CN111471709A - 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统 - Google Patents

一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统 Download PDF

Info

Publication number
CN111471709A
CN111471709A CN202010162003.0A CN202010162003A CN111471709A CN 111471709 A CN111471709 A CN 111471709A CN 202010162003 A CN202010162003 A CN 202010162003A CN 111471709 A CN111471709 A CN 111471709A
Authority
CN
China
Prior art keywords
zju
artificial sequence
gene
pedv
strain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010162003.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111471709B (zh
Inventor
黄耀伟
王斌
于佳琦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202010162003.0A priority Critical patent/CN111471709B/zh
Publication of CN111471709A publication Critical patent/CN111471709A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111471709B publication Critical patent/CN111471709B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统，包括：包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体，其中ORF3区被替换为GLuc报告基因；包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株N基因的辅助质粒，所述猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的全基因组序列GenBank号为KU558701.1。本发明构建的感染性克隆带有GLuc报告基因，拯救的重组病毒在感染动物和细胞时会产生分泌型Gaussia荧光素酶，非常易于检测，在病毒毒力分析等实验研究方面有很强的应用价值。同时，由于ORF3区被替换为GLuc报告基因，本系统拯救的重组病毒可制成新型标记疫苗，通过检测猪血清中是否有Gaussia荧光素酶，快速区别疫苗株免疫和野毒株感染，实用价值很高。

Description

一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗 传系统
技术领域
本发明涉及冠状病毒反向遗传技术领域，特别是涉及一种基于DNA质粒转染的拯救猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的反向遗传系统。
背景技术
猪流行性腹泻是猪的一种急性、高度接触性的肠道传染病，由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)所引起。该病以急性肠炎、呕吐、水样腹泻和食欲下降为基本特征。各年龄猪均易感，但以新生仔猪最为严重，其发病率和死亡率可达90％-100％。该病首先发现于欧洲，现广泛流行于包括中国、韩国、菲律宾等在内的许多亚洲国家，已成为严重危害养猪业的主要传染病之一。目前，亚洲、美洲流行的PEDV主要是G2基因亚型毒株，占比90％以上，对全球养猪业造成了巨大的威胁。
PEDV属于尼多病毒目、冠状病毒科、α-冠状病毒属的成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV基因组全长约28kb，含有7个开放阅读框(Open reading fram,ORF)，包括负责编码多聚蛋白的ORF1a和ORF1b，编码辅助蛋白的ORF3和编码四种结构蛋白的S基因(纤突糖蛋白)、E基因(小分子膜蛋白)、M基因(膜蛋白)、N基因(核衣壳蛋白)。
反向遗传学技术是通过构建RNA病毒的感染性全长cDNA克隆，在DNA分子水平上对其进行体外操作，从而研究病毒结构与功能的方法。但目前，仍然存在一些问题阻碍冠状病毒全长感染性cDNA克隆的构建，例如冠状病毒的基因组很大(27-32kb)、常规技术很难操作、一些复制酶基因cDNA克隆在细菌中具有不稳定性、在体外得到的转录本具有异质性等。
如公开号为CN 107267532A的发明专利申请公开了一种PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用。该发明利用酶切连接获得病毒基因组全长cDNA，通过T7 RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA，再电转化入Vero细胞进行病毒拯救。但该方法酶切位点选取限制较多，而且体外将多个大片段进行酶切连接效率较低，难以适用于其他毒株全长感染性克隆的构建。此外利用添加的T7启动子，进行体外转录获得的转录本具有异质性，病毒拯救效率较低。
PEDV ZJU/G2/2013株是本实验室于2013年分离的浙江强毒株，该毒株通过细胞传代适应之后可在Vero细胞上稳定增殖并产生细胞病变。对ZJU/G2/2013株进行全基因组测序，并与其他PEDV毒株的全基因序列及S基因序列比对分析遗传进化关系，表明PEDV ZJU/G2/2013株属于当前流行的G2基因亚型。现有技术中，缺乏用于研究PEDV ZJU/G2/2013株致病机制的全长感染性cDNA和有效疫苗。
现有技术制备的疫苗在使用过程中，特别是在区分疫苗株免疫与野毒株感染时，检测鉴定比较困难，工作量大、耗费时间长。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，建立了一种基于DNA质粒转染的拯救PEDVZJU/G2/2013株的反向遗传系统，克服了现有技术中冠状病毒部分复制酶基因cDNA克隆在细菌中不能稳定保存的问题，克服了传统的酶切连接效率较低的问题，也克服了体外转录导致的转录本异质性的问题。
同时，由于本发明中使用该系统拯救的PEDV ZJU/G2/2013株的重组病毒带有GLuc报告基因，能够产生分泌型Gaussia荧光素酶，在被感染细胞的培养基和被感染动物的血清、粪便中都能十分灵敏地检测到荧光素酶活性。因此利用本发明制备标记疫苗，能够快速有效地区分疫苗株免疫与野毒株感染。
一种用于拯救PEDV G2基因亚型ZJU/G2/2013株的基于DNA质粒转染的反向遗传系统，包括：
包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体，其中ORF3区被替换为GLuc报告基因；
