CN114410681B - 一种基于m基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用 - Google Patents

一种基于m基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用，属于减毒疫苗技术领域。本发明所述致弱方法，包括以下步骤：删除流感病毒M2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。本发明致弱方法所产生的致弱病毒株具有良好生长特性和生产安全性，可以在鸡胚中快速生长繁殖，给生产致弱病毒疫苗候选株带来巨大便捷；同时，致弱毒株具有限制性复制能力，并非单次感染细胞，能够产生高水平病毒HAI效价，免疫小鼠攻毒后状态良好，10天内体重恢复健康水平，为开发流感减毒疫苗奠定基础。

Description

一种基于M基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及 致弱流感病毒株和应用
技术领域
本发明涉及减毒疫苗技术领域，具体涉及一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用。
背景技术
流感病毒属于正黏病毒科单股负链分节段RNA病毒，根据核蛋白(NP)和基质蛋白(M1)抗原性的区别可以分为A，B，C，D型。A型流感病毒(IAV)普遍感染人和禽类动物等多种宿主。B型流感病毒(IBV)宿主特异性强，目前发现主要感染人和海豹。C型流感病毒致病症状轻微，主要感染人和猪。大多数有症状的流感病例都是由A型和B型流感病毒引起。IAV和IBV基因组都包含8个节段，分别为PB1，PB2，PA，HA，NP，NA，M，NS，不同的亚型可以编码10个或者11个蛋白，其中囊膜蛋白HA负责识别和结合细胞表面唾液酸受体，帮助病毒入侵细胞，囊膜蛋白NA负责移除HA和唾液酸受体之间的结合，帮助子代病毒释放。除不同基因组片段内核苷酸的突变，作为一种基因组分段的病毒，流感病毒不同菌株和谱系之间的基因片段可以在伴随感染期间经历重配，形成新的病毒亚型。
由于流感病毒高度的遗传漂变，几乎每年都会暴发，导致需要每年度根据当季流行的毒株进行疫苗生产研发。这就需要快速成熟的疫苗生产体系，灭活疫苗和减毒活疫苗可以满足以上要求。灭活疫苗一般是通过病毒反向遗传操作技术获得重配株或者自然筛选流行株，在体外大量培养，将病毒灭活、纯化后制备而成。流感重配疫苗候选株将当季流行的流感病毒毒株的HA和NA基因与WHO推荐的高生长特性的毒株的6个内部基因，如A/PuertoRico/8/1934 H1N1(PR8)，通过病毒反向遗传技术而获得的。相比灭活疫苗，减毒活疫苗是对病毒的基因组进行修改，获得病毒致弱的特性，比较常见的是冷适应温度敏感型减毒活疫苗，可以通过鼻腔黏膜途径免疫。但研究显示，冷适应株疫苗保护效率在儿童中严重不足，具体为2013～2014年(18％)，2014～2015年(28％)，和2015～2016年(48％)，可见，冷适应株的免疫效果并不理想。
另一种减毒活疫苗是对病毒基因组进行修改后，再利用病毒反向遗传学技术生产限制性感染的致弱病毒毒株。目前，已经有研究报道对NS节段，M节段的基因进行突变而产生缺陷型致弱毒株。但目前还缺乏高效而稳定的流感病毒致弱方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用。本发明致弱方法所产生的致弱病毒株具有良好生产安全性，不仅毒力减弱，同时拥有较好的生长特性，可以在鸡胚中快速生长繁殖，给生产带来巨大便捷；另外，本发明所产生的致弱病毒株具有限制性复制能力，可以产生高水平病毒HAI效价，免疫小鼠攻毒后状态良好，10天内体重恢复健康水平，为开发流感减毒疫苗奠定基础。
本发明提供了一种流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：
删除流感病毒M2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。
优选的是，所述致弱方法的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934。
优选的是，所述删除包括删除流感病毒M基因第767位碱基到第877位碱基之间任意位置和长度的核苷酸序列。
优选的是，所述删除包括删除M2以下基因序列之一：SEQ ID NO.1～6。
优选的是，删除流感病毒M2部分基因序列后的流感病毒M基因的核苷酸序列如SEQID NO.7～12之一所示。
优选的是，所述致弱方法包括以下步骤：制备含删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒；将所述缺陷型M质粒、流感病毒反向遗传的其他7个质粒和表达蛋白的质粒共转染细胞，收获病毒，得到致弱流感病毒株；所述反向遗传的其他7个质粒包括表达以下基因组片段的双向表达质粒：PB2、PB1、PA、NP、NS、HA和NA；所述表达蛋白的质粒包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
本发明还提供了一组基于上述技术方案所述致弱方法制备得到的致弱流感病毒株。
