CN114480303B - 一组a型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用，属于病毒致弱技术领域。本发明提供了一组A型流感病毒致弱毒株，所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得，所述修饰包括进行终止密码子突变和在突变的终止密码子后进行缺失突变。本发明所述致弱毒株稳定性更强，多次传代不会发生回复突变，安全性更高，对细胞系的依赖不强，在疫苗生产过程中具有较强的优势。

Description

一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及病毒致弱技术领域，具体涉及一组A型流感病毒致弱毒株及 其制备方法和应用。
背景技术
A型流感病毒(Influenza A virus)是一类引起季节性流感的常见病毒种 类，是一种RNA病毒，易发生突变和重配。由于遗传漂变现象和病毒重配 导致每年引发流感的病毒都有可能不同，在人群中难以形成稳定的免疫，造 成反复发病。但是，由于缺乏针对流感的特效药物，最有效的方法仍是接种 流感疫苗。目前的流感疫苗有灭活疫苗和减毒活载体疫苗两类。减毒疫苗相 比灭活疫苗可以避免灭活过程中对抗原造成的损伤，同时也能刺激机体产生更持久、更有效的免疫，如黏膜免疫、细胞免疫等，是相关疫苗研发的重要 方向。
当前市场上的流感减毒疫苗是温度敏感性减毒毒株，在25～33℃时可高 效复制，但在37～39℃时则复制受限。这类减毒疫苗则面临着保护力不稳定 的缺陷，有报道显示在不同年份提供的保护力差异从18～80％不等。因此， 急需开发新型的流感病毒减毒策略。
发明内容
本发明的目的在于提供一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应 用。本发明所述致弱毒株稳定性更强，多次传代不会发生回复突变，安全性 更高，对细胞系的依赖不强，在疫苗生产过程中具有较强的优势。
本发明提供了一组A型流感病毒致弱毒株，所述致弱毒株通过对M2基 因进行修饰获得，所述修饰包括进行终止密码子突变和在突变的终止密码子 后进行缺失突变。
优选的是，所述致弱毒株的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934病毒。
优选的是，所述进行终止密码子突变为将M基因第761至第766位点 的核苷酸序列突变为两个终止密码子。
优选的是，所述缺失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8～91 个核苷酸。
优选的是，所述缺失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8、28、 73或91个核苷酸。
优选的是，对M2基因进行修饰后，M基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株的构建方法，包括以下步 骤：
构建含修饰后M2基因的质粒，获得缺陷型M2-2×stop+del质粒；
利用反向遗传系统，将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转 染细胞，收获病毒，得到A型流感病毒致弱毒株；
所述质粒包括缺陷型M2-2×stop+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA 质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA片段的质粒；
所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
优选的是，构建含修饰后M2基因的质粒所需的引物序列如SEQ ID NO.5～9所示。
优选的是，所述缺陷型M2-2×stop+del质粒分别含如SEQ ID NO.1～4 所示的核苷酸序列。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株或上述技术方案所述构建 方法构建得到的致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。
本发明提供了一组A型流感病毒致弱毒株。本发明采用终止密码子和缺 失突变的方法对流感病毒基因组进行改造，终止密码子导致M2蛋白自跨膜 区起后续氨基酸缺失，同时缺失突变造成病毒核酸水平的功能改变，引起不同毒株间的特性差异。拯救获得的致弱毒株在正常MDCK细胞中复制能力 严重受限，而在过表达M2的MDCK细胞仍能够达到较高的复制速率；此 外，本发明的致弱毒株与还具备特殊的生长特性，在MDCK细胞系中高滴 度接种时，仍能够正常复制增殖，也能够在鸡胚中正常生长，对细胞系的依 赖不强，在疫苗生产过程中具有较强的优势。低剂量接种MDCK细胞病毒 不能生长，高剂量接种MDCK细胞病毒可以生长，显示了病毒的限制性增 殖能力，相比一过性感染，该能力预示着病毒拥有更好的诱导免疫效果。