包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株N基因的辅助质粒，
其中，所述猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的全基因组序列GenBank号为KU558701.1。
优选的，所述重组表达载体为pSB2μ(Yongle Yang,et al.Characterization ofa novel bat-HKU2-like swine enteric alphacoronavirus(SeACoV)infection incultured cells and development of a SeACoV infectious clone.Virology.2019Oct；536:110-118)，是本实验室通过在BAC主链载体pSMART-BAC-BamHI(CopyRight v2.0 BAC克隆试剂盒，Lucigen)上插入酵母复制起点(2μ)、巨细胞病毒(CMV)启动子、丁型肝炎病毒核酶(HDVRz)序列和牛生长激素(BGH)poly A尾序列优化改造而成的。
本发明所用pSB2μ重组表达载体还进行了优化构建，其上添加CMV启动子序列，使构建的感染性克隆能在细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装；添加HDVRz序列，发挥剪切功能，获得精确的3’末端，很大地提高了病毒的拯救效率。
GLuc报告基因的基因序列如SEQ ID No.1所示。N基因的基因序列如SEQ ID No.2所示。辅助质粒使用的载体为pRK5质粒。
本发明又提供了一种拯救猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的方法，包括以下步骤：将所述系统中的重组表达载体和辅助质粒共转染到宿主细胞中，待细胞病变后反复冻融并收集上清液获得拯救后的病毒。
本发明还提供了所述方法拯救得到的拯救病毒。
本发明还提供了所述拯救病毒的应用，所述应用为：
在创制猪流行性腹泻病毒新型标记疫苗中的应用；
在筛选抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用；
在猪流行性腹泻病毒致病机理研究中的应用；
或在猪流行性腹泻病毒基因功能研究中的应用。
本发明采用BAC载体进行PEDV ZJU/G2/2013株的拯救，BAC载体具有大容量、低拷贝并且复制严谨性高的优点，能够保证PEDV的大片段基因组序列在细菌中稳定保存。
本发明构建的PEDV ZJU/G2/2013株感染性克隆带有GLuc报告基因，使用该感染性克隆拯救的重组病毒在感染动物和细胞时会产生分泌型Gaussia荧光素酶，Gaussia荧光素酶具有高活性、高稳定性的特点，检测时灵敏度高。因此本发明拯救系统拯救的病毒非常易于检测，有很强的应用价值。
用本发明拯救的重组病毒感染Vero细胞时，GLuc能分泌到细胞生长培养基中，允许使用者在实验过程中从相同来源多次取样检测荧光素酶活性。这种非破坏性样品采集方法加快了测定方案，简化了实验设计，使细胞保持完整，因此细胞可用于进一步的下游检测，如RT-PCR，Western Blot，RNA表达分析，活体成像，细胞活力检测等。用本发明拯救的重组病毒感染仔猪时，可用实验猪的血清检测荧光素酶活性，以鉴定病毒对实验猪的感染，极大地简便了实验过程，确保了样品无环境污染，能够让使用者更快速地得到检测结果。
本发明所述病毒拯救系统，除了有利于更深入地开展PEDV的致病机理和基因功能的实验研究外，在抗病毒药物筛选与疫苗研发中也具有非常重要的应用价值。
本发明创新性地将PEDV ZJU/G2/2013株重组表达载体的ORF3基因替换为GLuc报告基因。一方面GLuc报告基因作为正标记区分疫苗株免疫与野毒株感染，通过BioLux测定系统测量血清样品中有无荧光素酶活性，从而进行鉴定区分；另一方面ORF3区的删除则可以作为负标记区分疫苗株免疫与野毒株感染，利用ORF3C蛋白(ORF3 C端截短蛋白)(XimeiLei,et al.Specific recombinant proteins of porcine epidemic diarrhea virusare immunogenic,revealing their potential use as diagnosticmarkers.Veterinary Microbiology.2019Sep；236:108387)通过间接ELISA检测血清样品中有无ORF3的抗体，从而进行鉴定区分。使用上述两种标记进行鉴定，可进一步保障鉴定的准确性，如表1所示。
表1
疫苗株免疫 野毒株感染 疫苗株与野毒株皆有 疫苗株与野毒株皆无
GLuc + - + -
ORF3 - + + -
因此，在创制猪流行性腹泻病毒新型标记疫苗中，能够快速鉴定区分疫苗株免疫与野毒株感染，在实际生产应用中有巨大价值。
附图说明
图1为PEDV-G2-ZJU的5段基因片段示意图。
图2为PEDV-G2-ZJU的5段基因片段扩增结果检测图。
图3为表达GLuc的PEDV-G2-ZJU感染性克隆质粒pSB-PEDV-G2-ZJU-GLuc构建示意图。
图4为表达GLuc的PEDV-G2-ZJU感染性克隆质粒26段测序片段示意图。
图5为表达GLuc的PEDV-G2-ZJU感染性克隆质粒26段片段扩增鉴定结果图。
图6为拯救病毒rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染Vero细胞72h后利用PEDV-S1蛋白抗体进行免疫荧光检测结果图。
图7为检测拯救病毒与亲本病毒生长曲线结果图。
图8为检测拯救病毒感染Vero细胞后生长培养基中的Gaussia荧光素酶活性结果图。
图9为检测拯救病毒感染仔猪后的粪便排毒情况结果图。
图10为检测拯救病毒感染仔猪后其血清中的Gaussia荧光素酶活性结果图。
具体实施方式
实施例1
1、PEDV-G2-ZJU-GLuc全长感染性克隆目的片段的扩增
根据发明人在Genbank上公布的猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株基因序列(Genbank号是KU558701.1，基因结构如图1)，病毒基因组全长28038nt。取细胞稳定传代毒株ZJU/G2/2013株(来源：发明人于2013年分离的浙江强毒株)的细胞感染上清样品，Trizol法提取RNA后反转录得到cDNA，使用本发明提供的5对引物(引物序列见表2)，扩增得到相应的5个基因组全长片段，通过pCR-Blunt载体克隆，挑取3个单克隆菌落，提取质粒进行测序并拼接测序结果，确定ZJU/G2/2013的基因组全长序列。
使用表2中5对引物，分别以保存的上述带有ZJU/G2/2013株基因组的5个片段的pCR-Blunt质粒为模板进行PCR扩增，所得扩增产物进行1％琼脂糖凝胶(GoldView 0.5μg/mL)电泳，结果见图2，各片段与预期大小相符。切取含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶，使用AxyGen胶回收试剂盒回收目的片段，并测定浓度。
表2
Figure BDA0002406132650000041
Figure BDA0002406132650000051
