CN109750006A - 一种犬瘟热病毒复制缺陷毒株及其构建方法 - Google Patents

一种犬瘟热病毒复制缺陷毒株及其构建方法 Download PDF

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黄娟
单虎
林佳旭
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Abstract

本发明涉及一种犬瘟热病毒的犬瘟热病毒复制缺陷株的拯救及验证，该系统包含：转录质粒，所述转录质粒pCI‑CDV‑SD16F能够表达所述犬瘟热病毒流行毒株SD16F的基因组全长cDNA序列，经定点突变后的pCI‑CDV‑SD16F‑M质粒为不表达M蛋白的重组质粒；和一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒SD16F流行毒株的核蛋白(NP)、磷蛋白(P)和大聚合酶蛋白(L)；可稳定表达SD16F M蛋白的Vero‑SLAM‑M细胞系。通过上述反向遗传操作系统，成功的拯救出重组复制缺陷犬瘟热病毒。本研究所述的犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷毒株为新型犬瘟热基因工程生物防治制剂的研制创造了便利条件及犬瘟热病毒相关基础研究提供了极佳的技术平台。

Description

一种犬瘟热病毒复制缺陷毒株及其构建方法
技术领域
本发明属于病毒反向遗传操作技术领域，具体涉及一种犬瘟热病毒复制缺陷毒株及其构建方法。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper,CD)是一种可导致多种动物共患的高度接触性传染病，由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)中的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染所引起的。在自然条件下，最为易感的动物以犬科、鼬科、猫科等肉食兽为主，感染后的死亡率极高。
CDV为有囊膜的单股负链RNA病毒，主要编码有6个结构蛋白，分别是核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和大聚合酶蛋白(L)。免疫接种是目前防制犬瘟热的主要手段，灭活苗对CDV强毒攻击不能提供完全的保护，因此，弱毒活疫苗被广泛应用于犬和经济动物犬瘟热的防制。商品化犬瘟热弱毒疫苗的疫苗毒株多是通过将分离的强毒株经异种动物(雪貂等)、鸡胚或细胞连续传代以致弱，如CDV/R-20/8株、 Onderstepoort株等，但是这种致弱方法获得的弱毒株存在毒力返强的风险，而且疫苗株对野生动物有不同程度的致病性；少数商品化犬瘟热弱毒疫苗的疫苗毒株是从自然界分离筛选获得的自然弱毒株，如用于狐狸的CDV-11株，是从体温一过性升高的犬分离获得，对犬、貉、水貂、狐狸均安全，但该疫苗株在动物体内可自主复制，在免疫接种时存在散毒风险，对野生动物的安全性也未知。
与传统致弱方式相比，以反向遗传学为基础，利用点突变毒力基因相关位点及病毒拯救的方法获得减毒株，具有病毒致弱机制更明确的优点；将病毒基因组某个复制必须蛋白基因缺失，获得病毒复制缺陷毒株，该毒株只能在提供该蛋白的复制许可细胞上复制，在其他细胞或动物体内均无复制性，接种动物后通过一次性感染使其获得免疫力，而不会在动物体内复制，更不会排毒，因此更加安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷毒株及其构建方法，从而克服现有技术中存在的问题。
本发明首先提供一种构建犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷毒株的方法，包括如下的步骤：
1)在转录质粒中插入不表达M蛋白的犬瘟热病毒基因组全长cDNA序列，获得重组质粒；
所述的不表达M蛋白，是经过定点突变获得的；
其一种具体的定点突变，是在M基因起始密码子处进行碱基定点突变，将A 碱基突变为C。
2)构建辅助质粒，所述辅助质粒能够表达犬瘟热病毒的核蛋白NP、磷蛋白P及大聚合酶蛋白L；
3)构建表达犬瘟热病毒M蛋白的细胞系，所述的细胞系为Vero-SLAM-M 细胞系；
4)使用重组质粒和辅助质粒共转染表达犬瘟热病毒M蛋白的细胞，从转染细胞的细胞悬液中拯救出重组犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷株。
本发明再一个方面提供一种用于制备犬瘟热病毒复制缺陷株的制品：所述的制品包含有：
1)转录质粒，所述转录质粒为插入不表达M蛋白的犬瘟热病毒基因组全长cDNA序列的重组质粒；
2)一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒的核蛋白 (NP)、磷蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)；
3)宿主细胞系，所述细胞系能够稳定表达犬瘟热病毒的M蛋白。
本发明另一个目的是提供犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷毒株在制备预防犬瘟热的疫苗中的应用。
本发明还提供稳定表达犬瘟热病M蛋白的Vero-SLAM-M细胞系。
