷酸序列编码SEQ ID NO：314至389中任一个的蛋白。
至于源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列，参见例如PCT/US98/20230，将其全文以引用的方式引入本文中。
在优选的实施方案中，可在本发明的嵌合病毒内表达的异源基因序列包括但不限于编码病毒的抗原表位和糖蛋白的那些，例如流感病毒的糖蛋白，特别是血凝素H5、H7、呼吸道合胞病毒的抗原表位、新城疫病毒的抗原表位、引起呼吸道疾病的仙台病毒(Sendaivirus)和传染性喉气管炎病毒(ILV)。在最佳的实施方案中，该异源核苷酸序列源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒和/或禽类肺病毒。在本发明另一个实施方案中，可设计成在本发明的嵌合病毒内的异源基因序列，包括但不限于编码病毒抗原表位和病毒糖蛋白，例如B型肝炎病毒表面抗原、爱氏顿病毒的A或C型肝炎病毒的表面糖蛋白、人乳头状瘤病毒、猿病毒5或流行性腮腺炎病毒、西尼罗河病毒(WestNilevirus)、登革病毒(Denguevirus)的糖蛋白、疱疹病毒的糖蛋白、骨髓灰白质炎病毒的VPI以及源自人免疫缺陷病毒(HIV)，优选走第1型或第2型的序列的那些。在另外的实施方案中，可设计成在本发明的嵌合病毒内的异源基因序列，包括但不限于编码马立克氏(Marek′s)病病毒(MDV)的抗原表位、传染性华氏囊炎病毒(1BDV)的抗原表位、鸡贫血病毒、传染性喉气管炎病毒(ILV)、禽类流感病毒(AIV)、狂犬病、猫白血病病毒、犬瘟热病毒、水疱性口炎病毒和猪痘病毒的抗原表位的那些(参见Fields等人(编辑)，1991，FUNDAMENTALVIR010GY，第2版，RaVenPress，NewYork，将其全文以引用的方式引入本文中)。
本发明其它的异源序列，包括编码为自体免疫疾病所特有的抗原的那些。这些抗原通常将源自哺乳动物组织的细胞表面、细胞质、核、粒线体及其类似物，包括糖尿病、多发性硬化症、全身性红斑性狼疮、风湿性关节炎、恶性贫血、Addison’s病、硬皮病、自体免疫萎缩性胃炎、青少年糖尿病和盘状红斑性狼疮所特有的抗原。为过敏原的抗原通常包括蛋白或糖蛋白，包括源自花粉、尘埃、霉、孢子、皮屑、昆虫和食物的抗原。此外，为肿瘤抗原所特有的抗原，：通常将源自肿瘤组织的细胞的表面、细胞质、核、胞器及其类似物。实例包括肿瘤蛋白所特有的抗原，包括由突变的致癌基因编码的蛋白：与肿瘤有关的病毒蛋白：以及糖蛋白。肿瘤包括，但不限于从下列类型的癌症衍生的那些：唇、鼻咽、咽和口腔、食道、胃、结肠、直肠、肝脏、胆囊、胰脏、喉、肺和支气管、皮肤的黑色素瘤、乳房、子宫颈、卵巢、膀胱、肾脏、子宫、脑和神经系统的其它部分、甲状腺、前列腺、睾九、霍奇金氏症、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。
在本发明一个特定的实施方案中，该异源序列源自人免疫缺陷病毒(HIV)，优选人免疫缺陷病毒-1或人免疫缺陷病毒-2的基因组。在本发明其它的实施方案中，可将该异源编码序列插入PIV基因编码序列中，而得以表达在PIV病毒蛋白中，含有该异源肽序列的嵌合基因产物。在本发明的这类实施方案中，该异源序列亦可源自人免疫缺陷病毒，优选是人免疫缺陷病毒-1或人免疫缺陷病毒-2的基因组。
在异源序列为HIV-衍生的案例中，这类序列可包括，但不限于源自env基因(即编码全部或部分gp160、gp120和/或gp41的序列)、pol基因(即编码全部或部分逆转录酶、核酸内切酶、蛋白酶和/或整合酶的序列)、gag基因(即编码全部或部分p7、p6、p55、p17/18、p24/25的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx的序列。
在另一个实施方案中，异源基因序列能被改造引入嵌合病毒中，所述嵌合病毒包括那些编码蛋白具有免疫增强活性的病毒。免疫增强蛋白的例子包括，但不限于细胞因子、1型干扰素，γ-干扰素，集落刺激因子和白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12。
此外，其它异源基因序列可被改造引入嵌合病毒中，包括编码源自细菌的抗原的那些，例如细菌表面糖蛋白、源自真菌的抗原以及源自各种其它病原和寄生虫的抗原。源自细菌病原的异源基因序列的实例包括但不限于编码源自下列属的物种的抗原的那些：沙门氏杆菌属(Salmonella)、志贺杆菌属(Shigella)、衣原体属(Chlamydia)、螺杆菌属(Helicobacter)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、博德氏菌属(Bordatella)、假单孢菌属(Pseudomonas)、奈瑟菌属(Ne“seria)、弧菌属(Vibrio)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、霉浆菌属(Mycoplasma)、链霉菌属(Streptomyces)、密螺旋体属(Treponema)、柯克斯体属(Coxiella)、艾利希体属(Ehrlichia)、布氏杆菌属(Brucella)、链杆菌属(Streptobacillus)、梭菌螺旋体属(Fusospirocheta)、螺菌属(Spirillum)、脲原体属(Ureaplasma)、螺旋体属(Spirochaeta)、霉浆菌属、放线菌属(Actinomycetes)、疏螺旋体属(Borrela)、类杆菌属(Bacteroides)、奇可莫拉菌属(Trichomoras)、布兰汉球菌属(Branhamella)、巴斯德菌属(Pasteurella)、梭状茅胞杆菌属(C10stridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、李士德菌属(listeria)、杆菌属(Bacillus)、丹毒丝菌属(Erysipelothrix)、红球菌属(Rhodococcus)、埃希杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、假单孢菌属、肠杆菌属(Enterobac(er)、沙雷菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、军团杆菌属(Legionella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、变形杆菌属(Proteus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、肠球菌属(Enterococcus)、不动杆菌属(Acinetobacter)、摩根菌属(Morganella)、莫拉菌属(Moraxella)、柠檬酸细菌属(C“robacter)、立克次体属(Ricke“sia)、罗查利马氏体属(Rochlimeae)，以及细菌物种，例如铜绿假单胞菌(P..aeruginosa)、大肠杆菌、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、表皮葡萄球菌(S.epidermis)、粪肠球菌(E.faecalis)、肺炎链球菌(S.pneumonias)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、酿脓链球菌(S.pyogen)、败血性巴斯德杆菌(Pasteurella multocida)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)和奇异变形菌(P.mirabilis)。
源自病原性真菌的异源基因序列的实例，包括但不限于编码源自下列真菌的抗原的那些，例如：新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)；皮炎茅生霉菌(Biastomyces dermatitidis)；皮炎艾洛霉菌(Aiellomyces dermatitidis)；英膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)；粗球霉菌(Coccidioides immitis)；念珠菌属(Candida)物种，包括白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、吉利蒙念珠菌(C.guilliermondii)和克鲁斯念珠菌(C.krusei)，面菌属(Aspergi1lus)物种，包括烟绚菌(A.fumigatus)、黄麹菌(A.flavus)及黑面菌(A.niger)，根霉菌属(Rhizopus)物种：根毛霉菌属(Rhizomucor)物种；克银漠霉属(Cunninghammella)物种；囊托霉菌属(Apophysomyces)物种，包括沙氏囊托霉菌(A.saksenaea)、毛霉菌(A.mucor)和棘子须霉菌(A.absidia)；中克氏孢子丝菌(Sporothrix schenckii)、巴西副球霉菌(Paracoccidioidesbrasiliensis)；波迪假霉样真菌(Pseudallescheria boydii)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)；毛癣菌属(nichophyton)物种、小茅孢菌属(Microsporum)物种和皮癣菌属(Dermatophyres)物种，以及任何目前已知或稍后确认为病原性的其它酵母菌或真菌。
最后，源自寄生虫的异源基因序列的实例，包括但不限于编码源自下列物种的抗原的那些：顶复动物门(Apicomplexa)的成员，例如例如焦虫属(Babesia)、弓浆虫属(Toxoplasma)、疟原虫属(Plasmodium)、艾美球虫属(Eimeria)、等孢球虫属(Isospora)、阿托索浆虫属(Atoxoplasma)、囊等孢球虫属(Cystoisospora)、哈蒙虫属(Hammondia)、贝诺虫属(Besniotia)、肉孢予虫属(Sarcocystis)、福瑞克虫属(Frenkelia)、血变形虫属(HaemOproteus)、白血细胞孢予虫属(Leucocytozoon)、泰勒虫属(Theileria)、普金虫属(Perkinsus)和孢子虫属(Gregarina spp。)：卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carinii)；微孢子门(Microspora)的成员，例如例如小孢予虫属(Nosema)、肠微孢子虫属(Enterocytozoon)、脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon)、赛普塔塔虫属(Septata)、马拉辛凯虫属(Mrazekia)、钝孢子虫属(Amblyospora)、阿美森虫属(Ameson)、格留虫属(G1ugea)、普孢予虫属(Pleistophora)和微孢子属(Microsporidium spp.)；以及奇异孢子虫门(Ascetospora)的成员，例如例如单孢予虫属(Haplosporidiumspp.)，以及包括下列的物种：恶性疟原虫(P1asmo山umfalciparum)、间日疟原虫(P.vivax)、卵形疟原虫(P.ovale)、三日疟原虫(P.malaria)；鼠弓浆虫(Toxoplasma gondii)：墨西哥利什曼原虫(Leishmaniamexicana)、热带利什曼原虫(L.tropica)、硕大利什曼原虫(L.major)、埃塞俄比亚利什曼原虫(L.aethiopica)、杜氏利什曼原虫(L.donovanj)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、布氏锥虫(T.brucei)、曼氏住血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及住血吸虫(S.haematobium)、日本住血吸虫(S.japonium)；旋毛虫(Trichinella spiralis)；班氏吴策丝虫(Wuchereria bancrofti)；马来布鲁线虫(Brugia malayli)；溶组织内阿米巴(Entamoeba hist01ytica)；蛲虫(Enterobius vermiculoarus)；有钩绦虫(Taeniasolium)、无钩绦虫(T.saginata)；阴道滴虫(Trichomonas vaginatis)、人滴虫(Thominis)、口腔毛滴虫(T.tenax)：肠梨形虫  (Giardia lamblia)；短小隐孢予虫(Cryptosporidiumparvum)；卡氏肺孢予虫、牛焦虫(Babesia bovis)、分歧焦虫(B.divergens)、田鼠焦虫(B.microti)、贝氏等孢球虫(Isospora belli)、人焦虫(L.hominis)；脆弱双核阿米巴(Dientamoebafragilis)：人盘尾丝虫(OnchOcerca vOlVUlus)；人蛔虫(Ascarislumbricoides)：美洲钩虫(NecatOr americanis)；十二指肠钩虫(AncylOstomaduodenale)；；粪类圆线虫(StrOngylOidesstercoralis)；菲律宾毛细线虫(Capillariaphilippinensis)；广东血管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)；短小包膜绦虫(Hymenolepis nana)：阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)；细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)、多房型棘球绦虫(E.multilocularis)；卫氏并殖吸虫(Paragonimuswestermani)、卡列并殖吸虫(P.caliensis)；中华后睾吸虫(Chlonorchissinensis)；猫后睾吸虫(Opisthorchis felineas)、维氏腹囊双口吸虫(G.viverini)、肝蛭(Fasciola hepatica)、疥癣虫(Sarcoptes scabiei)、人虱(Pediculus humanus)；阴虱(Phthirluspubis)和人肤蝇(Dermatobiahominis)，以及任何目前已知或稍后确认为病原性的其它寄生虫。
5.1.2.欲插入的间质肺病毒序列
哺乳动物MPV的蛋白。本发明还涉及编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白含有哺乳动物MPV蛋白质或其片段以及一种或多种非源自哺乳动物MPV的蛋白质。在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白质含有哺乳动物MPV蛋白质或其片段以及一种肽标签，例如，但不限于一种聚组氨酸标签。本发明进一步还涉及融合蛋白，其中所述融合蛋白含有哺乳动物MPV蛋白质或其片段以及一种或多种非源自哺乳动物MPV的肽或蛋白质。本发明还涉及编码哺乳动物MPV蛋白质的核酸的衍生物。本发明还涉及哺乳动物MPV蛋白质的衍生物。衍生物可以是，但不限于，该蛋白的突变形式，例如，但不限于添加、缺失、截短、取代和反转。衍生物还可以是哺乳动物MPV蛋白质的嵌合形式，其中所述蛋白的至少1个结构域源自不同的蛋白质。衍生物还可以是哺乳动物MPV蛋白质与另一分子如药物共价或非共价连接的一种形式。
名为NL/1/00(又名00-1)的病毒分离株是哺乳动物MPV变种A1，其基因组序列如SEQ ID NO：95所示。名为NL/17/00的病毒分离株是哺乳动物MPV的变种A2，其基因组序列如SEQ ID NO：96所示。名为NL/1/99(又名99-1)的病毒分离株是哺乳动物MPV的变种B1，基因组序列如SEQ ID NO：94所示。名为NL/1/94的病毒分离株是哺乳动物MPV的变种B2，基因组序列如SEQ ID NO：97所示。本中请公开的一系列序列及其相应的序列编号列于表16。
哺乳动物MPV的蛋白质可以是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白M2-2蛋白或其片段。哺乳动物MPV蛋白质的片段的长度可以为至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少175个氨基酸、至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸、至少300个氨基酸、至少325个氨基酸、至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸、至少450个氨基酸、至少475个氨基酸、至少500个氨基酸、至少750个氨基酸、至少1000个氨基酸、至少1250个氨基酸、至少1500个氨基酸、至少1750个氨基酸、至少2000个氨基酸或至少2250个氨基酸。哺乳动物MPV蛋白质的片段的长度可以为至多25个氨基酸、至多50个氨基酸、至多75个氨基酸、至多100个氨基酸、至多125个氨基酸、至多150个氨基酸、至多175个氨基酸、至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸、至多275个氨基酸、至多300个氨基酸、至多325个氨基酸、至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸、至多450个氨基酸、至多475个氨基酸、至多500个氨基酸、至多750个氨基酸、至多1000个氨基酸、至多1250个氨基酸、至多1500个氨基酸、至多1750个氨基酸、至多2000个氨基酸或至多2250个氨基酸。
本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为N蛋白，其中所述N蛋白与哺乳动物MPV的N蛋白，例如SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97(参见表16对这些SEQ ID NO的描述)所示病毒基因组编码的N蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为P蛋白，其中所述P蛋白与哺乳动物MPV的P蛋白，例如SEQ ID NO：94、SEQID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的P蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M蛋白，其中所述M蛋白与哺乳动物MPV的M蛋白，例如SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒组编码的M蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为F蛋白，其中所述F蛋白与哺乳动物MPV的F蛋白，例如SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的F蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白与哺乳动物MPV的M2-1蛋白，例如SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的M2-1蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与哺乳动物MPV的M2-2蛋白，例如SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的M2-2蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为G蛋白，其中所述G蛋白与哺乳动物MPV的G蛋白，例如SEQID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的G蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的任一蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为SH蛋白，其中所述SH蛋白与哺乳动物MPV的SH蛋白，例如SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：96或SEQ ID NO：97所示病毒示基因组编码的SH蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的任一蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为L蛋白，其中所述L蛋白与哺乳动物MPV的L蛋白，例如SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的L蛋白，在系统发育上的相关程度比与APV C型的任一蛋白在系统发育上的相关程度更密切。
在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为N蛋白，其中所述N蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的N蛋白的氨基酸序列(各个N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：366-369所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％，或至少99.5％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为P蛋白，其中所述P蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的P蛋白的氨基酸序列(各个P蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：78-85所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M蛋白，其中所述M蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的M蛋白的氨基酸序列(各个M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：358-361所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为F蛋白，其中所述F蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的F蛋白的氨基酸序列(各个F蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：18-25所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或99.5％的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的M2-1蛋白的氨基酸序列(各个M2-1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：42-49所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与SEQ IDNO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的M2-2蛋白的氨基酸序列(各个M2-2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：50-57所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为G蛋白，其中所述G蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ IDNO：97所示病毒基因组编码的G蛋白的氨基酸序列(各个G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：26-33所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为SH蛋白，其中所述SH蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的SH蛋白的氨基酸序列(各个SH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：86-93所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明的在一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为L蛋白，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQID NO：96或SEQ ID NO：97所示病毒基因组编码的L蛋白的氨基酸序列(各个L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：34-41所示；也参见表16)之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。
哺乳动物MPV蛋白的片段与SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20或SEQ ID NO：21所示的病毒编码的同源性蛋白之间在该蛋白与所述片段同源的那部分具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。在一个具体的范例性实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV F蛋白的片段，其中包括F蛋白的胞外区及其同系物。含有胞外区的哺乳动物MPV F蛋白的片段的同系物与含有SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20或SEQ IDNO：21所示的病毒编码F蛋白胞外区(各个F蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：314-317所示；也参见表16)的相应片段之间具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。
在一些实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的蛋白及其片段。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的N蛋白，其中所述N蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的G蛋白，其中所述G蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的P蛋白，其中所述P蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ IDNO：97所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的M蛋白，其中所述M蛋白与SEQ IDNO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的F蛋白，其中所述F蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与SEQID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的SH蛋白，其中所述SH蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ IDNO：96所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV A亚组的L蛋白，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。
在其它实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的蛋白及其片段。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的N蛋白，其中所述N蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的G蛋白，其中所述G蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的P蛋白，其中所述P蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ IDNO：96所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的M蛋白，其中所述M蛋白与SEQ IDNO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的F蛋白，其中所述F蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与SEQID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的SH蛋白，其中所述SH蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ IDNO：97所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV B亚组的L蛋白，其中所述L蛋白与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：97所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQ ID NO：95或SEQ ID NO：96所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。
本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的G蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的G蛋白(SEQ ID NO：28)之间具有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。在具体的实施方案中，哺乳动物MPV的G蛋白具有SEQ ID NO：119-153所示氨基酸序列。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的N蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的N蛋白(SEQ IDNO：72)之间具有至少98.5％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的P蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的P蛋白(SEQ ID NO：80)之间具有至少96％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的M蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的M蛋白(SEQ ID NO：64)相同。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的F蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的F蛋白(SEQ ID NO：20)之间具有至少99％的序列同一性。在具体的实施方案中，哺乳动物MPV的F蛋白具有SEQ IDNO：248-327所示氨基酸序列。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的M2-1蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的M2-1蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的M2-1蛋白(SEQ ID NO：44)之间具有至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的M2-2蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的M2-2蛋白(SEQ ID NO：52)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的SH蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的SH蛋白(SEQ ID NO：88)之间具有至少83％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B1的L蛋白与变种B1的原型分离株NL/1/99的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种A1的原型分离株NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的L蛋白(SEQ ID NO：36)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。
本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的G蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的G蛋白(SEQ ID NO：26)之间具有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的N蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的N蛋白(SEQ ID NO：70)之间具有至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的P蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的P蛋白(SEQ IDNO：78)之间具有至少96％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的M蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的M蛋白(SEQ IDNO：62)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的F蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的F蛋白(SEQ ID NO：18)之间具有至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M2-1蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的M2-1蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的M2-1蛋白(SEQ ID NO：42)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的M2-2蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的M2-.2蛋白(SEQ ID NO：50)之间具有至少96％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的SH蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的SH蛋白(SEQ ID NO：86)之间具有至少84％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的L蛋白与变种A1的原型分离株NL/1/00的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种A1的L蛋白(SEQ ID NO：34)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。
本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的G蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQ ID NO：27)之间具有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的N蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQ ID NO：71)之间具有至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的P蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQ IDNO：79)之间具有至少96％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的M蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQ ID NO：63)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的F蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQ ID NO：19)之间具有至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-1蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的M2-1蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的M2-1蛋白(SEQ ID NO：43)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQ ID NO：51)之间具有至少96％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQ ID NO：87)之间具有至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的L蛋白与变种A2的原型分离株NL/17/00的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQ ID NO：35)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。
本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的G蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQ ID NO：29)之间具有至少66％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的N蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQ ID NO：73)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的P蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQ ID NO：81)之间具有至少96％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的M蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQ IDNO：65)相同。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的F蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQ ID NO：21)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-1蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的M2-1蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-1蛋白，其中所述M2-1蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的M2-1蛋白(SEQ ID NO：45)之间具有至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQ ID NO：53)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQ IDNO：89)之间具有至少84％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％或至少99.5％的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的L蛋白与变种B2的原型分离株NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离株NL/1/99、变种A1的原型分离株NL/1/00或变种A2的原型分离株NL/17/00的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQ ID NO：37)之间具有至少99％或至少99.5％的序列同一性。
在一些实施方案中，序列同一性的百分比是以蛋白全长比对为基础的。其它实施方案中，序列同一性的百分比是以蛋白的连续氨基酸序列的比对为基础的，其中所述氨基酸序列长度可以为25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。
本发明进一步还提供了源自哺乳动物MPV的核酸序列。本发明还提供了源自哺乳动物MPV的核酸序列的衍生物。一些具体实施方案中，所述核酸经过了修饰。
在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV亚组A的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一个具体实施方案中，哺乳动物MPV的G基因具有SEQ IDNO：98-132所示核苷酸序列。在一个具体实施方案中，哺乳动物MPV的F基因具有SEQID NO：168-247所示核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV亚组B的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种A1的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种A2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种B1的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种B2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。
在一些实施方案中，本发明提供了一种核苷酸序列，该序列与SEQID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示核苷酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的核酸序列与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：96或SEQ ID NO：97所示核苷酸序列的片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性，其中所述片段的长度为至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少1,250个核苷酸、至少1,500个核苷酸、至少1,750个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少2,00个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少12,500或至少15,000个核苷酸。在一个具体实施方案中，本发明的核苷酸序列与SEQ ID NO：98-132；SEQ ID NO：168-247；SEQ ID NO：22-25；SEQ ID NO：30-33；SEQ IDNO：38-41；SEQ ID NO：46-49；SEQ ID NO：54-57；SEQ ID NO：58-61；SEQ ID NO：66-69；SEQ ID NO：74-77；SEQ ID NO：82-85；或SEQ IDNO：90-93所示的核苷酸序列具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或至少99.5％或100％的序列同一性。
本发明的具体实施方案中，本发明的核酸序列能够在低度严格、中度严格或高度严格条件下与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ IDNO：96或SEQ ID NO：97所示的核酸序列杂交。本发明的具体实施方案中，本发明的核酸序列能够在低度严格、中度严格或高度严格条件下与SEQ ID NO：98-132；SEQ ID NO：168-247；SEQ ID NO：22-25；SEQ ID NO：30-33；SEQ ID NO：38-41；SEQ ID NO：46-49；SEQ IDNO：54-57；SEQ ID NO：58-61；SEQ ID NO：66-69；SEQ ID NO：74-77；SEQ ID NO：82-85；或SEQ ID NO：90-93所示的核酸序列杂交。在一些实施方案中，核酸与SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96或SEQ ID NO：97所示的核酸序列杂交部分的长度为至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少1,250个核苷酸、至少1,500个核苷酸、至少1,750个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少2,00个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少12,500个核苷酸或至少15,000个核苷酸。
本发明进一步还提供了抗体以及能特异性结合哺乳动物MPV的蛋白质的抗原-结合片段。本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。具体实施方案中，所述抗体为人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV亚组A的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。一些其它实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV亚组B的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种A1的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。其它实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种A2的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种B1的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。一些其它实施方案中，在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种B2的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-1蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。
5.1.3异源基因序列的插入
在本发明的病毒载体中插入外源基因序列可通过以下方法实现：用异源序列完全取代或部分取代病毒编码区，或在病毒基因组中添加异源核苷酸序列。优选可通过使用PCR指导的突变来实现完全取代。简而言之，PCR引物A含有从5’到3’端：单一限制性内切酶位点，如IIS类限制性内切酶位点(即，“移位”酶；其识别特定序列仅仅切割该序列上游或下游的DNA)；一段与要被取代的基因区互补的核苷酸；和一段与异源序列的羧基末端编码区互补的核苷酸。PCR引物B含有从5’到3’端：单一限制性内切酶位点；一段与要被取代的基因互补的核苷酸；和一段相应于异源或非天然基因5’编码区的核苷酸。在使用这些具有异源或非天然基因克隆拷贝引物的PCR反应后，产物可被切除并使用单一限制性位点克隆。用IIS类内切酶消化和用纯化的噬菌体聚合酶转录，将产生含有携带有异源或非-天然基因插入的病毒基因正确的未翻译末端RNA分子。在另一个实施方案中，PCR引物反应可被用于制备含有噬菌体启动子序列的双链DNA，和使RNA模板能被直接转录而无须克隆的杂交基因序列。
异源核苷酸序列可添加或插入到本发明病毒的不同位置。在一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置1.在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置2。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置3。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置4。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置5。也在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置6。在本文中所用的术语“位置”指异源核苷酸序列在被转录的病毒基因组中的位置，如，位置1表示被转录的第一个基因的位置，和位置2表示被转录的第二个基因的位置。相对于在越高数目位置的插入，在病毒越低数目位置插入的异源核苷酸序列通常会产生越强的异源核苷酸序列表达，其归结于存在于病毒基因组中的转录梯度。然而，转录梯度也产生特定比率的病毒mRNA。外源基因插入将干扰该比率并导致合成不同数量的可能会影响病毒复制的病毒蛋白。因而，当选择插入位置时，转录梯度和复制动力学都要被考虑。例如，在b/h PIV3载体的位置2处插入异源核苷酸序列，产生最佳的异源基因的复制速率和表达程度。如果期望得到强的异源核苷酸序列表达，本发明的优选实施方案是在较低数目位置插入异源核苷酸序列。在一个优选实施方案中，异源序列添加或插入到位置1、2或3中。
当插入异源核苷酸序列到本发明病毒中时，可改变在异源基因编码序列末端和下游基因编码序列起点之间的基因间隔区以达到期望的效果。在本文中所用的术语“基因间隔区”指在一种在基因停止信号和与其连接的下游开放阅读框编码序列的起始密码子(如AUG)之间的核苷酸序列。基因间隔区可以包含基因的非编码区，即在转录起始位点和基因编码序列起始位点(AUG)之间的区域。该非编码区天然存在于一些病毒基因中。该非编码区天然存在于bPIV3 mRNA和其它病毒基因中，在表2中以非限制性实例说明：
表2：bPIV3mRNA的非编码区的长度
  ...CTT[基因起点]...............AUG...