为了将ORF3基因替换为GLuc报告基因，扩增GLuc片段并将上述PEDV-G2-ZJU-F5片段扩增为两个片段PEDV-G2-ZJU-F5a和PEDV-G2-ZJU-F5b。为了保证PEDV-G2-ZJU-F5a片段的3’端与GLuc片段5’端、PEDV-G2-ZJU-F5b片段5’端与GLuc片段3’端至少有20bp的同源区，以便于重叠PCR。将F5a、F5b和GLuc片段利用重叠PCR方法融合，最后获得重组F5片段PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5。引物序列及GLuc序列如下：
PEDV-G2-ZJU-F5a上游引物PEDV-G2-ZJU-F5a-F：
5’-ATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTG-3’，
PEDV-G2-ZJU-F5a下游引物PEDV-G2-ZJU-F5a-R：
5’-GCAAACAGAACTTTGACTCCCATCACTGCACGTGGACCTT-3’，
PEDV-G2-ZJU-F5b上游引物PEDV-G2-ZJU-F5b-F：
5’-CAAGGGGGCCGGTGGTGACTGACTCAATTCAACTAGACGAG-3’，
PEDV-G2-ZJU-F5b下游引物PEDV-G2-ZJU-F5b-R：
5’-TTTTTTTTGTGTATCCATATCAACACCGTCAGGTCTTCAG-3’，
GLuc上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F：
5’-TTGAAAAGGTCCACGTGCAGTGATGGGAGTCAAAGTTCTG-3’，
GLuc下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-R：
5’-ATACTCGTCTAGTTGAATTGAGTCAGTCACCACCGGCCCC-3’。
GLuc序列如SEQ ID No.1所示。
为了将PEDV-G2-ZJU-GLuc全长各片段连接进载体上，要求PEDV-G2-ZJU-F1片段的5’端与载体片段3’端、PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5片段3’端与载体片段5‘端’至少有20bp的同源区，以便于同源重组。引物序列如下：
PEDV-G2-ZJU-F1上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F1-F：
5’-GAGCTCGTTTAGTGAACCGTACTTAAAAAGATTTTCTATC-3’，
PEDV-G2-ZJU-F1下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F1-R：
5’-CTTATAAGAATAGAACGGTTTGACAACAGGCTCCAATA-3’，
PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5上游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5-F：
5’-ATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTG-3’，
PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5下游引物PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5-R：
5’-TTTTTTTTGTGTATCCATATCAACACCGTCAGGTCTTCAG-3’。
2、PEDV-G2-ZJU-GLuc全长感染性克隆的拼接
通过Gibson装配方法进行组装，用GBclonart无缝克隆试剂盒将PEDV-G2-ZJU-GLuc各个DNA片段及线性化的pSB2μ载体(插入位点在CMV启动子与HDVRz序列之间)通过体外同源重组的方式连接成全长感染性克隆重组质粒。通过转化连接产物至DH10B筛选并扩增阳性重组质粒克隆。
将扩增好的PEDV-G2-ZJU-F1、PEDV-G2-ZJU-F2、PEDV-G2-ZJU-F3、PEDV-G2-ZJU-F4、PEDV-G2-ZJU-GLuc-F5总共5个片段与实验室已构建好的线性化载体片段等比例加入离心管中，按照GBclonart无缝克隆试剂盒的步骤要求操作，反应体系如下：
Figure BDA0002406132650000061
混匀并45℃孵育2h后，转移到冰上。立即转化DH10B感受态细胞。
3、PEDV-G2-ZJU-GLuc全长感染性克隆的验证
随机挑取单个克隆，分别接种到5mL含有氯霉素(30μg/mL)抗性的LB液体培养基中，37℃摇床培养，按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒说明书提取PEDV-G2-ZJU-GLuc全长感染性克隆质粒。为对全长感染性克隆进行PCR扩增验证及后续测序验证，本研究将全长基因组序列分成26段，每段1400bp左右，以便于测序时只需上下游两个反应便可测通(图4)。
26段序列的PCR引物见表3。
表3
Figure BDA0002406132650000071
Figure BDA0002406132650000081
对提取的全长感染性克隆质粒进行PCR验证。取5μL PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测(图5)，选取阳性克隆，将该克隆1～26各段PCR产物送往尚亚生物技术有限公司测序，保存测序正确的全长感染性克隆甘油菌。将获得的重组BAC，命名为pSB-PEDV-G2-ZJU-Gluc(BAC图谱如图3所示)，得到表达GLuc的猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全长感染性克隆质粒。
4、病毒拯救
4.1、PEDV-G2-ZJU-GLuc感染性克隆质粒大提
配备1L 2×YT液体培养基，按照菌液与培养基1:100的比例将甘油菌接于含有氯霉素(30μg/mL)抗性的2×YT液体培养基，37℃200rpm摇床培养12h。按照BAC/PAC DNAIsolation Maxi Kit说明书提取PEDV-G2-ZJU-GLuc感染性克隆质粒，-20℃保存备用。
4.2pRK5-PEDV-N质粒构建
根据上游引物PEDV-N-F：
5’-CGGAATTCATGGCTTCTGTCAGTTTTCA-3’；
下游引物PEDV-N-R：
5’-GCTCTAGATTAATTTCCTGTGTCGAAGA-3’；
以pSB-PEDV-G2-ZJU-GLuc质粒为模板，扩增片段PEDV-N(N基因序列如SEQ IDNo.2所示)，使用EcoR I和Xba I两个酶切位点，对pRK5质粒通过双酶切反应进行线性化。使用T4 DNA连接酶，连接线性化pRK5质粒及片段PEDV-N，将连接产物转化进入Top10感受态，挑取单克隆菌落，提取质粒测序验证，成功构建pRK5-PEDV-N质粒。
4.3、PEDV-G2-ZJU-GLuc转染拯救