本发明构建了犬瘟热病毒基因组全长cDNA克隆，并根据定点突变技术构建出不表达M蛋白的重组基因组全长cDNA克隆及表达CDV NP、P和L 蛋白的辅助质粒，新建能够稳定表达犬瘟热病毒流行毒株SD16F的M蛋白的细胞系；采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术，成功拯救出重组犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷株。本发明为进一步发展预防犬瘟热的新型疫苗及生物制品研制及CDV其它研究奠定了基础。
附图说明
图1：本发明的技术路线图；
图2：pCI-CDV-SD16F-△M质粒中的插入片段序列，其中两端斜体字为插入片段克隆至pCI的酶切位点Nhe I和Not I，下划线区域为5'端添加的锤头核酶Ham Rz序列和3'端添加的丁型肝炎核酶HDV Rz序列,中间区域为犬瘟热病毒(CDV)基因全长序列，黑色加粗字体为突变M基因(起始密码子ATG突变为 CTG)；
图3：重组质粒酶切鉴定结果图，其中M1：DL10000 DNA分子量标准； M2：DL5000DNA分子量标准；1：重组质粒用Xho I/Not I酶双酶切；2：重组质粒用Xho I酶单酶切；
图4：间接免疫荧光试验鉴定Vero-SLAM-M细胞中M基因的稳定表达 (F10代)，其中A：pCI-neo转染细胞；B：pCI-neo-M转染细胞；
图5：Vero-SLAM-M细胞系和Vero-SLAM细胞系一步生长曲线图；
图6：CDV胶体金试纸条检测拯救出的病毒检测图；
图7：免疫小鼠体内中和抗体效价测定图。
具体实施方式
下面将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。
实施例1犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷株系统的构建
1、犬瘟热流行毒株SD16F(GenBank登录号为MH337872)由发明人所在实验室分离自CD发病狐狸，接种幼犬可致其发病死亡；Vero-SLAM细胞(非洲绿猴肾细胞，ATCCNo.CCL-81)，培养液为含8％胎牛血清的DMEM；质粒 pCI由本实验室保存；其他限制性内切酶、T4DNA连接酶和Ex Taq酶等均购自TaKaRa公司；无内毒素质粒小量提取试剂盒、DMEM培养基、G418硫酸盐溶液以及胎牛血清均购于生工生物工程有限公司公司；转染试剂lipo3000购自Invitrogen公司；CDV N单克隆抗体购自山东绿都生物科技有限公司，犬源阳性血清由本实验室保存，荧光标记的兔抗犬IgG购自北京博奥森生物技术公司，HRP标记的二抗(抗鼠)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 CDV SD16F株基因组全长cDNA的克隆及辅助质粒的构建
2、为了构建SD16F株全长cDNA克隆，采用HD Cloning Kit 无缝连接技术分三步克隆(图1)，第一步是3’端克隆，将丁型肝炎病毒核酶 (HdvRz)全部序列添加到引物中，根据Nhe I和Not I限制性酶切位点克隆到pCI 载体上，命名为pCI-CDV-3’；第二步扩增出中间序列以Sph I酶切位点插入到 pCI-CDV-3’质粒中，命名为pCI-CDV-3’-Plus，第三步克隆是5’端克隆，将锤头核酶(HamRz)全部序列添加到引物中去，以Sph I酶切位点插入到 pCI-CDV-3’-Plus，重组质粒的克隆送去TaKaRa公司测序。
犬瘟热病毒反向遗传技术体系主要是构建RNA病毒基因组全长cDNA克隆及辅助质粒，其中辅助质粒分别表达N、P、L三个功能蛋白，通过RT-PCR方法扩增N、P、L开放阅读框基因，将扩增出的DNA片段与真核表达载体pCI 连接，并将重组质粒转染Vero-SLAM细胞，RT-PCR和IPMA方法验证其表达情况。
3、CDV基因组全长cDNA的定点突变
在上述CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-SD16F的基础上，引入 SalⅠ/SacⅡ限制性酶切位点，在M基因起始密码子处进行碱基定点突变，将A 碱基突变为C。
表1：引物设计
名称 序列(5’－3’) 长度(mers)
pCI-CDV-SD16F-M F1 TACGGCAAATGTCGACATTAAC 22
pCI-CDV-SD16F-M F2 TCTCCACAAAACTGACTGAGGTGTAC 26
pCI-CDV-SD16F-M R1 CTCAGTCAGTTTTGTGGAGAGGAC 24
pCI-CDV-SD16F-M R2 TCCAATCGGGGGTCCGCGGCTAT 23
使用上述引物和HS(Premix)，对质粒pCI-CDV-SD16F进行 PCR扩增，获得两个PCR产物，分别命名为pCI-CDV-SD16F-A(489bp)和 pCI-CDV-SD16F-B(221bp)。对上述PCR产物使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0进行切胶回收。将质粒pCI-CDV-SD16F，使用SalⅠ /SacⅡ进行酶切。使用TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 切胶回收约19kbp的DNA片段后，命名为pCI-CDV-SD16F-Vector。使用HD Cloning Kit，将片段与载体进行In-Fusion反应，反应体系如下表，反应条件为50℃反应15min。
