KR101577397B1 - 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5는 돼지 및 그로부터 2차 감염되는 개체의 파라인플루엔자 바이러스 감염질환을 예방하기 위한 백신 또는 진단 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 숙주 동물에서 특이적인 임상증상을 나타내지 않으며, 상기 바이러스를 높은 역가로 배양할 수 있으므로 이를 이용한 바이러스 기반 벡터로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트{Novel porcine parainfluenza virus 5(pPIV5), composition comprising thereof and diagnostic kits of the novel porcine parainfluenza virus}

본 발명은 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트에 관한 것이다.

파라인플루엔자 바이러스는 파라믹소 바이러스과(Paramyxoviridae)의 파라믹소 바이러스(Paramyxovirus) 속에 포함되며, 혈청형은 5형으로 나누어져 있고, 각각의 숙주가 알려져 있다. 1형(센다이 바이러스 또는 HVJ)은 돼지, 마우스, 기니피그, 햄스터, 사람, 2형은 사람, 원숭이, 개, 3형은 소(수송열), 말, 면양, 사람 4형은 사람, 5형은 2형과 같으며, 그 외 칠면조에 감염되는 칠면조 파라인플루엔자 바이러스 (turkey para influenza virus)가 있다.

파라인플루엔자 바이러스 5(parainfluenza virus 5, PIV5)는 비분절화 음성 가닥 RNA 바이러스(non-segmented negative strand RNA virus: NNSV)로 1956년에 처음 원숭이에서 분리되어 당시에는 시미안 바이러스 5(simian virus 5: SV5)로 불리었다. 그러나 이후 원숭이 및 SV와 관련성이 없는 것으로 입증되어 2009년에 International Committee on Taxonomy of Viruses에서 PIV5로 재분류되었다. PIV5는 켄넬 코프(kennel cough)로 알려진 개의 전염성 기관지염의 원인으로 주목 받고 있다.

돼지의 파라인플루엔자 바이러스는 2차 감염의 가능성과 치사율이 다양하기 때문에 백신으로 예방하는 것이 중요하다. 이러한 배경 하에, 본 발명자들은 자돈의 폐와 소장 샘플로부터 분리 배양한 불멸화 돼지 폐포대식세포(PAM)로부터 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5형 바이러스를 분리하였고, 상기 바이러스의 염기서열 분석을 실시하였다. 그 결과 분리된 신규한 바이러스가 원형(Prototype)인 PIV5와 비교하여 대부분의 유전자에서 98% 이상의 높은 상동성을 나타냈으나, SH 유전자의 경우 아미노산 수치에서 74.4%의 낮은 상동성을 보이는 것을 확인하였고, 나아가 상기 바이러스의 병원성을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5), 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 이용한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 검정 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5는 돼지 및 그로부터 2차 감염되는 개체의 파라인플루엔자 바이러스 감염질환을 예방하기 위한 백신 또는 진단 용도로서 매우 유용하게 사용될 수 있으며, 숙주 동물에서 특이적인 임상증상을 나타내지 않으며, 상기 바이러스를 높은 역가로 배양할 수 있으므로 이를 이용한 바이러스 기반 벡터로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5로 감염된 PAM 세포의 세포변성효과(CPE)를 100배 배율의 도립현미경으로 관찰한 사진(A) 및 전자현미경으로 관찰한(B) 사진이다.
도 2는 PIV5 및 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 SH 유전자의 뉴클레오티드 서열 정렬을 나타낸 도이다.
도 3은 Paramyxoviridae 과에 속하는 36개의 파라믹소바이러스들의 인단백질(P) 유전자(도 3A) 및 13개의 PIV5 분리주의 융합(F) 유전자(도 3B)의 뉴클레오티드 서열을 계통발생적으로 분석한 도이다. 기준자는 염기서열간의 불일치를 나타내는 거리(distance)를 의미한다.
도 4는 PAM 세포, PK-15 세포, ST 세포, HeLa 세포, HEK-293T 세포, Vero 세포, MDBK 세포, 및 BGK-21 세포에 1의 감염다중도(MOI)로 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5를 감염시킨 후, 24시간 후에 촬영한 도이다.
도 5는 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포, PK-15 세포, 및 ST 세포에 대한 본 발명에 따른 신규한 바이러스 역가를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포의 혈구 응집반응을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포의 면역 관련 유전자의 mRNA 발현을 나타낸 도이다(*, P = 0.001 에서 0.05; †, P < 0.001).
도 8은 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 접종 돼지의 바이러스-중화 항체의 역가를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5(pPIV5)를 제공한다.

본 발명의 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 PIV5(parainfluenza virus 5)형 파라인플루엔자 바이러스이다.

구체적으로, 본 발명자는 자돈의 폐와 소장 샘플로부터 분리 배양한 불멸화 돼지 폐대식세포(Porcine alveolar macrophage, PAM)에서 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5를 분리하였다. 분리된 신규한 바이러스는 원형(Prototype)인 PIV5와 비교하여 대부분의 유전자에서 98% 이상의 높은 상동성을 나타냈으나, SH 유전자의 경우 아미노산 수치에서 74.4%의 낮은 상동성을 보였다. 이에 본 발명자는 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5를 2013년 8월 14일자로 대한민국 대전시 유성구 어은동에 위치한 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여, 2013년 9월 16일자로 기탁번호 KCTC 12474BP를 부여받았다.

본 발명에서 사용된 용어 "상동성"이란 본 발명의 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스의 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 바람직하게는 90% 이상 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상 동일할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일반적으로, 단백질 상동물은 목적 단백질과 동일한 활성 부위를 포함할 것이다. 이러한 상동성 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 파라인플루엔자 바이러스 5 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 파라인플루엔자 바이러스 백신 조성물을 제공한다.

상기 항원은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분을 의미한다.

본 발명의 백신 조성물이 면역 반응을 일으킬 수 있는 숙주 동물은 인간, 개, 돼지, 닭, 오리, 칠면조 등을 포함할 수 있으며, 본 발명의 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5는 오직 돼지 유래의 세포주(PAM, PK-15, ST)에서만 특이적인 세포변성효과를 나타내므로 바람직하게는 돼지이다.

