CN101851607A - Canine-SLAM/Vero细胞系及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种Canine-SLAM/Vero细胞系及构建方法，采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因；构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用G418筛选稳定表达SLAM的细胞系；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的表达情况，得到细胞系。本发明不但可用于犬瘟热病毒的分离和病毒的滴定，而且还显著缩短分离病毒的时间和提高了病毒的产量，有力地推动了对犬瘟热病毒表现型和遗传型等分子特征的研究。

Description

Canine-SLAM/Vero细胞系及构建方法

技术领域：

本发明提供了一种Canine-SLAM/Vero细胞系，本发明还提供了上述细胞系的构建方法，用于犬瘟热病毒野毒株的分离及其病原学的研究，属于生物工程技术领域。

背景技术：

犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属的一种有囊膜的单股负链RNA病毒。近年来，伴随着生态环境的变化及动物和病毒的进化，CDV的自然感染宿主已由传统的犬科、鼬科及浣熊科扩展到了食肉目所有8个科及偶蹄目猪科、灵长目猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，并且CDV自然感染的宿主范围还有不断扩大的趋势。

虽然犬瘟热病毒的宿主范围在不断扩大，但从患病动物中成功分离到犬瘟热野毒株一直比较困难，尤其是在犬瘟热发病的非急性期分离是极其不易的，严重制约着对犬瘟热病的深入研究。传统分离犬瘟热病毒的方法比较多，但都有其明显局限性。例如，将早期感染犬瘟热动物的病毒阳性组织研磨液上清与SPF犬的淋巴细胞、或SPF雪貂腹腔巨噬细胞、或丝裂原刺激的犬淋巴细胞、或犬肺泡巨噬细胞共培养分离到CDV野毒株，但获取这些细胞比较困难，并且有的要求SPF动物增加了实验的成本和操作要求；也有极少采用病料接种鸡胚绒毛尿囊膜成功分离到犬瘟热野毒株，但该种方法至少要在新鸡胚上盲传数周才会出现明显的CPE，并且盲传会导致病毒毒力下降，且利用该途径分离犬瘟热病毒的成本也比较高；目前低成本分离病毒的途径是利用组织培养分离法。在早期，Vero和MDCK被广泛用于分离CDV，但该方法至少要在细胞上盲传一个月才会出现CPE，且不是所有的毒株都会产生CPE，研究发现适应MDCK或Vero细胞系的CDV毒株的遗传特征会发生变化；经EB病毒刺激的来自狨猴B淋巴细胞的B95a系(B95-8)对CDV易感，但狨猴是一种濒临灭绝的动物，且该细胞可向外分泌EB病毒，从实验安全和成本上讲该细胞系也不是分离犬瘟热病毒的最佳选择。鉴于目前国内还多用传统的方法分离培养犬瘟热病毒，分离成功的几率小，且时间较长，成本高。所以尽快建立起方便、快速分离犬瘟热病毒的方法显得尤为重要。

SLAM是免疫球蛋白超家族CD2的成员，存在于所有激活的T细胞、B细胞和树突状细胞。目前SLAM已被证实是犬瘟热病毒的主要受体，其与犬瘟热病毒的组织嗜性和感染宿主有密切联系，研究表明SLAM的V结构域与CDV的膜蛋白H蛋白结合，随之引起融合蛋白(F蛋白)结构变化，从而使病毒囊膜与细胞膜融合，使病毒进入细胞。

发明内容：

本发明公开了一种Canine-SLAM/Vero细胞系，是一种稳定表达犬瘟热病毒受体的细胞系，能快速且敏感地分离出CDV野毒株，并且在接种病料后36-48h内就能出现CPE，用于犬瘟热病毒野毒株的分离、滴定及其病原学等多方面的研究。

本发明还提供了上述细胞系的构建方法，缩短了分毒时间，提高了病毒产量，稳定表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体。

本发明的Canine-SLAM/Vero细胞系，其特征在于：

Vero细胞中转染含犬SLAM的真核表达载体，细胞表面稳定表达有犬瘟热病毒受体SLAM。

本发明上述细胞系的构建方法，技术解决方案如下：

无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因；构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用G418筛选稳定表达SLAM的细胞系——Canine-SLAM/Vero；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的表达情况；最后利用Canine-SLAM/Vero分离不同动物源犬瘟热野毒株，并进行敏感性比较研究。

具体制备方法包括以下步骤：

1.犬外周血淋巴细胞的分离

无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液按说明书操作分离外周血淋巴细胞；

2.犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增

按照经典总RNA提取试剂盒说明书操作提取犬外周血淋巴细胞的总mRNA，应用Random Primer(6 mer)pd(N)6、Oligo d(T)15反转录引物合成cDNA后，用引物对SLAM-F/SLAM-R扩增犬SLAM基因；

上游引物SLAM-F：5’-GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3’(Xho I)

下游引物SLAM-R：5’-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3’(Bgl II)；

3.重组表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的构建和在Vero细胞上的表达；

4.Canine-SLAM/Vero细胞阳性克隆的筛选和培养；

在脂质体介导pCAGGS-Neo/SLAM转染Vero细胞后，用含800μg/mL G418的2％DMEM培养液进行筛选，按常规在细胞长满时消化、传代，连续培养6周后，间接免疫荧光检测SLAM的表达情况，将得到稳定表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体的Vero细胞系——Canine-SLAM/Vero，冻存于液氮罐中备用。

本发明的细胞系培养过程中：

①培养细胞时需要在培养液中添加微量的G418(建议用量600-800μg/mL)，来稳定受体SLAM的表达；

②细胞系冻存前必须添加G418；

③用于分离犬瘟热病毒研究时，最好使用复苏后的前30代细胞。

应用Canine-SLAM/Vero细胞对犬瘟热病毒进行分离情况：

利用构建的Canine-SLAM/Vero细胞单层吸附接犬源和猴源野生型CDV与疫苗株CDV，Vero细胞作为对照，实验发现这两株野生型CDV都能在Canine-SLAM/Vero细胞上生长，且在接毒24-36h产生明显细胞病变，而不能在Vero细胞上产生病变；疫苗株可在Canine-SLAM/Vero细胞和Vero细胞产生病变，但发现在前者中出现的病变快。

本发明与传统病毒分离方法相比其积极效果在于：构建了表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体的Vero细胞系(Canine-SLAM/Vero)，接种犬瘟热病料后，可在24-36h出现明显细胞病变，Canine-SLAM/Vero(前30代之内)不但可用于犬瘟热病毒的分离和病毒的滴定，而且还显著缩短分离病毒的时间和提高了病毒的产量，有力地推动了对犬瘟热病毒表现型和遗传型等分子特征的研究。此外，本细胞系可安全地进行国内外实验室间的交流和运输。

附图说明

图1：目的片段SLAM的克隆图；

图2：表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的PCR鉴定图；

图3：Canine-SLAM/Vero细胞的间接免疫荧光检测SLAM的表达情况照片；

图4：正常Vero细胞的间接免疫荧光检测SLAM的表达结果为阴性；

图5：细胞照片；A、B、C分别是犬源、猴源野生型CDV和疫苗株CDV在Canine-SLAM/Vero细胞上病变情况；D、E、F分别是犬源、猴源野生型CDV和疫苗株CDV在Vero细胞上病变情况。

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。

实施例1

Canine-SLAM/Vero细胞系的建立

1.犬外周血淋巴细胞的分离

无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血7ml，应用犬淋巴细胞分离液按说明书操作分离外周血淋巴细胞后，2500rpm/min离心10min。用Hank’s液重悬后置-20℃备用。

2.犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增

按照经典总RNA提取试剂盒说明书操作提取犬外周淋巴细胞的总mRNA，应用Random Primer(6 mer)pd(N)6、Oligo d(T)15反转录引物合成cDNA后，用参考GenBank：AF390108.1设计的引物对：

上游引物SLAM-F：5’-GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3’(Xho I)

下游引物SLAM-R：5’-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3’(Bgl II)

扩增犬SLAM基因(见图1)。将PCR产物回收后，将其克隆入PMD18-T载体；挑取阳性重组克隆送北京华大中天生物有限公司测序；

3.重组表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的构建及在Vero细胞上表达

经鉴定正确的扩增基因片段经Xho I和Bgl II双酶切后，克隆入经同样酶切操作的真核表达载体pCAGGS-Neo中，构建表达犬SLAM基因的质粒pCAGGS-Neo/SLAM，并进行PCR鉴定(见图2)。