  N               45个核苷酸P               68个核苷酸M               21个核苷酸F               201个核苷酸HN              62个核苷酸L               12个核苷酸b/h RSV F1      10个核苷酸b/h RSV F2      86个核苷酸b/h RSV F1NP-P  83个核苷酸
在许多实施方案中，在异源核苷酸序列和下游基因之间的基因间隔区可彼此独立地被工程改造成具有至少10nt长度，至少20nt长度，至少30nt长度，至少50nt长度，至少75nt长度，至少100nt长度，至少125nt长度，至少150nt长度，至少175nt长度或至少200nt长度。在一些实施方案中，在异源核苷酸序列和下游基因之间的基因间隔区可彼此独立地被工程改造成具有至多10nt长度，至多20nt长度，至多30nt长度，至多50nt长度，至多75nt长度，至多100nt长度，至多125nt长度，至多150nt长度，至多175nt长度或至多200nt长度。在一些实施方案中，病毒基因组中期望基因的非编码区也可彼此独立地被工程改造成具有至少10nt长度，至少20nt长度，至少30nt长度，至少50nt长度，至少75nt长度，至少100nt长度，至少125nt长度，至少150nt长度，至少175nt长度或至少200nt长度。在一些实施方案中，病毒基因组中期望基因的非编码区也可彼此独立地被工程改造成具有至多10nt长度，至多20nt长度，至多30nt长度，至多50nt长度，至多75nt长度，至多100nt长度，至多125nt长度，至多150nt长度，至多175nt长度或至多200nt长度。
当插入异源核苷酸序列时，可合并使用位置和基因间隔区的操纵，以便达到想要的效果。例如，可在选自位置1、2、3、4、5和6的位置，加入或插入异源核苷酸序列，并可改变在异源核苷酸序列与下一个下游基因之间的基因间隔区(参见表3)。在代表性的具体实施例中，将hRSV F基因插入b/h PIV3载体的位置1处，并将在F基因和N基因(即F的下一个下游基因)之间的基因间隔区改为177个核苷酸。本发明包括多更多的组合，并在表3中举例显示其中的一些。
表3.异源核苷酸序列插入方式的例子
Figure S03808914919950506D000581
 a基因间隔区，以核苷酸计算
基于插入异源核苷酸序列的目的(如，具有强免疫原性)，可通过不同指标确定插入位置和插入异源核苷酸序列的基因间隔区长度，包括但不限于，复制动力学和蛋白质或mRNA表达水平，可通过以下非限制性分析实施例测定：噬斑测定，荧光聚焦测定，感染中心测定，转化分析，终点稀释试验，成斑率，电子显微镜，血凝反应，测定病毒酶活性，病毒中和作用，血凝抑制反应，补体结合作用，免疫染色，免疫沉淀和免疫印迹法，酶联免疫吸附测定，核酸检测(如，Souther印迹分析，Northern印迹分析，蛋白印迹分析)，生长曲线，使用报告基因(如，使用一种报告基因，如绿色荧光蛋白(GFP)或增强型绿色荧光蛋白(eGFP)，以同样方式整合到病毒基因组中，通过蛋白表达可观察到感兴趣的异源基因)，或它们的组合。进行这些分析方法的步骤是本领域已知的(参见，如Flint等，PRINCIPLESOF VIROLOGY，MOLECULAR BIOLOGY，PATHOGENESIS，ANDCONTROL，2000，ASM Press pp25-56，文献全文在此引入作为参考)，和下文中实施例部分所给出的非限制性例子。
例如，用本发明病毒感染培养基中细胞，并随后测定蛋白表达水平，通过如，蛋白印迹分析或使用特异于异源序列基因产物抗体的ELISA，或测定RNA表达水平，通过如使用特异于异源序列探针的NORTHERN印迹分析，表达水平可被测定。同样地，通过感染动物模型和测定来自动物模型中本发明重组病毒异源序列蛋白表达水平可测定异源序列的表达水平。通过获得来自感染动物组织样本和然后将该组织样本进行蛋白质印迹分析或使用特异于异源序列基因产物抗体的ELISA可进行蛋白水平测定。此外，如果使用动物模型，通过任何本领域技术人员已知技术可测定产生自动物抗异源基因产物抗体的浓度，包括但不限于ELISA。
当异源序列可能与病毒基因组中的核苷酸序列同源时，应注意探针和抗体要真正特异于异源序列或其基因产物。
在一些特定实施方案中，通过任何本领域技术人员已知技术可测定来自嵌合b/h PIV3 RSV或b/h PIV3 hMPV或b/h PIV3 RSV F和hMPV F的RSV或hMPV F-蛋白的表达水平。通过用本发明的嵌合病毒感染培养基中的细胞和测定蛋白表达水平，通过如蛋白质印迹分析或使用特异于hMPV的F-蛋白和/或G-蛋白的抗体的ELISA，或通过例如Northern印迹分析，使用对人间质肺病毒的F-基因和/或G-基因特异性探针，测量RNA的表达程度，来确定F-蛋白的表达程度。同样地，可使用动物模型，通过感染动物，并在该动物模型中，测量F-蛋白和/或G-蛋白的含量，来确定该异源序列的表达程度。同样地，使用动物模型，通过感染动物和测定动物模型中的F-蛋白和/或G-蛋白的水平，异源序列的表达水平可被测定。通过获得来自感染动物的组织样本和然后将该组织样本进行蛋白质印迹分析或使用特异于异源序列的F-蛋白和/或G-蛋白的抗体的ELISA可测定蛋白水平。此外，如果使用动物模型，通过任何本领域技术人员已知技术可测定源自动物的抗F-蛋白和/或G-蛋白的抗体滴度，包括但不限于ELISA。
通过任何本领域技术人员已知技术可测定本发明重组病毒的复制速率。
在一些实施方案中，为方便鉴定异源序列在病毒基因组中最佳位置和基因间隔区最佳长度，异源序列编码一个报告基因。一旦确定了最佳参数，即用编码所选择抗原的异源核苷酸序列取代上述报告基因。任何本领域技术人员已知的报告基因都能被用在本发明方法中。更详细内容，见5.5节。
通过任何本领域技术人员已知标准技术可测定重组病毒复制速率。所述复制速率由病毒的生长速率代表和可通过将病毒滴度与感染后时间制图来确定。通过任何本领域技术人员已知技术可测定病毒滴度。在一些实施方案中，含有病毒的悬浮液与病毒易感的细胞孵育。可用于本发明方法的细胞类型包括但不限于，非洲绿猴肾细胞(Verocells)，LLC-MK-2细胞，Hep-2细胞，LF 1043(HEL)细胞，MRC-5细胞，WI-38细胞，tMK细胞，293 T细胞，QT 6细胞，QT 35细胞或鸡胚成纤维细胞(CEF)。在病毒与细胞孵育后，测定感染细胞的数量。一些特定实施方案中，病毒包含报告基因。因而，表达报告基因的细胞数量代表了感染细胞的数量。一个特定实施方案中，病毒包含编码eGFP的异源核苷酸序列，并FACS测定表达eGFP的细胞数量，即被病毒感染的细胞数量。
在一些实施方案中，同样条件下，本发明重组病毒复制速率至多是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的20％。该同样条件指相同的病毒初始滴度、相同的细胞系、相同的孵育温度、生长培养基、细胞数量和其它可能影响复制速率的测试条件。例如，在位置1处具有RSV的F基因的b/h PIV3的复制速率，最多是bPIV3的复制速率的20％
在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒复制速率是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的至多5％，至多10％，至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多80％、至多90％。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒复制速率是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒的复制速率是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的5％-20％、10％-40％、25％-50％、40％-75％、50％-80％或75％-90％。
在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒异源序列表达水平至多是该重组病毒所源自的野生型病毒F-蛋白表达水平的20％。该同样条件指相同的病毒初始滴度、相同的细胞系、相同的孵育温度、生长培养基、细胞数量和其它可能影响复制速率的测试条件。例如，在bPIV3的位置1处，MPV的F-蛋白的异源序列的表达程度，最多是bPIV3的牛F-蛋白的表达程度的20％。
在某些实施方案中，在相同条件下，本发明重组病毒中的异源序列的表达水平是该重组病毒所源自的野生型病毒的F-蛋白表达水平的最多5％、最多10％、最多20％、最多30％、最多40％、最多50％、最多75％、最多80％、最多90％。在某些实施方案中，在相同条件下，本发明重组病毒中的异源序列的表达水平是该重组病毒所源自的野生型病毒的F-蛋白表达水平的至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少75％、至少80％、至少90％。在某些实施方案中，在相同条件下，本发明重组病毒中的异源序列的表达水平是该重组病毒所源自的野生型病毒的F-蛋白表达水平的5％-20％、10％-40％、25％-50％、40％-75％、50％-80％或75％-90％。
5.1.4将异源基因序列插入HN基因内
带来PIV的血凝素和神经氨酸酶活性的蛋白由单一基因HN编码。该HN蛋白是病毒的主要表面糖蛋白。对各种病毒而言，例如副流感病毒，已经显示血凝素和神经氨酸酶蛋白含有许多抗原位置。结果，该蛋白在感染之后，是体液免疫应答的可能标靶。因此，以一部分外源的蛋白替代HN的抗原位置，可提供对抗该外源肽的旺盛的体液反应。若将序列插入HN分子内，并在HN的外表面上表达它，则它是免疫原性的。例如，可用源自HIV的gp160的肽来代替HN蛋白的抗原位置，结果产生对gp160和HN蛋白两者的体液免疫应答。以不同的方法，可将外源的肽序列插入抗原位置内，而不删除任何病毒的序列。这类构建体的表达产物，可用在对抗外源抗原的疫苗中，且确实可规避稍早讨论的问题，即是重组病毒在接种疫苗的宿主中繁殖。仅在抗原位置发生替代的完整HN分子，仍可给予HN功能，并因此容许构建可存活的病毒。因此，该病毒不需添加另外的辅助功能便可生长。亦可以其它方式将该病毒减毒，以避免任何意外脱逸的危险。
可进行其它的杂交构建，在细胞表面表达蛋白或得以从细胞中释放它们。作为表面糖蛋白，HN具有运送至细胞表面所需的氨基末端的可切开信号序列，以及膜锚定所需的羧基末端序列。为了在细胞表面上表达完整的外源蛋白，可能需要使用这些HN信号，产生杂交蛋白。在该情况下，可以与另外的内部启动子分开的融合蛋白形式，来表达该融合蛋白。或者，若只出现运送信号，但缺乏膜固定结构域，则可将蛋白分泌至细胞外。
5.1.5.双顺反子RNA的构建
可构建二顺反予mRNA，容许从内部开始病毒序列的翻译，并容许从正常的末端起始位点表达外源蛋白编码序列。或者，可构建二顺反予mRNA序列，其中从正常末端的开放阅读框翻译病毒序列，而从内部位置开始外源序列。可使用某些内部的核糖体进入位置(1RES)序列。应选择短得足以避免干扰副流感病毒的包装限制的IRES序列。因此，为这类双顺反子方法所选出的IRES，长度优选不超过500个核苷酸，而理想的长度是小于250个核苷酸。在具体实施方案中，该IRES源自小核糖核酸病毒，且不包括任何另外的小核糖核酸病毒的序列。优选的IRES元件包括，但不限于哺乳动物BiP IRES和C型肝炎病毒IRES。
或者，可从新的内部转录单位来表达外源蛋白，其中该转录单位具有起始位点和聚腺苷酸化作用位置。在另一个实施方案中，将外源基因插入PIV基因内，使得所得的表达蛋白为融合蛋白。
5.2.使用重组cDNA和RNA模板表达异源基因产物
可使用按照上述制备的重组模板，以各种方式在适当的宿主细胞中，表达异源基因产物，或产生表达该异源基因产物的嵌合病毒。在一个实施方案中，可使用重组的cDNA，转染适当的宿主细胞，而所得的RNA可以指导该异源基因产物以高水平表达。提供高水平表达的宿主细胞系统包括供给病毒功能的连续细胞系，例如以PIV重复感染的细胞系、工程改造以补充PIV功能的细胞系等等。
在本发明另一个实施方案中，可使用重组模板，转染表达病毒聚合酶蛋白的细胞系，以便达成该异源基因产物的表达。为了这个目的，可利用表达聚合酶蛋白，例如L蛋白的转化细胞系，作为适当的宿主细胞。可以类似的方式工程改造宿主细胞，提供其它的病毒功能，或另外的功能，例如HN、NP或N。
在其它的实施方案中，辅助病毒可提供由细胞利用的RNA聚合酶蛋白，以便达成该异源基因产物的表达。在另一个实施方案中，可利用编码病毒蛋白，例如N或NP、P和L蛋白的载体，转染细胞。
可使用不同的技术，检测异源基因产物的表达(参见，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY，MOLECULAR BIOLOGY，PATHOGENESIS，AND CONTROL，2000，ASM Press第25-56页，将其全文引入本文以供参考)。在示例测定中，利用甲醇或丙酮，使以病毒感染的细胞变成可透过的，并与抗该异源基因产物的抗体一起培养。然后加入识别第一个抗体的第二个抗体。该第二个抗体通常与指示剂缀合，而得以用肉眼看到或检测出该异源基因产物的表达。
5.3.拯救重组的病毒颗粒
为了制备嵌合病毒，可使用编码PIV基因组和/或外源蛋白的修饰的cDNA、病毒RNA或RNA，以正义或负义转染提供复制和拯救所需的病毒蛋白和功能的细胞。或者，可在通过编码PIV基因组和/或外源蛋白的DNA或RNA分子转染之前、期间或之后，以辅助病毒转染细胞。可通过几种本领域技术人员已知的技术，例如在以下文献中描述的技术在传染性病毒颗粒内复制并拯救合成的重组质粒PIV DNA和RNA：1992年11月24日出版的美国专利5,166,057；1998年12月29日出版的美国专利5,854,037；1996年2月20日出版的欧洲专利出版物EP 0702085A1；美国专利申请09/152,845；1997年4月3日出版的国际专利出版物PCT WO 97/12032；1996年11月7日出版的WO 96/34625；欧洲专利出版物EP-A 780475；1999年1月21日出版的WO 99/02657；1998年11月26日出版的WO 98/53078；1998年1月22日出版的WO 98/02530；1999年4月1日出版的WO99/15672；1998年4月2日出版的WO 98/13501；1997年2月20日出版的WO 97/06270；和1997年6月25日出版的EPO 780 47SA1，其中任一文献全文在此引入作为参考。
在本发明的一个实施方案中，可制备合成的重组病毒RNA，其含有由病毒聚合酶识别，以及产生成熟病毒颗粒所需的包装信号所必要的负链病毒RNA的非编码区。可使用许多不同的方法，将反向遗传法应用在拯救负链RNA病毒上。首先，从重组的DNA模板中合成重组的RNA，并在体外利用经过纯化的病毒聚合酶复合物重建，形成重组的核糖核蛋白(RNP)，可用它来转染细胞。在另一种方法中，若在体外或在体内，在合成RNA的转录期间出现病毒的聚合酶蛋白，则达成更有效的转染。利用该方法，可从cDNA质粒转录合成的RNA，其在体外与编码聚合酶蛋白的cDNA质粒共转录，或在体内，在聚合酶蛋白的存在下转录，即在暂时性或组成性地表达聚合酶蛋白的细胞中。
在本文描述的其它方法中，可在表达PIV病毒聚合酶蛋白的宿主细胞系统中(例如在病毒/宿主细胞表达系统中；在工程改造成表达聚合酶蛋白的转化的细胞系中等等)复制有传染性的嵌合病毒的产生，而得以拯救有传染性的嵌合病毒。在该例子中，不需使用辅助病毒，因为通过所表达的病毒聚合酶蛋白提供了该功能。
根据本发明，可使用任何本领域技术人员已知的技术，达成嵌合病毒的复制和拯救。一种方法涉及在转染宿主细胞之前，在体外供应复制所需的病毒蛋白和功能。在这类的实施方案中，可以野生型病毒、辅助病毒、经过纯化的病毒蛋白，或以重组表达的病毒蛋白的形式，提供病毒蛋白。可在编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA的转录之前、期间或之后，提供病毒蛋白。可使用整个混合物来转染宿i细胞。在另一种方法中，可在编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA的转录之前或期间，提供复制所需的病毒蛋白和功能。在这类的实施方案中，可以野生型病毒、辅助病毒、病毒草取物、合成的cDNA或RNA，其经由感染或转染导入宿主细胞内，来表达病毒蛋白的形式，提供病毒蛋白。该感染/转染是在导入编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA之前，或与其同时发生。
在特别理想的方法中，工程改造细胞使其表达PIV病毒的所有基因，结果可能产生有传染性的嵌合病毒，其含有想要的基因型；因此排除了对选择系统的需求。在理论上，可利用外源序列代替编码PIV的结构蛋白的六个基因中的任一个，或六个基因中任一个的一部分。然而，该取代的必要部分是繁殖有缺陷的病毒的能力(因为缺失或改变正常的病毒基因产物而变成有缺陷的)。可利用许多可能的方法，规避该问题。在一种方法中，可使具有突变蛋白的病毒生长细胞系中，将该细胞系构建成，或使其组成性地表达相同蛋白的野生型版本。以此方式，使该细胞系补充了病毒中的突变。可使用类似的技术，构建转化的细胞系，使其组成性地表达任何的PIV基因。可使用这些能够表达病毒蛋白的细胞系，补充在重组病毒中的缺陷，并由此繁殖它。或者，可利用某些天然的宿主排列系统，来繁殖重组的病毒。
在另一个实施方案中，复制所需的病毒蛋白和功能可以作为合成cDNA或RNA形式的遗传材料来供应，使其与编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA共转录。在一种特定期望的方法中，表达嵌合病毒和病毒聚合酶和/或其它病毒功能的质粒共转录入宿主细胞中。例如，可将编码野生型或修饰的基因组或反基因组PIV RNA的质粒与编码PIV病毒聚合酶蛋白NP或N、P、M2-1或L的质粒共转染到宿主细胞内。或者，可通过使用编码T7 RNA聚合酶的修饰的痘苗病毒安卡拉(Modified Vaccinia Virus Ankara)(MVA)或MVA与编码聚合酶蛋白(N、P和L)的质粒的组合，实现嵌合b/h PIV3病毒的拯救。例如，可将MVA-T7或禽类Pox-T7感染导Vero细胞、LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF 1043(HEL)细胞、tMK细胞、LLC-MK2、HUT 292、FRHL-2(恒河猴)、FCL-1(绿猴)、WI-38(人)、MRC-5(人)细胞、293T细胞、QT 6细胞、QT 35细胞和CEF细胞内。在用MVA感染之后，可将全长的反基因组b/h PIV3 cDNA与编码NP、P和L的表达质粒一起转染到HeLa或Vero细胞内。然后可收获细胞和细胞上清液，并接受单次的冷冻-融解。然后可使用所得的细胞溶胞产物，在1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(araC)，一种痘苗病毒的复制抑制剂的存在下，感染新鲜的HeLa或Vero细胞单层，产生病毒原种。然后从这些培养平板中收获上清液和细胞，冷冻-融解一次，并通过病毒噬斑的免疫染色，使用PIV3特异性抗血清检测bPIV3病毒颗粒的存在。
在其它繁殖重组病毒的方法，可能涉及与野生型病毒共同培养。这可通过简单地取得重组的病毒，并以该病毒和其它野生型病毒(优选是疫苗株)共同-感染细胞来进行。野生型病毒应该补充有缺陷的病毒基因产物，并容许野生型和重组病毒两者生长。或者，可使用辅助病毒，供应重组病毒的繁殖。
在另一种方法中，可在以表达PIV病毒聚合酶蛋白的重组病毒共感染的细胞中，复制合成的模板。事实上，可使用该方法，根据本发明来拯救重组有传染性的病毒。为了这个目的，可在任何表达载体/宿主细胞系统，包括但不限于病毒表达载体(例如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒等等)，或表达聚合酶蛋白的细胞系中，表达PIV聚合酶蛋白(参见，例如Krystal等人，1986，PrOc.Natl.Acad.Sci，USA83：2709-2713)。再者，表达所有六个PIV蛋白的宿主细胞的感染，可能导致有传染性的嵌合病毒颗粒的产生。请注意有可能构建不改变病毒存活力的重组病毒。这些经过改变的病毒将能够生长，且不需辅助功能便可复制。
5.4.重组病毒的减毒
可进一步以遗传方式工程改造本发明的重组病毒，以便表达出减毒的表型。特别是在将其施用作为疫苗的病毒的个体中，本发明的重组病毒表达出减毒的表型。可通过任何本领域技术人员已知的方法，完成减毒作用。不受缚于理论，例如，可通过在特定的宿主中，使用自然不能完美复制的病毒(例如在人中使用牛PIV3载体)，或通过相对于病毒的野生型株，降低病毒基因组的复制、降低病毒感染宿主细胞的能力，或降低病毒蛋白装配成有传染性的病毒颗粒的能力，而引起重组病毒的减毒表型。可使用小基因组(minigenome)测定(参见5.5.1章节)，测试病毒某些序列的存活力。
可通过任何本领域技术人员已知的方法(参见，例如5.5章节)，来测试本发明重组病毒的减毒表型。例如，可测试一种候选病毒感染宿主能力或在细胞培养系统中复制速率。在一些实施方案中，当改变的基因是N、P、L、M2或它们的组合时，用小基因组系统测试减毒病毒。在一些实施方案中，用不同温度下的生长曲线测试病毒减毒表型。例如，一种减毒病毒能在35℃下生长，但在39℃或40℃下无法生长。在一些实施方案中，用不同细胞系评估病毒减毒表型。例如，一种减毒病毒仅在猴细胞系中生长，而无法在人细胞系中生长，或对于减毒病毒而言，在不同细胞系中可达到的病毒滴度是不同的。在一些实施方案中，在小动物模型包括但不限于仓鼠、棉鼠、小鼠和豚鼠呼吸道中的病毒复制被用于评估病毒减毒表型。在其它实施方案中，病毒诱导的免疫响应，包括但不限于抗体滴度(如通过噬斑减小中和分析或ELISA测定)被用于评估病毒减毒表型。在特定实施方案中，在低剂量下进行噬斑减小中和分析或ELISA。在一些实施方案中，可测定重组病毒在动物模型中诱导病症能力。重组病毒在动物模型中诱导病症能力的降低意味着其是减毒型。在一个特定实施方案中，在猴模型中进行候选病毒鼻感染测试，通过产生的粘液来指示。
可将本发明的病毒减毒，而使得一个或多个病毒的功能特征受损。在某些实施方案中，与从其中衍生该减毒病毒的病毒的野生型株相比较，来测量减毒作用。在其它的实施方案中，通过比较减毒病毒在不同宿主系统中的生长，来确定减毒作用。因此，对于非限制性的实例，与牛PIV3在牛宿主中的生长相比较，若降低了牛PIV3在人宿主中的生长，便将在人宿主中生长的牛PIV3称为减毒的。
在某些实施方案中，本发明的减毒病毒能够感染宿，能够在宿主中复制，而得以产生有传染性的病毒颗粒。然而，与野生型株相比较，减毒的株生长至较低的滴度，或生长得更慢。可使用任何本领域技术人员已知的技术，确定减毒病毒的生长曲线，并将其与野生型病毒的生长曲线相比较。关于代表性的方法，参见下文的实施例章节。在具体实施方案中，减毒的病毒在所述条件下，在Vero细胞中，生长至低于105pfu/毫升、低于104pfu/毫升、低于103pfu/毫升或低于102pfu/毫升的滴度。
在某些实施方案中，本发明的减毒病毒(例如嵌合PIV3)在人细胞中不能象野生型病毒(例如野生型PIV3)一样好地复制。然而，减毒的病毒能够在缺乏干扰素功能的细胞系，例如Vero细胞中良好地复制。
在其它实施方案中，本发明的减毒病毒能够感染宿在宿主中复制，并使本发明的病毒的蛋白插入细胞质膜内，但减毒病毒不能使宿主产生新的有传染性的病毒颗粒。在某些实施方案中，减毒病毒以与野生型哺乳动物病毒相同的效力，感染宿主、在宿主中复制，并使病毒蛋白插入宿主的细胞质膜内。在其它的实施方案中，与野生型病毒相比较，减毒病毒降低了使待插入细胞质膜内的病毒蛋白进入宿主细胞内的能力。在某些实施方案中，与野生型病毒相比较，减毒病毒降低了在宿主中复制的能力。可使用任何本领域技术人员已知的技术，确定病毒是否能够感染哺乳动物细胞、在宿主内复制，并使病毒蛋白插入宿主的细胞质膜内。关于示例性的方法，参见5.5节。