본 발명의 "백신"은 항원 물질을 포함하는 수의학용 백신이고 돼지 파라인플루엔자에 대하여 특이적이고 능동 또는 수동의 면역성을 유도하기 위한 목적으로 투여된다. 상기 백신은 약독화된 생독 백신 또는 사독 백신, 서브유닛 백신(subunit vaccine), 합성 백신(synthetic vaccine) 또는 유전공학 백신(genetic engineering vaccine)일 수 있으나, 효과적인 면역 반응을 유도하는 사독 백신이 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "생독 백신"이란 살아있는 바이러스 활성성분을 포함하는 백신을 의미한다. 또한 용어 "약독화된(attenuation)"이란 살아있는 병원체의 독성을 인공적으로 약하게 한 것으로, 병원체의 필수 대사에 관여하는 유전자를 변이시켜 체내에서 질병을 일으키지 못하고 면역 체계만을 자극해서 면역성을 유도하는 것을 의미한다. 바이러스의 약독화는 자외선(UV) 조사, 약품처리 또는 시험관 내 고차 연속 계대배양에 의해 달성될 수 있다. 약독화는 또한 명확한 유전 변화를 만듦으로써, 예를 들어 독성을 제공하는 것으로 알려진 바이러스 서열의 특정 결실 또는 바이러스 게놈 내로의 서열의 삽입에 의해 달성될 수 있다. 용어 "사독 백신"이란 불활화 백신 또는 사균 백신이라고도 하며, 죽은 바이러스를 포함한 백신이다. 이의 예로는 전 바이러스 백신(whole-virus vaccine)과 분할 백신(split vaccine)이 있으며, 이들은 공지된 방법으로 용이하게 제조가능하다. 예컨대 전 바이러스 백신은 바이러스 전체에 포르말린을 처리하여 제조할 수 있으며, 분할 백신은 바이러스에 에테르를 처리하여 외피만을 분쇄, 수득하여 제조할 수 있다. 용어 "서브유닛 백신"은 바이러스의 구성성분 중 면역기능을 일으킬 수 있는 항원 성분만을 추출하여 제조한 백신으로, 바이러스 방어에 필요한 항원 부위에 대해서면 면역형성을 유도함으로써 부작용을 최소화할 수 있다. "유전공학 백신"은 바이러스의 병원성을 일으키는 특이 유전자를 변형하거나 제거한 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 백신은 돼지에 발생하는 파라인플루엔자 이외의 질병을 예방하기 위하여 사용되는 다른 백신의 제조에 사용되는 불활화된 균체들 또는 항원들과 혼합하여 인플루엔자를 포함한 다른 질병들을 함께 예방할 수 있는 혼합 또는 복합 백신으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 백신 조성물은 추가적으로 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 용매로는 생리식염수 또는 증류수가 있으며, 면역증강제로는 프레운즈(Freund's) 불완전체 또는 완전체 어쥬번트, 알루미늄 하이드록사이드 겔과 식물성 및 광물성 오일 등이 있으며, 부형제로는 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드 또는 알루미늄 포타슘 설페이트가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자가 기술자에게 잘 알려진 백신 제조에 사용되는 물질을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물을 경구형 또는 비경구형 제제로 제조할 수 있으며, 바람직하게는 비경구형 제제인 주사 액제로 제조하며, 진피 내, 근육 내, 복막 내, 정맥 내, 비강 또는 경막 외(eidural) 경로로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 파라인플루엔자 바이러스 5 또는 이의 항원을 포함하는 PIV5형 돼지 파라인플루엔자 바이러스의 검정 키트를 제공한다. 본 발명의 파라인플루엔자 바이러스 5 또는 이의 항원은 항원-항체 복합체 반응을 통해 감염될 또는 감염된 세포 중의 파라인플루엔자 바이러스 5를 제거하는데 사용될 뿐만 아니라, 파라인플루엔자 바이러스 5를 특이적으로 검출하기 위해서도 사용될 수 있다.

이러한 검정 키트에는 본 발명의 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5 뿐만 아니라, 면역학적 분석에 사용되는 당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함될 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함될 수 있으나 이를 제한하는 것은 아니다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 적합한 담체로는, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액(PBS), 불용성 담체, 예를들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종리, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

항원-항체 복합체 형성은 조직면역 염색, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블럿(Western blotting), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산 분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나, 이로 제한되지는 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 비오틴 유도체 등이 있다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이롤로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)₈, [Os(bpy)3]²⁺, [RU(bpy)3]²⁺, [MO(CN)₈]^4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

또한 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5는 숙주 동물에서 특이적인 임상증상을 나타내지 않으며 상기 바이러스를 높은 역가로 배양할 수 있으므로 바이러스 기반 벡터로서 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

준비예 1. 바이러스의 분리

신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5를 분리하기 위하여, 2011년에 경상북도의 돼지 축사에서 호흡계에 문제가 있는 돼지새끼의 폐 조직을 분리하였다. 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Invitrogen) 및 1% 항생성-항진균성 용액이 추가된 RPM1 1640 배지에서 배양된 돼지폐포대식세포(porcine alveolar macrophage, PAM)에 상기 조직 샘플을 접종하였다. 접종된 세포는 5% CO₂ 및 37℃ 조건을 유지하며 배양하였으며, 매일 세포변성효과(cytopathic effect, CPE)를 관찰하였다. 배양 상청액은 세포의 70%에서 CPE가 나타날 때 수거하여, -80℃에서 보관하였다. 바이러스 상청액은 TE 완충용액(10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1mM EDTA)에서 준비된 20% 수크로오스 쿠션(sucrose cushion)(wt/vol)을 통하여, 4℃에서 2시간 동안 40,000 rpm으로 원심분리(P70AT rotor, CP100WX; Hitachi)하여 정제하였다. 상기 과정을 통해 신규한 돼지 파라인플루엔자 바이러스 5를 분리하였으며, 이를 2013년 8월 14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하여, 기탁번호 KCTC 12474BP를 부여받았다.