应用无内毒素质粒中提试剂盒按照说明书提取重组质粒pCAGGS-Neo/SLAM，测定其浓度和纯度。当浓度达到0.8μg/μL以上、OD₂₆₀/OD₂₈₀达到1.8-2.0时既可用于转染。用含8％犊牛血清的DMEM将Vero细胞培养于50mL培养瓶中，当细胞生长至80％单层左右，按1∶2的比例铺于24孔板，在37℃、5％CO₂的培养箱培养12h。将纯化的重组质粒pCAGGS-Neo/SLAM用转染试剂Lipofectamine^TM2000Reagent(Invitrogen公司)按照操作说明书等量转染Vero细胞，同时设置重复转染孔及正常细胞培养孔，置37℃、5％CO₂的培养箱培养24h后，用间接免疫荧光鉴定SLAM蛋白是否表达(见图3、图4)，同时提取细胞基因组，用RT-PCR检测SLAM基因表达情况。

4.pCAGGS-Neo/SLAM细胞阳性克隆的筛选和培养

在脂质体介导pCAGGS-Neo/SLAM转染Vero细胞24-48h内，对转染孔和对照孔进行1孔变2孔的传代，用含800μg/mLG418的2％DMEM培养液进行筛选，按常规在细胞长满时消化、传代，连续培养6周后，用间接免疫荧光检测SLAM的表达情况，将得到稳定表达犬瘟热病毒的犬SLAM受体的Vero细胞系——Canine-SLAM/Vero，冻存于液氮罐中备用。

实用例1

用Canine-SLAM/Vero细胞分离犬瘟热病毒情况

利用构建的Canine-SLAM/Vero细胞单层吸附分离犬源(见图5A)和猴源野生型CDV(见图5B)与疫苗株CDV(见图5C)，Vero细胞作为对照(见图5D、E、F)，发现这两株野生型CDV都能在Canine-SLAM/Vero细胞上生长，且在接毒24-36h产生明显细胞病变，而不能在Vero细胞上产生病变；疫苗株可在Canine-SLAM/Vero细胞和Vero细胞产生病变，但发现在前者中出现的病变快。

实验发现用Canine-SLAM/Vero细胞培养的病毒滴度比普通Vero细胞至少高10倍。总而言之，用Canine-SLAM/Vero细胞分离犬瘟热野毒株具有时间短产毒量高等优点。

Claims (3)

1.一种Canine-SLAM/Vero细胞系，其特征在于：Vero细胞中转染含犬SLAM的真核表达载体，细胞表面稳定表达有犬瘟热病毒受体SLAM。

2.权利要求1所述细胞系的构建方法，技术解决方案如下：采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，通过PCR方法获得犬SLAM基因；构建pCAGGS-Neo/SLAM质粒；将构建的pCAGGS-Neo/SLAM表达盒转染到Vero细胞中，采用G418筛选稳定表达SLAM的细胞系；利用间接免疫荧光法鉴定和检测SLAM在细胞膜表面的表达情况，得到细胞系。

3.权利要求2所述细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)犬外周血淋巴细胞的分离

无菌颈静脉采集犬瘟热阳性犬抗凝血，应用犬淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞；

2)犬SLAM基因cDNA编码的RT-PCR扩增

提取犬外周血淋巴细胞的总mRNA，应用Random Primer(6mer)pd(N)6、Oligo d(T)15反转录引物合成cDNA后，用引物对SLAM-F/SLAM-R扩增犬SLAM基因；

上游引物SLAM-F：5’-GCCTCGAGACAGGTGAGAGCTTGATGAAT-3’(Xho I)

下游引物SLAM-R：5’-GCAGATCTCAGCTCTCTGGGAACGTCAC-3’(Bgl II)；

3)重组表达载体pCAGGS-Neo/SLAM的构建和在Vero细胞上的表达；

4)Canine-SLAM/Vero细胞阳性克隆的筛选和培养

在脂质体介导pCAGGS-Neo/SLAM转染Vero细胞后，用含800μg/mL G418的2％DMEM培养液进行筛选，按常规在细胞长满时消化、传代，连续培养6周后，间接免疫荧光检测SLAM的表达情况，将得到细胞系。

Images