在某些实施方案中，本发明的减毒病毒能够感染宿主。然而，与野生型PIV相反，减毒的PIV不能在宿主中复制。在具体实施方案中，减毒的哺乳动物病毒可感染宿主，并可使宿将病毒蛋白插入其细胞质膜内，但减毒病毒不能在宿主中复制。可使用任何本领域技术人员已知的方法，测试减毒病毒是否感染宿主细胞，并使宿主将病毒蛋白插入其细胞质膜内。
在某些实施方案中，与野生型病毒感染相同宿主的能力相比，减毒的哺乳动物病毒降低了感染宿主的能力。可使用任何本领域技术人员已知的技术，确定病毒是否能够感染宿主。关于示例性的方法，参见5.5章节。
在某些实施方案中，将突变(例如错义突变)导入病毒的基因组内，产生具有减毒表型的病毒。可将突变(例如错义突变)导入重组病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因内。突变可以是添加、取代、缺失或它们的组合。一个特定实施方案中，单氨基酸缺失突变导入N、P、L或M2蛋白，其在小基因组分析系统中被功能性地筛选出并被评估在病毒中具有预计的功能。在更特定实施方案中，错义突变是冷敏感突变。在其它实施方案中，错义突变是热敏感突变。在一个实施方案中，病毒P蛋白的主要磷酸化位点被除去。在另一个实施方案中，单一突变或多突变导入病毒L基因中以产生温度敏感型菌株。也在另一个实施方案中，通过切除不发生或发生效率非常低的这样一种方式，F基因剪切位点被突变。
在其他实施方案中，缺失导入重组病毒的基因组中。在更特定实施方案中，缺失可导入重组病毒N基因，P基因，M基因，F基因，M2基因，SH基因，G基因或L基因。在特定实施方案中，缺失发生在本发明重组病毒M2基因中。在其它特定实施方案中，缺失发生在本发明重组病毒SH基因中。也在另一个特定实施方案中，M2基因和SH基因都被缺失。
在一些实施方案中，重组病毒基因间隔区被改变。在一个实施方案中，基因间隔区长度被改变。参见5.1.2章节关于示例性实施例。在其它实施方案中，间隔区从病毒基因组的5’末端被移动到3’末端。
在其它实施方案中，重组病毒单个基因或多个基因在基因组中的位置被改变。在一个实施方案中，F或G基因被移动到基因组3’末端。在另一个实施方案中，N基因被移动到基因组5’末端。
在某些实施方案中，通过以不同物种的病毒的基因代替野生型病毒的基因，实现病毒的减毒作用。在示例性的实施方案中，可利用hPIV3的N-基因、P-基因、F-基因、M2-单因、M2-1-基因、M2-2-基因、SH-基因、HN-基因或L-基因，分别代替bPIV3的N-基因、P-基因、F-基因、M2-单因、M2-1-基因、M2-2-基因、SH-基因、HN-基因或L-基因。在其它示例性的实施方案中，可利用bPIV3的N-基因、P-基因、F-基因、M2-单因、M2-1-基因、M2-2-基因、SH-基因、HN-基因或L-基因分别代替hPIV3的N-基因、P-基因、F-基因、M2-单因、M2-1-基因、M2-2-基因、SH-基因、HN-基因或L-基因。在一个优选实施方案中，通过用不同种类的病毒基因取代一个或多个聚合酶相关基因(例如N、P、L或M2)可达到病毒减毒的目的。
在一些实施方案中，通过用源自不同种类病毒的相应蛋白的结构域取代野生型病毒蛋白的一个或多个特殊结构域可达到病毒减毒的目的。在一个范例的实施方案中，bPIV3 F蛋白的胞外结构域被间质肺病毒F蛋白的胞外结构域取代。在一个优选的实施方案中，L、N或P蛋白的一个或多个特殊结构域被源自不同种类病毒的相应蛋白的结构域取代。在一些另外的实施方案中，通过缺失野生型病毒蛋白的一个或多个特殊结构域可达到病毒减毒的目的。在另一个特定实施方案中，缺失F蛋白的跨膜结构域，这样可表达可溶性F蛋白。
在本发明的一些实施方案中，本发明重组病毒的前导和/或尾随序列可被修饰以得到减毒表型。在一些更特定实施方案中，前导和/或尾随序列的长度相对与野生型病毒减少了至少1个核苷酸，至少2个核苷酸，至少3个核苷酸，至少4个核苷酸，至少5个核苷酸或至少6个核苷酸。在一些另外更特定实施方案中，重组病毒的前导和/或尾随序列被突变。在一个特定实施方案中，前导和尾随序列彼此是100％互补。在其它实施方案中，前导和尾随序列相互之间有1个核苷酸，2个核苷酸，3个核苷酸，4个核苷酸，5个核苷酸，6个核苷酸，7个核苷酸，8个核苷酸，9个核苷酸，或10个核苷酸不互补，其中前导和尾随序列中其余核苷酸是互补的。在一些实施方案中，非互补的核苷酸彼此相同。在一些其它的实施方案中，非互补的核苷酸相互不同。在其它实施方案中，如果尾随序列中非互补核苷酸是嘌呤，前导序列中相应核苷酸也是嘌呤。在另一个实施方案中，如果尾随序列中非互补核苷酸是嘧啶，前导序列中的相应的核苷酸也是嘌呤。
当使用活的减毒疫苗时，也必须考虑其安全性。该疫苗不能导致疾病。任何本领域已知的可使疫苗安全的技术可用于本发明中。除减毒技术外，可使用其它技术。一个非限制性例子是使用可溶性异源基因，所述异源基因无法被整合入病毒颗粒膜中。例如，使用可溶性RSVF基因单拷贝，一种缺乏跨膜和胞质结构域的RSV基因类型。因为其无法被整合入病毒颗粒膜中，预计病毒嗜性不改变。
许多分析方法可用于测试疫苗的安全性。参见下文5.5节。具体而言，蔗糖梯度和中和试验可用于测试安全性。蔗糖梯度试验可用于测定异源蛋白是否插入到病毒颗粒中。若异源蛋白插入到病毒颗粒中，该病毒颗粒应测试出具有致病能力，即使其亲本菌株无法致病。不受理论限制，如果异源蛋白整合入病毒粒中，该病毒可获得新的，病理上可能的特性。
5.5.测量嵌合病毒的病毒滴度、抗原序列的表达、免疫原性及其它特征
根据本发明内容，许多方法可用于测定嵌合或重组病毒在细胞培养系统、动物模型或在个体中的生长速率。根据本发明内容，许多方法也可用于确定嵌合或重组病毒达到感染、复制和病毒颗粒包装目的所必需的条件。
本文中所述方法可用于全程分析病毒滴度以测定病毒生长特性，一个特定实施方案中，通过获得源自被感染细胞或被感染个体样本，制备一系列样本稀释物，并在能出现单噬斑的病毒稀释度下，感染对病毒易感的单层细胞，可测定病毒滴度。然后，噬斑计数且病毒滴度可表示为每毫升样本的噬斑形成单位。本发明一个特定实施方案中，根据抗个体体中病毒抗体滴度估计本发明个体体中病毒生长速率。不受理论限制，个体体中抗体滴度不但包括个体体中病毒滴度而且还包括抗原性。如果病毒抗原性不变，个体体中增加的抗体滴度可用于测定个体体中病毒生长曲线。在一个优选实施方案中，动物或人体中病毒生长速率最好的测定方法是通过在感染前的多时间点在宿主中取样生物液体并测定病毒滴度。
通过任何本领域技术人员已知技术可测定细胞培养系统或个体中异源基因序列表达量。在一些实施方案中，异源基因表达可通过定量转录水平来测定。通过分别使用特异于转录物的探针或引物的NORTHERN印迹或RT-PCR可测定转录水平。因为病毒是反义方向而转录物是有义方向，所以转录物可区别于病毒基因组。在一些实施方案中，异源基因表达可通过定量异源基因蛋白产物水平来测定。通过使用特异于该蛋白抗体的蛋白质印迹分析可测定蛋白水平。
在一个特定实施方案中，异源基因被标记一个肽标记。所述肽标记可用抗该肽标记的抗体检测。检测的肽标记水平代表异源基因表达蛋白的水平。可替代地，由于具有肽标记的优点，异源基因表达蛋白可被分离。纯化蛋白的数量与异源基因的表达水平相关。所述肽标记和结合有所述一个肽标记的蛋白的分离方法在本领域中众所周知。本领域中已知许多肽标记可用于修饰异源基因，例如，但不限于免疫球蛋白恒定区，多组氨酸序列(Petty，1996，Metal-chelate affinitychromatography，in Current Protocols in Molecular Biology，1-3卷(1994-1998).Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kunston，R.E.，Moore，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.和Struhl，K编.John Wiley and sons，Inc，USA，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience出版.)，谷胱甘肽S-转移酶(GST；Smith，1993，Methods Mol.Cell Bio.4：220-229)，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(Guan等，1987，Gene 67：21-30)，不同的纤维素结合域(美国专利5,496,934；5,202,247；5,137,819；Tomme等，1994，Protein Eng.7：117-123)，和FLAG表位(Short Protocols in MolecularBiology，1999，Ed.Ausubel等.，John Wiley & Sons，Inc.，Unit 10.11)等。通过特定的结合伴侣，其它的肽标记被识别，并因而有利于通过与结合伴侣的结合被亲和分离，该结合伴侣优选固定化的和/或在固体载体上。本领域中那些技术人员能意识到许多方法可用于获得上述肽标记的编码区，包括但不限于，DNA克隆，DNA扩增，和合成的方法。一些肽标记和用于检测及分离它们的试剂可从市场上购买到。
源自个体的样本可通过任何本领域技术人员已知方法获得。在一些实施方案中，该样本由鼻抽吸物，咽拭子，痰或支气管肺泡灌洗液组成。
5.5.1小基因组构建体
可产生含有一个反义报告基因的小复制子构建物。任何本领域技术人员已知的报告基因都可用于本发明。在一个特定实施方案中，报告基因是CAT。在一些实施方案中，报告基因可侧接在连接有肝炎δ核酶(Hep-d Ribo)和T7聚合酶终止(T-T7)信号的负义bPIV或hPIV前导序列上，和位于T7 RNA聚合酶启动子后面的bPIV或hPIV尾随序列上。
在一些实施方案中，编码小复制子的质粒转染入宿主细胞中。所述宿主细胞表达T7 RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因。在一些实施方案中，编码T7 RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的质粒转染宿主细胞。在其他实施方案中，编码小复制子的质粒转染入宿主细胞中并用辅助病毒转染该宿主细胞。
通过任何本领域技术人员已知方法可测定报告基因表达水平和/或其活性，例如，但不限于在5.5.6节中所述的方法。
在一些更特定实施方案中，小复制子包含如下元件，按顺序列出：T7 RNA聚合酶或RNA聚合酶I，前导序列，基因起点(gene start)，GFP，尾随序列，肝炎δ核酶或RNA聚合酶I终止序列。如果T7被用作为RNA聚合酶，肝炎δ核酶序列应被用作为终止序列.如果RNA聚合酶I被使用，RNA聚合酶I终止序列可被用作为终止信号。依赖于拯救系统，小复制子序列可以是有义或反义方向。在一些实施方案中，相对于本发明病毒的野生型前导序列，该前导序列可被修饰。任选地，前导序列可位于AC之后。T7启动子序列可结合或不结合G偶联体或三联体，其中G偶联体或三联体提供了增加的转录活性。
在一个特定实施方案中，用本发明病毒在T0感染细胞。24小时后，在T24，用小复制子构建物转染该细胞。T0的48小时后和T0的72小时后，测试该细胞报告基因的表达。如果使用荧光报告基因产物(如GFP)，可使用FACS测定报告基因的表达。
在另一个实施方案中，用六个质粒在T＝0小时转染一个细胞。然后，在T＝40小时和T＝60小时收获细胞并分析CAT或GFO表达。
在另一个特定实施方案中，用MVA-T7在T0感染细胞。1小时后，在T1，用小复制子构建物转染该细胞。T0的24小时后，用hMPV感染该细胞。T0的72小时后，测试该细胞报告基因的表达。如果使用荧光报告基因产物(例如GFP)，可使用FACS测定报告基因的表达。
5.5.2.测量感染速率的发生率
可通过任何本领域中已熟知的方法，确定感染的发生率，包括但不限于针对感染的存在，测试临床样本(例如鼻抹拭物)，例如，可通过免疫萤光测定(IFA)，分别使用抗-hMPV-抗原抗体、抗-RSV-抗原抗体、抗-hPIV-抗原抗体，和/或对异源核苷酸序列的基因产物的特异性抗体，来检测hMPV、RSV、hPIV或bPIV/hPIV组分。
在一些实施方案中，含有完整细胞的样本可直接被处理，而分离的无完整细胞的样本首先应在容许的细胞系(permissive cell line)上培养(如，HEp-2细胞)。一个范例实施方案中，培养的细胞悬浮物应通过离心清除，如在室温以300xg离心5分钟，接着在同样条件下用PBS，pH 7.4(无Ca++和Mg++)洗涤。细胞沉淀在小体积的PBS中再悬浮用于透析。含有完整细胞的初步临床分离物与PBS混合并在室温300xg条件下离心5分钟。用无菌吸液管从分界面除去粘液，并在同样条件下，再次用PBS洗涤细胞沉淀。然后，沉淀再悬浮在小体积PBS中用于透析。5到10微升的每种细胞悬液点在丙酮洗涤的12孔HTC超硬载玻片的每个5mm孔中并在空气中干燥。载玻片在冷(-20℃)丙酮中固定10分钟。室温下孵育10分钟后，添加PBS-1％BSA到每个孔中封闭反应。载玻片在PBS-0.1％Tween-20中洗涤3次并在空气中干燥。向每孔中滴入10微升用封闭缓冲液稀释至250ng/ml的各种第一抗体试剂，在37℃湿润环境孵育30分钟进行反应。然后，换液3次用PBS-0.1％Tween-20彻底洗涤载玻片，并在空气中干燥。10微升在封闭缓冲液中被稀释到250ng/ml的适当的第二缀合抗体(secondary conjugated antibody)试剂分别点在每个孔中并在潮湿的37℃环境中孵育额外30分钟进行反应。然后，交替使用PBS-0.1％Tween-20洗涤载玻片3次。5微升的PBS-50％甘油-10mM Tris pH8.0-1mM EDTA点在每个反应孔中，并在载玻片上盖上盖玻片。随后通过荧光显微镜在200x倍下使用B-2A滤光器(EX 450-490nm)分析每个反应孔。阳性反应不同于源自未染色的细胞或用第二试剂单独染色的细胞的自身荧光背景。RSV阳性可通过被感染细胞质中小包涵体特有的亮荧光标记被鉴定。
5.5.3.测量血清滴度
可通过任何本领域众所周知的方法测定抗体血清滴度，例如但不限于，可通过夹心酶联免疫分析来定量血清样本中的抗体或抗体片段的数量。简而言之，ELISA包括用识别血清中抗体或抗体片段的抗体在4℃下包被微滴定板过夜。然后，该滴定板用PBS-Tween-0.5％BSA在室温下封闭大约30分钟。使用在PBS-TWEEN-BSA中稀释的纯化的抗体或抗体片段构建标准曲线，和样本在PBS-BSA中稀释。样本和标准品被加到分析滴定板的两个孔中并在室温下孵育大约1小时。接下来，用PBS-TWEEN洗去没有结合的抗体和结合的抗体用标记的第二抗体(如与辣根过氧化物酶连接的山羊抗人IgG)在室温下处理大约1小时。通过添加特异于标记物的显色底物和如，通过分光光度计测定底物转化率的方法，可检测标记抗体的结合。通过在一些稀释物中比较底物对样本的转化率和底物对标准曲线的转化率可测定血清中抗体或抗体片段的浓度水平。
5.5.4.攻毒试验
使用该测定来确定本发明的重组病毒和本发明的疫苗，在动物模型系统，包括棉鼠、叙利亚黄金仓鼠和Balb/c老鼠中，预防下呼吸道病毒感染的能力。可通过静脉内(IV)途径、通过肌内(IM)途径或通过鼻内途径(IN)，施用该重组病毒和/或疫苗。可通过任何本领域技术人员已熟知的技术，施用该重组病毒和/或疫苗。该试验也可用于分析抗体血清浓度与该抗体所结合病毒的肺滴度减小之间的相互关系。
在第0天，通过肌内注射，通过静脉内注射或通过鼻内途径，用目的重组病毒或疫苗或BSA接种动物组，包括但不限于棉鼠(棉鼠(Sigmodonhispidis)，平均重100克)和仓鼠(例如叙利亚黄金仓鼠)。在施用本发明的重组病毒或疫苗之前、同时或之后，以野生型病毒感染动物，其中该野生型病毒是针对其产生疫苗的病毒。在某些实施方案中，在施用本发明的重组病毒和/或疫苗之后至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周或至少4周，以野生型病毒感染动物。在优选的实施方案中，在施用本发明的重组病毒和/或疫苗之后21天，以野生型病毒感染动物。在另一个优选的实施方案中，在施用本发明的重组病毒和/或疫苗之后28天，以野生型病毒感染动物。
在感染之后，将动物杀死，并收获它们鼻部的鼻甲组织和/或肺组织，再通过适当的测定，例如噬斑测定和TCID50测定，来确定病毒滴度。可使用牛血清白蛋白(BSA)10毫克/公斤作为阴性对照组。可使用夹层ELISA，确定在攻毒时，在血清中的抗体浓度。
5.5.5临床试验
可进一步在正常健康的人志愿者组别中，包括所有年龄的组别中，就其安全性、耐受性、免疫原性、传染性和药物动力学，评估已经在体外测定和动物模型中测试过的本发明的疫苗或其片段。在优选的实施方案中，健康的人志愿者是大约6周大的婴儿，或较大的儿童和成人。以经鼻、肌内、静脉内的方式，或通过肺递送系统，将单一剂量的本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗施用志愿者。在6至60个月龄的血清阴性的儿童中，可能需要多个剂量的本发明的病毒和/或疫苗。在生命中前6个月，利激局部和全身免疫力，并克服母体抗体的中和作用，亦可能需要多个剂量的本发明的病毒和/或疫苗。在优选的实施方案中，使用在2、4和6周龄时的最初剂量摄生法，以及在生命第二年开始时的补强剂量。可单独或与在相当年龄时所建议的小儿科疫苗一起，施用本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗。
在优选的实施方案中，使用双盲随机的、安慰剂-对照的临床试验。在具体实施方案中，使用电脑产生的随机计昼。例如，将在研究中的每个个体登记为单一的单位，并指派独特的案号。为了登记的目的，将个别处理在一个家族中的多个个体。在研究期间，将仍使患者/监护人、个体和研究者不知道个体己被分配到那一个处理组。将由不知处理组分配的实验室人员来进行血清学和病毒学的研究。然而，预期在接种疫苗之后，从鼻洗涤液中获得痘苗病毒的分离，将可能使病毒学实验室的人员确认疫苗。将血清学和病毒学的人员分开，并将避免血清学组获得任何培养结果的知识。
优选在接受本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗之前，先监测每个志愿者至少12小时，并在临床处接受给药之后，将监测每个志愿者至少15分钟。然后在给药后第1-14、21、28、35、42、49和56天，以门诊病患的方式监测志愿者。在优选的实施方案中，在每次接种疫苗之后的第1个月，以门诊病患的方式监测志愿者。在整个试验期间，将报告与所有疫苗有关的严重不利事件。将严重不利的事件定义为1)导致死亡，2)立刻威胁生命的，3)导致永久或实际上的无能，4)导致患者住院，或延长现正住院的患者的住院期间，5)导致先天异常，6)是癌症或7)是研究疫苗药量过多的结果的事件。在第一次接种疫苗的当天(第0天)开始报告与疫苗无关的严重不利事件，并持续至最后一次接种疫苗之后30天。在最后一次接种疫苗之后的30天报告期间之后5至8个月，将不再报告与疫苗无关的严重不利事件。在先前的剂量之后，若儿童有与疫苗有关的严重不利事件，将不再给予疫苗/安慰剂的给药。并未将任何不利事件视为是与疫苗有关的，但若担心，将在决定进行另一次给药之前，由临床研究监测者与医疗监测者先进行讨论。
以下列之间隔：(1)在施用本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗的给药之前：(2)在施用本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗的给药期间；(3)在施用本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗的给药之后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时以及(4)在施用本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗的给药之后3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天，经由留置套管或直接静脉穿刺(例如，通过使用10毫升红盖的真空采血管)，收集血液样本。在具体实施方案中，获得总共5次抽血(各3-5毫升)，分别在施用疫苗或安慰剂的第一次、第三次和补强给药之前，以及在第三次给药和补强给药之后大约1个月。容许样本在室温下凝固，并在离心之后收集血清。
针对抗本发明病毒的株一特异性血清血凝素抑制作用(HA1)抗体含量，测试血清。亦测试其它免疫原性的指示剂，例如IgG、IgA或中和抗体。可测量对一个或多个其它同时给予的疫苗的血清抗体反应。可通过ELISA定量在得自患者的样本中，对抗本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗所产生的抗体含量。
通过从在施用本发明的重组病毒和/或本发明的疫苗的给药之后，在每个收集间隔处的血清含量，减去给药前的血清含量(背景含量)，修正在志愿者血清中的抗体含量的浓度。对每个志愿者，根据模式·独立性方法(Gibal山等人，编辑，1982，PharmacOkinetics，第2版，MarcelDekker，NewYork)，从经过修正的血清抗体或抗体片段浓度，计算药物动力学参数。
培养在每次施用疫苗/安慰剂之后大约2、3、4、5、6、7或8天时获得的鼻洗涤液，检测本发明的痘苗病毒的排毒。在优选的实施方案中，培养在每次施用疫苗/安慰剂之后7天时获得的鼻洗涤液。亦使用鼻咽抹拭物、咽喉抹拭物或鼻洗涤液，确定在志愿者中，在研究期间的任何时间，在医学上伴随著发烧疾病(直肠温度大于或等于102。F)，和/或喉炎、支气管炎或肺炎而至的其它病毒的存在。将样本放在乾冰上运送至指定的研究场所。使用分离和定量本发明的痘苗病毒的测定，以及使用MAb来确认本发明的痘苗病毒的免疫染色测定(在下文的实例章节中，提供这类测定的实例)。可针对其它的病毒和免疫应答，包括IgG、IgA和中和抗体，测试鼻洗涤液的样本。
5.5.6报告基因
在某些实施方案中，本发明的方法可使用在组织培养或在动物模型中测定报告基因表达的测定。将报告基因的核苷酸序列克隆到病毒内，例如bPIV、hPIV或b/h PIV3，其中(i)改变报告基因的位置，和(ii)改变位于报告基因旁侧的基因间隔区的长度。测试不同的组合，确定报告基因表达的最佳速率以及包括该报告基因的病毒的最佳复制速率。
在某些实施方案中，产生包含报告基因的小基因组构建体。在5.5.1节中描述了小基因组构建体的构建。
可通过任何本领域技术人员已知的技术，确定报告基因产物的丰富性。这类技术包括，但不限于Northern印迹分析或Western印迹分析，分别使用对该报告基因有特异性的探针或抗体。
在某些实施方案中，报告基因发出在FACS中可被检测到的荧光信号。FACS可用于检测表达报告基因的细胞。
除非另有说明，用于解决本发明具体问题的技术将包括，分子生物学、微生物学和重组DNA操作和生产的常规技术，本领域技术人员可熟练地操作上述技术。参见，如，Sambrook等，Molecular cloning，a laboratory manual，second ed.，vol.1-3.(Cold Spring HarborLaboratory，1989)，A Laboratory Manual，Second Edition；DNACloning，Volumes I and II(Glover，Ed.1985)；和Transcription andTranslation(Hames & Higgins，Eds.1 984)。
报告基因产物的生化活性代表报告基因的表达水平。报告基因活性的总水平也依赖于本发明重组病毒的复制速率。因而，要测定报告基因在重组病毒中的实际表达水平，应把总的表达水平除以在细胞培养物中的或在动物模型中的重组病毒的滴度。
可用于本发明方法的报告基因包括但不限于列在如下表4中的基因：