附图说明
图1为本发明提供的M2基因修饰示意图；
图2为本发明提供的病毒生长曲线结果图；
图3为本发明提供的不同剂量M2del8病毒感染MDCK细胞时的生长特 性图；
图4为本发明提供的不同剂量M2del28病毒感染MDCK细胞时的生长 特性图；
图5为本发明提供的不同剂量M2del73病毒感染MDCK细胞时的生长 特性图；
图6为本发明提供的不同剂量M2del91病毒感染MDCK细胞时的生长 特性图。
图7为本发明提供的小鼠体重随时间的变化图；
图8为本发明提供的攻毒后小鼠体重随时间的变化图。
具体实施方式
本发明提供了一组A型流感病毒致弱毒株，所述致弱毒株通过对M2基 因进行修饰获得，所述修饰包括进行终止密码子突变和在突变的终止密码子 后进行缺失突变。
在本发明中，所述致弱毒株的背景毒株优选包括A/Puerto Rico/8/1934 病毒。在本发明，所述进行终止密码子突变的操作优选为突变为两个终止密 码子。在本发明中，所述进行终止密码子突变更优选为将M基因第761至 第766位点的核苷酸序列突变为两个终止密码子。在本发明中，所述缺失突 变优选为在所述突变的终止密码子后进行核苷酸的缺失，更优选的，所述缺 失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8～91个核苷酸；最优选的， 所述缺失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8、28、73或91个核 苷酸。具体的，在本发明中，对M2基因进行修饰后，M基因的核苷酸序列 分别如SEQ ID NO.1～4所示。
A型流感病毒M基因包括M1和M2，存在可变剪接，共用部分序列， 如图1所示。本发明利用领域公认的典型A型流感病毒快速复制株：A/Puerto Rico/8/1934病毒为背景，对M2基因进行修饰，如图1所示位置突变为2个 终止密码子(TGATGA，SEQ ID NO.10)同时在该位置后续进行缺失突变，在保障M1不改变的前提下，M2蛋白自跨膜区起后续氨基酸缺失，同时缺 失突变造成病毒核酸水平的功能改变，引起不同毒株间的特性差异。本发明 在终止密码子的基础上增加了M2基因缺失突变，毒株稳定性更强，多次传代不会发生回复突变，安全性更高。
本发明对M基因(SEQ ID NO.11)的修饰方法具体如下：大写字母表 示M2编码序列，小写字母两端表示剪接位点，下划线表示M1和M2共有 的序列，小括号“()”表示删除区域。
ATGAGTCTTCTAACCGAGGTCGAAACgtacgtactctctatcatcccgtcaggccccc tcaaagccgagatcgcacagagacttgaagatgtctttgcagggaagaacaccgatcttgaggttctcatggaatggctaaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttaggatttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacgctttgtccaaaatgcccttaatgggaacggggatccaaataacatggacaaagcagt taaactgtataggaagctcaagagggagataacattccatggggccaaagaaatctcactcagttattctgctggtgcacttgccagttgtatgggcctcatatacaacaggatgggggctgtgaccactgaagtggcatttggcctggtatgtgcaacctgtgaacagattgctgactcccagcatcggtctcataggcaaatggtgacaacaaccaatccactaatcagacatgagaacagaatggttttagccagcactacagctaaggctatggagcaaatggctggatcgagtgagcaagcagcagaggccatggaggttgctagtcaggctagacaaatggtgcaagcgatgagaaccattgggactcatcctagctccagtgctggtctgaaaaatgatcttcttgaaaatttgcagGCCTATCAGAAACGAATGGGGGTGCAGATGCAACGGT TCAAGTGATTGATGA((((ACTATTGC)del8CGCAAATATC ATTGGGATCT)del28TGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTT CAAATGCA)del73TTTACCGTCGCTTTAAAT)del91ACGGACTGAAAGGAGGG CCTTCTACGGAAGGAGTGCCAAAGTCTATGAGGGAAGAATATCGAAAGGAACAGCAGAGTGCTGTGGATGCTGACGATGGTCATTTTGTCAGCATA GAGCTGGAGTAA
终止密码子的位置位于M2基因跨膜区起始位置，即761～766位置:TGA TGA。
所述删除的M2基因序列的一部分包括：
ACTATTGC(del8，SEQ ID NO.12)，
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCT(del28，SEQ ID NO.13)，
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGATTCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCA(del73，SEQ ID NO.14)，
ACTATTGCCGCAAATATCATTGGGATCTTGCACTTGACATTGTGGAT TCTTGATCGTCTTTTTTTCAAATGCATTTACCGTCGCTTTAAAT(del91， SEQ ID NO.15)，
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株的构建方法，包括以下步 骤：
构建含修饰后M2基因的质粒，获得缺陷型M2-2×stop+del质粒；
利用反向遗传系统，将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转 染细胞，收获病毒，得到A型流感病毒致弱毒株；
所述质粒包括缺陷型M2-2×stop+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA 质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA片段的质粒；
所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
本发明构建含修饰后M2基因的质粒，获得缺陷型M2-2×stop+del质粒。 在本发明中，构建含修饰后M2基因的质粒所需的引物序列优选如SEQ ID NO.5～9所示。在本发明中，所述缺陷型M2-2×stop+del质粒优选分别含如 SEQ ID NO.1～4所示的核苷酸序列。
获得缺陷型M2-2×stop+del质粒后，本发明利用反向遗传系统，将表达 流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞，收获病毒，得到A型流 感病毒致弱毒株；所述质粒包括缺陷型M2-2×stop+del质粒、PB2质粒、PB1 质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA片段的质粒；所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。pFlu载体是一种双向转录载体，是病毒拯 救常用的载体，本发明优选以此载体为基础进行质粒的构建。在本发明中， 所述质粒优选包括pFlu-PR8-PB2，pFlu-PR8-PB1，pFlu-PR8-PA， pFlu-PR8-NP，pFlu-PR8-M2-2×stop+del(缺陷型M2-2×stop+del质粒)， pFlu-PR8-NS和2个外部基因pFlu-HA，pFlu-PR8-NA以及表达PR8-M2蛋 白的质粒(表达A/Puerto Rico/8/1934全长M2蛋白的质粒)。
本发明还提供了上述技术方案所述致弱毒株或上述技术方案所述构建 方法构建得到的致弱毒株在制备流感减毒疫苗中的应用。本发明提供了一种 A型流感病毒减毒策略，利用反向遗传技术，可在特定细胞中拯救获得低毒 性的流感病毒，为制备生产流感减毒疫苗提供了新的选择。
下面结合具体实施例对本发明所述的一组A型流感病毒致弱毒株及其 制备方法和应用做进一步详细的介绍，未注明的常规实验方法参考《分子克 隆实验指南第三版》(萨姆布鲁克主编，科学出版社，2002)。本发明的技术 方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.构建M2-2×stop+del缺陷型质粒
定义M2基因上两个终止密码子，缺失不同长度序列del8，del28，del73， del91缺陷型质粒统称为M2-2×stop+del质粒。