转染前在12孔板铺BHK-21细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到70％左右进行转染。转染时将细胞培养液弃掉，用Opti-MEM洗两遍，转染试剂作阴性对照，将感染性克隆质粒pSB-PEDV-G2-ZJU-Gluc与pRK5-PEDV-N质粒按照
Figure BDA0002406132650000082
3000转染试剂盒说明书进行共转染，其中感染性克隆质粒pSB-PEDV-G2-ZJU-GLuc按照1.5μg/孔添加，pRK5-PEDV-N质粒按照1μg/孔添加，转染7h后换液，逐日观察，直到出现细胞病变为止，反复冻融收集拯救病毒上清液，命名为rPEDV-G2-ZJU-GLuc。
在12孔板铺Vero细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到90％左右进行感染，感染3天后使用PEDV-S1蛋白鼠多克隆抗体，通过间接免疫荧光检测(IFA)检测病毒拯救情况(图6)。
5、与亲本病毒wtPEDV-G2-ZJU相比，检测rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染Vero细胞的病毒生长特性和培养基中Gaussia荧光素酶活性
5.1、绘制rPEDV-G2-ZJU-GLuc病毒生长曲线
在7个35mm细胞培养皿中铺Vero细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到90％左右进行感染，7个细胞培养皿分别在感染后2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h反复冻融收集rPEDV-G2-ZJU-GLuc病毒上清液。在7个96孔细胞培养板中铺Vero细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到90％左右时，用之前收集的2h、6h、12h、24h、36h、48h、72h病毒做10倍梯度稀释感染，3天后观察病变孔数计算病毒的TCID50，绘制病毒生长曲线图。亲本病毒wtPEDV-G2-ZJU实验步骤与上述相同。结果如图7所示，两者具有一致生物学特性。
5.2、检测细胞生长培养基中的Gaussia荧光素酶活性，确定其分泌性
在两个35mm细胞培养皿中铺Vero细胞，置于5％CO2，37℃培养箱中培养，待细胞密度达到90％左右分别用重组病毒rPEDV-G2-ZJU-GLuc和rPEDV-G2-ZJU进行感染。在感染后2h、6h、12h、24h、36h、48h分别取皿内生长培养基测定荧光素酶活性，并绘制曲线图(图8)。如图所示，从12h起，被rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染的Vero细胞上清中可以检测到明显的荧光素酶活性，即检测到病毒复制，且其活性曲线与病毒生长曲线趋势相似，而被rPEDV-G2-ZJU感染的Vero细胞上清中则检测不到荧光素酶活性。
6、与亲本病毒相比，检测rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染仔猪后的病毒排毒和血清中的Gaussia荧光素酶活性
6.1、rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染仔猪后的粪拭子排毒情况检测
将重组病毒rPEDV-G2-ZJU-GLuc和亲本病毒wtPEDV-G2-ZJU分别感染仔猪，并在感染后的12h、24h、36h、48h、60h、72h采集粪拭子。通过qRT-PCR比较重组病毒rPEDV-G2-ZJU-GLuc和亲本病毒wtPEDV-G2-ZJU感染仔猪后在12h、24h、36h、48h、60h、72h的排毒量，结果如图9所示，拯救病毒与亲本病毒具有一致的生物学特性。
6.2、rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染仔猪后血清中的Gaussia荧光素酶活性检测
将重组病毒rPEDV-G2-ZJU-GLuc和重组病毒rPEDV-G2-ZJU分别感染仔猪，在感染后的12h、24h、36h、48h、60h、72h采集血液，静置半小时后离心获得血清并检测其荧光素酶活性(图10)。如图所示，从24h起，被rPEDV-G2-ZJU-GLuc感染的仔猪血清中可以检测到明显的荧光素酶活性，即检测到病毒复制，且随着时间的延长而增长，而被rPEDV-G2-ZJU感染的仔猪血清中则检测不到荧光素酶活性，与预期结果相同。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
1.本发明所用BAC载体为发明人优化构建的pSB2μ重组表达载体，该载体能够保证PEDV的大片段基因组序列在细菌中稳定保存；能够获得精确剪切的3’末端，很大地提高病毒拯救效率；能够使构建的感染性克隆在细胞内转录，获得具有感染性的转录本，完成病毒包装。
2.本发明描述了一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统，运用体外同源重组技术，快速完成了一种表达GLuc的PEDV ZJU/G2/2013株基因组全长感染性克隆的构建。通过将该全长感染性DNA与辅助质粒直接共转染细胞，能够拯救出与野毒具有相似生长特性的拯救病毒，为体外研究病毒的致病机理和基因功能提供了有效的工具。
3.本发明将ZJU/G2/2013株基因组中的ORF3基因替换为GLuc报告基因，可作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志，并将其发展为新型标记疫苗。由于本系统拯救的病毒具有GLuc报告基因，能产生分泌型Gaussia荧光素酶，在感染细胞培养基和感染动物血清中都能检测荧光素酶活性，非常便于检测且灵敏度高。因此在猪流行性腹泻病毒G2基因亚型毒株的毒力分析等实验研究方面有很强的应用价值。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgggagtca aagttctgtt tgccctgatc tgcatcgctg tggccgaggc caagcccacc 60
gagaacaacg aagacttcaa catcgtggcc gtggccagca acttcgcgac cacggatctc 120
gatgctgacc gcgggaagtt gcccggcaag aagctgccgc tggaggtgct caaagagatg 180
gaagccaatg cccggaaagc tggctgcacc aggggctgtc tgatctgcct gtcccacatc 240
aagtgcacgc ccaagatgaa gaagttcatc ccaggacgct gccacaccta cgaaggcgac 300
aaagagtccg cacagggcgg cataggcgag gcgatcgtcg acattcctga gattcctggg 360
ttcaaggact tggagcccat ggagcagttc atcgcacagg tcgatctgtg tgtggactgc 420
acaactggct gcctcaaagg gcttgccaac gtgcagtgtt ctgacctgct caagaagtgg 480
