CN107267532A - PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用，属于分子生物学和病毒学领域。构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，扩增6片段，分别插入载体pSMART中，然后将位置不合适的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变；将各重组载体酶切，回收目标的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA。本发明PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法，该方法巧妙，效率高，可以应用于拯救猪流行性腹泻病毒，以研究PEDV致病机制及新型疫苗。

Description

PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用

技术领域

本发明属于分子生物学和病毒学领域，具体涉及PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是一种急性、高度传播性疾病，引起该病的主要病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。该病以呕吐、水样腹泻、脱水及代谢性酸中毒等为主要临床特征。各年龄阶段的猪均易感，但若影响哺乳仔猪，发病率为100％，死亡率高达80％-100％。国际病毒分类委员会将PEDV划归为套式病毒目、冠状病毒亚科、alpha-冠状病毒属。Alpha冠状病毒的其他成员还有Alphacoronavirus 1(包括猫冠状病毒、TGEV和犬冠状病毒等)、人冠状病毒NL63、人冠状病毒229E、长翼蝠冠状病毒HKU8、长翼蝠冠状病毒1、黄蝠冠状病毒512和菊头蝠冠状病毒HKU2。

PEDV是有囊膜、不分节段、单股正链RNA病毒，到目前为止超过一百个毒株的全基因组被测序完成，不同毒株基因组大小不等，全长约为28kb，包含5’cap结构和3’poly A尾。PEDV全基因组由5’端非编码区、3’UTR和至少7个开放阅读框(Open reading fram，ORF)组成，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b及非结构蛋白ORF3)和4个结构蛋白(S、E、M和N)，它们在基因组的顺序为5’UTR-P1a/1b-S-ORF3-E-M-N-3’UTR。ORF3是一个位于结构基因S和E之间的非结构基因，该类基因在不同的冠状病毒中的数目和大小均不同。

现有技术中，缺乏用于研究PEDV JS2008株致病机制的全长感染性cDNA和有效疫苗。

发明内容

本发明的目的是提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法，该方法巧妙，效率高。

本发明的另一目的是提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

本发明的再一目的是提供PEDV JS2008株全长感染性cDNA的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：

(1)以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物A-1-F和A-4997-R扩增PEDV-A片段，采用引物B-4971-F和B-11100-R扩增PEDV-B片段，采用引物C-11073-F和C-16216-R扩增PEDV-C片段，采用引物D-16194-F和D-19726-R扩增PEDV-D片段，采用引物E-19702-F和E-24860-R扩增PEDV-E片段，采用引物F-24832-F和F-27954-R扩增PEDV-F片段；

(2)将步骤(1)PCR扩增获得的6片段，分别插入载体pSMART中，得到插入了PEDV-A片段的重组载体pS-A、插入了PEDV-B片段的重组载体pS-B、插入了PEDV-C片段的重组载体pS-C、插入了PEDV-D片段的重组载体pS-D、插入了PEDV-E片段的重组载体pS-E、插入了PEDV-F片段的重组载体pS-F；

(3)将重组载体pS-B内PEDV-B片段、重组载体pS-D内PEDV-D片段、重组载体pS-F内PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，分别得到重组载体pS-mB、pS-mD和pS-mF；

(4)将重组载体pS-A使用XbaI和PflmI进行双酶切，将重组载体pS-mB、pS-C、pS-mD和pS-E使用PflmI进行单酶切，将重组载体pS-mF使用PflmI和EcoRV进行双酶切；回收各重组载体酶切后的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

在本发明中，将pS-B内PEDV-B片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-B为模板，采用引物6577-A/G-F和6577-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-B片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mB。

在本发明中，将pS-D内PEDV-D片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-D为模板，采用引物18027-A/G-F和18027-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-D片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mD。

在本发明中，将pS-F内PEDV-F片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-F为模板，采用引物25997-A/G-F和25997-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mF。

本发明还提供所述方法构建得到的PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

本发明还提供所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA在拯救猪流行性腹泻病毒中的应用，包括如下步骤：

(1)以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物N-F和N-R进行PCR扩增，得到N基因cDNA片段；