表4：报告基因及其各自报告基因产物的生化性质
Figure S03808914919950506D000781
大量的报告基因可通过，尤其是蛋白质印迹或NORTHERN印迹或任何其它用于定量核苷酸序列转录、其mRNA其蛋白的丰度的技术被测定(参见，Short Protocols in Molecular Biology，Ausubel等，(编辑)，John Wiley & Sons，Inc.，4thedition，1999)。在一些实施方案中，报告基因产物的活性被测定作为来自重组病毒的报告基因表达的示值读数。报告基因产物的生化性质可用于定量报告基因产物的活性(参见，表1)。用于测定报告基因产物生化活性的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的。可用于本发明方法的范例的报告基因的更详细描述见下文。
虫萤光素酶
虫萤光素酶是在氧和底物(虫萤光素)存在下发光的酶，并已经在细胞培养、个别细胞、整个生物和基因转质的生物中，用于基因表达的真-时、低-光显影(由Greer & Szalay，2002，Luminescence 17(1)：43-74回顾)。
当在本文中使用时，关于本发明所使用的“虫萤光素酶”一词，企图包括所有的虫萤光素酶，或源自具有虫萤光素酶活性的虫萤光素酶的重组酶。已经完全定出得自萤火虫的虫萤光素酶基因的特征，例如得自萤火虫属(Photinus)和丝角萤属(Luciola)的物种(参见，例如国际专利公开案第WO 95/25798号的北美萤火虫(Photinus pyralis)，欧洲专利申请案第EP 0 524 448号的十字丝角萤(Luciola cruciata)和侧丝角萤(Luciola lateralis)，以及Devine等人，1993，Biochim.Biophys.Acta 1173(2)：121-132的明格里卡丝角萤(Luciol amingrelica).其它真核生物的虫萤光素酶基因包括，但不限于海三色堇(sea panzy)(海三色堇(Renilla renifOrmis)，参见，例如Lorenz等人，1991，Proc Natl AcadScius A 88(10)：4438-4442)，以及无翅萤火虫(无翅萤火虫(Lampyrisnocti1uca)，参见，例如Sula-Newby等人，1996，Biochem J.313：761-767)。细菌的虫萤光素-虫萤光素酶系统包括但不限于陆生萤光光杆菌(Photorhabdus luminescens)的细菌lux基因(参见，例如，Manukhov等人，2000，Genetika 36(3)：322-30)，和海洋细菌费氏弧菌(vibrio fischeri)和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)(分别参见，例如Miyamoto等人，1988，J Biol Chem.263(26)：13393-9和Cohn等人，1983，ProcNatl Acad Sci USA.，80(1)：120-3)。本发明所包括的虫萤光素酶亦包含在Squirrell等人的美国专利6,265,177号中描述的突变体虫萤光素酶，将其全文以引用的方式引入本文中。
绿萤光蛋白
(“GFP”)是238个氨基酸的蛋白，其中氨基酸65至67涉及发色团的形成，不需另外的底物或辅因子来发出萤光(参见，例如Prasher等人，1992，Gene 111：229-233；Yang等人，1996，Nature Biotechnol.14：1252-1256和cody等人，1.993，Biochemistry 32：1212-1218)。
当在本文中使用时，关于本发明所使用的“绿萤光蛋白”，或“GFP”一词意欲包括所有的GFPs(包括显示出绿色以外的颜色的各种形式的GFPs)，或源自：具有GFP活性的GFPs的重组酶。从生物发光的水母(水母(Aequorea victoria))中，克隆GFP的天然基因(参见，例如Moin等人，1972，J.Cell Physiol.77：313-318)。野生型GFP在395毫微米处具有主要的激发峰，并在470毫微米处具有次要的激发峰。在470毫微米处的吸光度峰，容许使用标准的萤光素异硫代氰酸酯(F汀C)滤纸组来监测GFP含量。已经发现GFP基因的突燮种，可用来增强表达，并修饰激发和萤光。例如，以丙胺酸、甘胺酸、异亮胺酸或苏胺酸替代在位置65处的丝胺酸的突变体GFPs，结果使突变体GFPs在激发最高点出现位移，并当在488毫微米处激发时，有比野生型蛋白更大的萤光(参见，例如Heim等人，1995，Nature 373：663-664；美国专利5,625,048号；Delagrave等人，1995，Biotechnology 13：151-154；Cormack等人，1996，Gene173：33-38和Cramer等人，1996，NatureBiotechnol.14：315-319)。在488毫微米处激发GFP的能力，容许将GFP用于标准萤光激活细胞分类(“FACS”)设备。在另一个实施方案中，从水母以外的生物中分离GFP，例如但不限于海三色茎，海三色堇。
EGFP是野生型GFP(3-5)的变红变种，为了在哺乳动物细胞中更明亮的萤光和更高的表达，而充分运用它。(最大激发二488毫微米；最大发射＝507毫微米)。EGFP编码GFPmutl，其含有Phe-64至Ieu和Ser-65至Thr的双-氨基酸替代。EGFP基因的编码序列含有超过190个沉默碱基变化，其与人的密码子-使用偏好一致。
β-半乳糖苷酶
β-半乳糖苷酶(“b-gal”)是催化β-半乳糖苷，包括乳糖，以及半乳糖苷类似物邻硝基苯基-b-β-吡喃半乳糖苷(“ONPG”)和氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(“CPRG”)的水解作用的酶(参见，例如Nielsen等人，1983Proc Natl Acad Sci USA 80(17)：5198-5202；Eustice等人，1991，Biotechniques 11：739-742以及Henderson等人，1986，Clin.Chem.32：1637-164)。β-gal基因非常适合作为报告基因，因为其蛋白产物是极稳定的，对于在细胞溶胞产物中的蛋白水解的降解作用有抵抗力，并容易测定。当使用ONPG作为底物时，可利用分光光度计或微量滴定板读取器来定量测定β-gal活性。
当在本文中使用时，关于本发明所使用的术语“β-半乳糖苷酶”或“β-gal”包括所有的β-gal，包括1acZ基因产物，或源自具有β-gal活性的β-gal的重组酶。β-gal基因非常适合作为报告基因，因为其蛋白产物是极稳定的，对于在细胞溶胞产物中的蛋白水解的降解作用有抵抗力，并容易测定。在ONPG为底物的具体实施方案中，可利用分光光度计或微板读数器确定在420毫微米处转化的ONPG的量，来定量确定β-gal活性。在CPRG为底物的实施方案中，可利用分光光度计或微板读数器确定在570至595 nm处转化的CPRG的量，来定量确定β-gal活性。
氯霉素乙酰转移酶
氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)在哺乳动物细胞系统中，经常用来作为报告基因，因为哺乳动物细胞没有可检测的含量的CAT活性。CAT的测定涉及将细胞萃取物与放射性标示的氯霉素和适当辅因子一起培养，通过例如薄层层析法(“TLC”)从产物中分离起始物质，然后是闪烁计数(参见，例如美国专利第5,726,041，将其全文以引用的方式引入本文中)。
当在本文中使用时，关于本发明所使用的术语“氯霉素乙酰转移酶”或“CAT”意欲包括所有CAT，或源自具有CAT活性的CAT的重组酶。虽然优选不需要细胞加工、放射性同位素和层析分离的报告系统，将更可接受高输贯量的筛选，但在报告基因的稳定性极为重要的情况下，以CAT作为报告基因可能是优选的。例如，CAT报告蛋白具有大约50小时的在体内的半衰期，当想要累积对动力学变化类型的结果时，这是有利的。
分泌性碱性磷酸酶
分泌性碱性磷酸酶(“SEAP”)酶是碱性磷酸酶的截短形式，其中蛋白的跨膜结构域的；切开，容许将其从细胞中分泌至周围培养基内。
当在本文中使用时，关于本发明所使用的术语“分泌性碱性磷酸酶”或“SEAP”意欲包括所有的SEAP，或源自具有碱性磷酸酶活性的SEAP的重组酶。可通过各种方法检测SEAP活性，包括但不限于测量萤光底物的催化作用、免疫沉淀法、HPLC和放射检测。发光法是定优选的，因为它增加的敏感性胜过热量检测法。使用SE的优点是不需要细胞溶解步骤，因为SEAP蛋白被分泌到细胞外，其有助于采样和测定程序的自动化。在Potts等人的美国专利6,280,940中描述了以细胞为基础，使用SEAP的测定，可用在C型肝炎病毒蛋白酶抑制剂的以细胞为基础的评估中，将其全文以引用的方式引入本文中。
5.5.7细胞培养系统、胚胎卵和动物模型
可使用本领域中已知的细胞培养系统，繁殖或测试本发明的病毒的活性(参见，例如Flint等人，PRINCIPIES OF VIROLOGY，MOLECULAR BIOLOGY，PATHOGENESIS，AND CONTROL，2000，ASM Press第25-29页，将其全文以引用的方式引入本文中)。这类细胞培养系统的实例，包括但不限于从动物组织制备的原始细胞培养物(例如源自猴肾、人胚胎羊膜、肾脏和包皮以及鸡或老鼠胚胎的细胞培养物)；由单一类型的均一族群所组成的二倍体细胞系，在染色之前可分裂高达100次(例如源自人胚胎的细胞培养物，例如源自人胚胎肺的WI-38株)；以及由单一细胞类型组成的连续细胞系，并可在培养中无限期地繁殖(例如HEp-2细胞、Hela细胞、Vero细胞、L和3T3细胞以及BHK-21细胞)。
也可在鸡胚中繁殖本发明的病毒。在受精后5至14天，在壳上钻孔，并将病毒注射到适合其复制的地方。
在本发明中可使用任何本领域中已知的动物模型，达成各种目的，例如确定本发明的疫苗的效力和安全性。这类动物模型的实例包括，但不限于棉鼠(棉鼠(Sigmodonhispidis))、仓鼠、小鼠、猴子和黑猩猩。在优选的实施方案中，使用叙利亚黄金仓鼠。
5.5.8中和测定
可进行中和测定，提出将异源表面糖蛋白引入病毒颗粒内，是否可能产生改变病毒向性表型的结果的重要安全性争论。当在本文中使用时，术语“向性”意指病毒对特定细胞类型的亲和力。通常通过存在于特定细胞上的细胞受体，来确定向性，其容许病毒侵入并仅限于该特定细胞类型。通过使用异源表面糖蛋白的Mab(非限制性的实例为负链RNA病毒的F蛋白)，或包括对抗该异源表面糖蛋白的抗体的多克隆抗血清，来进行中和测定。测试不同稀释度的抗体，看是否可中和本发明的嵌合病毒。异源表面糖蛋白不应该以足以导致抗体结合和中和作用的量存在于病毒颗粒表面上。
5.5.9蔗糖梯度测定
可通过使用生化测定，进一步研究异源蛋白是否被引入病毒颗粒内的问题。可在20-60％的蔗糖梯度中，分级分离被感染细胞的溶胞产物，收集各种级分，并通过Western印迹法分析异源蛋白和载体蛋白的存在与分布。也可通过噬斑测定，峰值病毒滴度，测定级分和病毒蛋白。在下文第23节中提供了蔗糖梯度测定的实例。当异源蛋白与病毒颗粒结合时，它们将与病毒颗粒一起移动。
5.6.使用嵌合病毒的疫苗制剂
本发明包括含有本发明的经过工程改造的负链RNA病毒的疫苗制剂。可使用本发明的重组PIV病毒，作为表达外源抗原表位的媒介，该抗原表位诱导对任何各种病原的保护性反应。在具体实施方案中，本发明包括在疫苗制剂中使用已经修饰的重组bPIV病毒或减毒的hPIV，赋予抗hPIV感染的保护。
本发明的疫苗制剂包括多价疫苗，包括二价和三价的疫苗制剂。可以一个表达每个异种抗原序列的PIV载体，或二或多个分别编码不同的异种抗原序列的PIV载体的形式，施用本发明的二价和三价疫苗。例如，可将表达一个或多个异种抗原序列的第一个嵌合PIV，与表达一个或多个异种抗原序列的第二个嵌合PIV一起施用，其中在第二个嵌合PIV中的异种抗原序列，与在第一个嵌合PIV中的异种抗原序列不同。在第一和第二个嵌合NV中的异种抗原序列，可源自相同的病毒，但编码不同的蛋白，或源自不同的病毒。在优选的实施方案中，在第一个嵌合PIV中的异种抗原序列，源自呼吸道合胞病毒，而在第二个嵌合PIV中的异种抗原序列，源自人间质肺病毒。在另一个优选的实施方案中，在第一个嵌合PIV中的异种抗原序列，源自呼吸道合胞病毒，而在第二个嵌合PIV中的异种抗原序列，源自禽类肺病毒。
在某些优选的实施方案中，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由负链RNA病毒引起的感染，包括但不限于流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和哺乳动物间质肺病毒(例如人间质肺病毒)。更具体来说，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由人间质肺病毒和/或禽类肺病毒引起的感染。在某些实施方案中，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由(a)人间质肺病毒和呼吸道合胞病毒和/或(b)禽类肺病毒和呼吸道合胞病毒引起的感染。
在一个优选实施方案中，本发明提供了一种由本发明核酸编码的蛋白质样分子或间质肺病毒-特异性病毒蛋白或其功能片段。有用的蛋白质样分子例如源自可得自本发明病毒的任一基因或基因组片段。本申请提供的这类分子或其抗原性片段可用于例如诊断方法或试剂盒以及药物组合物如亚-单位疫苗。尽管F、SH和/或G蛋白或其抗原片段引入作为抗原或亚单位免疫原是特别有用的，但是也可使用灭活的全病毒。特别有用的还有那些由系统发育分析鉴定的重组核酸片段编码的蛋白质样物质，当然优选在可用于系统发育分析鉴定的ORF的优选范围和边界内的那些，特别是能够激发MPV特异性抗体或T细胞应答，无论体内(例如为了保护或者为了提供诊断抗体)还是体外(例如通过噬菌体展示技术或用于制备合成抗体的任一技术)。
含有本发明所述病毒、核酸、蛋白质样分子或其片段、抗原和/或抗体的药物组合物例如可用于治疗或预防MPV感染和/或呼吸道疾病的方法，该方法包括向个体提供本发明的药物组合物。当所述个体是人的时候这是最有用的。特别是所述人的年龄低于5岁时，因为婴幼儿最有可能被本发明提供的人MPV所感染。通常，在急性期患者表现出常见于其它呼吸道疾病及其它疾病的上呼吸道症状。另外，也可能下呼吸道疾病，发生常见于更严重及其它严重病症的。本发明的组合物可以用于治疗免疫受损个体，包括癌症患者、移植接受者及老年人。
本发明还提供了获得可用于治疗呼吸道疾病的抗病毒药物的方法，该方法包括：建立一种含本发明病毒的细胞培养物或实验动物，用候选抗病毒药物治疗所述培养物或动物，测定所述药物对所述病毒或其感染所述培养物或动物的效果。本发明还提供了本发明抗病毒药物用于制备一种药物组合物的用途，具体而言，是用于制备用于治疗呼吸道疾病的药物组合物，特别是因MPV感染或相关疾病引发时，本发明提供了一种含有本发明抗病毒药物的药物组合物，该组合物可用于治疗或预防MPV感染或呼吸道疾病，所述方法包括向个体提供这类药物组合物。
在本发明的一些实施方案中，本发明的疫苗含有本发明定义的哺乳动物间质肺病毒。一些更具体的实施方案中，所述哺乳动物间质肺病毒是人间质肺病毒。在一个优选实施方案中，用于所述疫苗制剂的哺乳动物间质肺病毒具有减毒的表型。获得减毒表型的方法，参见章节5.4。
本发明提供了用于预防和治疗PIV、RSV、APV和/或hMPV感染的疫苗制剂。在一些实施方案中，本发明的疫苗含有本发明所述重组及嵌合病毒。在一些实施方案中，该病毒是减毒的。
在一个具体实施方案中，所述疫苗含有APV，所述疫苗用于预防和治疗人体的hMPV感染。不受理论的限制，由于APV的F蛋白与hMPV的F蛋白高度同源，所以APV感染会导致宿主产生能与hMPV交叉反应的抗体，并保护宿主免受hMPV感染及相关疾病。
在另一具体实施方案中，所述疫苗含有hMPV，该疫苗可用于预防和治疗禽类的APV感染，例如，但不限于火鸡。不受理论的限制，由于APV的F蛋白与hMPV的F蛋白高度同源，所以hMPV感染会导致宿主产生能与APV交叉反应的抗体，并保护宿主免受APV感染及相关疾病。
在某些实施方案中，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由(a)人间质肺病毒和人副流感病毒和/或(b)禽类肺病毒和人副流感病毒引起的感染及相关疾病。
在某些实施方案中，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由(a)人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒和/或(b)禽类肺病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒引起的感染及相关疾病。
在某些实施方案中，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒引起的感染。在某些其它的实施方案中，使用本发明的疫苗制剂，保护对抗由禽类肺病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒引起的感染及相关疾病。
因为在不同病毒物种的F蛋白中的高度同种性，关于代表性的氨基酸序列比较，参见图1，故可使用本发明的疫苗制剂，保护免受与从其中衍生编码F蛋白的异源核苷酸序列的病毒不同的病毒。在特定的代表性实施方案中，该疫苗制剂含有包括源自禽类肺病毒A型的异源核苷酸序列的病毒，并使用该疫苗制剂，保护免受禽类肺病毒A型和禽类肺病毒B型的感染。在另一个特定的代表性实施方案中，该疫苗制剂含有包括源自禽类肺病毒C亚组的异源核苷酸序列的病毒，并使用该疫苗制剂，保护免受禽类肺病毒C亚组和禽类肺病毒D亚组的感染。
本发明包括待施用人和动物的疫苗制剂，其可用来保护对抗PIV、hMPV、APV(包括APV C和APV D)、流感、RSV、仙台病毒、腮腺炎病毒、喉气管炎病毒、猿病毒5、人乳头状瘤病毒以及其它病毒、病原体。本发明更进一步包括待施用人和动物的疫苗制剂，其可用来保护对抗人间质肺病毒感染和禽类肺病毒感染及相关疾病。
在一个实施方案中，本发明涉及可用于抗家养动物致病因子的疫苗制剂，包括狂犬病病毒、猫白血病病毒(FLV)以及犬瘟热病毒。另一实施方案中，本发明涉及可用于提供家畜抗下述病毒保护的疫苗制剂：水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、猪痘病毒，并且保护野生动物抗狂犬病病毒。
在本文中描述的疫苗和医药组合物中，可使用通过反向遗传方法产生的减毒病毒。亦可使用反向遗传技术，为其它对产生疫苗很重要的病毒基因，工程改造另外的突变。例如，在5’非编码区中的突变，可影响mRNA翻译，咸相信在衣壳蛋白中的突变会影响病毒的装配，而热敏性和冷敏性的突变体，通常具有比亲代病毒更低的病原性(参见，例如Flint等人，PRINCIPLES OF VIROLOGY，MOLECUIARBIOLOGY，PATHOGENESIS，ANDCONTROL，2000，ASM Press第670-683页，将其全文以引用的方式引入本文中)可将有用病毒株变种的抗原表位，工程改造在减毒病毒内。或者，可将完全外源的抗原表位，包括源自其它病毒或非病毒病原的抗体工程改造到减毒株内。例如，可将无关的病毒，例如HIV(gp160、gp120、gp41)、寄生虫抗原(例如疟疾)、细菌或真菌抗原，或肿瘤抗原工程改造到减毒株内。或者，可将在体外改变病毒向性的抗原表位工程改造到本发明的嵌合减毒病毒内。
几乎可将任何的异源基因序列构建至本发明的嵌合病毒内，以便在疫苗中使用。优选的是，对任何各种的病原诱导保护性免疫应答的抗原表位，或与中和抗体结合，可由嵌合病毒表达，或为其一部分的抗原。例如，可构建至本发明的嵌合病毒内的异源基因序列，包括但不限于流感和副流感血凝素-神经氨酸酶，以及融合糖蛋白，例如人PIV3的HN和F基因。在另一个实施方案中，可工程改造在嵌合病毒内的异源基因序列，包括编码具有免疫强化活性的蛋白的那些。免疫强化蛋白的实例包括，但不限于细胞因子、干扰素第1型、γ干扰素、集落刺激因子、介白素-1、-2、-4、-5、6、-12。
此外，可被构建至本发明的嵌合病毒内，并在疫苗中使用的异源基因序列，包括但不限于源自人免疫缺陷病毒(HIV)，优选是第1或第2型的序列。在优选的实施方案中，免疫原性的HIV-衍生肽，可以是构建至嵌合PIV内的抗原的来源，然后用它来诱导脊椎动物的免疫应答。这类HIV-衍生的.肽，可包括但不限于源自env基因(即编码全部或部分gp160、gp120和/或gp416的序列)、pol基因(即编码全部或部分逆转录酶、核酸内切酶、蛋白酶和/或整合酶白勺序歹)、gag基因(即编码全部或部分p7、p6、p55、p17/18、p24/25的序列)、tat、rev、nef、vif、vpu、vpr和/或vpx序列。
其它的异源序列可源自B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)；A或C型肝炎病毒表面抗原、爱氏顿病毒的糖蛋白：人乳头状瘤病毒的糖蛋白；呼吸道合胞病毒、副流感病毒、仙台病毒、猿病毒5或腮腺炎病毒的糖蛋白；流感病毒的糖蛋白：疱疹病毒的糖蛋白；骨髓灰白质炎病毒的VP1；诸如细菌和寄生虫的类非-病毒性病原的抗原表位，此外还有很多。在另一个实施方案中，可表达全部或部分的免疫球蛋白基因。例如，可将模仿这类抗原表位的抗遗传性型的免疫球蛋白的可变区构建至本发明的嵌合病毒内。
其它的异源序列可源自肿瘤抗原，并可使用所得的嵌合病毒产生对抗该肿瘤细胞的免疫应答，导致肿瘤在体内退化。为了治疗肿瘤，这些疫苗可与其它治疗摄生法并用，包括但不限于化学治疗、辐射治疗、手术、骨髓移植等等。根据本发明，可工程改造重组病毒，表达与肿瘤有关的抗原(TAAs)，包括但不限于由T细胞识别的人肿瘤抗原(RObbinS和KaWakami，1996，CUrr.Opin.工mmUn018：628-636，将其全文以引用的方式引入本文中)、黑色素细胞系统的蛋白，包括gp100、MART-1/MelanA、TRP-1(gp75)、酪氨酸酶；肿瘤特异性广泛共享的抗原，MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、N-乙酰葡萄糖氨基转移酶-V、p15；肿瘤特异性突变抗原，a-凯特宁(a-catenin：)、MUM-1、CDK-4；乳房、卵巢、子宫颈和胰脏癌的非黑色素瘤抗原、HER-2/neu、人乳头状瘤病毒-E6、-E7、MUC-1。
在其它实施方案中，异源核苷酸序列源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒和/或禽类肺病毒。在另外的实施方案中，本发明的病毒含有两个不同的异源核苷酸序列，其中一个源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒及或禽类肺病毒，而另一个源自呼吸道合胞病毒。异源核苷酸序列编码个别病毒的F蛋白或G蛋白。在具体实施方案中，异源核苷酸序列编码嵌合F蛋白，其中该嵌合F蛋白含有间质肺病毒的F蛋白的胞外结构域以及副流感病毒的F蛋白的跨膜结构域和鲁米那结构域。
可配制活的重组病毒疫苗或失活的重组病毒疫苗。活疫苗可能是优选的，因为在宿主中增殖，导致与在自然感染时所发生的刺激类似种类和大小的延长刺激，并因此赋予实质上长期-持续的免疫力。可使用涉及在细胞培养物或在鸡胚的尿囊中繁殖病毒的传统方法，然后纯化，完成这类活重组病毒疫苗制剂的产生。另外，已经证实bPIV在人中是非-病原，陆的，该病毒极适合用来作为活疫苗。
关于这一点，为了疫苗而使用遗传工程改造的PIV(载体)，可能希望在这些株中，有减毒特征的存在。将适当的突变(例如删除)导入用来转染的模板中，可提供具有减毒特征的新颖病毒。例如，可将与感温性或冷适应性有关的特定误义突变，做成删除突变。这些突变应该比与冷感或热感突变体有关的点突变更稳定，且逆转的频率应该很低。