ctgccgcaac gctgtgcgac ctttgccagc aagatccagg gccaggtgga caagatcaag 540
ggggccggtg gtgactga 558
<210> 2
<211> 1326
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus)
<400> 2
atggcttctg tcagttttca ggatcgtggc cgcaaacggg tgccattatc cctctatgcc 60
cctcttaggg ttactaatga caaacccctt tctaaggtac ttgcaaataa tgctgtaccc 120
actaataaag gaaataagga ccagcaaatt ggatactgga atgagcaaat tcgctggcgc 180
atgcgccgtg gtgagcgaat tgaacaacct tccaattggc atttctacta cctcggaaca 240
ggacctcacg ccgacctccg ctataggact cgtactgagg gtgttttctg ggttgctaaa 300
gaaggcgcaa agactgaacc cactaacctg ggtgtcagaa aggcgtctga aaagcctatc 360
attccaaatt tctctcaaca gcttcccagc gtagttgaga ttgttgaacc taacacacct 420
cctacttcac gtgcaaattc acgtagcagg agtcgtggta atggcaacaa caggtccaga 480
tctccaagta acaacagagg caataaccag tcccgcggta attcacagaa tcatggaaat 540
aaccacggtc gtggagcttc tgagaacaga ggaggcaata ataataacaa taacaagtct 600
cgtaaccagt ccaagaacag aaaccagtca aatgaccgtg gtggtgtaac atcacgcgat 660
gatctggtgg ctgctgtcaa ggatgccctt aaatctttgg gcattggcga aaaccctgac 720
aagcttaagc aacagcagaa gcccaaacag gaaaggtctg acagcagcgg caaaaataca 780
cctaagaaga acaaatccag agccacttcg aaagaacgtg acctcaaaga catcccagag 840
tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc caggggaggc 900
ttcaaaaatt ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcctc aggctatgct 960
cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa tgtggctgtt 1020
cgtgagctag cggactctta cgagattaca tataattata aaatgactgt gccaaagtct 1080
gatccaaatg tagagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg gaatgcaaaa 1140
ccccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgcagcagct gaatgaagag 1200
gccatctacg atgatgtggg tgtgccatct gattcgactc atgccaattt ggaatgggac 1260
acagctgtag acggtggtga cacggccgtt gaaattatca acgagatctt cgacacagga 1320
aattaa 1326
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagctcgttt agtgaaccgt acttaaaaag attttctatc 40
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttataagaa tagaacggtt tgacaacagg ctccaata 38
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtattggag cctgttgtca aaccg 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acaacaccta ggaaaacatt accag 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acttctccat ttcatctggt aatgt 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttgaccacct aggattttta gccaa 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgttgtgc gtatgttttt ggcta 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acacagaaag aactaaaccc attga 25
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atctgacact actatcaatg ggtttagttc tttctgtg 38
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttttttttgt gtatccatat caacaccgtc aggtcttcag 40
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atctgacact actatcaatg ggtttagttc tttctgtg 38
<210> 14
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaaacagaa ctttgactcc catcactgca cgtggacctt 40
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
caagggggcc ggtggtgact gactcaattc aactagacga g 41
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttttttttgt gtatccatat caacaccgtc aggtcttcag 40
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ttgaaaaggt ccacgtgcag tgatgggagt caaagttctg 40
<210> 18