(2)将JS2008株全长感染性cDNA和N基因片段分别采用体外转录试剂盒进行体外转录，获得全长RNA和N基因cDNA的转录物；

(3)将步骤(2)获得的全长RNA和N基因cDNA的转录物共转染Vero细胞，得到拯救后的病毒。

由于PEDV不同毒株之间基因序列存在差异，已经公开的构建PEDV全长感染性cDNA的方法并不适用于PEDV JS2008株。本发明申请人试验过多种内切酶及多种划分片段的策略，通过大量富有创造性的劳动才构建成功PEDV JS2008株全长感染性cDNA。本发明巧妙的将PEDV JS2008株全长RNA划分为6个片段，利用沉默突变消除或引入II型内切酶PflmI酶切位点，然后将各片段连接，得到了PEDV JS2008株全长感染性cDNA。上述构建方法，效率高。本发明提供的PEDV JS2008株全长感染性cDNA是研究PEDV致病机制及新型疫苗的有力工具。

附图说明

图1是本发明实施例1的PEDV JS2008株基因组cDNA连接策略图，其中a显示了JS2008株基因组的的结构，b显示了将JS2008株基因组划分成6个片段的示意图；其中斜字体标记碱基为沉默突变碱基，用以引入新的PflmI酶切位点，上方黑色标记碱基为亲本毒株序列。

图2是本发明实施例2中JS2008株全长cDNA 6片段的PCR扩增产物电泳图，其中M表示分子量Mark，泳道A、B、C、D、E、F分别为PEDV-A、PEDV-B、PEDV-C、PEDV-D、PEDV-E和PEDV-F片段的扩增产物。

图3是本发明实施例3中酶切片段经T4连接酶连接后电泳图，M表示分子量Mark，泳道A为酶切片段经T4连接酶的连接产物。

图4是本发明实施例4中克隆株rJS2008和JS2008株(对照)感染vero细胞后的细胞病变图。

图5是本发明实施例4是拯救病毒rJS2008株的第3代和JS2008株的间接免疫荧光实验结果图，对照为Vero细胞。

图6是本发明实施例4中RT-PCR扩增了拯救病毒rJS2008株与亲本株JS2008中含人工沉默突变的片段的酶切结果图，其中，M表示分子量Mark，泳道rV为拯救病毒rJS2008株扩增片段，wV为JS2008株扩增片段。

图7是本发明实施例4中拯救病毒rJS2008株与亲本株JS2008形成的蚀斑图。

图8是本发明实施例4中拯救病毒rJS2008株与亲本株JS2008生长曲线比较图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

实施例1：猪流行性腹泻病毒JS2008株基因组全长cDNA构建的设计

本发明方法的关键之处在于酶切位点的选择，然后将猪流行性腹泻病毒JS2008株全长基因组分为大小合适的数个片段，利用沉默突变消除或引入II型内切酶PflmI酶切位点，经过对各片段的克隆保存后，使用合适的内切酶进行酶切，然后体外连接得到PEDVJS2008株全长感染性cDNA。

对PEDV JS2008株全长基因组序列(Genebank登录号：KC109141.1)中存在的各种内切酶酶切位点进行分析，并进行了大量的实验。最终发现一个II类内切酶PflmI适于分割JS2008株全长基因组以制备JS2008株全长感染性cDNA。

在PEDV JS2008株全长基因组中，发现II类内切酶PflmI酶切位点存在于基因组的第4986、6582、18032、19716、24848和26002位，其中第4986、19716和24848位的三处酶切位点可分出3段5kb左右的片段，并且第19716至24848位片段恰好包含整个S基因；在第4986至19716位长度的片段中，发现通过引入第11083位A/C和第16203位C/A的沉默点突变而引入两个PflmI酶切位点，可使其分为合适的3片段，见图1。综上，通过使用II类内切酶PflmI，将整个基因组分为6个片段PEDV-A、PEDV-B、PEDV-C、PEDV-D、PEDV-E和PEDV-F，使用oligo6.0软件设计扩增各片段的引物；合成了3对用于消除额外PflmI酶切位点的引物，通过引入沉默突变消除基因组中位置不合适的PflmI酶切位点(第6582、18032和26002位)，以上引入突变均可作为遗传标记。引物序列见表1，连接策略图见图1。