优选的是，所述致弱流感病毒株以A/Puerto Rico/8/1934为背景，删除流感病毒M2部分基因序列。
本发明还提供了一组用于制备致弱流感病毒株的含删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒，所述缺陷型M质粒含上述技术方案所述致弱方法中所述的删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸。
本发明还提供了上述技术方案所述的致弱方法或上述技术方案所述的致弱流感病毒株或上述技术方案所述的缺陷型质粒在制备流感致弱活疫苗中的应用。
本发明提供了一种流感病毒的致弱方法。本发明致弱方法所产生的致弱病毒株，不会引起小鼠治病或死亡，具有良好生产安全性，不仅毒力减弱，同时拥有较好的生长特性，可以在鸡胚中快速生长繁殖，给生产带来巨大便捷。另外，本发明致弱流感病毒具有限制性复制能力，可以产生高水平病毒HAI效价，为开发流感减毒疫苗奠定基础。
附图说明
图1为本发明提供的缺陷型M质粒构建策略图；大写字母表示M2编码序列，箭头表示剪接位点，小括号“()”表示删除区域；
图2为本发明提供的M缺陷型流感重组病毒的生长曲线；
图3为本发明提供的缺陷型致弱流感病毒接种MDCK后病毒增殖情况；
图4为本发明提供的缺陷型致弱流感病毒接种小鼠后，小鼠体重随时间变化图，dpi代表感染后天数，纵坐标代表体重变化百分比；
图5为本发明提供的缺陷型致弱流感病毒感染小鼠后三天鼻甲和肺叶组织的病毒滴度图；
图6为本发明提供的免疫小鼠攻毒后体重变化图，横坐标代表攻毒后天数，纵坐标代表体重变化百分比。
具体实施方式
本发明提供了一种流感病毒的致弱方法，包括以下步骤：
删除流感病毒M2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出致弱流感病毒株。
在本发明中，所述致弱方法的背景毒株优选包括A/Puerto Rico/8/1934(PR8)。
本发明以PR8流感病毒为背景，直接删除M1基因之后的M2基因序列(部分序列)，提供了新颖的直接删除方法，导致M2蛋白翻译的移码或截短，或M基因的部分缺失引起的核酸水平功能性改变，达到缺陷毒株致弱目的。细胞以及动物试验结果显示，以本发明方法生产的致弱疫苗株生长特性良好且没有致病力，另外，本发明产生的致弱流感病毒可在鸡胚中生长繁殖，极大地方便了致弱毒株的生产。在本发明中，所述删除优选包括删除流感病毒M基因第767位碱基到第877位碱基之间任意位置和长度的核苷酸序列。更优选的，本发明删除M基因从第767位碱基起，8～111bp长度的核苷酸序列，最优选的，本发明删除M基因从第767位碱基起，8bp、28bp、51bp、73bp、91bp和111bp长度的核苷酸序列。
当本发明删除M基因从第767位碱基起，8bp、28bp、51bp、73bp、91bp和111bp长度的核苷酸序列时，在本发明中，所述删除包括删除M2以下基因序列之一：SEQ ID NO.1～6：
ACTATTGC(del8，SEQ ID NO.1)；
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCT(del28，SEQ ID NO.2)；
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTT(del51，SEQ IDNO.3)；
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCA(del73，SEQ ID NO.4)；
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAAT(del91，SEQ ID NO.5)；
或，ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAATACGGACTGAAAGGAGGGCCT(del111，SEQ ID NO.6)。
在本发明中，删除流感病毒M2部分基因序列后的流感病毒M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7～12之一所示。
在本发明中，所述致弱方法优选包括以下步骤：制备含删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒；将所述缺陷型M质粒、流感病毒反向遗传的其他7个质粒和表达蛋白的质粒共转染细胞，收获病毒，得到致弱流感病毒株；所述反向遗传的其他7个质粒包括表达以下基因组片段的双向表达质粒：PB2、PB1、PA、NP、NS、HA和NA；所述表达蛋白的质粒包括表达PR8-M2蛋白的质粒。本发明对质粒的制备方法、质粒转染细胞的方法以及病毒的收获方法没有特殊限定，采用本领域技术人员公知常规方法即可。
本发明还提供了一组基于上述技术方案所述致弱方法制备得到的致弱流感病毒株。
在本发明中，所述致弱流感病毒株以A/Puerto Rico/8/1934为背景，删除流感病毒M2部分基因序列。在本发明中，删除流感病毒M2部分基因序列后的流感病毒M基因的核苷酸序列同上文所述，最优选如SEQ ID NO.7～12之一所示。