针对所要构建的缺陷型质粒，设计如表1所示的引物：
表1缺陷型质粒构建用引物序列
2×stop-del8-F tcaagtgatTGATGAcgcaaatatcattgggat(SEQ ID NO.5)
2×stop-del28-F tcaagtgaTGATGAtgcacttgacattgtggattcttg(SEQ ID NO.6)
2×stop-del73-F tcaagtgatTGATGAtttaccgtcgctttaaatacg(SEQ ID NO.7)
2×stop-del91-F tcaagtgatTGATGAacggactgaaaggagggccttct(SEQ ID NO.8)
PR8delR tcatcaatcacttgaaccgttg(SEQ ID NO.9)
以包含A型流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934)M基因的载体质粒(以 pFlu载体为基础，采用常规重组载体构建方法构建得到)为模板，以表1中 所示的每个上游引物和共同的下游引物PR8delR配对，用高保真酶 PrimerSTAR进行PCR扩增，按PrimerSTAR说明常规操作说明进行实验， 分别扩增得到M2-2×stop+del片段。实验中，退火温度58℃，延伸温度72℃， 延伸时间1.5min。反应体系如表2：
表2反应体系
将扩增得到的片段按照HiFi DNAAssembly试剂盒说明书 要求，进行同源重组克隆。克隆体系如表3：
表3克隆体系
名称 体积/微升
载体骨架 2(0.1pmol)
M2-2×stop+del片段 5(0.2pmol)
去离子H2O 3
2×mastermix 10
总体积 20
将克隆产物转化大肠杆菌细胞，涂布LB氨苄平板后，在37℃培养24h， 挑单克隆菌落，用常规生物学方法提取质粒，将获得的载体用引物 gctggtctgaaaaatgatcttcttg(SEQID NO.16)进行测序。通过测序比对突变体 M2序列，最终得到缺陷型M2-2×stop+del质粒。
2.缺陷型流感病毒拯救及制备
采用流感反向遗传操作系统拯救重组疫苗。将293T细胞接种在六孔板 (ThermoFisher)，待细胞密度达到70～80％时进行转染。将6个PR8内部 基因pFlu-PR8-PB2，pFlu-PR8-PB1，pFlu-PR8-PA，pFlu-PR8-NP，pFlu-PR8- NS以及pFlu-PR8-M2-2×stop+del，和2个外部基因pFlu-PR8-HA， pFlu-PR8-NA各0.5μg以及表达全长M2的质粒0.25μg混合后，用LTX转染试剂盒进行转染，转染体系滴入准备好的293T细 胞中，放入37℃二氧化碳培养箱培养。
转染48～72h后，将细胞在-80℃冻融，收集上清并接种于MDCK-M2细 胞(过表达M2的MDCK细胞，本发明对过表达M2的MDCK细胞的制备 方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的过表达蛋白细胞构建方法进 行构建即可)，放入37℃病毒培养箱培养。每天观察病变情况，病变达到一 定程度后收集病毒，分装到病毒保存管中。
取一部分病毒测序鉴定确保M基因为所设计的缺陷型，其余冻存于-80℃备用。所得到M2缺陷型流感病毒分别命名为M2del8，M2del28， M2del73，M2del91流感重组病毒。
3.病毒生长曲线
将MDCK-M2细胞铺于24孔板，待细胞长满单层后，将M缺陷型流感 病毒株以感染复数(MOI)为0.001的剂量接种细胞，感染2h后，弃掉24 孔板中的液体，用PBS洗涤后加入含2％FBS的DMEM培养基维持细胞生 长，置37℃、5％CO2，培养箱中培养。
分别在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h收获病毒，将收获的不 同时间点的病毒液作连续10倍倍比稀释后，每个稀释度做4个重复，分别 接种于96孔板中长至单层的MDCK-M2细胞中，感染2h后换成2％FBS的 DMEM培养液维持细胞的生长，48h后用观察细胞病变，测定不同时间点收 集的缺陷型流感病毒株的毒价，应用Reed-Muench方法计算其TCID50，数 据分析完成后，绘制M缺陷型流感重组病毒的生长曲线。图2为病毒生长 曲线。
M2缺陷型毒株与野生型毒株相比，48h内生长速度显著降低，但在过 表达M2的MDCK细胞仍能够达到较高的复制速率，获得较高的病毒滴度。
4.M2缺陷型病毒在MDCK细胞的生长特性
将MDCK细胞铺于24孔板，待细胞长满单层后，将M缺陷型流感病 毒株从感染复数(MOI)为0.001(250TCID50)起，按梯度增加接种细胞， 置于37℃5％CO2培养箱进行培养。