或者，亦可构建具有”自杀”特征的嵌合病毒。这类病毒在宿i内将仅完成一次，或数次复制。当用来作为疫苗时，重组的病毒将完成有限回合的复制，并引起足够程度的免疫应答，但它将不会在人宿主中进一步运转，并引起疾病。缺乏一个或多个PIV基因，或持有突变PIV基因的重组病毒，将不能经历成功的连续复制。可在永久表达这类基因的细胞系中，产生有缺陷的病毒。缺乏必要基因的病毒将在这些细胞中复制，然而，当施用人宿主时，它们将不能完成一回合的复制。这类制品可转录和翻译-在该不成熟的回合中-足够数目的基因，而诱导免疫应答。或者，可施用较大量的株，使这些制品得以作为失活的(杀死的)病毒疫苗。关于失活的疫苗，优选是以病毒组份的形式来表达异源基因产物，使基因产物得以与病毒颗粒结合。这类制品的优点是它们含有天然蛋白，且未经历通过福马林或其它用来制造死毒疫苗的制剂处理的失活作用。或者，可将由cDNA制造的突变PIV高度减毒，使其仅可复制数回合。
在一些实施方案中，本发明的疫苗含有减毒的病毒。不受缚于理论，所述减毒病毒可以用作疫苗，即使该减毒病毒不能使得细胞生成新的感染性病毒颗粒，因为病毒蛋白插入了宿主胞质膜内因而激发了免疫应答。
在本发明这一方面的另一实施方案中，可以通过常规技术“杀死”嵌合病毒制备出灭活的疫苗制剂。灭活疫苗是“死的”，即他们的感染活性已被破坏。理想的，病毒的感染活性被破坏但不影响其免疫原性。为了制备灭活疫苗，可以用细胞培养基或鸡胚的尿囊培养嵌合病毒，通过区带超速离心纯化，用甲醛或β-丙内酯灭活，然后存储起来。得到的疫苗通常通过肌肉内接种。
为了增强免疫应答可以用合适的佐剂配制灭活的病毒。所述佐剂包括但不限于矿物胶，例如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子；肽；油乳化剂；以及潜在有效人用佐剂，如BCG、小棒状杆菌、ISCOMS及病毒体。
许多方法可用于导入上述疫苗制剂，这些方法包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、以及鼻内和吸入途径。优选通过制疫苗用病原体自然感染途径导入嵌合病毒疫苗。
在一些实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物。所述免疫原性组合物含有嵌合PIV。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物含有减毒的嵌合PIV。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物进一步还含有药物学可接受载体。
可使用各种技术来评估根据本发明的疫苗的效力和安全。有效的疫苗是通过引起适当天生的细胞和体液反应，保护接种疫苗的个体免受病原引起的疾病，并具有最低副作用的疫苗。疫苗不得引起疾病。可使用任何能够测量病毒的复制，以及接种疫苗的个体的免疫应答的技术，来评估病毒。在下文的实例章节中提供非限制性的实例。
5.6.1剂量方案、给药和制剂
本发明提供了疫苗和免疫原性制剂，包括表达一个或多个异源或非天然抗原序列的嵌合PIV。本发明的疫苗或免疫原性制剂，包括一价或多价的疫苗，包括二价和三价的疫苗。本发明的疫苗或免疫原制剂，可用来提供对抗各种病毒感染的保护。具体来说，本发明的疫苗或免疫原制剂提供宿主对抗呼吸道感染的保护。
可单独或与其它疫苗一起施用本发明的重组病毒和/或疫苗或免疫原制剂。优选的是，与其它提供对抗呼吸道疾病的保护的疫苗或免疫原制剂，一起施用本发明的疫苗或免疫原制剂，例如但不限于呼吸道合胞病毒疫苗、流感疫苗、肺炎球菌疫苗、立克次体疫苗、葡萄球菌疫苗、百日咳疫苗或对抗呼吸道癌症的疫苗。在优选的实施方案中，本发明的病毒和/或疫苗可与在相符年龄建议的小儿科疫苗同时施用。例如，在2、4或6个月龄时，本发明的病毒和/或疫苗可与DtaP(IM)、Hib(IM)、Polio(IPV或OPV)和B型肝炎(IM)同施用。在12或15个月龄时，本发明的病毒和/或疫苗可与Hib(IM)、Polio(IPV或OPV)、MMRII(SubQ)；Varivax
Figure S03808914919950506D000902
(SubQ)和B型肝炎(IM)同时施用。能与本发明方法使用的疫苗的综述见各种公开文献，例如，The JordanReport 2000，Division of Microbiology and Infectious Diseases，National Institute of Allergy and Infectious Diseases，NationalInstitutes of Health，United States，在此引入作为参考。
本发明的疫苗或免疫制剂可以其本来形式或者以药物或治疗组合物的形式施用给个体。含有佐剂和本发明免疫原性抗原(例如，病毒、嵌合病毒、突变病毒)的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸剂、磨碎、乳化、包囊、包载或冷冻加工制备而成。可以用一种或多种有助于将本发明免疫原性抗原制成药用制剂的生理学可接受载体、稀释剂、赋形剂或辅剂以常规方式配制药物组合物。合适制剂形式依所选施用形式而定。
当本发明的疫苗或免疫原性组合物含有佐剂或与一种或多种佐剂一起使用时，可用的佐剂包括但不限于无机盐或无机盐凝胶佐剂、微粒佐剂、粘膜佐剂以及免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝凝胶、氟氏完全佐剂、氟氏不完全佐剂、角鲨烯或角鲨烷水包油佐剂制剂、生物级及生物相容性聚酯、聚合脂质体、三萜系化合物配糖或皂角苷(例如，QuilA和QS-21，也以商标名STIMULON，ISCOPREP出售)、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(Threonyl-MDP，以商标TERMURTIDE销售)，LPS，单磷酰脂质A(3D-MLA，以商标MPL销售)。
本发明疫苗或免疫原性组合物的施用对象优选为哺乳动物，最优选为人，但也可以为非-人哺乳动物，，包括但不限于，灵长类、牛、马、绵羊、猪、禽类(例如鸡、火鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和啮齿类。
许多方法可用于导入本发明的疫苗或免疫组合物，这些方法包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、鼻内和吸入途径，以及经由刮擦给药(使用例如分叉针头刮擦皮肤上层)。
对于局部施用而言，本发明的疫苗或免疫原性制剂可配制成溶液、凝胶、软膏、乳液、悬液等，这些都已为本领域所熟知。
对于通过鼻内或吸入施用而言，本发明用的制剂可以通过增压装置或喷雾器以气溶胶形式方便地递送，使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。就增压气溶胶而言，剂量单位可以由提供递送计算量的真空管来测定。胶囊及药包，例如吸入器或吹药器用的凝胶可以配制含有由混合物和合适粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。
就注射而言，所述疫苗或免疫原性制剂可以配制成含水溶液，优选生理相容缓冲液如Hanks′s溶液、林格溶液或生理盐水缓冲液。所述溶液可以含有制剂化的药物，如悬浮、稳定和/或分散的药物。替代地，所述蛋白可以是粉末，在使用前用与合适载体配制，例如，无热原的灭菌水。
本领域技术人员有能力确定给药用的疫苗或免疫原制剂的有效量，特别是根据在本文中提供的详细揭示内容。
有效量起初可以通过体外试验来测定。例如，可以用本领域熟知的技术计算出在动物模型实现诱导免疫应答的量。本领域普通技术人员可以很容易地根据本发明描述的结果优化施用。剂量和给药间隔也可以根据个体作出调整。例如，当作为免疫原性组合物使用时，合适剂量就是当按照上述方法施用时能够激发抗体应答的组合物的量。当用作疫苗时，本发明的疫苗或免疫原性制剂可以在1-36周期间给与1-3份的量。优选地，施用1-2份的剂量，间隔为约2周-约4周，加强接种可以随后定期进行。也可以使用适合动物个体的其它方法。合适剂量是当按照上述方法施用时能够激发被免疫动物免疫应答足以保护该动物至少4-12个月免受感染的组合物的量。通常，剂量中的抗原量为约1pg-约100mg/kg宿主，常用为约10pg-约1mg，优选约100pg-约1μg。合适剂量因注射途径及患者的大小而定，但是通常为约0.1mL-约5mL。
在一具体实施方案中，本发明的病毒和/或疫苗施用的初始剂量为至少103 TCID50，至少104 TCID50，至少105 TCID50，至少106 TCID50。另一具体实施方案中，本发明的病毒和/或疫苗以多剂量方式施用。一个优选实施方案中，在2、4及6月龄时首次接种，然后在出生后第二年的年初加强免疫。更优选地，在多剂量接种方案中每一剂量为至少105 CID50或至少106 TCID50。在临床试验中，可使用病毒的复制速率作为调整疫苗剂量的指标。例如，可使用测试病毒复制速率的测定(例如生长曲线，关于可利用的测定，参见5.5节)，比较本发明的病毒和/或疫苗的复制速率与bPIV3的复制速率，bPIV3的复制速率是在先前的研究中确定的(参见clements等人，J.clin.Microbiol 29：1175-82(1991)；Karron等人，J.Infect.Dis.171：1107-14(1995)；Karron等人，Ped.Inf.Dis.J.5：650-654(1996)。这些研究显示牛PIV3疫苗通常是安全的，并为健康的人志愿者所能完全忍受的，包括成人、6-60个月龄的儿童以及2-6个月龄的婴儿。在这些研究中，个体接受至少一个剂量从103 TCID50至106 TCID50的bPIV3疫苗。12个儿童改而接受两个剂量的105 TCID50的PIV3疫苗代替一个剂量，没有不利的影响)。可与bPIV3相当的复制速率，暗示在临床试验中可使用相差不大的剂量。与bPIV3相比较，较低的复制速率暗示可使用较高的剂量。
5.6.1.1攻毒试验
该试验用于测定本发明重组病毒及本发明疫苗预防动物模型系统下呼吸道病毒感染的能力，例如，但不限于棉鼠或仓鼠。所述重组病毒和/或疫苗可通过静脉内(IV)途径、肌肉内(IM)途径或鼻内(IN)途径施用。所述重组病毒和/或疫苗可通过本领域任一熟知技术施用。该试验也可用于分析抗体血清浓度与该抗体所结合病毒的肺滴度减小之间的相互关系。
在第0天时，向动物组，例如但不限于棉鼠(Sigmodon hispidi，平均体重100g)和食蟹猴(cynomolgous macacque)(平均体重2.0kg)，施用目的重组或嵌合病毒或疫苗或者BSA，通过静脉内注射或鼻内途径。在施用本发明重组病毒或疫苗之前、同时或者之后，使动物感染野生型病毒，其中所述野生型病毒是制备疫苗所用的病毒。在一些实施方案中，用野生型病毒感染所述动物是在施用了本发明重组病毒和/或疫苗后至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天、1周或者1或多个月。
感染后，宰杀棉鼠，收集其肺组织，通过噬斑滴度测定肺病毒滴度。用牛血清白蛋白(BSA)10mg/kg作为阴性对照。攻毒时血清中抗体浓度用夹层ELISA测定。类似地，在食蟹猴中，可以测定鼻内及肺清洗液中的病毒滴度。
5.6.1.2目标群体
在本发明的一些实施方案中，本发明治疗及诊断方法的目标群体是通过年龄限定的。在一些实施方案中，本发明治疗及诊断方法的目标群体特征为除呼吸道感染外的疾病或病症。
在一个具体实施方案中，目标群体包括幼儿、低于2岁。更具体实施方案中，为低于2岁且不患有除呼吸道感染外的其它疾病。
其它实施方案中，目标群体包括5岁以上患者。更具体实施方案中，5岁以上的患者患有其它疾病或病症包括纤维囊肿、白血病和非霍奇金淋巴瘤、或者新近接受骨髓或肾移植。
本发明的一具体实施方案中，所述目标群体包括那些hMPV感染与宿主免疫抑制有关的患者。一具体实施方案中，所述患者为免疫受损个体。
在一些实施方案中，本发明目标方法的目标群体包括老年人。
在一个具体实施方案中，用本发明方法治疗或诊断的患者在冬季月份感染了hMPV。
5.6.1.3临床试验
可以将体外试验及动物模型测试的本发明疫苗或其片段在正常健康成人志愿者中进一步进行安全性、耐受性及药物动力学评价。通过肌肉内、静脉内或者肺部递送系统向志愿者施用单剂量的本发明重组病毒和/或本发明疫苗。所有志愿者在接受单剂量本发明重组病毒和/或本发明疫苗之前至少24小时便开始监测，所有志愿者在临床位置接受单剂量之前至少48小时便开始监测。然后，在接种后的第3、7、14、21、28、35、42、49和56天将志愿者作为门诊病人进行监测。
通过流置导液管或用10ml红顶Vacutainer管直接穿刺按下述间隔收集血样：(1)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗之前；(2)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗过程中；(3)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗之后的第5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、和48小时；以及(4)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗之后的第3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、和56天。让样本在室温下凝集然后通过离心收集血清。
来自患者样本中的抗本发明的重组病毒和/或本发明疫苗的抗体的量可以通过ELISA定量。也可以对PBMC和肺及鼻腔洗液中的T-细胞免疫(细胞毒性T细胞及辅助T细胞应答)进行监测。
志愿者血清中抗体浓度水平可以通过下述方法校准：将施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗后每一收集间隔的血清水平减去前剂量血清水平(背景水平)。对于所有志愿者而言，药物动力学参数可以采用模型-非依赖性方法(Gibaldi等人，eds.，1982，Pharmacokinetics，2nd edition，Marcel Dekker，New York)从校准后的血清抗体或抗体片段浓度计算得出。
下列的实施例是用来解释，而非限制本发明。如下维持在实例中使用的细胞和病毒：使RSVA2株和载有3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒的RSV病毒(bPIV3/hPIV3/RSV病毒)，在庆大霉素的存在下生长在在Opti-MEM(Gibco/BRL)中的Vero细胞中。使表达噬菌体T7RNA聚合酶的经过修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA-T7)或禽类-痘-T7(FP-T7)生长在鸡胚肾脏细胞(SPAFAS)中。将Vero、HeLa和Hep2细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM L-谷胺酰胺、非必要氨基酸和抗生素的MEM(JRH Biosciences)中.
6.实施例1：构建并克隆嵌合牛副流感病毒3/人副流感病毒3 cDNA
为了用hPIV3的F和HN基因替代bPIV3的F和HN基因，将另外的限制酶位点导入感染性bPIV3 cDA内。使用定点突变，在bPIV3cDNA的核苷酸位置5041处导入独特的Nhe I位点，并在nt 8529处导入SalI位点。用Nhe I和SalI限制酶处理修饰的全长bPIV3 cDNA，并通过凝胶纯化作用分离包括除了F和HN基因的外所有病毒bPIV3序列的14kb DNA片段。
为了获得hPIV3 F和HN基因序列，用hPIV3株(hPIV3/Tex/12084/1983)感染10cm培养皿的铺满的Vero细胞。在37℃下培养3天之后，收获细胞，并使用RNA STAT-LS 50(Tel-Testlnc.)分离总RNA。在hPIV3基因组的位置4828，使用hPIV3特异性退火寡核苷酸通过逆转录作用来产生病毒cDNA。通过PCR(聚合酶链反应)，使用Tap聚合酶扩增hPIV3 F和HN基因。将PCR产物克隆到pT/A TOPO克隆载体(Invitrogen)内，并从两个克隆(#11和#14)中测定hPIV3 F和HN基因的序列。序列分析显示，对于克隆#11，F基因是正确的，但HN基因含有异常序列；对于克隆#14，HN基因是正确的，但F基因含有异常终止密码子。因此，通过以下列方式合并#11的正确F基因与#14的正确HN基因，来构建包含功能性hPIV3 F和HN基因的质粒。用Nhe1和EcoR1消化两个hPIV3质粒(#11和#14)。从克隆#11中分离出了一个具有正确F基因的1.6kb片段，从克隆#14中分离出了一个具有正确HN基因和质粒序列的8.5kb片段。连接这两个片段，产生含有完整hPIV3 F和HN基因的质粒。通过DNA序列分析证实正确的序列。最后，在非翻译区中的HN基因的3’末端处加入一个核苷酸，以满足“六倍法则”。可通过使用QuikChange突变试剂盒(Stratagene)完成单一核苷酸的加入，并通过DNA测序证实。然后通过用Nhe 1和Sal 1消化来分离正确的hPIV3 F和HN基因DNA片段，并凝胶纯化3.5kb的DNA片段。
通过连接上述具有bPIV3序列的14.5kb DNA片段与含有hPIV3 F和HN基因的35kbDNA片段来构建全长的b/h PIV3嵌合cDNA(参见图3)。通过延伸限制酶作图，来证实全长的嵌合质粒DNA。此外，可通过DNA测序来证实嵌合构建体的M/F和HN/L基因接合点均含有bPIV3和hPIV3序列，以及分别含有Nhe1和Sal1限制酶位点。
7.实施例2：构建并克隆载有呼吸道合胞病毒F或G cDNA的嵌合牛副流感病毒3/人副流感病毒3
为了确定在b/h PIV3基因组位置1或2中插入RSV抗原对病毒复制的影响，将呼吸道融合细胞(RSV)F和G基因克隆到嵌合牛副流感病毒3/人副流感病毒3载体(b/h PIV3载体)的不同位置内。参见图4。
为了将外源基因插入牛/人(b/h)PIV3 cDNA内，使用QuickChange试剂盒(Stratagene)，通过定点突变将AVrII限制酶位点导入b/h PIV3cDNA质粒内(Haller等人，2000；2001，这是与在实例6中相同的构建体)。使用下列寡5’GAAATCCTAAGACCCTAGGCATGTTGAGTC3’及其互补链，将一个AvrII位点导入b/h PIV3基因组中的核苷酸(nt)104处，改变四个核苷酸。使用该限制酶位点在病毒基因组的第一个(最靠近3’)位置中插入RSV基因。使用下列寡5’CCACAACTCAATCAACCTAGGATTCATGGAAGACAATG3’及其互补链，将另一个AvrII位置在nt 1774处导入N-P基因间隔区中，改变两个核苷酸。使用该限制位点，在b/h PIV3的N和P基因之间的第二个位置中插入RSV基因(图4)。通过反向遗传学恢复病毒来测试在nt104和1774处具有AvrII位点的全长b/h PIV3 cDNA的功能。
RSV G弹夹(N-P基因终止/开始)的构建：使用b/h PIV3 cDNA作为PCR模板产生DNA片段，该DNA片段含有bPIV3 N-P基因间隔区以及RSV G基因的3’端序列。通过PCR使用下列寡核苷酸来产生该片段：5’CCCAACACACCACGCCAGTAGTCACAAAGAGATGACCACTATCAC3’和5’CCCAAGCTTCCTAGGTGAATCTTTGGTTGATTGAGTTGTGG3’。然后使用该片段进行重叠PCR，以将bPIV3 N-P基因间隔区加到RSV G基因中。对于第二个PCR反应，使用含有RSV G和F基因的质粒作为DNA模板，并使用寡5’CAGCGGATCCTAGGGGAGAAAAGTGTCGAAGAAAAATGTCC3’和从上述短PCR片段产生的寡核苷酸作为引物。将所得的含有RSV G基因(其与bPIV3N-P基因间隔区连接，并位于AvrII限制酶位点旁侧)的PCR片段克隆到pGEM3内。测定RSVG基因的序列，以证实完整的开放阅读框和预测的氨基酸序列的存在。使用在仅具有bPIV3基因组前5200个核苷酸(1-5 bPIV3)，并用AvrII线性化的亚克隆内的AvrII限制酶位点，将具有RSVG基因的DNA片段插入第一或第二个位置内。当在此处和其它实施例中使用时，1-5 bPIV3是指牛PIV3基因组的核苷酸1至5196(或5200)。在该处有BstB1位点。
RSV F弹夹(N-P基因开始/终止)的构建：通过PCR，使用在RSV F基因的5’和3’端加入Avrn的寡核苷酸，从全长的bPIV3/RSV F+GcDNA质粒中分离RSV F基因片段，并导入在nt 1774具有AvrII位点并用AvrII线性化的1-5 bPIV3质粒内。使用1-5 bPIV3/RSV G2作为模板，通过PCR分离bPIV3 N-P基因间隔区。使用寡5’GACGCGTCGACCACAAAGAGATGACCACTATCACC3’和在bPIV3 F基因中退火的寡核苷酸产生含有bPIV3 N-P基因间隔区、AvrII位点和高达nt 5200的bPIV3序列的PCR片段。用SalI和NheI消化该PCR片段，并加到用SalI和NheI处理，且在位置2中具有RSVF基因的1-5 bPIV3质粒中。为了将含有N-P基因间隔区的RSV F基因导入位置1内，使用AvrII切下1.8kb RSV F弹夹，并连接到在nt104处含有AvrII位点且用AvrII线性化的1-5 bPIV3内。
构建具有短基因间隔区的RSV F弹夹(N终止/N开始)：通过使用1-5 bPIV3/RSV F2作为模板，寡5’GCGCGTCGACCAAGTAAGAAAAACTTAGGATTAAAGAACCCTAGGACTGTA3’以及在包含AvrIIF限制酶位点的RSV F基因5’端上游退火的寡核苷酸进行PCR反应，来完成具有短N-N基因间隔区的RSV F基因的产生。用AvrII消化含有RSV F基因和短N-N基因间隔区的PCR产物，并导入用AvrII线性化的1-5 bPIV3 nt 104内。
在通过限制酶作图确定合适的方向之后，用SphI和BssHII消化在第一个位置具有RSV基因的质粒，并分离出4kb(1-5 bPIV3/RSV G1)或4.8kb(1-5 bPIV3/RSV F1)DNA片段。在第二个克隆步骤中，将其余b/h PIV3基因组作为SphI-BssHII 15.1kb DNA片段加入，产生全长的cDNA。使用SphI和NheI切开在第二个位置具有RSV基因的bPIV3亚克隆，并分离出5.8kb(bPIV3/RSV G2)和6.5kb(bPIV3/RSV F2)DNA片段。在第二个克隆步骤中，将其余b/h PIV3基因组作为14kb的NheI-SphI DNA片段加入。在STBL-2细胞(Gibco/BRL)中增殖全长的嵌合b/h PIV3/RSV质粒，其提供高产量的全长病毒cDNA质粒。
8.实施例3：载有呼吸道合胞病毒F或G的牛副流感病毒3/人副流感病毒3对于在体外的mRNA产生和蛋白表达以及病毒复制表现出位置效应
进行3个实验，以证实在实施例2的构建体中的RSV F或G基因的有效表达，并确定在PIV3基因组中的基因插入的位置效应。
首先，为了证实由嵌合病毒表达RSV蛋白，进行嵌合病毒-感染的细胞溶胞产物的Western印迹分析，并用RSV-特异性抗血清来探测。参见图5A。如下所述进行Western印迹分析：以0.1或1.0的MOI，使用嵌合病毒感染(70-80％)亚铺满的Vero细胞。在感染后48小时，取出覆盖的培养基，并用1毫升PBS洗涤被感染单层1次。然后用400毫升含有0.05％β-巯基乙醇(Sigma)的Laemmli缓冲液(Bio-Rad)溶解细胞。在12％Tris-HCl Ready Gel(Bio-Rad)上分离样本各15毫升，并使用半干的运送细胞(Bio-Rad)将其转移导尼龙膜上。用含有0.5％(体积/体积)吐温-20(Sigma)的PBS[pH 7.61](PBST)洗涤尼龙膜，并在室温下用含有5％(重量/体积)干乳的PBST(PBST-M)阻断20-30分钟。在室温下，将该膜与在PBST-M中进行了1∶1000稀释的RSV F单克隆抗体混合物(WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107)或在PBST-M中进行了1∶2000稀释的RSV G 10181多克隆抗体(Orbigen)一起培养1小时。在用PBST洗涤四次之后，在室温下将该膜与在PBST-M中进行了1∶2000稀释的第二辣根过氧化酶-缀合的山羊抗-鼠抗体(Dako)一起培养1小时。用PBST洗涤四次，并使用化学发光底物(Amersham Pharmacia)展开，在Biomax Light Film(Kodak)上曝光，观察蛋白谱带。
与在Vero细胞中降低b/h/RSV F1＊N-N的复制效率(图5C，参见下文)一致，在感染后48小时检测到的RSV F1含量，比存在于b/hPIV3/RSV F2或野生型RSV A2感染的细胞中的含量低约10倍(比较泳道2、3和4，图5A)。50 kDa的谱带代表在用所有嵌合病毒和野生型RSV感染的细胞中检测到的F1片段。然而，与野生型RSV相比，在嵌合病毒感染的细胞的溶胞产物中，有较多20kDa F片段的累积。当以1.06的较高MOI重复b/h PIV3/RSV F1＊N-N感染时(图5A，泳道1)，在感染后48小时，b/h PIV3/RSV F1感染的细胞中的F1片段，累积至野生型RSV的水平。在b/h PIV3/RSV F1或b/h PIV3/RSV F2感染的细胞中，50 kDa和20 kDa F1片段的相对量为大约1∶5。在用嵌合病毒感染的细胞中未检测到F0，这意味着在b/h PIV3/RSV F1和b/h PIV3/RSV F2感染期间，F0前体被有效地加工，这与在野生型RSV感染中所观察到的一样。
在图5A中显示了RSVG在b/h PIV3/RSV G1、b/h PIV3/RSV G2和野生型RSV感染的细胞中的相对表达。检测到了不成熟和糖基化形式的RSV G，二者分别迁移至约50kDa和90kDa。b/h PIV3/RSV G1感染的细胞显示出类似于在野生型RSV感染的细胞中看到的RSV G表达程度(泳道1和3，图5A)。然而，在b/h PIV3/RSV G2感染的细胞中，RSV G的累积比在野生型RSV感染的细胞中出现的累积多约2-3倍(泳道2和3，图5A)。这些数据在一起显示嵌合b/h PIV3/RSV在位置1或2有效地表达RSV蛋白。然而，在位置2具有RSV基因的病毒表达更高水平的RSV蛋白。
接下来，Northern印迹分析表明，mRNA转录作用与通过Western印迹分析所证实的蛋白表达结果相关，参见图5B。如下所述进行Northern印迹分析：使用Trizol LS(Life Technologies)，从病毒感染的细胞中制备总细胞RNA。通过一次酚-氯仿萃取进一步纯化RNA，并用乙醇使其沉淀。将RNA小团再悬浮在焦碳酸二乙酯处理过的水中，并储存在-80℃下。在含有1％甲醛的1％琼脂糖凝胶上分离等量的总RNA，并使用Turbblotter装置(schleicher&schuell)转移到尼龙膜(AmershamPharrnaciaBi.tech)上。使印迹与洋地黄毒苷(DIG)-UTP-标记的核糖核酸探针杂交，该探针是用DIG RNA标记试剂盒(RocheMolecular Biochemicals)通过体外转录作用合成的。在68℃，在ExpressHyb溶液(Clontech)中进行12小时杂交。在68℃，用2×SSC(1×SSC，含有0.015M NaCl与0.015M柠檬酸钠)-0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)洗涤印迹两次，然后用0.5×SSC-0.1％SDS洗涤一次，最后再用0.1×SSC-0.1％SDS洗涤。使用DIG-发光检测试剂盒(Roche MolecularBiochemicals)检测来自杂交探针的信号，并通过在Biomax Light Film(Kodak)上曝光来观察。
b/h PIV3/RSV F1＊N-N、b/h PIV3/RSV F2、b/hPIV3/RSV G1和b/h PIV3/RSV G2的Northern印迹分析表明，RSV F或RSV G的病毒mRNA含量与观察到的RSV蛋白含量非常相关(图5B)。对b/hPIV3/RSV F1＊N-N观察到最低含量的RSV F mRNA，其也表现出产生最低量的RSV F蛋白。b/h PIV3/RSV G1产生少量的RSV GmRNA，结果产生比在b/h PIV3/RSV G2中观察到的更低的RSV G蛋白含量。
最后，不同病毒(在位置1或位置2处有RSV F或G基因)的生长也与蛋白表达和RNA转录的结果有关。如下所述获得在图5C中所示的生长曲线：让Vero细胞生长至90％铺满，并以0.01或0.1的MOI用b/h PIV3、b/h PIV3 RSV F1、b/h PIV3 RSV G1、b/h PIV3 RSV F2和b/h PIV3 RSV G2感染。在37℃下培养被感染的单层。在感染后0、24、48、72、96和120小时，一起收获细胞和培养基，并储存在-70℃下。通过在Vero细胞中的TCID50或噬斑测定来确定在每个时间点收获的病毒滴度。TCID50测定是在37℃下培养6天之后，以肉眼检查CPE，而噬斑测定则是在培养5天之后，用RSV多克隆抗血清进行免疫染色来定量进行的。
在Vero细胞中，以0.01的MOI，在第-个位置具有RSV G或F基因的嵌合病毒(b/h PIV3 RSV G1和b/h PIV3 RSV F1＊N-N)比在第二个位置含有RSV基因的病毒以更慢的速率复制，产生更低的峰值滴度，并显示出较长的迟滞期。在感染后96小时，b/h PIV3/RSVF1＊N-N和b/h PIV3/RSV G1的峰值滴度分别为106.7和105.5 TCID50/ml(图5C)。相反，在感染后72和96小时，b/h PIV3/RSV F2和b/hPIV3/RSV G2的峰值滴度分别为108.0和107.4TCID50/ml(图5C)。b/hPIV3对照组病毒表现出108.0 TCID50/ml的峰值滴度(图5C)。b/hPIV3/RSV F2产生比b/h PIV3/RSV F1＊N-N高1.3log10的滴度。b/hPIV3/RSV G2复制至比b/h PIV3/RSV G1高1.9log10的滴度。结果表明，与在第二个位置具有RSV基因的嵌合病毒相比，在第一个位置具有RSV基因的嵌合病毒延迟开始体外复制。
为了确定b/h PIV3/RSV F1＊N-N和b/h PIV3/RSV G1的较高滴度是否能够达到，以0.1的较高MOI重复生长曲线。在0.1的MOI，b/hPIV3/RSV F1＊N-N和b/h PIV3/RSV G1的峰值滴度增加了0.5至1.3log10(数据未显示)。在生长周期中，这些病毒的迟滞期缩短了，并较早达到了峰值滴度。
9.实施例4：在牛副流感病毒3/人副流感病毒3基因组中插入eGFP对病毒复制的位置效应
通过依次在PIV3的所有基因之间导入eGFP基因，并观察对病毒复制和eGFP表达的影响(图6)，来系统性地评估将基因插入牛/人PIV3载体主链中的影响。这类测定研究所观察到的转录梯度对产生特定比例的病毒mRNA副粘病毒的重要性。外源基因的插入将扰乱这些比例，结果合成不同含量的病毒蛋白，其可影响病毒的复制。为了该测定选择eGFP基因，因为它不会被引入病毒颗粒的膜内，并因此应该不干扰病毒的加工例如包装、芽殖、侵入等等。将eGFP基因插到b/h PIV3基因组的四个位置内，其中三个是eGFP表达和病毒复制所特有的。将eGFP基因弹夹与bPIV3 N-P基因间隔区连接。b/hGFP1在b/h PIV3基因组最接近3’的位置中具有eGFP基因弹夹。b/hPIV3/GFP2在b/h PIV3基因组的N和P基因之间含有eGFP基因弹夹。b/h PIV3/GFP3是在P和M之间，b/h PIV3/GFP4是在b/h PIV3的M和F之间含有eGFP基因(图6)。
eGFP基因弹夹的构建：eGFP基因的模板是市售的，例如其可从BD Biosciences(pIRES2-EGFP)或Clontech(pEGFP-N1)购买。参见Hoffmann等人，Virology 267：310-317(2000)。通过PCR分离eGFP基因，并通过采用重叠PCR法，使用下列寡核苷酸加入bPIV3 N-P基因  间隔区：5’ATTCCTAGGATGGTGAGCAAGGGCG3’、5’GGACGAGCTGTACAAGTAAAAAAATAGCACCTAATCATG3’和5’CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3’。将eGFP弹夹插入pCR2.1内，测序，并证实遵守六倍法则。然后用AvrII消化eGFP弹夹，凝胶纯化，并如下所述插入b/h PIV3的位置1、2、3和4内。
产生在位置1和2处具有eGFP基因的全长cDNA：将eGFP基因弹夹插入含有从nts1至5200的bPIV3序列，并在nt104(位置1)或nt1774(位置2)含有AvrII限制酶位点的1-5 bPIV3质粒内。在通过限制酶作图确定合适的方向之后，用SphI和BssHII消化在第一个位置具有eGFP基因的质粒，并分离出4kb(1-5 eGFP1)DNA片段。然后，将其余b/h PIV3基因组作为SphI-BssHII 15.1kb DNA片段加入，产生全长的cDNA。至于在第2个位置中包含eGFP的全长cDNA的产生，用SphI和NheI切开在第二个位置具有eGFP基因的bPIV3亚克隆，并分离出5.8 kb(1-5 eGFP2)DNA片段。然后将其余b/h PIV3基因组作为14 kb的NheI-SphI DNA片段加入。在STBL-2细胞(Gibco/BRL)中增殖全长的嵌合b/h PIV3/eGFP质粒，其提供高产量的全长病毒cDNA质粒。
产生在位置3和4处具有eGFP基因的全长cDNA：为了将eGFP弹夹插入b/h PIV3基因组的位置3内，在含有bPIV3nts1-5200的亚克隆的P-M基因间隔区中在nt 3730处导入AvrII限制酶位点，改变两个核苷酸。在QuickChange PCR反应中使用下列寡核苷酸及其互补链以导入AvrII位置：5’GGACTAATCAATCCTAGGAAACAATGAGCATCACC3’。用AvrII消化eGFP弹夹，并连接到用AvrII线性化且在nt 3730处具有AvrII位点的1-5 bPIV3亚克隆内。从含有GFP的亚克隆中分离出从SphI至NheI的5.5kb DNA片段，并导入用SphI和NheI消化的b/h PIV3 cDNA内，产生全长的质粒。为了将eGFP基因弹夹加到b/h PIV3基因组的位置4内，产生含有从nt 1至8500的b/h PIV3序列的亚克隆。用NheI(nt 5042)将该亚克隆线性化，并插入含有可相容的AvrII末端的eGFP弹夹。然后用SphI和XhoI消化具有eGFP弹夹的亚克隆，并分离出7.1kb的DNA片段。用SphI和XhoI处理b/h PIV3质粒，产生11kb的片段。连接这两个DNA片段，产生b/h PIV3/GFP4。
以两种方法评估b/h PIV3/GFP1、2和3所产生的eGFP量。首先使用萤光显微镜，确定以0.1和0.01的MOI用b/h PIV3/GFP1、2和3感染Vero细胞20小时后所产生的绿细胞的量(图7A).b/h PIV3/GFP3产生的绿细胞明显比b/h PIV3/GFP1或2少。
其次，对被感染的细胞进行Western印迹分析，并用GFP MAb和PIV3 Mab探测印迹。最初的观察证实b/h PIV3/GFP3产生非常少的eGFP蛋白(图7B)。b/h PIV3 GFP1和GFP2产生类似量的GFP蛋白。Western印迹法控制相同的装载体积，以供使用PIV3抗体探测(图7B)。值得注意的是，所有三种病毒均显示产生类似量的PIV3蛋白(HN蛋白是最突出的谱带)。这些结果表明，与位置1和2相比，b/hPIV3/GFP3在位置3转录较少的GFP mRNA。该数据证实了在副粘病毒中存有病毒mRNA的转录梯度。PIV3HN蛋白的产量不受eGFP基因插入的影响(图7B)。
为了确定GFP基因插入对b/h PIV3/GFP1、2和3的病毒复制动力学是否有影响，在Vsro细胞中进行多回合的生长曲线(图7C)。生长曲线显示b/h PIV3/GFP1在感染后24和48小时具有比b/hPIV3/GFP2或GFP3延迟发生的病毒复制。然而，所有三种病毒最后获得的峰值滴度是类似的。b/h PIV3/GFP2和GFP3的复制动力学几乎是相同的(图7C)。值得注意的是，改变了的病毒mRNA比例似乎未显著地影响病毒复制。
10.实施例5：构建并克隆载有呼吸道合胞病毒F与不同基因间隔区的嵌合牛副流感病毒3/人副流感病毒3
使用三种不同的构建体，确定基因间隔区(在每个mRNA之间的核苷酸，例如在F基因和N基因之间的核苷酸)对蛋白表达和病毒复制的影响。参见图8。第一个构建体是在位置1中载有RSV F1＊N-N的b/h PIV3，其具有较短的bPIV N基因终止/N基因起始序列(RSVF1＊N-N，在图4中)；第二个构建体是在位置1中载有RSV F的b/h PIV3(RSV F2，在图4中)；而最后一个构建体是在位置1中载有RSV的b/hPIV3(RSV F1，在图4中)。根据在第6章节实施例2中描述的克隆方法产生所有三种构建体。
在两个弹夹之间最显著的差异是在N基因起始序列与N翻译起始密码子之间的距离，在b/h PIV3/RSV F1＊N-N中该距离仅有10个核苷酸长。相反，在b/h PIV3/RSV F2中，该距离为86个核苷酸长。另一个差异是，在b/h PIV3/RSV F1＊N-N中使用N基因起始序列，而在b/h PIV3/RSV F2中使用的是P基因起始序列。为了确定在病毒转录单元的转录基因起点和翻译起点之间的距离是否影响病毒的复制，产生b/h PIV3/RSV F1构建体，其含有与b/h PIV3/RSV F2所使用的相同的RSV F基因弹夹。
11.实施例6：在呼吸道融合细胞病毒基因下游的基因间隔区的长度和/或性质对病毒复制的影响
在下列的实验中，使用在实施例5中的三种构建体来确定基因间隔区对病毒蛋白表达和病毒复制的影响。参见图9。
首先，使用Western印迹分析，在以0.1的MOI感染Vero细胞后24和48小时，比较b/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV F1＊N-N和b/h PIV3/RSV F2的RSV F蛋白表达。如下所述进行Western印迹分析：以0.1的MOI，用嵌合病毒感染(70-80％)压铺满的Vero细胞。在感染后24和48小时，取出覆盖的培养基，并用1毫升PBS洗涤被感染单层1次。然后用400毫升含有0.05％β-巯基乙醇(Sigma)的Laemmli缓冲液(Bio-Rad)溶解细胞。在12％Tris-HCl Ready Gel(Bio-Rad)上分离样本各15毫升，并使用半干的运送细胞(Bio-Rad)将其转移导尼龙膜上。用含有0.5％(体积/体积)吐温-20(Sigma)的PBS[pH 7.6](PBST)洗涤尼龙膜，并在室温下用含有5％(重量/体积)干乳的PBST(PBST-M)阻断20-30分钟。在室温下，将该膜与在PBST-M中进行了1∶1000稀释的RSV F单克隆抗体混合物(WHO 1269、1200、1153、1112、1243、1107)或在PBST-M中进行了1∶2000稀释的RSV G10181多克隆抗体(Orbigen)一起培养1小时。在用PBST洗涤四次之后，在室温下将该膜与在PBST-M中进行了1∶2000稀释的第二辣根过氧化酶-缀合的山羊抗-鼠抗体(Dako)一起培养1小时。用PBST洗涤四次，并使用化学发光底物(Amersham Pharmacia)展开，在BiomaxLight Film(Kodak)上曝光，观察蛋白谱带。
在感染后24和48小时，b/h PIV3/RSV F1表达的RSV F1蛋白量接近对b/h PIV3/RSV F2所观察到的量，但比b/h PIV3/RSV F1＊N-N的高很多。因此，在基因开始元件与翻译起始密码子之间的间隔，对病毒复制可能是很重要的。将N基因起始序列变更成P基因起始序列，然而，该变更仅导致一个核苷酸的改变。这些因素中任一个可能负责拯救RSV F蛋白表达的表型。
接下来，进行多回合的生长曲线，以便在以0.1的MOI感染的Vero细胞中比较b/h PIV3/RSV F1、b/h PIV3/RSV F1＊N-N和b/h PIV3/RSVF2的病毒复制动力学(参见图9B)，这是如下所述进行的：使Vero细胞生长至90％铺满，并以0.1的MOI用b/h PIV3、b/h PIV3/RSVF1＊N-N、b/h PIV3/RSV F1和b/h PIV3/RSV F2感染。在37℃下培养被感染的单层。在感染后0、24、48、72和96小时，一起收获细胞和培养基，并储存在-70℃下。通过在Vero细胞中的噬斑测定来确定在每个时间点收获的病毒滴度。噬斑测定是在培养5天之后用RSV多克隆抗血清进行免疫染色来定量进行的。
如图9B所示，与b/h PIV3/RSV F2相比，b/h PIV3/RSV F1＊N-N的复制开始延迟了，且峰值滴度较低。相反，PIV3/RSV F1表现出与对b/h PIV3/RSV F2所观察到的几乎相同的生长曲线。
12.实施例7：克隆三价牛副流感病毒3/人副流感病毒3负载的构建体
下列的实施例涉及三价疫苗的产生，它具有hPIV3的表面糖蛋白(F和HN)、RSV F和hMPVF，以便使用单一的活减毒病毒疫苗，保护儿童免受由RSV、hMPV和hPIV3引起的疾病。此等三价病毒通过反向遗传恢复。
如下所述进行两个病毒基因组的构建(参见图10)，其分别包括具有两个另外的异源序列插入的嵌合b/h PIV3主链，其中一个异源核苷酸序列源自间质肺病毒F基因，而另一个异源核苷酸序列源自呼吸道合胞病毒F基因：用SphI和NheI消化质粒b/h PIV3/RSV F2或b/hPIV3/hMPV F2，并分离6.5 kb的片段。用SphI和NheI消化b/h PIV3RSV F1或b/h PIV3/hMPV F1的全长cDNA，并分离出14.8 kb的DNA片段，再将其与源自质粒b/h PIV3/RSV F2或b/h PIV3/hMPV F2的6.5 kb DNA片段连接，产生全长的病毒cDNA。
已经在Vero细胞中扩增了具有上述构建体的病毒。可使用按照在本文中描述的工程改造病毒作为三价疫苗，对抗副流感病毒感染、间质肺病毒感染和呼吸道合胞病毒感染。
13.实施例8：将两种呼吸道合胞病毒克隆到至牛副流感病毒3/人副流感病毒3载体内
设计携带两个RSV F基因拷贝的嵌合病毒，以确定由嵌合病毒产生较多的RSV蛋白是否将导致改善的免疫原性。可通过在Vero细胞中的反向遗传、生物学克隆和扩增来拯救该病毒，以产生具有1×106pfu/ml的滴度的病毒原种。可使用病毒b/h PIV3/RSV F1F2来评估病毒生长动力学、RSV F蛋白的产生以及在仓鼠中的复制和免疫原性。
以下列方式产生构建体(参见图11)：用sphI和NheI消化1-5 RSVF2质粒，并分离6.5kb的片段。用sphI和NheI消化b/h PIV3 RSV F1的全长cDNA，并分离14.8kb DNA片段，再与源自1-5 bPIV3/RSV F2的6.5kb DNA片段连接，产生全长的病毒cDNA。
14.实施例9：构建和克隆载有人间质肺病毒F cDNA的牛副流感病毒3/人副流感病毒3
将人间质肺病毒(hMPV)的F基因插到b/h PIV3基因组的位置1和2中(图12)。HMPV F基因弹夹具有bPIV3 N-P基因间隔区。使用hMPV F基因质粒(pRF515)，并修正在hMPV F基因中的单一核苷酸突变(即将核苷酸3352从C修正为T(野生型))，产生pRF515-M4.使用重叠PCR，将bPIV3 N-P基因间隔区加到hMPV F基因的3’端。至于hMPv F，重叠PCR寡核苷酸为5’GGCTTCATACCACATAATTAGAAAAATAGCACCTAATCATGTTCTTACAATGGTCGACC3’。在该克隆步骤期间，在5’端使用的寡核苷酸(5’GCAGCCTAGGCCGCAATAACAATGTCTTGGAAAGTGGTGATC3’)以及在PCR反应中在hMPV F基因弹夹的3’端使用的寡核苷酸(5’CTACCTAGGTGAATCTTTGGTTG3’)含有AvrII限制酶位点。使用QuickChange突变试剂盒和下列的寡核苷酸(5’CCTAGGCCGCAATAGACAATGTCTTGG3’，5’CCAAGACATTGTCTATTGCGGCCTAGG3’)调整hMPVF基因弹夹，以使其符合六倍法则。以与在上文第8章节实施例4中关于b/hPIV3/eGFPl和eGFP2所述相同的方式，产生全长的b/h PIV3/hMPVF1(位置1)和F2(位置2)cDNA质粒。
15.实施例10：载有人间质肺病毒F的牛副流感病毒3/人副流感病毒3的免疫沉淀和复制测定
为了证实F蛋白在于位置2处载有人间质肺病毒F(hMPV F2)的b/h PIV3中表达，使用豚鼠或人抗血清对hMPVF蛋白进行免疫沉淀(参见图13A)。为了将由b/h PIV3表达的hMPV F蛋白免疫沉淀，以0.1或0.05的MOI，用b/h PIV3或b/h PIV3/hMPV F2感染Vero细胞。在感染后24小时，用不含半胱氨酸和蛋氨酸(ICN)的DME洗涤细胞1次，并在相同的培养基中培养30分钟。取出培养基，将0.5毫升不含半胱氨酸和蛋氨酸，含有100μCi[35S]-Pro-Mix(Amersham)的DME加到细胞中。在37℃于35S-同位素存在下培养被感染的细胞5小时。取出培养基，并用含有蛋白酶抑制剂的0.3 MRIPA缓冲液溶解被感染的细胞。将该细胞溶胞产物与hMPV豚鼠或人多克隆抗血清一起培养，并与IgG-琼脂糖(Sigma)结合。在用0.5M RIPA缓冲液洗涤三次之后，在10％蛋白凝胶上分级分离样本。将凝胶干燥，并在X-光软片上曝光。
通过免疫沉淀作用，使用gp和人抗-hMPV抗血清，显示由b/hPIV3/hMPV F2表达的hMPVF蛋白(图13A)。值得注意的是，在b/hPIV3/hMPV F2的溶胞产物中观察到在约80kDa移动的特定谱带。该尺寸与F前体蛋白F0符合。也在b/h PIV3和模拟品对照组泳道中观察到不同尺寸的非特异性谱带(图13)。这些数据表明b/h PIV3/hMPVF2表达hMPV F蛋白。然而，可利用的hMPV抗体试剂是有限的，且这些抗血清仅与hMPVF蛋白的前体产生相互作用。被裂解的F1也可能是不稳定的，并因此不易使用该方法观察。
进行生长曲线以确定b/h PIV3/hMPV F2的病毒复制动力学，并将其与在Vero细胞中以0.0的MOI对b/h PIV3和b/h PIV3/RSV F2所观察到的那些结果进行比较(图13B)。数据显示，在感染后24小时，与b/h PIV3/RSV F2相比，b/h PIV3/hMPV F2表现出延迟的复制发生。然而，在感染后48小时和之后，不再观察到复制上的差异。
也进行生长曲线以确定b/h PIV3/hMPV F1的病毒复制动力学，并将其与在Vero细胞中以0.01的MOI对b/h PIV3/hMPV F2和b/hPIV3所观察到的那些结果进行比较(图13C)。数据显示，与b/hPIV3/hMPV F2或b/h PIV3相比，b/h PIV/hMPV F1具有延迟的复制发生，并产生较低的峰值滴度。b/h hMPV F1的噬斑尺寸也比b/hhMPV F2小。
也评估嵌合病毒b/h PIV3/hMPV F1和F2在叙利亚黄金仓鼠中感染和复制的能力(表5)。结果显示b/h PIV3/hMPV F1和F2在仓鼠鼻甲和肺中复制达到所观察到的b/h PIV3的水平。甚至在仓鼠的上和下呼吸道中，hMPV也复制至5.3和3.6log10TCID50/g组织的滴度。这些数据表明b/h PIV3/hMPV F1和F2在仓鼠的呼吸道中可有效地感染和复制，由此证实仓鼠代表适合用来确定hMPV免疫原性的小动物模型，并可使用该动物模型来评估hMPV疫苗候选对象。
表5
在位置1或2中表达hMPV F蛋白的b/h PIV3在仓鼠中的复制病毒b/h PIV3