同时表达N基因cDNA的转录物对病毒全长RNA的稳定性和拯救病毒的成活具有促进作用，故合成1对用于扩增JS2008株N基因cDNA的引物，得到的扩增产物带有T7启动子和终止子，以利于N基因cDNA的体外转录。由英俊生物工程有限公司合成，序列见表1。

表1PEDV JS2008株全长基因组各片段以及N基因扩增引物(划横线序列位置为酶切位点)

实施例2：扩增JS2008株基因组全长感染性cDNA的各片段

(1)病毒、载体与主要试剂

PEDV经典毒株JS2008(GenBank登录号:KC109141)，由本实验室分离和保存；片段克隆载体pSMART试剂盒(包含4×CloneSmart Vector Premix和CloneSmart DNA Ligase)购自美国Lucigen公司；病毒RNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒和大提试剂盒购自于QIAGEN公司；反转录试剂盒SuperScriptIII First-Strand SynthesisSystem(包括SuperScriptTM IIIReverse Transcriptase和Oligo dT(18))购自Thermo公司；DNA高保真聚合酶Pfu UltraTM II Fusion HS DNA Polymerase购自Stratagene公司。Marker等其它生化试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他常规试剂为国产或进口分析纯。

(2)引物

由英俊生物工程有限公司合成表1中各引物。

(3)各片段的扩增

将PEDV JS2008株病毒液，采用QIAGEN公司RNA提取试剂盒提取总RNA。采用反转录试剂盒SuperScriptIII First-Strand Synthesis System，以Oligo dT(18)为反转录引物，采用SuperScriptTM III Reverse Transcriptase将提取的总RNA反转录为cDNA。

以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物cDNA为模板，使用DNA高保真酶PfuUltraTM II Fusion HS DNA Polymerase，以表1中相应的引物分别扩增PEDV-A、PEDV-B、PEDV-C、PEDV-D、PEDV-E和PEDV-F片段。采用引物A-1-F(SEQ ID NO:1)和A-4997-R(SEQ IDNO:2)扩增PEDV-A片段，采用引物B-4971-F(SEQ ID NO:3)和B-11100-R(SEQ ID NO:4)扩增PEDV-B片段，采用引物C-11073-F(SEQ ID NO:5)和C-16216-R(SEQ ID NO:6)扩增PEDV-C片段，采用引物D-16194-F(SEQ ID NO:7)和D-19726-R(SEQ ID NO:8)扩增PEDV-D片段，采用引物E-19702-F(SEQ ID NO:9)和E-24860-R(SEQ ID NO:10)扩增PEDV-E片段，采用引物F-24832-F(SEQ ID NO:11)和F-27954-R(SEQ ID NO:12)扩增PEDV-F片段。

另外，以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物cDNA为模板，使用DNA高保真酶Pfu UltraTM II Fusion HS DNA Polymerase，以N-F(SEQ ID NO:19)和N-R(SEQ ID NO:20)为引物，进行PCR扩增，得到5′端带有T7启动子，3′端带有终止子的PEDVN基因cDNA片段，命名为PEDV-N片段。

PCR反应结束后，将扩增产物进行1％琼脂糖凝胶(GoldView 0.5μg/mL)电泳，结果见图2，各片段与预期大小相符。使用TGreen蓝光切胶仪切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积，从而提高DNA的回收产率。采用Qiagen公司胶回收试剂盒回收目的片段，并取2μl回收产物进行电泳以鉴定回收效果。

(4)扩增片段的克隆

将PEDV-A、PEDV-B、PEDV-C、PEDV-D、PEDV-E和PEDV-F片段分别插入载体pSMART。具体连接反应按pSMART平端克隆载体操作说明进行，包括如下步骤：将本实施例标题(3)中PCR扩增产物胶回收后得到的PEDV-A、PEDV-B、PEDV-C、PEDV-D、PEDV-E和PEDV-F片段分别取3.25μL，与1.25μl 4×CloneSmart Vector Premix和0.5μl CloneSmart DNA Ligase(2U/μl)混合，最终连接反应体系为5.0μl，于25℃连接1h。反应完成后，将各连接产物分别转化Vazyme公司的XL10化学感受态细胞，挑取卡那霉素抗性平板上的单菌落。

利用菌液PCR方法对各重组质粒进行鉴定。挑取单菌落，置于150μl含有卡那霉素的LB液体培养基中，作为模板；以各片段的中间短片段为检测目的片段。各重组质粒，选取3个阳性克隆的菌液，涂布于新的卡那霉素抗性平板，置于25℃温箱内培养48h，刮取菌落，采用Qiagen质粒提取试剂盒提取质粒，并送到上海英俊公司测序。将测序正确的重组载体，分别命名为pS-A(载体pSMART中插入了PEDV-A片段)、pS-B(载体pSMART中插入了PEDV-B片段)、pS-C(载体pSMART中插入了PEDV-C片段)、pS-D(载体pSMART中插入了PEDV-D片段)、pS-E(载体pSMART中插入了PEDV-E片段)和pS-F(载体pSMART中插入了PEDV-F片段)。

(5)沉默点突变消除PflmI酶切位点

将重组质粒pS-B内PEDV-B、重组质粒pS-D内PEDV-D和重组质粒pS-F内PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点分别进行沉默突变，以消除内切酶PflmI酶切位点。

将重组质粒pS-B内PEDV-B片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-B为模板，采用引物6577-A/G-F(SEQ ID NO:13)和6577-A/G-R(SEQ ID NO:14)进行PCR扩增，回收大小约为8.1kb的扩增产物；采用Vazyme公司的重组酶试剂盒ClonExpress II One StepCloning Kit对引物6577-A/G-F和6577-A/G-R的扩增产物进行重组反应，反应体系为10μl：回收的扩增产物7μl，2μl 5×CE II Buffer和1μl重组酶 II，于37℃反应30min。重组反应结束后，在重组反应体系中，加入1μl DpnI酶(购自Takara公司)，37℃酶切30min，然后转化XL10感受态细胞，于25℃温箱中培养48h，挑取卡那霉素抗性平板上的单个菌落，涂布于新的卡那霉素抗性平板，放置于25℃温箱中培养，刮取菌落，提取质粒，并送到上海英俊公司测序。经测序正确的载体命名为pS-mB。

将重组质粒pS-D内PEDV-D片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-D为模板，采用引物18027-A/G-F(SEQ ID NO:15)和18027-A/G-R(SEQ ID NO:16)进行PCR扩增，回收大小约为5.5kb的扩增产物；采用Vazyme公司的重组酶试剂盒ClonExpress II One StepCloning Kit将引物18027-A/G-F和18027-A/G-R的扩增产物进行重组反应，反应体系为10μl：回收的扩增产物7μl，2μl 5×CE II Buffer和1μl重组酶 II，于37℃反应30min。重组反应结束后，在重组反应体系中加入1μl DpnI酶(购自Takara公司)，37℃酶切30min，然后转化XL10感受态细胞，于25℃温箱中培养48h后，挑取卡那霉素抗性平板内的单个菌落，涂布于新的卡那霉素抗性平板，于25℃温箱中培养，刮取菌落，提取质粒，并送到上海英俊公司测序。经测序正确的载体命名为pS-mD。

将重组质粒pS-F内PEDV-F片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-F为模板，采用引物25997-A/G-F(SEQ ID NO:17)和25997-A/G-R(SEQ ID NO:18)进行PCR扩增，回收大小约为5.1kb的扩增产物；采用Vazyme公司的重组酶试剂盒ClonExpress II One StepCloning Kit将引物25997-A/G-F和25997-A/G-R的扩增产物进行重组反应，反应体系为10μl：回收的扩增产物7μl，2μl 5×CE II Buffer和1μl重组酶 II，于37℃反应30min。重组反应结束后，在重组反应体系中加入1μl DpnI酶(购自Takara公司)，37℃酶切30min，然后转化XL10感受态细胞，25℃温箱培养48h后，挑取卡那霉素抗性平板上的单个菌落，涂布于新的卡那霉素抗性平板，放置于25℃温箱中培养，刮取菌落，提取质粒，并送到上海英俊公司测序。经测序正确的载体命名为pS-mF。

实施例3：构建JS2008株基因组全长感染性cDNA

1.材料与方法

(1)主要试剂

DNA凝胶回收试剂盒自于QIAGEN公司；所有的限制性内切酶和T4 DNA连接酶均购自于NEB公司；体外转录试剂盒mMESSAGE T7 Ultra Kit购自Thermo公司。Marker等其它生化试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他常规试剂为国产或进口分析纯。

(2)酶切片段的制备

按连接策略图1所示，将重组载体pS-A使用XbaI和PflmI进行双酶切，pS-mB、pS-C、pS-mD和pS-E使用PflmI进行单酶切，将pS-mF使用PflmI和EcoRV进行双酶切，回收cDNA片段(Qiagen胶回收试剂盒)，然后使用Nanodrop测定各酶切片段的浓度。

(3)JS2008株基因组全长感染性cDNA的制备

取pS-A、pS-mB、pS-C、pS-mD、pS-E和pS-mF酶切后回收的cDNA片段，按照摩尔浓度比为1：1：1：1：1：1混合，加入T4DNA连接酶及其Buffer，4℃连接过夜，然后使用酚氯仿抽提法从连接产物中抽提DNA，取少量DNA溶液采用琼脂糖凝胶电泳进行验证。结果如图3所示，可见大小约为28kb的条带，证明连接产物为JS2008株基因组全长感染性cDNA。

(4)JS2008株基因组全长感染性cDNA的体外转录

使用体外转录试剂盒mMESSAGE T7 Ultra Kit，按照说明书方法对JS2008株基因组全长感染性cDNA进行体外转录，采用异丙醇沉淀，获得JS2008株基因组全长RNA。同时使用该转录试剂盒，对回收的PEDV-N片段(实施例2标题(3)获得的PCR片段)进行体外转录，得到N基因(编码N蛋白)cDNA转录物(mRNA)，用于JS2008株全长RNA的共转染，以提高病毒成活率和全长RNA的稳定性。

实施例4PEDV JS2008株病毒的拯救和鉴定

(1)病毒、细胞与主要试剂

PEDV经典毒株JS2008株由本实验室分离并保存；Vero细胞由本实验室保存；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)购自GIBICO公司；抗PEDV单克隆抗体购自山东绿都生物科技有限公司；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体购自于Sigma公司。Marker等其它生化试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司；其他常规试剂为国产或进口分析纯。

(2)JS2008株基因组全长RNA的转染

在500μl浓度约1×10⁷个细胞/ml的Vero细胞悬浮液中，加入约20μg JS2008株基因组全长RNA(实施例3制备)和5μg PEDV N基因cDNA转录物(实施例3制备)，然后转移到电极杯中；使用电穿孔仪ECM630(BXT，美国)进行电转化，条件为175V、50μF，3次脉冲。将电转化后的细胞在室温下放置10分钟，然后转移到12孔板中，在37℃培养2小时后，使用含有2％FBS的DMEM培养基清洗细胞一次，然后加入1ml含有2％FBS的DMEM培养基进行培养，培养48h后开始出现细胞病变，72h后出现典型的细胞病变(图4)。培养四天后，收获拯救病毒，记为P1代；为获得高滴度病毒，将P1代病毒采用Vero传代两次，均在接种后48h产生典型的细胞病变；然后将病毒蚀斑纯化，得到拯救病毒rJS2008株。拯救病毒rJS2008株采用Vero传代三次，得到拯救病毒rJS2008株的第3代。