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atactcgtct agttgaattg agtcagtcac caccggcccc 40
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgggcgtgga tagcggtttg act 23
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcatgaagcc acaaggactg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ctgttgtctt gtctgagcca 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caggatgttc aatgacaacg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccaatgtgaa tctcgtcgtc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agatcctgtg agatcgtgtc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ctcccttgaa tttgagttcg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgacaccacg tccaacttta 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ccagacgttg agcctgtatt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tgttgtctgt gacaacggtg 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atgtggagcg tttctacgca 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aacatcatca caaacagggc 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggcctttcgt aagagggatg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aagggcaatg aaatcacgta 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gttgctgagg ctcatcgtta 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agagcctacg aacttgtcac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcggtgatat gtctgttggc 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgcagagact ggattgaggc 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tggtaccgtt gagttttgct 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ttcatgctag agagacagcc 20
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tgcttctacg gtattctcta ctgg 24
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tgcaccatta ggagaatcca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cctggtaagc tgaagcagcg 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aagcactcac tagcaaggca 20
<210> 43
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
cattcatcgt gtctatgcat tg 22
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tgctctgtcg cactttgggt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ccatgactac tcggcagtat 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cacacatatg gagtgatggc 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
aatctgcagg gctttgtgtt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gacagcgata acacttgtgc 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tggtggatga ggtctctatg 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gggcatgttt gaaacaacag 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggttgcgttg taactgagtc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtcctacctt acgtttggca 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tcggcgggct ttactatttg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gcaccaagat gtagcacacg 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ctccagacat tttatccgca 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cgcgcagtag cattagtgtt 20
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tggcgttcat ggtatctttg ttagc 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gaatacgctg aatggcagtt ccttg 25