取上述In-Fusion产物2.5ul热转化至E.coli HST08Premium Competent Cells中，涂布平板，37℃过夜培养。挑选阳性菌落植菌，提取质粒命名为 pCI-CDV-SD16F-△M，对上述质粒进行测序。
4、稳定表达CDV SD16F株M蛋白的Vero-SLAM-M细胞系的构建
设计合成引物，SD16F-M-F：CCGCTCGAGGCCACCATGACTGAGGTG TACGACTTCG；SD16F-M-R：ATAAGAATGCGGCCGCTTAGAGAATTTT GAAAAGACCCTG，从犬瘟热病毒狐狸源流行毒株SD16F中扩增出M基因，将其克隆至真核表达质粒pCI-neo的Xho I/Not I位点处。重组质粒经PCR、Xho I/Not I双酶切及测序鉴定后转染Vero-SLAM细胞，通过G418抗性压力、RT-PCR及间接免疫荧光试验(IFA)筛选、鉴定细胞系中M蛋白的表达。
5、病毒的拯救
转染前一天将Vero-SLAM-M细胞接种在6孔板上，使孔内细胞密度达到 2×105，当细胞达到85-90％时进行转染。将pCI-CDV-SD16F-△M重组载体与辅助质粒pCI-SD16F-N、pCI-SD16F-P、pCI-SD16F-L分别按5μg、0.8μg、 0.5μg、0.8μg的用量共转染Vero-SLAM-M细胞，置于5％CO2培养箱37℃培养，具体操作步骤按LipofectamineTM 3000试剂盒说明书进行。共转染6-8小时后，弃掉孔内的转染混合液，换上含血清Vero-Slam-M全培养基，置于5％CO2培养箱37℃培养24小时后更换培养基。培养3-5天，倒置显微镜下观察细胞病变；收获细胞悬液，作为种毒保存于-80℃冰箱。将病毒接种复制非许可细胞——Vero-SLAM细胞作为对照。
6、CDV复制缺陷株致病性和免疫原性试验
将100μl SD6F复制缺陷毒和母本毒分别经绒毛尿囊膜接种11日龄非免疫鸡胚，37℃培养5天，每天观察鸡胚状况，弃去24h死亡的鸡胚，并于第5日将鸡胚置于4℃冷缩血管后观察绒毛尿囊膜上痘斑。将100μl SD6F复制缺陷毒和母本毒分别经皮下接种4周龄Balb/c小鼠，间隔1周二免，2周后三免，三免2 周后摘眼球采血分离血清测定中和抗体。
结果如下：
1、CDV基因组全长cDNA的克隆及辅助质粒的构建
结果表明，重组质粒中的CDV全基因组序列与全基因组扩增时获得的全长基因序列完全一致，将重组的最终全长cDNA克隆质粒命名为pCI-CDV-SD16F。经过质粒酶切鉴定和测序结果鉴定确定了三种辅助蛋白基因真核表达载体构建成功，分别命名为pCI-SD16F-N、pCI-SD16F-P和pCI-SD16F-L，RT-PCR能够检测到重组质粒的转录产物，IPMA能够观察到转染细胞中辅助蛋白特异性着色细胞。这为进一步进行病毒的拯救奠定基础。
2、CDV基因组全长cDNA的定点突变
在上述CDV基因组全长cDNA克隆pCI-CDV-SD16F的基础上，引入 SalⅠ/SacⅡ限制性酶切位点，在CDV cDNA3432bp处进行碱基定点突变，将 A碱基突变为C，构建成不表达M蛋白的重组基因组全长cDNA克隆 pCI-CDV-SD16F-△M，对上述质粒进行测序，结果显示正确(图2)。
3、稳定表达犬瘟热病M蛋白的Vero-SLAM-M细胞系的构建
为了构建稳定表达CDV M蛋白的细胞系，通过RT-PCR成功构建了重组质粒pCI-neo-M(图3)，瞬时及稳定转染Vero-SLAM细胞后，RT-PCR和IFA 能够检测到M基因的转录和表达(图4)，且G418筛选后细胞与其亲本 Vero-SLAM细胞生长特性基本一致(图5)，表明获得一株能稳定表达M蛋白的Vero-SLAM细胞系，命名为Vero-SLAM-M。
普通的Vero细胞或Vero-SLAM细胞不能用于犬瘟热病毒M蛋白缺陷病毒的拯救及生长，因此，本发明构建了稳定表达犬瘟热病M蛋白的 Vero-SLAM细胞系。
4、从cDNA克隆拯救重组犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷株
质粒转染细胞后出现明显的细胞病变，收获病毒，反复冻融、离心后，收取细胞悬液，作为拯救出的复制缺陷株的F1代。按上述方法将拯救的病毒再传3 代，进一步的RT-PCR及胶体金试纸条检测结果显示，在缺陷毒株复制许可细胞Vero-SLAM-M上可以检测到CDV，表明病毒拯救成功，而复制非许可细胞 Vero-SLAM上不能成功增殖病毒(图6)。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用CDV流行毒株SD16F基因组定点突变cDNA克隆成功拯救出重组犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷株，命名为SD16F-M。
5、CDV复制缺陷株致病性和免疫原性试验
重组病毒SD16F-M及亲本毒SD16F接种鸡胚后，重组病毒未引起鸡胚病变，而亲本毒使鸡胚绒毛尿囊膜产生特征性痘斑。整个免疫过程中，重组病毒 SD16F-M及亲本毒SD16F组，小鼠全部存活，均未出现任何CDV临床感染症状。采集血清测得中和抗体，两组滴度无明显差异(图7)。