준비예 2. 세포의 준비

ST 및 베로 세포(Vero cell)는 10%의 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS, Invitrogen) 및 항생-항진균 용액(100x, Invitrogen)이 보충된 α-최소필수배지(alpha minimum essential medium, α-MEM, Invitrogen)에서 배양하였다. HeLa세포, 인간배아신장세포(HEK-293T), 및 새끼햄스터신장세포 (BHK-21)는 10%의 우태아혈청 및 항생-항진균 용액이 보충되고 높은 글루코오스를 처리한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에서 배양하였다. PK-15 및 MDBK(Marbin-Darby bovine kidney) 세포는 10%의 우태아혈청 및 항생-항진균 용액이 보충된 RPMI 1640(Rosewell Park Memorial Institue) 배지에서 배양하였다. 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포는 <Sagong et al., 2012>에 언급된 방법으로 배양하였고, 5% CO₂, 37℃에서 유지하였다.

실시예 1. 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 세포변성효과 및 관찰

상기 준비예 1에서 분리한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5(KCTC 12474BP)를 배양하기 위하여, PAM 세포에 본 바이러스를 37℃에서 1시간동안 0.1의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)로 감염시켰다. 대조군은 모의-감염(mock-infected)시켜서 배양하였다. 감염 24시간 후 바이러스-특이적 세포변성효과(CPE)를 100배의 배율의 도립현미경으로 관찰하였다. 또한 정제된 바이러스 현탁액을 2% 텅스텐 산(phosphotungstic acid)으로 염색(negatively stained)하여 투과형 전자현미경으로 관찰하였으며, 이의 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, 본 바이러스에 감염된 PAM 세포는 본 바이러스에 감염되어 뚜렷한 세포 라운딩(rounding) 및 응집(clumping)된 세포변성효과가 나타남을 확인하였다. 또한 도 1B의 상단은 배양 세포에서 나타나기 시작한 비리온(budding virion, 30,000)을, 하단은 정제된 비리온(100,000)을 나타낸 것으로, 이를 통해 상기 다형성 비리온의 직경은 약 50-200 nm임을 확인하였다.

실시예 2. RT-PCR, DNA 클로닝 및 서열 분석

상기 준비예 1에서 분리한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5(KCTC 12474BP)의 게놈 서열의 전체 길이를 알아보기 위하여, 유전자 분석을 실시하였다. RT-PCR 단편(fragments)을 얻기 위해 원형 PIV5(formerly SV5; GenBank accession no. NC_006430)의 알려진 서열을 바탕으로 올리고뉴클레오티드 프라이머를 선택하였다. 그 후에 RACE 실험 및 뉴클레오티드 시퀀싱을 위해, 상기 프라이머를 이용하여 새로 증폭된 신규한 바이러스 서열을 확인한 후, 본 바이러스 특이적인 새로운 프라이머를 합성하였다. 이용된 프라이머는 하기 표 1에 나타내었다.

Primer name	Nucleotide sequences	Purpose	Location (nt)
PIV5-NP-F	5′-ATGTCATCCGTGCTTAAAGC-3′	PCR	152-171
PIV5-NP-R	5′-CTAGATGTCAAGATCACCCA-3′	RT and PCR	1662-1681
KCTC 12474BP-3′ leader-R2	5′-CGGCTCATACCTGAACGAGC-3′	3′-RACE-PCR	503-522
KCTC 12474BP-3′ leader-R1	5′-GCATAGGCATTGATCTCTCC-3′	3′-RACE-PCR	524-543
KCTC 12474BP-3′ leader-F1	5′-GCAGAAGATCTACCTGACAC-3′	3′-RACE-PCR	551-570
KCTC 12474BP-3′ leader-F2	5′-CCATGCAACACCTCTCGTTG-3′	3′-RACE-PCR	557-577
KCTC 12474BP-3′ leader-RT	5′-GCAGTTCCCTCGACTTCGG-3′	3′-RACE-RT	600-618
KCTC 12474BP-NP/P junction-F	5′-TGCAGGCACCCATGATGATG-3′	PCR	1501-1520
KCTC 12474BP-NP/P junction-R	5′-GCATTGGTTAGTAGTCCTGT-3′	RT and PCR	1991-2010
PIV5-P-F	5′-ATGGATCCCACTGATCTGAG-3′	PCR	1850-1869
PIV5-P-R	5′-TCAAATTGCACTGCGGATGA-3′	RT and PCR	3007-3026
KCTC 12474BP-P/M junction-F	5′-GATTGAAGATCACACTAGAG-3′	PCR	2881-2990
KCTC 12474BP-P/M junction-R	5′-CTCCGACAATAGTATTCCCC-3′	RT and PCR	3341-3360
PIV5-M-F	5′-ATGCCATCCATCAGCATCCC-3′	PCR	3141-3160
PIV5-M-R	5′-TCATTCCAGCTCCGTCAGGT-3′	RT and PCR	4255-4274
KCTC 12474BP-M/F junction-F	5′-CTCTTATCGTGGAGACTACT-3′	PCR	4141-4160
KCTC 12474BP M/F junction-R	5′-CAACAATGAATGCTGATGAG-3′	RT and PCR	4661-4680
PIV5-F-F	5′-ATGGGTACTATAATTCAATT-3′	PCR	4530-4549
KCTC 12474BP-F-801-F	5′-GCAGATGGTCATAAAAAT-3′	Sequencing	5330-5347
PIV5-F-R	5′-TTATTTATGATAAACAAAAT-3′	RT and PCR	6100-6119
KCTC 12474BP-F/SH junction-F	5′-TCTGTCTTGGATCGTTAGGT-3′	PCR	6001-6020
PIV5-SH-F	5′-ATGCTGCCTGATCCGGAAGA-3′	PCR	6303-6322
PIV5-SH-R	5′-TTAGGACAGCAAGTGTCTTA-3′	RT and PCR	6418-6437
KCTC 12474BP-SH/HN junction-R	5′-ATGATTTGCTTTCGGGTTAT-3′	RT and PCR	6701-6720
PIV5-HN-F	5′-ATGGTTGCAGAAGATGCCCC-3′	PCR	6584-6603
KCTC 12474BP-HN-801-F	5′-TGATACAATCGTGGAGCG-3′	Sequencing	7384-7401
PIV5-HN-R	5′-TTAGGATAGTGTCACCTGAC-3′	RT and PCR	8262-8281
KCTC 12474BP-HN/L junction-F	5′-AACTTGTTTTAGGGACACAG-3′	PCR	8161-8180
KCTC 12474BP-HN/L junction-R	5′-TCTTCATGTGCTATCTGATT-3′	RT and PCR	8561-8580
PIV5-L-part 1-1-F	5′-ATGGCTGGGTCTCGGGAGAT-3′	PCR	8414-8433
PIV5-L-part 1-1-R	5′-AGCACACATAGACTCGCG-3′	RT and PCR	9554-9571
PIV5-L-part 1-2-F	5′-CACCCAGGATGAATTAAG-3′	PCR	9409-9426
KCTC 12474BP-L-10159-F	5′-CCATGCTGGGAAGTTAAT-3′	Sequencing	10159-10176
KCTC 12474BP-L-10909-F	5′-TAGCAAGAGAATATTCTATCA-3′	Sequencing	10909-10929
PIV5-L-part 1-2-R	5′-GTTCACAGTAGCCCGATCCA-3′	RT and PCR	11941-11960
PIV5-L-part 2-F	5′-GCAATGACACTTGAAACATG-3′	PCR	11801-11820
KCTC 12474BP-L-12701-F	5′-GCTGTAGATATGACAGGT-3′	Sequencing	12701-12718
KCTC 12474BP-L-13447-F	5′-CAATTACTACCTGACCAG-3′	Sequencing	13347-13464
PIV5-L-part 2-R	5′-TTAGATTTCCTCGCCATCGA-3′	RT and PCR	15162-15181
KCTC 12474BP-5′ trailer-RT	5′-GGTTGATCCTCCCACCTTC-3′	5′-RACE-RT	14847-14865
KCTC 12474BP-5′ trailer-R2	5′-CCTGCTTCACGATCATCCG-3′	5′-RACE-PCR	14870-14888
KCTC 12474BP-5′ trailer-R1	5′-CCTGAATATGCCGAATTCC-3′	5′-RACE-PCR	14893-14911
KCTC 12474BP-5′ trailer-F1	5′-CCATCCTCAATTCTGATCG-3′	5′-RACE-PCR	14919-14937
KCTC 12474BP-5′ trailer-F2	5′-CCTGAGGCTTTCTCCAAATA-3′	5′-RACE-PCR	14941-14960