本发明还提供了一组用于制备致弱流感病毒株的含删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒(实施例简称M缺陷型质粒，Mdel质粒)，所述缺陷型M质粒含上述技术方案所述致弱方法中所述的删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸。最优选的，所述缺陷型M质粒含删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸，所述核苷酸如SEQ ID NO.7～12之一所示。
在本发明中，制备含删除流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒所用引物的核苷酸序列优选包括SEQ ID NO.13～19。
本发明还提供了上述技术方案所述的致弱方法或上述技术方案所述的致弱流感病毒株或上述技术方案所述的缺陷型M质粒在制备流感致弱活疫苗中的应用。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.构建Mdel缺陷型质粒
定义Mdel8，Mdel28，Mdel51，Mdel73，Mdel91，Mdel111缺陷型质粒统称为Mdel质粒。
针对所要构建的缺陷型质粒，设计如表1所示引物：
表1构建缺陷型质粒的引物
del8-F tcaagtgatcctctccgcaaatatcattgggatcttg(SEQ ID NO.13)
del28-F tcaagtgatcctctctgcacttgacattgtggattcttg(SEQ ID NO.14)
del51-F tcaagtgatcctctcgatcgtctttttttcaaatg(SEQ ID NO.15)
del73-F tcaagtgatcctctctttaccgtcgctttaaatacg(SEQ ID NO.16)
del91-F tcaagtgatcctctcacggactgaaaggagggccttct(SEQ ID NO.17)
del111-F tcaagtgatcctctctctacggaaggagtgccaaag(SEQ ID NO.18)
PR8delR tcatcaatcacttgaaccgttg(SEQ ID NO.19)
以包含A型流感病毒M基因的载体质粒pFlu-PR8-M(本发明对所述质粒的构建方法没有特殊限定，采用常规重组载体构建方法将A/Puerto Rico/8/1934的M基因构建到载体质粒上即可)为模板，以表1中所展示的每个上游引物和共同的下游引物PR8delR配对，按照PrimerSTAR说明书分别扩增得到Mdel8，Mdel28，Mdel51，Mdel73，Mdel91和Mdel111片段。将扩增得到的片段按照 HiFi DNA Assembly试剂盒说明书要求，进行同源重组克隆。对克隆产物涂布LB氨苄平板后挑菌并鉴定，鉴定所用引物为：gctggtctgaaaaatgatcttcttg(SEQ ID NO.20)。最终得到缺陷型M质粒。
图1为缺陷型M质粒构建策略图，其中，大写字母表示M2编码序列，箭头表示剪接位点，小括号“()”表示删除区域。
2.缺陷型流感病毒拯救及制备
将293T细胞铺赛默飞的特制六孔板，待细胞密度达到70～80％时进行转染。采用经典“6+2”流感反向遗传操作系统拯救缺陷型重组流感病毒。将6个PR8内部基因pFlu-PR8-PB2，pFlu-PR8-PB1，pFlu-PR8-PA，pFlu-PR8-NP，pFlu-PR8-M缺陷型，pFlu-PR8-NS和2个外部基因pFlu-PR8-HA，pFlu-PR8-NA各0.5μg以及表达M2的质粒0.25μg分别共转染到293T细胞(Lipofectamine 3000)。转染后24h更换含有终浓度为0.5μg/ml TPCK-Trypsin的培养液，并在转然后48h收集细胞上清，将细胞上清按照0.2ml/枚通过尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚。接种后的鸡胚在37℃温箱内培养48h。收集鸡胚尿囊液(F0代)，分别获得M缺陷型流感病毒，并测定其是否有血凝价。如果没有血凝价，将收获病毒盲传一代，再测其是否有血凝价。
所得到M缺陷型流感病毒分别命名为PR8-Mdel8，PR8-Mdel28，PR8-Mdel51，PR8-Mdel73，PR8-Mdel91和PR8-Mdel111流感重组病毒。
3.病毒生长曲线
将MDCK-M2细胞铺于24孔板，待细胞长满单层后，将M缺陷型流感病毒株以感染复数(MOI)为0.001的剂量接种细胞，做3个重复，感染2h后，弃掉24孔板中的液体，用PBS洗涤后加入含2％FBS的DMEM培养基维持细胞生长，置37℃、5％CO2，培养箱中培养。分别在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h收获病毒，将收获的不同时间点的病毒液作连续10倍倍比稀释后，每个稀释度做4个重复，分别接种于96孔板中长至单层的MDCK-M2细胞中，感染2h后换成2％FBS的DMEM培养液维持细胞的生长，48h后观察细胞病变，测定不同时间点收集的缺陷型流感病毒株的毒价，应用Reed-Muench方法计算其TCID50，数据分析完成后，绘制M缺陷型流感重组病毒的生长曲线，如图2所示。