a以1×106pfu的指定病毒鼻内接种每组六只仓鼠
a标准误差
注解：对第10天的CPE读取TCID50测定
实施例11：克隆可溶性呼吸道融合细胞病毒F基因构建体
也产生含有可溶性RSV F基因-缺乏跨膜和胞外结构域的RSV F基因的单一拷贝的构建体(图14)。可使用该构建体测试免疫原性。其优点将是该可溶性RSV F不能被引入病毒颗粒膜内。因此，可将该病毒视为较安全的病毒，因为预计它的病毒向性不会改变。可通过反向遗传拯救b/h PIV3/sol RSV F的cDNA质粒。
使用质粒1-5/RSV F2(前述)作为PCR的DNA模板。使用寡RSVf.2(5’GCTGTAACAGAATTGCAGTTGC3’)(其在RSV的nt 5946退火)和寡5’CGTGGTCGACCATTGTAAGAACATGATTAGGTGCTATTTTTATTTAATTTGTGGTGGATTTACCGGC3’除去RSV F的跨膜和胞质结构域，删除150个核苷酸。用HpaI和SalI消化所得的PCR片段，并导入用HpaI和SalI处理过的1-5 RSV F2内，以产生1-5 bPIV3/sol RSV F。用SphI和NheI消化该质粒，并将所得片段导入用SphI和NheI消化过的b/h PIV3 cDNA内，以产生全长的cDNA。
17.实施例12：在用载有人间质肺病毒F的牛副流感病毒3/人副流感病毒3感染的细胞中人间质肺病毒F的表达
连续10倍稀释b/h 104 hMPVF病毒原种，并用来感染亚铺满的Vero细胞。用含有庆大霉素的optiMEM培养基覆盖被感染的细胞，并在35℃下培养5天。用100％甲醇固定细胞，并依次用1∶1000稀释的抗-hMPV001豚鼠血清和1∶1000稀释的抗-豚鼠HRP缀合抗体进行免疫染色。通过在AEC底物系统(DAKO corporation)存在下的比色展开来观察hMPV F的表达。参见图15A。
连续10倍稀释b/hNP-P hMPV F病毒原种，并用来感染亚铺满的Vero细胞。用补充有包含青霉素/链霉素、L-谷胺酰胺和胎牛血清的1×L15/MEM培养基的EMEM/L-15培养基(JRH Biosciences；Lenexa，KS)中的甲基纤维素覆盖被感染的细胞。在35℃下培养被感染的细胞5天，用100％甲醇固定细胞，并依次用1∶1 000稀释的抗-hMPV00l豚鼠血清和1∶1000稀释的抗-豚鼠HRP缀合抗体进行免疫染色(参见图15B)。抗hMPV001豚鼠血清对hMPV001蛋白有特异性，且不与b/h PIV3蛋白结合。
18.实施例13：在HELA细胞和VERO细胞中拯救嵌合3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒
使用与bPIV3拯救类似的方法进行嵌合b/h PIV3病毒的拯救。在HeLa细胞中，使用Lipofec TACE(Gibco/BRl)，通过反向遗传进行b/h PIV3嵌合病毒的拯救。以4的MOI，用MVA感染80％铺满的HeLa细胞、Hep-2细胞或Vero细胞。在感染1小时之后，将全长的反基因组b/h PIV3 cDNA(4微克)与NP(0.4微克)、P(0.4微克)和L/pCITE(0.2微克)表达质粒一起转染到被感染的Hela或Vero细胞内。在感染后40小时，收获细胞和细胞上清液(P0)，并使其接受一回合的冷冻-融解。然后使用所得细胞溶胞产物在1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胞嘧啶(ara C)-一种痘苗病毒的复制抑制剂的存在下感染新鲜的Vero细胞单层，产生P1病毒原种。收获得自这些培养平板的上清液和细胞，冷冻融解一次，并使用PIV3-特异性抗血清通过病毒噬斑的免疫染色来测定bPIV3病毒颗粒的存在。P1收获物的细胞溶胞产物导致Vero细胞单层的完全CPE，且免疫染色表示出现广泛的病毒感染。
19.实施例14：拯救载有人间质肺病毒F病毒的3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒
如下所述获得在位置1(b/h104 hMPV F)或位置2(b/h NP-P hMPVF)处表达hMPV F的b/h PIV3病毒。以0.1至0.3的感染复数(m.o.i)，用禽类痘-T7感染在6孔培养皿中的80-90％铺满的Hep-2或Vero细胞。在用禽类痘-T7感染之后，用PBS洗涤细胞一次，并以以下用量的质粒DNA转染：全长的b/h104 hMPV F或b/h NP-P hMPV F cDNA2.0微克，pCite N 0.4微克，pCite P 0.4微克，pCite L 0.2微克(pCite质粒具有T7启动子，在该启动子后面是源自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES元件)。根据制造商的指示，在Lipofectamine 2000(InVitrogen)存在下进行转染。在33℃下培养转染反应5至12小时，然后用2毫升含有庆大霉素的新鲜OptiMEM替代含有Lipofectamine 2000的培养基。在33℃下进一步培养转染的细胞2天。用SPG稳定细胞，并通过一回合在-80℃的冷冻融解使细胞溶解。使用粗制的细胞溶胞产物感染新的Vero细胞单层，以便扩增拯救的病毒。
20.实施例15：通过反向遗传，拯救载有呼吸道合胞病毒基因的3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒
通过反向遗传，在HeLa或HEp-2细胞中使用前述的转染法(参见实施例13)来回收有传染性的病毒(Haller等人，2000)。简言之，分别以0.1至0.3或1至5的感染复数(m.o.i)，用FP-T7或MVA-T7感染在6孔组织培养皿中的80-90％铺满的HEp-2或Vero细胞。在用FP-T7或MVA-T7感染之后，用PBS洗涤细胞一次，并用以下量的质粒DNA转染(2.0微克全长b/h PIV3 RSV F或G cDNA，0.4微克pCITE/N，0.4微克pCITE/P，0.2微克pCITE/L)。根据制造商的指示，在Lipofectamine 2000(Invitrogen)存在下进行转染。在33℃下培养转染反应5至12小时，然后用2毫升含有庆大霉素的新鲜OptiMEM替代含有Lipofectamine 2000的培养基。在33℃下进一步培养转染的细胞2天。用SPG稳定细胞，并通过一回合在-80℃的冷冻融解使细胞溶解。使用粗制的细胞溶胞产物感染新的Vero细胞单层，以便扩增拯救的病毒。通过在Vero细胞中有限的稀释来纯化嵌合病毒，并产生106-108PFU/ml的高滴度病毒原种。通过RT-PCR分离嵌合病毒的RSV基因，并证实其序列。通过用RSV山羊多克隆抗血清(Biogenesis)对被感染的Vero细胞单层进行免疫染色来证实RSV蛋白的表达。
21.实施例16：通过RT-PCR证实嵌合3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒拯救
为了确定所拯救的病毒在性质上是嵌合的，即该病毒在bPIV3主链中含有hPIV3 F和HN基因序列，通过RT-PCR进一步分析病毒RNA基因组。收获用三种独立衍生的b/h PIV3分离株的P1病毒原种感染的Vero细胞，并分离总RNA。使用在bPIV3的位置4757处退火的寡核苷酸来扩增病毒RNA。通过PCR扩增从nt 5255至6255的病毒区域。所得1kb PCR片段应含有hPIV3序列。这可通过用对hPIV3有特异性的酶(Sac1和Bg1 II)消化来证实，且它不切开bPIV3的互补区(参见图2)。象所预期的那样，Sac1和Bg1 II将PCR片段切成较小片段，证实了该分离的序列是源自hPIV3(参见泳道3、5、7)。此外，通过PCR扩增在聚合酶L基因中从nt 9075至nt 10469的区域。该区域应含有bPIV3序列。同样使用对bPIV3有特异性的酶(Pvull和BamH1)消化所得的1.4kb PCR片段，它不切开hPIV3的相同区域(图3)。通过Pvull和BamH1消化1.4 kb片段，证实了该聚合酶基因的来源是bPIV3(参见图3的泳道3、4、6、7、9和10)。总而言之，RT-PCR分析显示该拯救的b/h PIV3病毒在性质上是嵌合的。它在bPIV3遗传主链中含有hPIV3 F和HN基因。
22.实施例17：载有呼吸道合胞病毒基因的3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒的遗传稳定性
为了确定b/h PIV3/RSV嵌合病毒在遗传上是稳定的，并保持导入的RSV基因弹夹，将被感染细胞的溶胞产物在Vero细胞中连续盲传代10次。以0.1的MOI，用b/h PIV3/RSV感染在T25烧瓶中的亚铺满的Vero细胞，并在33℃下培养4天，或直到看见CPE为止。在培养期间结束时，收获被感染的细胞和培养基，冷冻并融解两次，并使用所得细胞溶胞产物感染新的T25烧瓶中的Vero细胞。重复该循环10次。通过噬斑测定并用RSV多克隆抗血清进行免疫染色，来分析得自P1至P10的所有细胞溶胞产物以确定RSV蛋白的表达和病毒滴度。在第10次传代时，通过RT-PCR分离出RSV基因弹夹，并通过DNA序列分析证实RSV基因序列(以便确认可能的核苷酸改变)。所有的分离株均保持RSV基因弹夹，并分析10次传代的RSV蛋白表达(数据未显示)。
23.实施例18：在蔗糖梯度上，载有呼吸道合胞病毒基因的3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒的病毒颗粒分级分离
通过使用生化测定，进一步研究RSV蛋白是否导入b/h PIV3病毒颗粒内的问题。以0.1的MOI，用每种嵌合b/h PIV3/RSV病毒接种Vero细胞。当看见最大CPE时，冷冻、融解被感染的单层，并以2000rpm旋转10分钟。经由20％蔗糖垫以100,000×g旋转澄清的上清液90分钟。然后将小团再悬浮于PBS中，并在20-66％蔗糖梯度的顶部轻轻地分层。将这些梯度以100,000×g旋转20小时以达成平衡。从梯度的顶部开始，收获18个2毫升级分。从每个级分中分别取出0.4毫升，进行病毒滴度确定。将每个级分再悬浮于2倍体积的20％PBS中，并通过以100,000×g旋转1小时来浓缩，然后将小团再悬浮于0.05mL Laemmli缓冲液(Biorad)中，并通过Western印迹法，使用RSV F Mab(NuMax L1FR-S28R)、RSV(Biogenesis)和bPIV3(VMRD)多克隆抗血清来分析RSV和PIV3蛋白。纯化在杆状病毒中表达的C-末端截短的RSV F蛋白至同质，也在蔗糖梯度上分析。
还通过噬斑测定来分析级分的峰值病毒滴度。首先进行游离RSV F(在杆状病毒中产生，并且是C-末端截短的)、RSV A2和b/h PIV3的对照梯度。大部分游离RSV F存在于梯度顶部的级分3、4、5和6中(图16A)。在级分10、11和12中观察到最大浓度的RSV病毒颗粒(图16B)。使用RSV多克隆抗血清和RSV F MAb探测RSV级分。含有最大量RSV病毒颗粒的级分也显示最强的RSV F信号，这意味着RSVF蛋白与RSV病毒颗粒一起移动并结合(图16B)。这些级分还表现出最高的病毒滴度(图16B)。b/h PIV3病毒颗粒可能是更多形的，因此含有b/h PIV3病毒颗粒的峰级分的散布是更广泛的。b/h PIV3病毒颗粒存在于级分9、10、11、12和13中(图16C)。具有最大量病毒颗粒的级分在通过噬斑测定时也表现出最高的病毒滴度(图16C)。使用PIV3多克隆抗血清和RSV F MAb分析b/h PIV3/RSV F2的蔗糖梯度级分(图16D)。如使用PIV3抗血清的Western印迹法所示，含有大部分病毒颗粒的级分是级分11、12、13和14。同样地，这些也是表现出最高含量的RSV F蛋白的级分。然而，也有些游离RSV F存在于级分5和6中。级分11、12、13和14表现出峰值病毒滴度(图16D)。类似地，含有b/h PIV3/RSV G2的大多数病毒颗粒的级分(级分9、10、11和12)也显示最强的RSV G蛋白信号(图16E)。这些也是具有最高病毒滴度的级分(图16E)。这些数据综合在一起表明大部分RSV F和G蛋白与b/h PIV3病毒颗粒一起移动并结合。然而，有些游离RSV蛋白也存在于梯度顶部的级分中。
24.实施例19：载有呼吸道合胞病毒(RSV)的嵌合3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒不能被RSV抗血清中和
为了搞清楚将RSV表面糖蛋白引入b/h PIV3病毒颗粒内是否导致病毒向性表型发生改变的重要安全问题性，进行中和测定(表6和7)。RSV F Mab(WHO 1200 MAb)在1∶2000的稀释度下中和了50％的野生型RSV A2(表6)。相反，即使1∶25的稀释度也不能中和任何嵌合b/h PIV3/RSV。同样地，1∶400稀释度的多克隆RSV抗血清(Biogenesis)中和了50％的RSV A2，但即使是1∶15.6的稀释度也不能中和b/h PIV3 RSV(表6)。
表6
b/h PIV3 RSV嵌合病毒不能被RSV抗体中和
Figure S03808914919950506D001131
hPIV3 F MAb C191/9在1∶500的稀释度下中和了50％的b/h PIV3以及b/h PIV3/RSV(表7)。hPIV3 HN MAb 68/2在1∶16,000的稀释度下中和了b/h PIV3，并在1∶32,000的稀释度下中和了b/h PIV3/RSV(表7)。
表7
b/h PIV3 RSV嵌合病毒被hPIV3 Mab中和
Figure S03808914919950506D001141
d未测定。
六倍法则
25.实施例20：当在体内给药时，嵌合牛PIV表现出减毒表型并诱导强的保护性反应
用5×105pfu的野生型bPIV3、重组bPIV3、hPIV3、人/牛PIV3和安慰剂感染5周龄的叙利亚黄金仓鼠。将五组不同的动物分开关在微生物隔离笼中。在感染后4天，将动物杀死。将动物的鼻甲和肺匀化，并冷冻在-80℃下。通过在37℃下，在MDBK细胞中的TCID50测定来确定存在于组织中的病毒。用豚鼠血红细胞通过血红细胞吸附作用来证实病毒感染。表8显示不同PIV3株在仓鼠肺和鼻甲中的复制滴度。注意，重组bPIV3和b/h PIV3嵌合病毒在仓鼠肺中是减毒了的：
表8
PIV3病毒在的叙利亚黄金仓鼠鼻甲和肺中的复制
Figure S03808914919950506D001151
a用5×105 PFU的指定病毒鼻内接种每组四只仓鼠。
b标准误差。
此外，在感染之前和在感染后21天，将从仓鼠中收集血液样本用血细胞凝集抑制测定来分析。用受体破坏酶(RDE，DENKA Seiken Co.)处理血清样本，并通过在冰上与豚鼠血红细胞一起培养1时来除去非特异性凝集素。将野生型bPIV3和hPIV3加到2-倍连续稀释的仓鼠血清样本中。最后，加入豚鼠血红细胞(0.5％)，让其在室温发生血细胞凝集作用。表9显示在用不同PIV3株感染的仓鼠中产生的抗体反应。注意到，b/h PIV3嵌合病毒产生与野生型hPIV3一样强的抗hPIV3的抗体反应，远超过由重组或野生型bPIV3所产生的反应：
表9
使用得自用不同PIV3病毒感染的仓鼠的血清的血细胞凝集抑制测定
Figure S03808914919950506D001152
这些结果证实了本发明b/h PIV3嵌合病毒的性质，其使这些重组体更适合用于疫苗制剂。当在体内给药时，b/h PIV3嵌合病毒不仅表现出减毒表型，而且产生与野生型hPIV3一样强的抗体反应。因此，由于本发明的嵌合病毒具有具减毒表型，并诱导与野生型hPIV一样强的免疫应答的独特组合，所以这些嵌合病毒具有在人中成功地用来抑制和/或保护抗PIV感染所必需的特征。
26.实施例21：载有呼吸道合胞病毒G或F蛋白的牛副流感病毒3/人副流感病毒3在仓鼠的上和下呼吸道中的复制
利用100毫升体积的1×106pfu或1×104pfu的b/h PIV3、b/hPIV3/RSV、RSV A2或安慰剂培养基，鼻内感染5周龄的叙利亚黄金仓鼠(每组6只动物)。将不同组的动物分开关在微生物隔离笼中。在感染后4天，收获动物的鼻甲和肺，匀化并储存在-70℃下。在Vero细胞中，通过TCID50测定来确定存在于组织中的病毒的滴度。关于攻毒测定，在第28天时用1×106pfu/毫升的hPIV3或RSV A2鼻内接种动物。在攻毒后4天，分离动物的鼻甲和肺，并通过噬斑测定来在Vero细胞上测定攻毒病毒的复制，用免疫染色来定量测定。表10显示在仓鼠中，不同株在肺和鼻甲中的复制滴度。
表10
表达RSV G或F蛋白的牛/人PIV3在仓鼠的上和下呼吸道中的复制
Figure S03808914919950506D001161
a以5×106PFU的指定病毒鼻内接种每组四只仓鼠。
b标准误差。
叙利亚黄金仓鼠代表适用于评估重组bPIV3和hPIV3遗传工程改造病毒的复制和免疫原性的小动物模型。预计导入RSV抗原将不会改变嵌合b/h PIV3在仓鼠中复制的能力。该结果显示所有的嵌合病毒均以类似b/h PIV3在仓鼠鼻甲中的水平复制(表10)。相反，在第1个位置具有RSV基因的嵌合病毒，与b/h PIV3相比，在仓鼠肺中表现出1-1.5log10降低的滴度(表10)。在第2个位置具有RSV基因的嵌合病毒以类似在仓鼠下呼吸道中对b/h PIV3所观察到的滴度复制(表10)。
27.实施例22：在用人副流感病毒3和呼吸道合胞病毒A2攻毒时，用载有呼吸道合胞病毒的牛副流感病毒3/人副流感病毒3免疫的仓鼠得到保护
在免疫之后28天，用1×106 PFU的RSV A2或hPIV3攻毒仓鼠，评估由b/h PIV3/RSV引起的免疫原性。接受b/h PIV3/RSV的动物受到完全免受RSV和hPIV3感染的保护(表11)。只有施用安慰剂培养基的动物，在下和上呼吸道中表现出高滴度的攻毒病毒。该测定也表明用RSV免疫的动物未得到免受hPIV3攻毒感染的保护。同样地，接种hPIV3疫苗的动物，表现出高滴度的RSV攻毒病毒(表11)。
表11
在用hPIV3和RSV A2攻毒时，b/h PIV3/RSV免疫的仓鼠受到保护
Figure S03808914919950506D001181
a在第0天用来免疫每组6只仓鼠的病毒。
b在第28天，用106pfu的hPIV3或RSV A2攻毒仓鼠。在攻毒后4天，收获动物的肺和鼻甲。
c标准误差。
28.实施例23：用载有呼吸道合胞病毒的牛副流感病毒3/人副流感病毒3接种仓鼠诱导血清HAI和中和抗体
在攻毒之前，在第28天从免疫动物中获得血清样本。使用50％噬斑降低测定来分析仓鼠血清中RSV中和抗体的存在，并通过进行血细胞凝集抑制(HAI)测定(表8)来分析PIV3 HAI血清抗体的存在。如下进行50％噬斑降低测定(中和测定)：连续2-倍稀释仓鼠血清，并与100 PFU的RSV A2一起培养1小时。然后将病毒-血清混合物转移到Vero细胞单层上，并用甲基纤维素覆盖。在35℃下培养5天之后，使用RSV多克隆抗血清将单层免疫染色，以便定量测定。通过在V型底的96-孔培养平板中，在25℃下，将第28天的仓鼠血清的连续2-倍稀释液与hPIV3一起培养30分钟，进行血细胞凝集抑制(HAl)测定。然后向每孔中加入豚鼠血红细胞，继续培养90分钟，并记录在每孔中血细胞凝集作用的出现或缺乏。
结果表明，表达RSV F蛋白的病毒表现出几乎象在得自用野生型RSV接种的动物的血清中观察到的一样高的RSV中和抗体滴度(表12)。相反，表达RSV G蛋白的病毒则表现出低很多的RSV中和抗体水平(表12)。所有嵌合b/h PIV3/RSV仓鼠血清，所显示出的HAI血清抗体的水平，都接近对b/h PIV3所观察到的水平(表12)。结果表明嵌合b/h PIV3可在仓鼠中有效地感染和复制，并诱导保护性免疫应答。
表12
用b/h PIV3/RSV接种仓鼠诱导血清HAI和中和抗体
  病毒<sup>a</sup>   对RSV的中和抗体反应<sup>b，c</sup>(平均倒数log<sub>2</sub>±SE) 对hPIV3的HAI抗体反应<sup>c</sup>(平均倒数log<sub>2</sub>±SE)
  RSV   7.9±1.00   ND
  b/h RSV F1＊N-N   7.8±0.85   6.6±0.5
  b/h RSV F1   5.5±0.53   5.5±0.5
  b/h RSV G1   3.4±0.50   6.6±0.7
  b/h RSV F2   6.9±0.65   6.7±0.8
  b/h RSV G2   3.4±0.50   5.2±0.4
  b/h PIV3   ND   7.2±0.5
a用来免疫仓鼠的病毒。
b通过50％噬斑降低测定来确定中和抗体滴度
c仓鼠前血清的中和抗体滴度＜1.0，且HAI抗体滴度＜4.0。
29.实施例24：以低剂量的载有呼吸道合胞病毒的牛副流感病毒3/人副流感病毒3接种仓鼠，保护仓鼠免受呼吸道合胞病毒A2的攻毒，并诱导血清HAI和中和抗体
为了确认最佳的疫苗候选者，使用低剂量的不同构建体(参见实施例2)来免疫仓鼠。在表13中概括了攻毒的结果。
表13
b/h PIV3/RSV-低剂量免疫的仓鼠获得免受RSV A2攻毒感染的保护作用
Figure S03808914919950506D001201
a在第0天，以104 PFU/毫升的低剂量用来免疫每组6只仓鼠的病毒。
b在第28天，以106 pfu的RSV A2攻毒仓鼠。在攻毒后4天收获动物的肺和鼻甲。
c标准误差
d未测定。
接下来，通过50％噬斑降低测定(中和测定)来确定中和抗体滴度。使用Vero细胞，对b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合病毒或RSV进行中和测定。在室温，在0.5ml OptiMEM中，将连续2倍稀释的RSV多克隆抗血清(Biogenesis；Poole，England)、得自Medlmmune的RSVF Mab(WHO 1200MAb)或hPIV3 F(C191/9)和HN(68/2)MAb与大约100PFU的b/h PIV3、b/h PIV3/RSV嵌合病毒或RSV一起培养60分钟。在培养之后，将病毒-血清混合物转移到Vero细胞单层上，在35℃下培养1小时，用在EMEM/L-15培养基(JRH Biosciences；Ienexa，KS)中的1％甲基纤维素覆盖，并在35℃下培养。在接种之后6天，将被感染的细胞单层免疫染色。以抑制50％病毒噬斑的最高血清稀释度的倒数来表示中和滴度。也对在感染后28天得自以b/hPIV3、b/h PIV3/RSV嵌合病毒或RSVA2免疫的仓鼠的血清进行中和测定。以连续2-倍稀释仓鼠血清，并与100PFU的RSV A2一起培养1小时。然后将病毒-血清混合物转移到Vero细胞单层上，并用甲基纤维素覆盖。在35℃下培养5天之后，使用RSV多克隆抗血清将该单层免疫染色，以便定量测定。仓鼠前-血清的中和抗体滴度＜1.0，而HAI抗体滴度＜4.0。通过在25℃下，在V型底的96-孔培养平板中，将连续2-倍稀释的第28天仓鼠血清与hPIV3一起培养，来进行血细胞凝集抑制(HAI)测定。然后，向每孔中加入豚鼠血红细胞，继续培养90分钟，并记录在每孔中血细胞凝集作用的出现或缺乏。表14概述了该结果：
表14
用较低剂量的b/h PIV3/RSV接种仓鼠诱导血清HAI和中和抗体
  病毒<sup>a</sup> 对RSV的中和抗体反应<sup>b，c</sup>(平均倒数log<sub>2</sub>±SE)   对hPIV3的HAI抗体反应<sup>c</sup>(平均倒数log<sub>2</sub>±SE)
  RSV   6.5±0.7   ND
  b/h RSV F1＊N-N   2.5±0.7   5.7±0.6
  b/h RSV G1   2.0±0.0   6.0±0.0
  b/h RSV F2   3.8±1.5   6.7±0.6
  b/h RSV G2   3.8±1.3   5.5±0.6
  b/h PIV3   ND   6.5±0.7
a以104pfu/毫升的低剂量用来免疫仓鼠的病毒.