전체 바이러스 게놈에 걸쳐서 중복된 cDNA 단편 및 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 바이러스성 RNA는 제조업체의 지침에 따라 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 정제된 바이러스 스톡(stock)에서 추출하였으며, 역전사는 바이러스 RNA 1μg과 특이적 역방향 프라이머(reverse primers)를 사용하여 PrimeScript 1st 가닥 cDNA 합성 키트(TaKaRa)로 수행하였다. PCR은 제조업사의 사용법에 따라 KOD Hot Start DNA 중합효소(Novagen)를 사용하여 각 cDNA 단편을 증폭하기 위해 수행하였다. 각각의 cDNA 증폭산물(amplicon)을 겔로 정제하였고, pGEM-T easy vector(Promega)에 클로닝하고, T7에 대한 프라이머, SP6 프로모터, 및 본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 특이적 프라이머를 이용하여 양 방향의 서열을 확인하였다. 바이러스 게놈의 리더 서열(leader sequence) 및 트레일러 서열(trailer sequence)은 RACE(rapid amplification of cDNA ends)로 확인하였다. 즉, 비리온(virion) RNA을 3＇리더 및 5＇트레일러 RT 프라이머를 사용하여 역전사(reverse transcribe) 하였다. cDNA 생성물은 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen)를 사용하여 정제하였고, Terminal Transferase(Roche)를 사용하여 Poly(A) 테일을 정제된 cDNA 생성물의 말단에 각각 첨가하는 3＇와 5＇ 테일링(tailing) 반응을 수행하였다. 그 후 QIAquick PCR 정제 키트를 사용하여 재정제하였다. PCR의 첫번째 반응은 아답터 프라이머(AP-dT17)와 리더 R1 또는 트레일러 F1 프라이머와 함께 poly(A) 테일이 부착된 cDNA 생성물 10μl를 사용하여 수행하였다. PCR의 두번째 반응은 아답터 프라이머와 리더 R2 또는 트레일러 F2 프라이머와 함께 첫번째 반응의 1:50 희석액 1μl를 사용하여 수행하였다. 각 반응으로부터 수득한 PCR 생성물을 겔로 정제하고 pGEM-T easy(Promega) 벡터로 클로닝하였으며, 각 반응의 두 클론을 서열분석하였다. 본 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 전체 게놈 시퀀스를 GeneBank에 기탁하였다(기탁번호 KC852177).

상기 실험에 의하여, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 완전한 게놈의 서열은 15,246개의 뉴클레오티드(nt)이며, 55-nt의 3＇리더, 14,701-nt의 단백질-코딩 지역(96.4% coding capacity), 및 31-nt의 5＇트레일러로 구성되어 있음을 알 수 있었다. 상기 바이러스의 게놈 길이는 PIV5의 2-1-6-1-2-1-6의 헥사머(hexamer) 위상 패턴인 "6의 법칙(rule of six)"과 일치하였다(Kolakofsky D, Pelet T, Garcin D, Hausmann S, Curran J, Roux L (1998) Paramyxovirus RNA synthesis and the requirement for hexamer genome length: the rule of six revisited. J Virol 72:891-899). 이러한 패턴은 각 N 모노머가 상기 바이러스 게놈의 6개의 nt와 상호작용하는, 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 조직에 관여하는 것으로 판단된다.