Claims (7)

1.一种构建犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷毒株的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)在转录质粒中插入不表达M蛋白的犬瘟热病毒基因组全长cDNA序列，获得重组质粒；
2)构建辅助质粒，所述辅助质粒能够表达犬瘟热病毒的核蛋白NP、磷蛋白P及大聚合酶蛋白L；
3)构建表达犬瘟热病毒M蛋白的细胞系，所述的细胞系为Vero-SLAM-M细胞系；
4)使用重组质粒和辅助质粒共转染表达犬瘟热病毒M蛋白的细胞，从转染细胞的细胞悬液中拯救出重组犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷株。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中所述的不表达M蛋白，是在M基因起始密码子处进行碱基定点突变，将A碱基突变为C。
3.一种用于制备犬瘟热病毒复制缺陷株的制品：其特征在于，所述的制品包含有：
1)转录质粒，所述转录质粒为插入不表达M蛋白的犬瘟热病毒基因组全长cDNA序列的重组质粒；
2)一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述犬瘟热病毒的核蛋白、磷蛋白及大聚合酶蛋白；
3)宿主细胞系，所述细胞系能够稳定表达犬瘟热病毒的M蛋白。
4.一种犬瘟热病毒流行毒株复制缺陷毒株，其特征在于，所述的复制缺陷毒株是使用权利要求1所述的方法制备的。
5.权利要求4所述的复制缺陷毒株在制备预防犬瘟热的疫苗中的应用。
6.一种疫苗，其特征在于，所述的疫苗中使用的抗原包含有权利要求4所述的复制缺陷毒株。
7.一种细胞系，其特征在于，所述的细胞系为稳定表达犬瘟热病M蛋白的Vero-SLAM-M细胞系。
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