b通过50％噬斑降低测定来确定中和抗体滴度。
c仓鼠前-血清的中和抗体滴度＜1.0，而HAI抗体滴度＜4.0。
当将接种剂量降低至每只动物1×104PFU时，加剧了在第一个位置具有RSV基因的嵌合病毒的受限复制表型。b/h PIV3/RSV F1和G1在仓鼠上呼吸道中复制的滴度，与b/h PIV3相比，降低了1.0-2.0log10(表13)。相反，在位置2具有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在上呼吸道中复制，达到在b/h PIV3中观察到的水平。在第一个位置具有RSV基因的b/h PIV3/RSV，在仓鼠肺中的复制也较受限制(表13)。相反，b/h PIV3/RSV F2在鼻甲和肺中的复制，仍分别达到105.2和103.9的高滴度(表13)。在第28天，以1×106pfu的RSVA2攻毒接种了疫苗的仓鼠(表13)。尽管在仓鼠的呼吸道中观察到低水平的复制，但是动物仍在下和上呼吸道中均得到免受RSV攻毒感染的保护(表13)。保护的程度与在以野生型RSV接种的动物中观察到的一样好。只有接受安慰剂培养基的动物在鼻甲和肺表现出高病毒滴度(表13)。在第28天，从免疫仓鼠中收集血清，并分析RSV中和抗体和PIV3 HAI血清抗体的存在(表14)。与在野生型RSV血清中观察到的滴度相比，在得自用b/h PIV3/RSV免疫的仓鼠的血清中，在RSV中和抗体滴度方面，观察到大约50％的下降(表14)。但得自接受在位置2中具有RSV基因的b/h PIV3的动物的血清，仍表现出比得自在位置1中带有RSV基因的PIV3/RSV的血清，更高的RSV中和抗体滴度。与b/h PIV3血清相比，PIV3 HAI血清抗体滴度也稍微降低(表14)。
30.实施例25：在用人副流感病毒3或人间质肺病毒NL/001攻毒时，用载有人间质肺病毒F的牛副流感病毒3/人副流感病毒3免疫的仓鼠得到保护
分别用b/h PIV3、b/h hMPV F1、b/h hMPV F2、hMPV或安慰剂免疫五组叙利亚黄金仓鼠(每组有六只仓鼠)。将5组不同的动物分开关在微生物隔离笼中。在免疫后28天，以1×106PFU的hPIV3或hMPV(NL/001株)攻毒仓鼠，以便评估由b/h PIV3/hMPV F诱导的免疫原性。在攻毒后4天，将动物杀死。将动物的鼻甲和肺匀化，并储存在-80℃下。通过在37℃下，在MDBK细胞中的TCID50测定来确定存在于组织中的病毒。用豚鼠血红细胞通过血细胞吸附来证实病毒感染。表15显示了PIV3株和MPV株在仓鼠肺和鼻甲中的复制滴度。
表15
在用hPIV3或hMPV/NL/001攻毒时，以b/h PIV3/hMPV F免疫的仓鼠得到保护
Figure S03808914919950506D001231
a在第0天用来免疫每组6只仓鼠的病毒。
b在第28天，用106pfu的hPIV3或hMPV攻毒仓鼠。在攻毒后4天，收获动物的肺和鼻甲。
ND＝未测定。
结果表明，接受b/h PIV3/hMPV F2(F在位置2)的动物，完全得到免受hMPV和hPIV3的保护(表15)。然而，b/h PIV3/hMPV F1(F在位置1)使上呼吸道(例如鼻甲)中感染hMPV的滴度仅降低了2.5log，虽然其在下呼吸道(例如肺)中提供了完全免受hMPV和hPIV3感染的保护(表15)。施用安慰剂培养基的动物在下呼吸道及上呼吸道中表现出高的攻毒病毒滴度(表15)。
本发明的范围不受特别说明的实施方案的限制，这些实施方案是作为本发明个别方面的单一解释，且任何在功能上相等的构建体、病毒或酶都在本发明范围内。实际上，除了在本文中显示和描述的以外，通过说明的描述和附图，本发明的各种变型对于本领域技术人员来说是显而易见的。这样的变型包括在权利要求书范围内。
本申请中引述的各种出版物，其内容作为一个整体在此引入作为参考。
表16
序列表的文字说明
SEQ ID NO：1人间质肺病毒分离株00-1基质蛋白(M)及融合蛋白(F)基因
SEQ ID NO：2禽类肺病毒融合蛋白基因，部分cds
SEQ ID NO：3禽类肺病毒分离株1b融合蛋白mRNA，全cds
SEQ ID NO：4火鸡鼻气管炎病毒融合蛋白(F1和F2亚基)的基因，全cds
SEQ ID NO：5禽类肺病毒基质蛋白(M)基因，部分cds，以及禽类肺病毒融合糖蛋白(F)基因，全cds
SEQ ID NO：6副粘病毒F蛋白hRSV B
SEQ ID NO：7副粘病毒F蛋白hRSV A2
SEQ ID NO：8人间质肺病毒01-71(部分序列)
SEQ ID NO：9人间质肺病毒分离株00-1基质蛋白(M)及融合蛋白(F)基因
SEQ ID NO：10禽类肺病毒融合蛋白基因，部分cds
SEQ ID NO：11禽类肺病毒分离株1b融合蛋白mRNA，全cds
SEQ ID NO：12火鸡鼻气管炎病毒融合蛋白(F1和F2亚基)的基因，全cds
SEQ ID NO：13禽类肺病毒融合糖蛋白(F)基因，全cds
SEQ ID NO：14火鸡鼻气管炎病毒(毒株CVL14/1)附着蛋白(G)mRNA，全cds
SEQ ID NO：15火鸡鼻气管炎病毒(毒株6574)附着蛋白(G)，全cds
SEQ ID NO：16火鸡鼻气管炎病毒(毒株CVL14/1)附着蛋白(G)mRNA，全cds
SEQ ID NO：17火鸡鼻气管炎病毒(毒株6574)附着蛋白(G)，全cds
SEQ ID NO：18 HMPV分离株NL/1/00的F蛋白序列
SEQ ID NO：19 HMPV分离株NL/17/00的F蛋白序列
SEQ ID NO：20 HMPV分离株NL/1/99的F蛋白序列
SEQ ID NO：21 HMPV分离株NL/1/94的F蛋白序列
SEQ ID NO：22 HMPV分离株NL/1/00的F-基因序列
SEQ ID NO：23 HMPV分离株NL/17/00的F-基因序列
SEQ ID NO：24  HMPV分离株NL/1/99的F-基因序列
SEQ ID NO：25  HMPV分离株NL/1/94的F-基因序列
SEQ ID NO：26  HMPV分离株NL/1/00的G蛋白序列
SEQ ID NO：27  HMPV分离株NL/17/00的G蛋白序列
SEQ ID NO：28  HMPV分离株NL/1/99的G蛋白序列
SEQ ID NO：29  HMPV分离株NL/1/94的G蛋白序列
SEQ ID NO：30  HMPV分离株NL/1/00的G-基因序列
SEQ ID NO：31  HMPV分离株NL/17/00的G-基因序列
SEQ ID NO：32  HMPV分离株NL/1/99的G-基因序列
SEQ ID NO：33  HMPV分离株NL/1/94的G-基因序列
SEQ ID NO：34  HMPV分离株NL/1/00的L蛋白序列
SEQ ID NO：35  HMPV分离株NL/17/00的L蛋白序列
SEQ ID NO：36  HMPV分离株NL/1/99的L蛋白序列
SEQ ID NO：37  HMPV分离株NL/1/94的L蛋白序列
SEQ ID NO：38  HMPV分离株NL/1/00的L-基因序列
SEQ ID NO：39  HMPV分离株NL/17/00的L-基因序列
SEQ ID NO：40  HMPV分离株NL/1/99的L-基因序列
SEQ ID NO：41  HMPV分离株NL/1/94的L-基因序列
SEQ ID NO：42  HMPV分离株NL/1/00的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：43  HMPV分离株NL/17/00的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：44  HMPV分离株NL/1/99的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：45  HMPV分离株NL/1/94的M2-1蛋白序列
SEQ ID NO：46  HMPV分离株NL/1/00的M2-1基因序列
SEQ ID NO：47  HMPV分离株NL/17/00的M2-1基因序列
SEQ ID NO：48  HMPV分离株NL/1/99的M2-1基因序列
SEQ ID NO：49  HMPV分离株NL/1/94的M2-1基因序列
SEQ ID NO：50  HMPV分离株NL/1/00的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：51  HMPV分离株NL/17/00的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：52  HMPV分离株NL/1/99的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：53  HMPV分离株NL/1/94的M2-2蛋白序列
SEQ ID NO：54  HMPV分离株NL/1/00的M2-2基因序列
SEQ ID NO：55  HMPV分离株NL/17/00的M2-2基因序列
SEQ ID NO：56  HMPV分离株NL/1/99的M2-2基因序列
SEQ ID NO：57  HMPV分离株NL/1/94的M2-2基因序列
SEQ ID NO：58  HMPV分离株NL/1/00的M2基因序列
SEQ ID NO：59  HMPV分离株NL/17/00的M2基因序列
SEQ ID NO：60  HMPV分离株NL/1/99的M2基因序列
SEQ ID NO：61  HMPV分离株NL/1/94的M2基因序列
SEQ ID NO：62  HMPV分离株NL/1/00的M蛋白序列
SEQ ID NO：63  HMPV分离株NL/17/00的M蛋白序列
SEQ ID NO：64  HMPV分离株NL/1/99的M蛋白序列
SEQ ID NO：65  HMPV分离株NL/1/94的M蛋白序列
SEQ ID NO：66  HMPV分离株NL/1/00的M基因序列
SEQ ID NO：67  HMPV分离株NL/17/00的M基因序列
SEQ ID NO：68  HMPV分离株NL/1/99的M基因序列
SEQ ID NO：69  HMPV分离株NL/1/94的M基因序列
SEQ ID NO：70  HMPV分离株NL/1/00的N蛋白序列
SEQ ID NO：71  HMPV分离株NL/17/00的N蛋白序列
SEQ ID NO：72  HMPV分离株NL/1/99的N蛋白序列
SEQ ID NO：73  HMPV分离株NL/1/94的N蛋白序列
SEQ ID NO：74  HMPV分离株NL/1/00的N基因序列
SEQ ID NO：75  HMPV分离株NL/17/00的N基因序列
SEQ ID NO：76  HMPV分离株NL/1/99的N基因序列
SEQ ID NO：77  HMPV分离株NL/1/94的N基因序列
SEQ ID NO：78  HMPV分离株NL/1/00的P蛋白序列
SEQ ID NO：79  HMPV分离株NL/17/00的P蛋白序列
SEQ ID NO：80  HMPV分离株NL/1/99的P蛋白序列
SEQ ID NO：81  HMPV分离株NL/1/94的P蛋白序列
SEQ ID NO：82  HMPV分离株NL/1/00的P基因序列
SEQ ID NO：83  HMPV分离株NL/17/00的P基因序列
SEQ ID NO：84  HMPV分离株NL/1/99的P基因序列
SEQ ID NO：85  HMPV分离株NL/1/94的P基因序列
SEQ ID NO：86  HMPV分离株NL/1/00的SH蛋白序列
SEQ ID NO：87  HMPV分离株NL/17/00的SH蛋白序列
SEQ ID NO：88  HMPV分离株NL/1/99的SH蛋白序列
SEQ ID NO：89  HMPV分离株NL/1/94的SH蛋白序列
SEQ ID NO：90  HMPV分离株NL/1/00的SH基因序列
SEQ ID NO：91  HMPV分离株NL/17/00的SH基因序列
SEQ ID NO：92  HMPV分离株NL/1/99的SH基因序列
SEQ ID NO：93  HMPV分离株NL/1/94的SH基因序列
SEQ ID NO：94分离株NL/1/99(99-1)HMPV(人间质肺病毒)cDNA序列
SEQ ID NO：95分离株NL/1/00(00-1)HMPV cDNA序列
SEQ ID NO：96分离株NL/17/00HMPV cDNA序列
SEQ ID NO：97分离株NL/1/94HMPV cDNA序列
SEQ ID NO：98分离株NL/1/00(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：99分离株BR/2/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：100分离株FL/4/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：101分离株FL/3/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：102分离株FL/8/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：103分离株FL/10/01(A1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：104分离株NL/10/01(A1)的G-基因编码序列
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SEQ ID NO：106分离株NL/17/00(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：107分离株NL/1/81(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：108分离株NL/1/93(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：109分离株NL/2/93(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：110分离株NL/3/93(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：111分离株NL/1/95(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：112分离株NL/2/96(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：113分离株NL/3/96(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：114分离株NL/22/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：115分离株NU24/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：116分离株NL/23/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：117分离株NL/29/01(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：118分离株NL/3/02(A2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：119分离株NL/1/99(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：120分离株NL/11/00(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：121分离株NL/12/00(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：122分离株NU5/01(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：123分离株NL/9/01(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：124分离株NL/21/01(B1)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：125分离株NL/1/94(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：126分离株NL/1/82(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：127分离株NL/1/96(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：128分离株NL/6/97(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：129分离株NL/9/00(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：130分离株NL/3/O1(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：131分离株NL/4/01(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：132分离株UK/5/01(B2)的G-基因编码序列
SEQ ID NO：133分离株NL/1/00(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：134分离株BR/2/01(A1)的G-蛋白序列
SEQID NO：135分离株FL4/01(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：136分离株FL/3/01(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：137分离株FL/8/01(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：138分离株FL/10/01(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：139分离株NL/10/01(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：140分离株NL/2/02(A1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：141分离株NL/17/00(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：142分离株NL/1/81(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：143分离株NL/1/93(A2)的G-蛋白序列
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SEQ ID NO：145分离株NL/3/93(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：146分离株NL/1/95(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：147分离株NL/2/96(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：148分离株NL/3/96(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：149分离株NL/22/01(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：150分离株NL/24/01(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：151分离株NL/23/01(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：152分离株NL/29/01(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：153分离株NL/3/02(A2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：154分离株NL/1/99(B1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：155分离株NL/11/00(B1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：156分离株NL/12/00(B1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：157分离株NL/5/01(B1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：158分离株NL/9/01(B1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：159分离株NL/21/01(B1)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：160分离株NL/1/94(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：161分离株NL/1/82(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：162分离株NL/1/96(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：163分离株NL/6/97(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：164分离株NL/9/00(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：165分离株NL/3/01(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：166分离株NL/4/01(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：167分离株NL/5/01(B2)的G-蛋白序列
SEQ ID NO：168分离株NL/1/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：169分离株UK/1/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：170分离株NL/2/00的F-基因编码序列
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SEQ ID NO：177分离株UK/7/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：178分离株FL/10/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：179分离株NL/6/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：180分离株NL/8/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：181分离株NL/10/01的F-基因编码序列
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SEQ ID NO：183分离株NL/20/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：184分离株NL/25/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：185分离株NL/26/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：186分离株NL/28/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：187分离株NL/30/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：188分离株BR/2/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：189分离株BR/3/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：190分离株NL/2/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：191分离株NU4/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：192分离株NL/5/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：193分离株NL/6/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：194分离株NL/7/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：195分离株NL/9/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：196分离株FL/1/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：197分离株NL/1/81的F-基因编码序列
SEQ ID NO：198分离株NUI/93的F-基因编码序列
SEQ ID NO：199分离株NL/2/93的F-基因编码序列
SEQ ID NO：200分离株NL/4/93的F-基因编码序列
SEQ ID NO：201分离株NL/1/95的F-基因编码序列
SEQ ID NO：202分离株NL/2/96的F-基因编码序列
SEQ ID NO：203分离株NL/3/96的F-基因编码序列
SEQ ID NO：204分离株NL/1/98的F-基因编码序列
SEQ ID NO：205分离株NL/17/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：206分离株NL/22/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：207分离株NL/29/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：208分离株NL/23/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：209分离株NL/17/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：210分离株NL/24/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：211分离株NL/3/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：212分离株NL/3/98的F-基因编码序列
SEQ ID NO：213分离株NL/1/99的F-基因编码序列
SEQ ID NO：214分离株NL/2/99的F-基因编码序列
SEQ ID NO：215分离株NL/3/99的F-基因编码序列
SEQ ID NO：216分离株NL/11/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：217分离株NL/12/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：218分离株NL/1/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：219分离株NL/5/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：220分离株NL/9/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO  221分离株NL/19/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：222分离株NL/21/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：223分离株UK/11/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：224分离株FL/1/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：225分离株FL/2/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：226分离株FL/5/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：227分离株FL/7/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：228分离株Fl/9/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：229分离株UK/10/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：230分离株NL/1/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：231分离株NL/1/94的F-基因编码序列
SEQ ID NO：232分离株NL/1/96的F-基因编码序列
SEQ ID NO：233分离株NL/6/9的F-基因编码序列7
SEQ ID NO：234分离株NL/7/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：235分离株NL/9/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：236分离株NL/19/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：237分离株NL/28/00的F-基因编码序列
SEQ ID NO：238分离株NL/3/0的F-基因编码序列1
SEQ ID NO：239分离株NL/4/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：240分离株NL/11/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：241分离株NL/15/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：242分离株NL/18/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：243分离株FL/6/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：244分离株UK/5/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：245分离株UK/8/01的F-基因编码序列
SEQ ID NO：246分离株NL/12/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：247分离株HK/1/02的F-基因编码序列
SEQ ID NO：248分离株NL/1/00的F-蛋白序列
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SEQ ID NO：251分离株NL/13/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：252分离株NL/14/00的F-蛋白序列
SEQ ID NO：253分离株FL/3/01的F-蛋白序列
SEQ ID NO：254分离株FL/4/01的F-蛋白序列
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Claims (48)

1.嵌合3型牛副流感病毒，所述病毒包含编码间质肺病毒多肽的异源核苷酸序列。
2.嵌合3型人副流感病毒，所述病毒包含编码间质肺病毒多肽的异源核苷酸序列。
3.嵌合3型牛副流感病毒/3型人副流感病毒，所述病毒包含编码间质肺病毒多肽的异源核苷酸序列。
4.权利要求1、2或3的病毒，其中所述病毒包含源自相同间质肺病毒基因的异源核苷酸序列。
5.权利要求1、2或3的病毒，其中所述病毒包含源自至少两种不同间质肺病毒基因的异源核苷酸序列。
6.权利要求1、2或3的病毒，其中在所述病毒的基因组中的一个或多个开放阅读框已经被编码一种或多种以下蛋白的ORF代替：(i)禽类肺病毒(APV)F蛋白；(ii)APV G蛋白；(iii)APV SH蛋白；(iv)APVN蛋白；(v)APV P蛋白；(vi)APV M2蛋白；(vii)APV M2-1蛋白；(viii)APV M2-2蛋白；或(ix)APV L蛋白。
7.权利要求1、2或3的病毒，其中在所述病毒的基因组中的一个或多个开放阅读框已经被编码一种或多种以下蛋白的ORF代替：(i)哺乳动物间质肺病毒(MPV)F蛋白；(ii)哺乳动物MPV G蛋白；(iii)哺乳动物MPV SH蛋白；(iv)哺乳动物MPV N蛋白；(v)哺乳动物MPVP蛋白；(vi)哺乳动物MPV M2蛋白；(vii)哺乳动物MPV M2-1蛋白；(viii)哺乳动物MPV M2-2蛋白；或(ix)哺乳动物MPV L蛋白。
8.权利要求6的病毒，其中所述禽类肺病毒是A型APV、B型APV、C型APV或D型APV。
9.权利要求7的病毒，其中所述哺乳动物MPV是变种A1、变种A2、变种B1或变种B2。
10.权利要求1、2或3的病毒，其中将所述异源核苷酸序列加到所述病毒的完整基因组中。
11.权利要求1、2或3的病毒，其中在所述副流感病毒基因组的核苷酸位置104、1774和3724加入所述异源核苷酸序列。
12.权利要求1、2或3的病毒，其中所述副流感病毒的核苷酸序列已经被所述异源核苷酸序列代替。
13.权利要求1、2或3的病毒，其中将所述异源序列插入到所述副流感病毒的基因组内，且其中已经删除了该基因组的一个或多个基因。
14.权利要求1的病毒，其中所述牛副流感病毒是Kansas株3型牛副流感病毒。
15.权利要求1、2或3的病毒，其中所述异源核苷酸序列源自编码F蛋白、G蛋白或其片段的核苷酸序列。
16.权利要求15的病毒，其中所述F蛋白包含间质肺病毒的F蛋白的胞外结构域、副流感病毒的F蛋白的跨膜结构域以及副流感病毒的F蛋白的鲁米那结构域。
17.权利要求1、2或3的病毒，其中所述核苷酸序列是SEQ IDNO：1至5、14或15。
18.权利要求1、2或3的病毒，其中所述核苷酸序列编码SEQ IDNO：6至13、16或17的蛋白。
19.权利要求1、2或3的病毒，其中所述病毒还包含源自呼吸道合胞病毒或呼吸道合胞病毒的突变形式的异源核苷酸序列。
20.权利要求19的病毒，其中所述呼吸道合胞病毒是A型呼吸道合胞病毒、B型呼吸道合胞病毒、牛呼吸道合胞病毒或禽类呼吸道合胞病毒。
21.权利要求19的病毒，其中所述序列源自编码所述呼吸道合胞病毒的F蛋白、G蛋白或其片段的核苷酸序列。
22.权利要求1、2或3的嵌合副流感病毒，其中除了所述异源核苷酸序列之外，所述病毒的基因组还含有突变或修饰，所述突变或修饰使嵌合病毒具有更适合用于疫苗制剂的表型，例如减毒表型或具有增强的抗原性的表型。
23.权利要求1、2或3的嵌合副流感病毒，其中所述异源核苷酸序列的基因间隔区被改变。
24.权利要求1、2或3的嵌合副流感病毒，其中在选自位置1、2、3、4、5和6的副流感病毒基因组的位置加入所述异源核苷酸序列，且其中所述异源核苷酸序列的基因间隔区被改变。
25.编码权利要求1、2或3的病毒的基因组的重组DNA或RNA分子。
26.编码权利要求18的病毒的基因组的重组DNA或RNA分子。
27.疫苗制剂，其中包含权利要求1、2或3的嵌合病毒以及可药用赋形剂。
28.疫苗制剂，其中包含权利要求18的嵌合病毒以及可药用赋形剂。
29.权利要求27的疫苗制剂，其中所述嵌合病毒包含基因组修饰或突变，所述修饰或突变产生减毒表型或增强的抗原性。
30.权利要求29的疫苗制剂，其中所述修饰或突变源自天然发生的突变体。
31.权利要求27的疫苗制剂，其中所述疫苗是用于调节人、灵长类动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、禽类或啮齿动物的免疫应答。
32.权利要求30的疫苗制剂，其中所述疫苗是用于调节人婴幼儿或儿童的免疫应答。
33.免疫原性制剂，其中包含权利要求1、2或3的嵌合病毒以及可药用赋形剂。
34.免疫原性制剂，其中包含权利要求18的嵌合病毒以及可药用赋形剂。
35.权利要求33的免疫原性制剂，其中所述嵌合病毒包含基因组修饰或突变，所述修饰或突变产生减毒表型或增强的抗原性。
36.权利要求35的免疫原性制剂，其中所述修饰或突变源自天然发生的突变体。
37.权利要求33的疫苗制剂，其中所述疫苗是用于调节人、灵长类动物、马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫、禽类或啮齿动物的免疫应答。
38.权利要求36的疫苗制剂，其中所述疫苗是用于调节人婴幼儿或儿童的免疫应答。
39.治疗或预防哺乳动物中呼吸道感染的方法，所述方法包括施用权利要求27的疫苗。
40.权利要求39的方法，其中所述呼吸道感染是MPV感染。
41.权利要求39的方法，其中所述呼吸道感染是MPV、RSV、hPIV感染或其组合。
42.权利要求39的方法，其中所述个体是人。
43.权利要求42的方法，其中所述人个体小于5岁。
44.权利要求42的方法，其中所述人个体小于2岁。
45.权利要求42的方法，其中除了呼吸道感染之外，所述个体还患有其它疾病或病症.
46.权利要求45的方法，其中所述疾病或病症是囊性纤维化、白血病、非霍奇金淋巴瘤、哮喘以及骨髓和肾移植。
47.权利要求42的人个体，其中所述人个体是免疫受损个体。
48.权利要求42的人个体，其中所述人个体是老年人。
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