또한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 및 Rubularvirus 속에 속하는 다른 파라믹소바이러스의 단백질간의 뉴클레오티드 및 아미노산의 동질성을 비교하였으며, 이의 결과를 표 2 및 도 2에 나타내었다.

종	신규한 바이러스와 비교한 뉴클레오티드(nt) 및 아미노산(aa)의 동질성(%)
	NP		P		V		M		F		SH		HN		L
	nt	aa	nt	aa	nt	aa	nt	aa	nt	aa	nt	aa	nt	aa	nt	aa
PIV5	99.3	99.2	98.8	98.0	98.7	97.8	98.8	98.4	98.6	98.3	84.4	74.4	98.3	96.8	99.2	99.0
SER	-a	-a	99.4	98.5	-a	-a	99.7	100	99.7	99.5	-a	-a	99.5	99.1	-a	-a
LPMV	59.3	53.6	51.5	32.1	48.1	32.6	53.9	36.8	54.7	45.5	-b	-b	53.6	41.7	60.2	54.8
MuV	58.7	52.9	52.8	36.9	52.0	40.8	55.1	41.2	54	42.6	40.2	20.6	56.5	43.9	61.7	58.3
hPIV2	60.1	56.1	56.6	41.4	56.4	43.6	58.7	48.8	56.4	45.7	-b	-b	55.4	45.4	63.1	61.7
MENV	57.5	47.0	53.0	33.0	50.1	33.1	52.8	38.3	52.3	35.8	-b	-b	49.0	21.1	58.2	49.7
TioV	58.0	49.4	51.2	33.1	48.7	32.9	54.3	37.0	55.0	37.4	-b	-b	48.8	20.7	58.5	49.8

a : SER의 유전자에 P, M, F, 및 HN 유전자에 대한 서열정보만 있어서, 수치를 표시하지 않음.

b : LPMV, hPIV2, MENV, 및 TioV 바이러스에는 SH 단백질이 암호화 되지 않음.

표 2에 나타낸 바와 같이, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 및 Rubularvirus속에 속하는 다른 파라믹소바이러스의 단백질간의 뉴클레오티드 및 아미노산의 동질성을 확인하였다.

상기 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 게놈은 8개의 단백질을 암호화 할 수 있는 7개의 비중첩 유전자(nonoverlapping genes)를 포함하였다(3-N-V/P-M-F-SH-HN-L-5). 바이러스 게놈은 각각의 유전자 및 유전자의 경계 사이에 존재하는 1- 내지 22-nt 길이의 매우 다양한 유전자간 지역(intergenic regions)에서, GS(gene starts) 및 GE(gene dend)의 보존 서열(conserved sequences)를 갖고 있다. 전체-길이 서열의 분석에서 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 유전자는 뉴클레오티드 수준에서 원형 PIV5 균주와 98.7%의 상동성을 보였다. 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 3' 리더(leader) 및 5' 트레일러(trailer) 지역은 원형 균주와 개별적으로 90.9% 및 93.5%의 동일성(5 및 2 뉴클레오티드 차이)을 갖는 것으로 확인되었다. 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5와 원형 PIV5에서 추론된 아미노산 서열을 비교한 결과, 상동성은 N(99.2%), V/P(P)(98%), V/P(V)(97.8%), M(98.4%), F(98.3%), SH(74.4%), HN(96.8%), L(99%)로 나타났다.

또한, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5와 SER 바이러스의 폴리뉴클레오티드 서열을 비교한 결과 P(98.5%), M(100%), F(99.5%), 및 HN(99.1%)을 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 및 PIV5 균주의 SH 유전자의 뉴클레오티드 서열의 차이를 확인하였다. 도 2에서 표시된 숫자는 PIV5 게놈의 뉴클레오티드 위치이며, SH 유전자의 전사 조절 서열을 시작하고 중지시키는 보존된 유전자는 점선 상자로 표시하였고, SH 유전자의 ORF는 회색으로 표시하였다. 또한, 양 바이러스에서 SH 유전자의 번역을 개시하고 종결하는 코돈은 실선 상자로 표시하였고, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 개시 및 종결코돈의 돌연변이는 별표와 함께 밑줄이 표시된 볼드체로 나타내었다. PIV5의 SH 유전자는 5-aa C-터미널 ectodomain, 23-aa TM domain, 및 N-터미널 16-aa cytoplasmic region으로 이루어진 44 aa 잔기(residue)의 타입 Ⅱ 막 단백질(membrane protein)이다. 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 게놈은 292nt의 SH 유전자를 암호화하고 있으며, 135nt 길이의 single ORF(open reading frame)를 포함하였다. 그러나, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5와 원형 PIV5의 SH 유전자는 74.4%의 낮은 상동성(similarity)를 가지며, 뉴클레오티드가 가장 상이한 곳은 개시코돈(start codon) 및 종결코돈(stop codon)이었다. PIV5 SH 유전자의 ATG 및 TAA triplets이 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에서는 ACG 및 CAA로 각각 바뀌기 때문에, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5는 ORF의 인식에 장애가 발생하여 SH 유전자의 발현의 결핍이 발생할 수 있음을 확인하였고, 이를 통해 본 발명의 신규한 바이러스는 돼지 파라인플루엔자 5의 신종임을 확인하였다.

실시예 3. 다중 정렬(Multiple alignments) 및 계통 분석

상기 준비예 1에서 분리한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 유전적 연관성을 알아내기 위해, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 전체 길이의 게놈, NP, P, 또는 M 단백질 및 파라믹소 바이러스과의 5개 대표적인 다른 균주를 이용하여 계통발생 분석(phylogenetic analyses)을 수행하였다. 파라믹소 바이러스과에 속하는 35개의 파라믹소바이러스의 인단백질(phosphoprotein, P) 유전자 서열 및 12개의 PIV5 균주의 융합(fusion, F) 유전자 서열들을 독립적으로 서열 정렬 및 계통 분석에 사용하였다. 다중-서열 정렬은 ClustalX 1.83을 이용하여 수행하였으며, 염기서열이 차이나는 백분율 또한 동일한 프로그램을 사용하였다. 계통수(Phylogenetic trees)는 인접 결합 방법(neighborjoining method)을 이용하여 정렬된 염기서열로부터 구축하였으며, 이는 트리 내부의 각 노드에서 비율 신뢰도 값을 결정하기 위해 1,000 반복을 부트스트랩 분석(bootstrap analysis)하였다. 모든 트리는 TreeView 프로그램을 사용하여 제작되었다.