由图2可知，与野生型病毒相比，致弱毒株生长滴度除在24h有大幅度下降外，48h，72h和96h都保持较高生长滴度。其中PR8-Mdel28毒株在48h生长滴度可以达到108.3。可见，对M基因的部分删除所形成的缺陷型毒株，仍然具有良好的生长特性，实现产品后，更有助于进行高效率的生产转化。同时，删除M基因的部分片段虽然都能达到致弱效果，但不同的删除片段对最终的致弱病毒株的生长特性具有不同影响，且这种影响并非是删除片段越长，病毒生长能力越低，如PR8-Mdel28和PR8-Mdel8，PR8-Mdel8的生长能力不及PR8-Mdel28。
4.缺陷型流感病毒高剂量接种在MDCK生长
分别取250，1000，4000，16000，64000，256000，1024000，4096000个TCID50的M缺陷型流感病毒接种48孔板MDCK细胞，观察细胞病变并检测细胞培养液HA效价。结果如图3。由结果可见，本发明M缺陷型流感病毒在低滴度时接种MDCK细胞不能生长，病毒安全性好。当接种剂量增加到16000个TCID50时，PR8-Del51、PR8-Del73、PR8-Del91可在MDCK细胞生长；当接种剂量继续增加，所有缺陷型流感病毒都能够在MDCK细胞生长。可见，本发明产生的缺陷型致弱病毒株具有限制性复制能力，这不同于其他致弱方式所产生的病毒具有一过性复制能力，限制性复制病毒有利于诱导机体产生更多抗体和更好的保护力。
5.缺陷型流感病毒可在鸡胚生长
将以上M缺陷型流感病毒原液分别接种10日龄SPF鸡胚，100μl/胚，每株病毒接种三只鸡胚，72h后收获尿囊液检测病毒HA效价。结果如表2所示：
表2病毒接种鸡胚HA效价
由以上结果可知，本发明所产生缺陷型流感病毒可以在鸡胚中正常繁殖，其中，PR8-Mdel8，PR8-Mdel73，PR8-Mdel91都具有良好的生长特性，接种的3只鸡胚血凝价均可达到27以上。如果后续应用于生产，可以直接在SPF鸡胚中进行病毒生产，避免了培养细胞时技术设备成本的大量投入，对控制成本和提高病毒产能有重大意义。
6.M缺陷型流感重组病毒小鼠试验
取4～5周龄Balb/c小鼠鼻内接种以上M缺陷型流感重组病毒以及野生型PR8病毒，每组接种106TCID50剂量病毒。除PR8-Mdel8，PR8-Mdel28，PR8-Mdel91毒株使用8只小鼠外，其余毒株每种接种5只小鼠，对照组小鼠施用PBS。接种后每天记录小鼠体重变化(图4)和感染征状，接种后3天，选择PR8-Mdel8，PR8-Mdel28，PR8-Mdel91每组3只小鼠，安乐死后取肺部组织和鼻甲组织使用PBS冲洗掉残留血液并研磨，吸打获取病毒并检测病毒滴度。病毒滴度的检测方法如下：将MDCK-M2细胞铺于96孔板，待细胞长满单层后，使用DMEM连续10倍倍比比例梯度稀释重组病毒，稀释至10-6即可，然后将96孔板中的培养基弃掉，用DMEM洗涤板子，每孔中加入100μL对应稀释度的重组病毒液，每个梯度做4个重复，于37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育2h后，弃掉细胞上清，换成含2％FBS的DMEM培养基以维持细胞生长，48h后弃去上清，用PBS洗涤板子两次，观察细胞病变，应用Reed-Muench方法计算其TCID50(图5)。同时，检测接种病毒后14天的小鼠血清HAI抗体效价。HAI试验参考GBT 18936-2003(高致病性禽流感诊断技术)，结果见表3。接毒21天后，对接毒小鼠进行野生型PR8病毒攻毒，攻毒剂量为106TCID50/50μL，记录攻毒后10天内小鼠状态和体重变化，体重变化见图6。
表3致弱毒株接种小鼠后HAI抗体效价
由图4结果得到，对于PR8-Mdel8，PR8-Mdel28，PR8-Mdel73，PR8-Mdel91毒株，小鼠在感染后第1天体重有略微下降，第2天PR8-Mdel28接种的小鼠体重已经恢复到接种前水平，其余毒株接种小鼠体重在第3天至第5天恢复到接种前水平。PR8-Mdel51接种小鼠在接种后第5天恢复到接种前体重水平。除对照组外所有致弱毒株感染小鼠没有出现死亡情况，感染后到14天状况良好，但野生型PR8病毒感染后的所有小鼠均在第5天死亡。可见，对M基因的删除所产生的缺陷型病毒，有突出的致弱效果。同时，由图5可知，致弱毒株在小鼠接种后3天，鼻甲和肺部病毒滴度与野生型毒株相比显著下降，特别是PR8-Mdel28，在鼻甲和肺部组织都检测不到病毒。通常流感病毒在感染后的3～7天，病毒会大量复制增殖，而本发明所产生的致弱毒株几乎不具有复制能力，可见M基因的直接删除具有显著的致弱效果。
同时，接毒后14天试验组小鼠血清均可以检测到HAI效价，最高可达到28.5(表3)，另外，攻毒后小鼠状态良好，PR8-Mdel8和PR8-Mdel28组小鼠体重在攻毒后1天到4天期间，PR8-Mdel91组小鼠体重在攻毒后5天内有5％以内的下降，随后体重逐渐恢复到攻毒前水平(图6)。可见，本发明致弱毒株具有较好的免疫作用，可作为流感活病毒疫苗候选株。