96h后观察细胞病变情况，并进行血凝检测，研究发现M2del病毒在高 剂量接种时可以在MDCK细胞中复制，达到较高的血凝价。
图3为不同剂量M2del8病毒感染MDCK细胞时的生长特性图；
图4为不同剂量M2del28病毒感染MDCK细胞时的生长特性图；
图5为不同剂量M2del73病毒感染MDCK细胞时的生长特性图；
图6为不同剂量M2del91病毒在MDCK细胞上的生长特性图；
采用终止密码子和缺失突变的方法对流感病毒基因组进行改造，拯救获 得的病毒株在正常MDCK细胞中复制能力受限，但不是一过性复制，作为 疫苗使用时，有利于诱导更好的保护力。
5.接鸡胚生长情况(生长特性)
选用10日龄的SPF鸡胚，标记出气室和胚胎的位置，在气室接近胚体 处用酒精进行消毒，穿一个小孔，用注射器插入适当的深度，注入0.1ml病 毒液后用石蜡封口，放回孵育箱中孵育，每天定时检卵一次，去除24h时死 亡的胚胎，对其他鸡胚进行观察，72h后取尿囊液进行血凝检测。结果如表 4：
表4鸡胚观察结果
M2缺陷型病毒接种鸡胚，72h后鸡胚全部存活，可见其致弱效果显著； 其中M2del8，M2del28，M2del73在鸡胚中能达到较高的血凝价，为后续疫 苗生产提供了一种选择。M2del91在鸡胚的血凝价偏低或无血凝，可能是由 于缺失片段过长，对病毒扩增影响相对其他毒株较大。
6.M2缺陷型病毒在小鼠体内减毒效果评价
用5周龄BALB/C雌性小鼠(维通利华)，每组8只小鼠，在鼻内分别 接种获得的M2缺陷型病毒：PR8-M2+del8、PR8-M2+del28、PR8-M2+del73、 PR8-M2+del91。以106TCID50/50uL每只小鼠的剂量对小鼠进行滴鼻(鼻腔 免疫接种)，对照组小鼠滴加等体积PBS。接种后记录14天内小鼠的体重 变化和感染症状，接种3天后从每组取3只小鼠，对小鼠的肺部和鼻甲骨研 磨液的病毒载量进行检测。
小鼠体重变化图如图7所示，流感病毒野生型毒株PR8接种小鼠后，体 重直线下降，第5天后小鼠死亡；而M2缺陷型毒株免疫小鼠后，部分毒株 (如M2-del8、M2-del28、M2-del73)导致小鼠体重短暂下降，然后在14天 内得到恢复，其中M2-del8对小鼠体重影响持续时间超过其他毒株；部分毒 株(M2-del91)对小鼠体重无显著影响。
表5小鼠免疫野生型和M2缺陷型病毒后鼻甲和肺组织病毒载量
小鼠接种流感野生型病毒或M2缺陷型病毒3天后，取小鼠的肺部组织 和鼻甲骨研磨液对病毒载量进行检测。结果(表5)显示，接种野生型病毒 后在鼻甲和肺组织中检测到较高的病毒滴度，如上表所示；M2-del8、 M2-del73、M2-del91等毒株接种3天后，病毒载量显著低于野生型或低于检 出限，显示出良好的弱毒性。
7.M2缺陷型病毒在小鼠体内诱导针对流感病毒的血清抗体
用7周龄BALB/C雌性小鼠(斯莱克)，每组8只小鼠，在鼻内分别接 种获得的M2缺陷型病毒：PR8-M2+del8、PR8-M2+del28、PR8-M2+del73、 PR8-M2+del91。以106TCID50/50μL每只小鼠的剂量对小鼠进行滴鼻(鼻腔 免疫接种)，对照组小鼠滴加等体积PBS。
免疫后14天对小鼠采血，测量血清抗体效价(血凝抑制价)。
表6血凝抑制价结果
如表6所示，除M2-del91毒株外，M2缺陷型毒株均在小鼠体内诱导出 较高的血凝抑制价，显示出针对流感病毒的血清抗体。
8.M2缺陷型病毒免疫小鼠21天后的攻毒实验
实施例6中所述小鼠中选取了M2-del8、M2-del73、M2-del91三组，3 只牺牲用于检测病毒载量，其余5只用于攻毒实验。将野生型PR8毒株以 106TCID50/50μL每只小鼠的剂量对小鼠进行攻毒，记录从接毒后第1天至 第11天的小鼠体重。
从实施例6(图8)可知，小鼠在野生型流感毒株接种后第5天死亡。 如图8所示，M2-del8毒株免疫后的小鼠在攻毒后体重基本保持稳定； M2-del73、M2-del91毒株免疫后的小鼠攻毒后体重略有降低，并且在观测期 间恢复正常体重。这些数据表明本发明的毒株具有作为减毒流感疫苗的潜 力。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江迪福润丝生物科技有限公司
<120> 一组A型流感病毒致弱毒株及其制备方法和应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 974
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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aaagccgaga tcgcacagag acttgaagat gtctttgcag ggaagaacac cgatcttgag 120
gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
ttagccagca ctacagctaa ggctatggag caaatggctg gatcgagtga gcaagcagca 600
gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
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<210> 2
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gttctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa ggggatttta 180
ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240
caaaatgccc ttaatgggaa cggggatcca aataacatgg acaaagcagt taaactgtat 300
aggaagctca agagggagat aacattccat ggggccaaag aaatctcact cagttattct 360
gctggtgcac ttgccagttg tatgggcctc atatacaaca ggatgggggc tgtgaccact 420
gaagtggcat ttggcctggt atgtgcaacc tgtgaacaga ttgctgactc ccagcatcgg 480
tctcataggc aaatggtgac aacaaccaat ccactaatca gacatgagaa cagaatggtt 540
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gaggccatgg aggttgctag tcaggctaga caaatggtgc aagcgatgag aaccattggg 660
actcatccta gctccagtgc tggtctgaaa aatgatcttc ttgaaaattt gcaggcctat 720
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 25
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gctggtctga aaaatgatct tcttg 25

Claims (7)

1.一组具有限制性复制能力的A型流感病毒致弱毒株，其特征在于，所述致弱毒株通过对M2基因进行修饰获得，所述修饰包括进行终止密码子突变和在突变的终止密码子后进行缺失突变；所述进行终止密码子突变为将M基因第761至第766位点的核苷酸序列突变为两个终止密码子；所述缺失突变为在所述突变的终止密码子后分别缺失8、28或73个核苷酸。
2.根据权利要求1所述的致弱毒株，其特征在于，所述致弱毒株的背景毒株包括A/Puerto Rico/8/1934病毒。
3.根据权利要求1所述的致弱毒株，其特征在于，对M2基因进行修饰后，M基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。
4.权利要求1～3任一项所述致弱毒株的构建方法，包括以下步骤：
构建含修饰后M2基因的质粒，获得缺陷型M2-2×stop+del质粒；
利用反向遗传系统，将表达流感病毒基因组片段和蛋白的质粒混合后转染细胞，收获病毒，得到A型流感病毒致弱毒株；
所述质粒包括缺陷型M2-2×stop+del质粒、PB2质粒、PB1质粒、PA质粒、NP质粒、NS质粒、HA质粒和NA质粒；
所述质粒还包括表达PR8-M2蛋白的质粒。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，构建含修饰后M2基因的质粒所需的引物序列如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述缺陷型M2-2×stop+del质粒分别含如SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列。
7.权利要求1～3任一项所述致弱毒株或权利要求4～6任一项所述构建方法构建得到的致弱毒株在制备具有限制性复制能力的流感减毒疫苗中的应用。
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