사용된 바이러스 서열은, Atlantic salmon pararmyxovirus (ASPV-Ro), EU646380; avian metapneumovirus (aMPV-15a), NC_007652; avian pararmyxovirus 2, EU338414; avian pararmyxovirus 6, NC_003043; Beilong virus (BeV), NC_007803; bPIV3-910N, D84095; bPIV3 strain Kanas/15626/84, AF178654; bPIV3-SF, AF178655; bPIV3-Q5592, EU277658; bovine respiratory syncytial virus (bRSV), NC_001989; canine distemper virus (CDV), NC_001921; dolphin morbillivirus (DMV), NC_005283; Fer-de-Lance virus, NC_005084; Hendra virus (HeV), AF017149; human metapneumovirus, NC_004148; hPIV1 strain Washington/1964 (hPIV1-Wa), NC_003461; hPIV2, NC_003443; hPIV3, AB012132; hPIV3-GPv, NC_001796; hPIV3-JS, Z11575; human RSV (hRSV), NC_001781; J-virus, NC_007454; measles virus, NC_001498; Menangle virus, NC_007620; Mossman virus (MoV), NC_005339; mumps virus (MuV), NC_002200; Newcastle disease virus (NDV), NC_002617; Nipha virus (NiV), NC_002728; pestedes-petits-ruminants virus, NC_006383; porcine rubulavirus (LPMV), NC_009640; rinderpest virus (strain Kabete O), NC_006296; Sendai virus (SeV), NC_001552; simian PIV5 (SV5), NC_006430; Tioman virus (TioV), NC_004074; Tupia pararmyxovirus (TPMV), NC_002199; Porcine PIV5-SER, AJ278916.1; PIV5-W3A, NC_006430; Simian PIV5-WR, AB021962.1; PIV5-MEL, AJ749988.1; PIV5-LN, AJ749987.1; PIV5-MIL, AJ749989.1; PIV5-DEN, AJ749986.1; PIV5-T1, AB033629; PIV5-78524, AJ749990.1; PIV5-H221, AJ749991.1; PIV5- CPI+, AJ278916.1; PIV5-CPI-, AJ278916.1 이다.

상기 방법을 이용하여, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5와 파라믹소 바이러스과에 속하는 36개의 파라믹소바이러스의 인단백질(P) 유전자의 뉴클레오티드 서열을 계통 발생적으로 분석(도 3A) 하였으며, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5와 13개의 PIV5 분리주의 융합(F) 유전자의 뉴클레오티드 서열을 계통 발생적으로 분석(도 3B)하여, 1000번 반복시 500번 이상인 것을 도 3에 나타내었다.

실시예 4. 세포에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 세포변성효과(CPE)

본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 세포에 따른 세포변성효과(CPE)를 확인하기 위하여, PAM 세포, PK-15 세포, ST 세포, HeLa 세포, HEK-293T 세포, Vero 세포, MDBK 세포, 및 BGK-21 세포에 1의 감염다중도(MOI)로 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5를 각각 감염시킨 후, 세포변성효과를 관찰하였다. 또한, 감염 24시간 후(24hpi)에 100배의 배율의 도립현미경을 사용하여 이를 촬영하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5는 돼지로부터 유래한 세포에서는 CPE나 바이러스 복제의 다른 징후가 나타났으나, 다른 세포에서는 그러한 징후가 나타나지 않음을 확인하였다. 또한, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5는 불멸화된 PAM 세포에서 감염 12시간 내에 세포변성효과(라운딩 및 응집)가 관찰되었다. 따라서 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5가 돼지로부터 유래한 세포를 특이적으로 선호함을 확인하였다.

실시예 5. 바이러스 역가측정(Virus titration)

본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포, PK-15 세포, 및 ST 세포에 대한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 역가를 측정하기 위하여, 각각의 세포를 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염시키고, 감염 1, 6, 12, 18, 24시간 후에 배양 상청액을 취하여 -80℃에서 보관하였다. 바이러스의 역가(titer)는 96 웰 플레이트에 담긴 각 세포의 혈청 샘플을 10배 단계 희석(serial dilution)하여 측정하였으며, 접종된 조직 배양의 세포변성효과(CPE)를 50% 발생시키기 위한 바이러스의 양으로 결정하였다. 또한 Spearman-Karber 방법(Finney, 1978)을 이용하여 50%의 조직 배양 감염량(Tissue Culture infectious dose, TCID₅₀)을 계산하고 이를 3중 웰(triplicate wells)의 평균으로 나타내었으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5는 빠르고 효율적으로 본 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포에서 복제되며, 감염 1일 후에 ~10⁸×TCID₅₀/ml의 역가에 도달함을 확인하였다. PK-15 세포 또한 본 신규한 바이러스에 감염된 PAM 세포와 같이 효과적으로 신규한 바이러스를 복제시키는 반면, ST 세포는 겨우 10^2.8×TCID₅₀/ml의 최대치를 나타냄을 확인하였다.

실시예 6. 혈구응집반응 측정(Hemagglutination assay, HA)

본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5를 이용한 혈구응집반응을 측정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다. 먼저 기니피그 적혈구를 PBS로 3회 세척하고 1% 현탁액으로 PBS에 재현탁하였다. 본 신규한 바이러스에 감염된 PAM 세포에서 제조된 신규한 바이러스 스톡(stock)을 U-bottom 마이크로 플레이트에서 상기 기니피그 적혈구에 두배 희석하여 적정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포로부터 얻은 바이러스 상청액은 1:512의 HA 역가에서 기니피그의 적혈구를 응집시키는 것을 확인하였다.