(3)间接免疫荧光检测

将拯救病毒rJS2008株的第3代(F3)接种Vero细胞，感染36h后用4％多聚甲醛固定15min，PBS洗3次，用0.3％Triton X-100溶液处理细胞15min，5％脱脂乳溶液封闭30min，加入抗PEDV单抗，室温孵育2h，用PBS洗3次，在加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(稀释度1:500)，用PBS洗3次，荧光显微镜观察并记录实验结果。另外，采用相同方法处理JS2008株，以Vero细胞为阴性对照。结果，拯救病毒rJS2008株的第3代和JS2008株的间接免疫荧光实验中均出现了PEDV N蛋白的特异性荧光(图5)，表明拯救的病毒rJS2008株为PEDV。

(4)感染性克隆毒株标记突变的检测

提取亲本病毒JS2008株和拯救病毒rJS2008株的总RNA，采用反转录试剂盒SuperScriptIII First-Strand Synthesis System，以Oligo dT(18)为反转录引物，将提取的总RNA反转录为cDNA。以反转录产物cDNA为模板，使用DNA高保真酶Pfu UltraTM IIFusion HS DNA Polymerase，以F(序列为CATTCCTAGATAATGGTAACGG)和R(序列为:ATCATAATCGCTATCACTGCTA)为引物，进行PCR扩增，获得长度为2048nt的扩增产物(核苷酸位置第5898-7945位)，恰好跨越在克隆毒株中由引入突变而消除的、位于6577碱基处的一个PflmI酶切位点。从亲本病毒JS2008株扩增的片段可以通过PflmI消化成两个片段(680和1369bp)，而从拯救病毒rJS2008株扩增的片段不能被PflmI所酶切，见图6，证明拯救病毒rJS2008株中分子标记稳定存在。

(5)病毒蚀斑检测

Vero细胞铺12孔板，待长满单层，接种500μl 10倍连续稀释的亲本病毒JS2008株或拯救病毒rJS2008株第3代，37℃吸附1小时后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞2次，然后加入含有1％低熔点琼脂糖的DMEM培养基(Invitrogen)；待凝胶覆盖层凝固后，将细胞板倒置，置于37℃、5％CO₂培养箱中；3天后，挑取斑块进行细胞接种或使用结晶紫染色。结果如图7所示，拯救病毒rJS2008株和亲本毒株JS2008所形成的蚀斑大小基本一致。

(6)病毒生长曲线

在24孔板中培养Vero细胞，当细胞密度达到90％左右时，将亲本病毒JS2008株和拯救病毒rJS2008株分别以0.01TCID₅₀的滴度感染细胞，孵育2h后，用无血清的DMEM培养基轻轻地清洗细胞2次，然后向每孔中加入lml含有2％FBS的DMEM培养基，分别在培养时间为12h、24h、36h、48h、72h和96h收集细胞上清，冻融3次后取上清测定TCID₅₀，分别绘制亲本病毒JS2008株和拯救病毒rJS2008株的生长曲线。从图8拯救病毒rJS2008株和亲本毒株JS2008的生长曲线分析可知，二者的生长特性基本一致。

其中病毒滴度(TCID₅₀)采用如下方法进行检测:将Vero细胞接种96孔板，将病毒上清做10倍梯度稀释8个梯度，将稀释好的病毒液加入到板中，每孔加入100μl，每个梯度设8个重复，37℃、5％CO₂的条件下孵育2h后弃去培养液，每孔加入100μl含有2％FBS的DMEM培养基继续培养。每天观察细胞病变情况，连续观察4天。记录结果，根据Reed-Muench方法计算TCID₅₀。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用

<130> 20170807

<160> 20

<170> PatentIn version 3.3

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<211> 55

<212> DNA

<213> artificial

<220>

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tactaatacg actcactata gacttaaaaa gattttctat ctacggatag ttagc 55

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

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<400> 2

tagcatcacc atcagatggc aatac 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> B-4971-F

<400> 3

tagtattgcc atctgatggt gatgc 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> B-11100-R

<400> 4

caataagccc attctgtgga atttg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> C-11073-F

<400> 5

cagcaaattc cacagaatgg gctta 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> C-16216-R

<400> 6

atttaccact acctggaggt ccctg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> D-16194-F

<400> 7

gggacctcca ggtagtggta aatct 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> D-19726-R

<400> 8

cacacttcca ttcactggct tgaag 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> E-19702-F

<400> 9

cttcaagcca gtgaatggaa gtgtg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> E-24860-R

<400> 10

cattgagctc caactcttgg acagc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> F-24832-F

<400> 11

ggatgctgtc caagagttgg agctc 25

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> F-27954-R

<400> 12

tttttttttt tttttttttt tttttgtgta tccatatcaa cac 43

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 6577-A/G-F

<400> 13

caccttagag acccgttaat tggtaatg 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 6577-A/G-R

<400> 14

cattaccaat taacgggtct ctaaggtg 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 18027-A/G-F

<400> 15

gtccatcaca tacccgttta ttggtaat 28

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 18027-A/G-R

<400> 16

attaccaata aacgggtatg tgatggac 28

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 25997-A/G-F

<400> 17

ctgcattccg gtgcttggag caccaactgg tgtaac 36

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 25997-A/G-R

<400> 18

tccaagcacc ggaatgcaga cctgtcggcc catcac 36

<210> 19

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> N-F

<400> 19

tactaatacg actcactata gatggcttct gtcagttttc 40

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> N-R

<400> 20

tttttttttt tttttttttt tttaatttcc agtatcgaag 40

Claims (6)

1.一种构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，包括如下步骤：

（1）以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物A-1-F和A-4997-R扩增PEDV-A片段，采用引物B-4971-F和B-11100-R扩增PEDV-B片段，采用引物C-11073-F和C-16216-R扩增PEDV-C片段，采用引物D-16194-F和D-19726-R扩增PEDV-D片段，采用引物E-19702-F和E-24860-R扩增PEDV-E片段，采用引物F-24832-F和F-27954-R扩增PEDV-F片段；

（2）将步骤（1）PCR扩增获得的6片段，分别插入载体pSMART中，得到插入了PEDV-A片段的重组载体pS-A、插入了PEDV-B片段的重组载体pS-B、插入了PEDV-C片段的重组载体pS-C、插入了PEDV-D片段的重组载体pS-D、插入了PEDV-E片段的重组载体pS-E、插入了PEDV-F片段的重组载体pS-F；

（3）将重组载体pS-B内PEDV-B片段 、重组载体pS-D内PEDV-D片段 、重组载体pS-F内PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，分别得到重组载体pS-mB、pS-mD和pS-mF；

（4）将重组载体pS-A使用XbaI和PflmI进行双酶切，将重组载体pS-mB、pS-C、pS-mD和pS-E使用PflmI进行单酶切，将重组载体pS-mF使用PflmI和EcoRV进行双酶切；回收各重组载体酶切后的cDNA片段，连接后得到所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

2.根据权利要求1所述构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，其特征在于将pS-B内PEDV-B片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-B为模板，采用引物6577-A/G-F和6577-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-B片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mB。

3.根据权利要求2所述构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，其特征在于将pS-D内PEDV-D片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-D为模板，采用引物18027-A/G-F和 18027-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-D片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mD。

4.根据权利要求3所述构建PEDV JS2008株全长感染性cDNA的方法，其特征在于将pS-F内PEDV-F片段采用如下方法进行沉默突变：以重组质粒pS-F为模板，采用引物25997-A/G-F和25997-A/G-R进行PCR扩增，回收扩增产物；回收的扩增产物在重组酶的催化下进行重组，从而将PEDV-F片段中的内切酶PflmI酶切位点进行沉默突变，得到重组载体pS-mF。

5.权利要求1-4之一所述方法构建得到的PEDV JS2008株全长感染性cDNA。

6.权利要求5所述PEDV JS2008株全长感染性cDNA在拯救猪流行性腹泻病毒中的应用，其特征在于包括如下步骤：

(1)以PEDV JS2008株病毒总RNA的反转录产物为模板，采用引物N-F和N-R进行PCR扩增，得到N基因cDNA片段；

(2)将JS2008株全长感染性cDNA和N基因片段分别采用体外转录试剂盒进行体外转录，获得全长RNA和N基因cDNA的转录物；

(3)将步骤（2）获得的全长RNA和N基因cDNA的转录物共转染Vero细胞，得到拯救后的病毒。