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ttgttggacg ctgtcacaat 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gaccattaga acagcgctta 20
<210> 61
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gtgctgggtg tttctgtg 18
<210> 62
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
agactctgaa cgctgctc 18
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gccttgactc tacgtgagcc 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cgctattaca caaccggtga 20
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgacacttt ctttcctcaa tg 22
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
agtcctatag cggaggtcgg 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
ggacgtgttg gtcgttcagt 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
catttggatc agactttggc 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gagatgcgga atttgtcgaa 20
<210> 70
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
ttttttttgt gtatccatat caacaccgtc aggtc 35
<210> 71
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
cggaattcat ggcttctgtc agttttca 28
<210> 72
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gctctagatt aatttcctgt gtcgaaga 28

Claims (8)

1.一种基于DNA质粒转染的拯救PEDV ZJU/G2/2013株的反向遗传系统，其特征在于，包括：
包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株全基因组cDNA的重组表达载体，其中ORF3区被替换为GLuc报告基因；
包含猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株N基因的辅助质粒，
所述猪流行性腹泻病毒G2基因亚型ZJU/G2/2013株的全基因组序列GenBank号为KU558701.1。
2.如权利要求1所述的系统，其特征在于，所述重组表达载体为pSB2μ。
3.如权利要求1所述的系统，其特征在于，GLuc报告基因的基因序列如SEQ ID No.1所示。
4.如权利要求1所述的系统，其特征在于，N基因的基因序列如SEQ ID No.2所示。
5.如权利要求1所述的系统，其特征在于，辅助质粒使用的载体为pRK5质粒。
6.一种拯救猪流行性腹泻病毒G2基因亚型毒株的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求1～5任一所述系统中的重组表达载体和辅助质粒共转染到宿主细胞中，待细胞病变后反复冻融并收集上清液获得拯救后的病毒。
7.如权利要求6所述方法拯救得到的拯救病毒。
8.如权利要求7所述拯救病毒的应用，其特征在于，所述应用为：
在创制猪流行性腹泻病毒新型标记疫苗中的应用，能够快速鉴定区分疫苗株免疫与野毒株感染；
在筛选抗猪流行性腹泻病毒药物中的应用；
在猪流行性腹泻病毒致病机理研究中的应用；
或在猪流行性腹泻病毒基因功能研究中的应用。
CN202010162003.0A 2020-03-10 2020-03-10 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统 Active CN111471709B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010162003.0A CN111471709B (zh) 2020-03-10 2020-03-10 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010162003.0A CN111471709B (zh) 2020-03-10 2020-03-10 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111471709A true CN111471709A (zh) 2020-07-31
CN111471709B CN111471709B (zh) 2022-03-25

Family

ID=71747238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010162003.0A Active CN111471709B (zh) 2020-03-10 2020-03-10 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471709B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114657213A (zh) * 2022-05-23 2022-06-24 华南农业大学 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用
CN116445528A (zh) * 2023-04-14 2023-07-18 扬州大学 重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用
WO2024032805A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Zhejiang University Recombinant porcine coronavirus

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267532A (zh) * 2017-08-09 2017-10-20 江苏省农业科学院 PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用
CN107698665A (zh) * 2017-10-26 2018-02-16 浙江大学 一种抗病毒多肽、编码基因、载体、宿主菌及应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107267532A (zh) * 2017-08-09 2017-10-20 江苏省农业科学院 PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用