실시예 7. 정량적 실시간 RT-PCR(Quantitative real-time RT-PCR)

본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 감염이 염증성 시토카인/케모카인, TLRs(toll-like receptors), 및 항생성 유전자(antiviral genes)의 전사 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 신규한 바이러스 균주로 감염시킨 PAM 세포에서 발현된 mRNA의 변화를 관찰하였다. 상기 감염된 PAM 세포는 37℃에서 1시간동안 1의 감염다중도(multiplicity of infection, MOI)로 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5를 접종시켜 제조하였다. 그 후 첨가된 바이러스(virus inoculum)를 제거하고 감염된 세포를 새 배지에 24시간 동안 유지시켰다. 총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen)을 이용하여 감염 6, 12 및 24시간 후에 감염된 세포의 용해액에서 추출하였고, DNase I(TaKaRa)을 제조사의 사용법에 따라 처리하였다. 추출된 RNA의 농도는 NanoVue 분광 광도계(GE Healthcare, Piscataway, NJ)를 이용하여 측정하였다. 정량적 실시간 역전사 효소 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time RT-PCR)은 (Sagong and Lee, 2011; Lee and Lee, 2012)에 언급된 유전자-특이적 프라이머 쌍을 이용하여 Thermal Cycler Dice Real Time System(TaKaRa)로 수행하였다. 면역 반응 유전자의 RNA 수준은 돼지 β-액틴 mRNA으로 정규화(normalize)하였고, mRNA의 누적된 상대량(relative quantities, RQ)은 2^-△△Ct 방법(Livak and Schmittgen, 2001)을 이용하여 측정하였다. pPIV 감염시 전염증 시토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 항염증 시토카인(anti-inflammatory cytokine)의 전사 활성을 측정하기 위해, 각각의 시토카인 유전자의 상대적인 변화(fold change)는 신규한 바이러스에 감염된 PAM 세포와 모의-감염(mock-infected) PAM 세포를 비교하여 계산하였으며, 이의 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5로 불멸화된 PAM 세포를 감염시킨 경우, IL-10을 제외한 대부분의 인터루킨(interleukin, IL) 유전자, TNF-α(tumor necrosis factor-α), AMCF-1(alveolar macrophage chemotactic factor-1), MCP(monocyte chemotactic protein), RANTES(regulated upon activation, normal T-cell expressed, and secreted), IFN-α(interferon-α), IFN-β, TLR-7(toll-like receptors-7), Mx1(interferon-inducible GTPases), ISG(interferon-stimulated gene)의 발현량이 증가하였으나, IL-10, IFN-γ, IRL의 일부, TLR-4의 발현이 감소함을 확인하였다. 이를 통해 신규한 바이러스 감염이 항바이러스 상태(antiviral state)를 만들기 위한 IFN 신호전달 경로를 효율적으로 자극함을 확인하였다.

실시예 8. 분리된 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 병원성 확인

본 발명에 따른 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5가 자연상태의 숙주에게 임상 질환을 일으킬 수 있는지에 대한 연구를 수행하였다. 본 발명의 in vivo 돼지 실험은 Institutional Animal Care and Use Comittee에서 마련된 지침에 따라 Optifarm Solution Medipig Center에서 수행되었다. 4주된 SPF(Specific Pathogen Free) 상태의 털이 없는 흰색 Yucatan 미니어쳐 돼지 6마리가 본 연구에 사용되었으며, 3마리씩 두 그룹으로 무작위로 나누었다. 상기 돼지는 PRRSV, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 circovirus 2에 대한 항체가 없다. 돼지는 1주일간 적응 기간을 둔 후, 돼지 기관지 내(intratracheally)로 10⁸ TCID₅₀을 포함한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 스톡 1ml을 접종하였으며, 대조군은 배양배지를 접종하였다. 직장(rectal) 온도는 하루에 두번 기록했으며, 식욕, 활동 수준, 및 호흡기 증상을 포함한 돼지의 임상 모니터링은 매일 수행되었다. 돼지의 체중은 접종 전날(-1dpi)과 접종 7일 후에 측정되었고, 혈액과 비강 면봉(nasal swab) 샘플은 접종 전날과 접종 당일, 접종 1, 3, 5 및 7일 후에 수집되었다. pPIV5-감염(실험군) 또는 모의-감염(대조군) 그룹의 모든 돼지는 접종 7일후에 안락사 시켰으며 부검을 하였다. 기관지, 폐, 편도선, 간 비장, 신장, 심장, 핌프절, 뇌, 및 다른 내부 장기의 조직은 부검 중에 수집하였으며, 각 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하고, 조직 병리학적 검사를 위해 사용하였다. 혈액, 비강 면봉 샘플, 및 폐와 림프절 조직의 10% 현탁액을 이용하여 RT-PCR을 실시하고, 바이러스를 분리하였다.

실험 결과, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 그룹의 세마리 중 두마리는 감염 2일 후 콧물 등의 매우 가벼운 호흡기 증상을 보여주기는 하였으나 대조군과 비슷한 임상적 징후를 보였다. 실험군과 대조군의 모든 돼지의 직장 온도는 실험기간 동안 39℃ 이하에 머물렀다. 7dpi에서 두 그룹의 무게에서 유의한 차이가 없었으며, 부검시 신규한 바이러스에 감염된 돼지에서 심한 병변의 표시는 관찰되지 않았다. 비록 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 그룹은 조직학적으로 폐에서 염증 세포의 가벼운 세기관지주위(peribronchiolar) 침투를 발견하였으나, 전반적인 미세한 병변은 평범했다.

또한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 어떠한 동물도 바이러스혈증(viremia)이나 코의 분비물에서 바이러스가 감지되지 않았으며, 감염 7일 후 부검된 동물의 폐 조직에서 어떠한 동물도 RT-PCR에 의해 바이러스-특이적 게놈이 발견되지 않았다. 이러한 결과는 in vivo에서 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5의 복제는 매우 제한되었고, 신속하게 제거된 것을 의미한다.

실시예 9. 혈청 중화 시험(Serum neutralization test)

상기 실시예 8에서 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염되었던 돼지의 중화항체(neutralizing antibodies, nAb)를 알아보기 위하여, 혈청 중화 실험을 수행하였다. 혈액 시료는 감염 1, 3, 5 및 7일 후에 수집 및 바이러스 중화 분석을 실시하였으며, 이의 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 모든 모의-감염(placebo-infected) 대조군 돼지는 중화 시험에서 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 대한 혈청반응 음성이 나왔다. 하지만 감염 5일 후, 모든 접종된 돼지는 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 대한 중화항체를 생성하였으며, 그들의 혈청 시료의 SN 역가의 범위는 2⁷에서 2⁸이었다. 상기 돼지는 기관지 내(intratracheal) 경로를 통한 pPIV5의 10⁸ TCID₅₀에 대하여 면역이 생겼으며, 중화 항체 역가는 log2 의 형태를 나타내었다.

실시예 10. pPIV5 바이러스의 유병률 조사

한국 돼지 무리에서 pPIV5 감염의 유병률(prevalence)을 조사하였다. 28마리의 돼지로부터 수집된 58개의 임상 조직 표본에서 pPIV5의 게놈을 검출하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. 예비 결과에서 pPIV5는 폐, 림프절, 소장 등의 7개의 시료(12.1%)에 있는 것으로 확인되었으며, 6마리의 돼지(21.4%)가 과거에 PRRSV, Rotavirus, porcine circovirus 2, Salmonella, 또는 Streptococcus에 감염되었던 것으로 진단되었다. 추가적으로 돼지에서 pPIV5의 혈청학적유병률(seroprevalence)을 조사하기 위해, 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5를 이용하여 SN 시험을 수행하였다. 한국 본토에 위치한 돼지 농장 10군데의 생후 30 내지 100일의 돼지로부터 무작위로 총 515개의 혈청 시료를 얻고, pPIV5-특이적 항체를 스크리닝하기 위해 중화 어세이를 수행하였다. 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5 스톡은 50Ｂμl 부피의 200 TCID₅₀을 만들기 위해 무혈청 RPMI 1640 배지에서 희석시켰다. 희석된 바이러스는 96-웰 플레이트에서 열처리(1시간, 56℃)에 의해 불활성화된 각각 혈청의 2배 희석액 50μl와 혼합하였다. 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 약 100μl에 2.3×10⁴ 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5에 감염된 PAM 세포를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 5% CO₂ 배양기에서 유지하였다. 48시간 동안 배양한 후, 중화 역가(titer)를 계산하였으며, nAb 역가가 8이상인 경우 pPIV5 항체 양성으로 분류하였다. 실험 결과, 515개의 시료 중 483(93.8%)개의 시료가 pPIV5 항체에 양성인 것으로 나타났으며, 이를 통해 한국 돼지 농장에서 pPIV5가 높은 유병률을 가짐을 확인하였다.

실시예 11. 백신 제조

분리한 신규한 돼지 파라 인플루엔자 바이러스 5를 종(seed) 바이러스로 하여 백신을 제조하였다. 10일령 부화란의 요막강에 종(seed) 바이러스를 접종하고 3일 후 요막강액을 채취하여 바이러스 벌크로 하였다. 이 바이러스 벌크에 0.2% 포르말린을 첨가하여 실온에서 24시간 불활화하였다. 불활화 여부는 불활화된 벌크를 부화란에 재접종하여 바이러스가 생존하지 않았을 때 불활화된 것으로 확인하였다. 이 벌크 70% 와 알루미늄 하이드록사이드 겔 30%를 10,000rpm으로 10분간 혼합한 후 무균검사를 실시하고, 이상이 없음을 확인한 후 백신으로 이용하였다.

한국생명공학연구원 KCTC12474BP 20130814

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel porcine parainfluenza virus 5(pPIV5), composition comprising thereof and diagnostic kits of the novel porcine parainfluenza virus <130> ddd <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 15246 <212> DNA <213> porcine parainfluenza virus 5 <400> 1 accaggggga aaatgaagtg gtgacgctaa tcatctaaga ccttcgagat tacataggtc 60 cggaacttat ggccttagtg accgacctcg agtcagagta gttcaataag gacctatcga 120 gtttgggcaa tttttcgtcc ccgacacaaa aatgtcatcc gtgcttaaag catatgagcg 180 attcacactc actcaagaac tgcaagatca gagtgaggaa ggtacaatcc cacctacaac 240 actaaaaccg gtaatcaggg tatttatact aacctctaat aacccagagc taagatcccg 300 gcttcttcta ttctgcctac ggattgttct cagtaatggt gcaagggatt cccatcgctt 360 tggatcatta cttacaatgt tttcgctacc atcagccaca atgctcaatc atgtcaaatt 420 agctgatcag tcaccagaag ctgatatcga aagggtagag atcgatggct ttgaggaggg 480 atcattccgc ttaatcccca atgctcgttc aggtatgagc cgtggagaga tcaatgccta 540 tgctgcactt gcagaagatc tacctgacac 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Claims (6)

1. 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드로 구성된 PIV5(parainfluenza virus 5)형 돼지 파라인플루엔자 바이러스.
2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 수탁번호 KCTC 12474BP 인 것을 특징으로 하는 돼지 파라인플루엔자 바이러스.
3. 제1항 또는 제2항의 바이러스, 또는 이의 항원을 유효성분으로 포함하는 PIV5형 돼지 파라인플루엔자 바이러스 예방 백신 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 백신은 돼지에게 적용되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 백신은 용매, 면역증강제(adjuvant) 및 부형제로 구성되는 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
6. 제1항 또는 제2항의 바이러스, 또는 이의 항원을 포함하는 PIV5형 돼지 파라인플루엔자 바이러스의 검정 키트.
   
   
   
   

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