在建立致弱毒株时，高效的弱毒疫苗株既可以有良好的生长特性便于生产，同时具有较弱的毒性以及良好的免疫原性。综合以上结果可知，本发明致弱方法所产生的致弱病毒株，对小鼠副作用小，不引起小鼠疾病或死亡，具有良好生产安全性，毒力减弱同时拥有较好的生长特性，特别是PR8-Mdel8，PR8-Mdel73，PR8-Mdel91可以在鸡胚中快速生长繁殖，给生产带来巨大便捷。另外，本发明致弱流感病毒具有限制性复制能力，可以产生高剂量病毒HAI抗体，有成为优秀流感减毒疫苗株的巨大潜力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江迪福润丝生物科技有限公司
<120> 一种基于M基因核苷酸片段删除的流感病毒的致弱方法以及致弱流感病毒株和应用
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actattgc 8
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actattgccg caaatatcat tgggatct 28
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct t 51
<210> 4
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct tgatcgtctt 60
tttttcaaat gca 73
<210> 5
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct tgatcgtctt 60
tttttcaaat gcatttaccg tcgctttaaa t 91
<210> 6
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
actattgccg caaatatcat tgggatcttg cacttgacat tgtggattct tgatcgtctt 60
tttttcaaat gcatttaccg tcgctttaaa tacggactga aaggagggcc t 111
<210> 7
<211> 974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctccgca aatatcattg 780
ggatcttgca cttgacattg tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc atttaccgtc 840
gctttaaata cggactgaaa ggagggcctt ctacggaagg agtgccaaag tctatgaggg 900
aagaatatcg aaaggaacag cagagtgctg tggatgctga cgatggtcat tttgtcagca 960
tagagctgga gtaa 974
<210> 8
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctctgca cttgacattg 780
tggattcttg atcgtctttt tttcaaatgc atttaccgtc gctttaaata cggactgaaa 840
ggagggcctt ctacggaagg agtgccaaag tctatgaggg aagaatatcg aaaggaacag 900
cagagtgctg tggatgctga cgatggtcat tttgtcagca tagagctgga gtaa 954
<210> 9
<211> 931
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcgatc gtcttttttt 780
caaatgcatt taccgtcgct ttaaatacgg actgaaagga gggccttcta cggaaggagt 840
gccaaagtct atgagggaag aatatcgaaa ggaacagcag agtgctgtgg atgctgacga 900
tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 931
<210> 10
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcttta ccgtcgcttt 780
aaatacggac tgaaaggagg gccttctacg gaaggagtgc caaagtctat gagggaagaa 840
tatcgaaagg aacagcagag tgctgtggat gctgacgatg gtcattttgt cagcatagag 900
ctggagtaa 909
<210> 11
<211> 891
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctcacgg actgaaagga 780
gggccttcta cggaaggagt gccaaagtct atgagggaag aatatcgaaa ggaacagcag 840
agtgctgtgg atgctgacga tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 891
<210> 12
<211> 871
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gtactctcta tcatcccgtc aggccccctc 60
aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
cagaaacgaa tgggggtgca gatgcaacgg ttcaagtgat cctctctcta cggaaggagt 780
gccaaagtct atgagggaag aatatcgaaa ggaacagcag agtgctgtgg atgctgacga 840
tggtcatttt gtcagcatag agctggagta a 871
<210> 13
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcaagtgatc ctctccgcaa atatcattgg gatcttg 37
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tcaagtgatc ctctctgcac ttgacattgt ggattcttg 39
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcaagtgatc ctctcgatcg tctttttttc aaatg 35
<210> 16
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tcaagtgatc ctctctttac cgtcgcttta aatacg 36
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcaagtgatc ctctcacgga ctgaaaggag ggccttct 38
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tcaagtgatc ctctctctac ggaaggagtg ccaaag 36
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tcatcaatca cttgaaccgt tg 22
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gctggtctga aaaatgatct tcttg 25

Claims (8)

1.一种A型流感病毒的致弱方法在制备具有限制性复制能力的A型流感致弱病毒疫苗株中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
删除A型流感病毒M2部分基因序列，利用反向遗传操作系统，拯救出A型致弱流感病毒株；所述删除为删除M基因从第767位碱基起，8bp、28bp、51bp、73bp和91bp长度的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用中的致弱方法针对的背景毒株是A/Puerto Rico/8/1934。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述删除包括删除M2以下基因序列之一：SEQ ID NO.1~5。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，删除A型流感病毒M2部分基因序列后的A型流感病毒M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7~11之一所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述致弱方法包括以下步骤：制备含删除A型流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒；将所述缺陷型M质粒、流感病毒反向遗传的其他7个质粒和表达蛋白的质粒共转染细胞，收获病毒，得到A型致弱流感病毒株；所述反向遗传的其他7个质粒包括表达以下基因组片段的双向表达质粒：PB2、PB1、PA、NP、NS、HA和NA；所述表达蛋白的质粒包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
6.一组基于权利要求1~5任一项所述应用中的致弱方法制备得到的具有限制性复制能力的A型流感致弱病毒疫苗株。
7.根据权利要求6所述的具有限制性复制能力的A型流感致弱病毒疫苗株，其特征在于，所述A型致弱流感病毒株以A/Puerto Rico/8/1934为背景，删除流感病毒M2部分基因序列。
8.一组用于制备具有限制性复制能力的A型流感致弱病毒疫苗株的含删除A型流感病毒M2部分序列后的核苷酸的缺陷型M质粒，其特征在于，所述缺陷型M质粒含权利要求1~4任一项所述应用中的致弱方法中所述的删除A型流感病毒M2部分序列后的核苷酸；用于制备具有限制性复制能力的A型流感致弱病毒疫苗株的质粒还含有5个内部基因PB2、PB1、PA、NP和NS，以及2个外部基因HA和NA。
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