CN107698665A (zh) * 2017-10-26 2018-02-16 浙江大学 一种抗病毒多肽、编码基因、载体、宿主菌及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUN-MIAO JI,ET AL: "Aminopeptidase-N-independent entry of porcine epidemic diarrhea virus into Vero or porcine small intestine epithelial cells", 《VIROLOGY》 *
PENGWEI ZHAO，等: "Identification of a peptide derived from the heptad repeat 2 region of the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) spike glycoprotein that is capable of suppressing PEDV entry and inducing neutralizing antibodies", 《ANTIVIRAL RESEARCH》 *
YONG-LE YANG,等: "Characterization of a novel bat-HKU2-like swine enteric alphacoronavirus (SeACoV) infection in cultured cells and development of a SeACoV infectious clone", 《VIROLOGY》 *
雷喜梅: "猪流行性腹泻病毒血清学与抑制病毒入侵细胞的研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114657213A (zh) * 2022-05-23 2022-06-24 华南农业大学 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用
CN114657213B (zh) * 2022-05-23 2022-08-02 华南农业大学 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用
WO2024032805A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Zhejiang University Recombinant porcine coronavirus
CN116445528A (zh) * 2023-04-14 2023-07-18 扬州大学 重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN111471709B (zh) 2022-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111471709B (zh) 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统
Park et al. Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild-and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses
CN107557494A (zh) 鉴别检测猪腹泻冠状病毒的引物及多重rt‑pcr方法
CN103320452A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒变异株n基因全序列的扩增方法
CN106755089B (zh) 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用
CN112458064A (zh) 盖他病毒全长感染性克隆、复制子系统及其制备和应用
CN105039585A (zh) 用于鸡传染性支气管炎病毒rt-pcr检测的引物及含有该引物的试剂盒及其检测方法
CN105463136B (zh) 用于鸡传染性支气管炎病毒rt-pcr分型检测的试剂盒
CN104561092B (zh) 表达猪瘟病毒e2蛋白重组prrs病毒基因工程疫苗的构建方法和应用
CN107267532B (zh) PEDV JS2008株全长感染性cDNA的构建方法及应用
CN110468155B (zh) 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用
CN108315306B (zh) 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法
CN110747175A (zh) 一株猪δ冠状病毒及其应用
CN113817753A (zh) 表达SARS-CoV-2纤突蛋白或其变异体SΔ21的假型化VSV病毒构建和应用
CN105695635A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒的多重rt-pcr检测试剂盒
CN103255111B (zh) 绿色荧光蛋白标记的重组猪瘟病毒及其拯救方法和应用
Ting et al. Establishment and cross-protection efficacy of a recombinant avian gammacoronavirus infectious bronchitis virus harboring a chimeric S1 subunit
CN107201371B (zh) 一种携带去优化m基因和两个g基因的重组狂犬病病毒
CN104694561B (zh) 表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的prrsv重组质粒的构建方法以及应用
CN110904056B (zh) 一种传染性支气管炎病毒rH120-YZS1Δ5a及其构建方法和应用
Wang et al. A strain of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus: genomic characterization, pathogenicity, and construction of an infectious full-length cDNA clone
CN115584352A (zh) 猪流行性腹泻病毒（pedv）orf3和e蛋白反式互补单轮感染系统及应用
CN114457042A (zh) 小反刍兽疫病毒强毒反向遗传系统及动物感染模型
CN113584080A (zh) 一种Nluc标记的重组猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建及其应用
CN105671006B (zh) 一种高效表达海肾荧光素酶基因的产品及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant