CN104694561B - 表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的prrsv重组质粒的构建方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的蓝耳病病毒(PRRSV)重组质粒的构建方法，及其应用。基于反向遗传操作平台，将海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因插入到pHuN4‑F112基因组中，成功构建了pA‑Rluc和pA‑Fluc这两个重组质粒。转染MARC‑145细胞后，二者均成功拯救出了活病毒，并且发现重组病毒vA‑Rluc、vA‑Fluc与亲本毒vHuN4‑F112具有相似的病毒学特性。将其感染MARC‑145细胞或者PAM细胞之后，获得的荧光素酶活性数值可以成为指征PRRSV在这两种细胞上复制水平的另外一种指标。

Description

表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建方 法以及应用

背景技术：

本发明属于生物工程领域，具体地说，涉及一种病毒的重组质粒的构建方法和应用，更具体地说，涉及到能够表达海肾和萤火虫荧光素酶的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组质粒的构建与其在指征PRRSV复制水平上的应用。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)是一种严重影响养猪业的接触性传染病，给世界各国造成的经济损失巨大。其病原PRRSV一直处于不断的变异及进化过程中。目前，反向遗传操作被广泛应用于研究PRRSV的生物学特性、致病机理、毒力决定因子以及不断变异的分子机制，而其基因组作为外源基因表达载体的研究也被广泛开展。PRRSV的基因组中除ORF1和ORF2以及ORF4和ORF5外，其结构蛋白编码框架之间有少则几个多则逾百的碱基重叠(overlap)。相关研究表明：ORF重叠区的影响会导致嵌合病毒失去感染性，因此可选择非重叠区或者将重叠区拉开作为外源基因的插入位点。需要注意的是外源基因的插入原则应以能在最小程度上改变病毒基因组为基础。但即便如此，插入外源基因也会在传代过程中逐渐丢失编码序列以致无法发挥其功能。呈现遗传不稳定性。Dr.DongwanYoo 2009年报道了其在ORF1b和ORF2之间插入了GFP基因，如果在其3′端下游插入一个二级结构简单的(由其自身及周围序列形成)转录调控序列6(TRS6)的拷贝，让外源基因的表达被一个独立的转录子所引导。所构建的突变体克隆能够在至少37代次的传达过程中保遗传稳定。Dr.Chengbao Wang的研究则表明TRS6拷贝的插入同样能够使在其他位点插入的外源序列稳定。而Dr.Dongwan Yoo在构建时在外源基因插入点的5′端和3′端分别引入了两个外源的酶切位点Afl II和Mlu I，以方便下游的替换或者插入操作，但是这或多或少可能对亲本病毒的生物学特性造成影响。Dr.Chengbao Wang所依赖的反向遗传操作系统是细菌人工染色体，而其外源基因的插入位点在ORF7和3′UTR之间。这个位点并没有编码基因的重叠，另外ORF7编码的是PRRSV病毒表达量最大的核衣壳蛋白(N protein)，因此这里也是外源基因插入的一个很好的选择。而他们同样选取了TRS6作为外源基因的转录调控序列。在TRS6的引导下，GFP这个外源基因仍然得到了很好的稳定的表达。

荧光素酶(英文名称：Luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是一种学名为Photinus pyrail的萤火虫体内的荧光素酶。在相应的化学反应中，荧光的产生是来自于荧光素的氧化，有些情况下反应系统中也包括三磷酸腺苷(ATP)。萤火虫发出的淡黄绿色的光是由其体内的荧光素酶产生的，这并不是一个简单的过程，早在很久以前，人们就已经通过对细菌、真菌、海葵及萤火虫的研究，发现了生物的发光现象。荧光素酶的辅因子，即荧光素，能与氧结合形成一个高度紧张的复合物，当这个氧化物在ATP的参与下被破坏时，产生CO2，从而形成具有较高活性的形式，即可发光。与O2结合的是荧光素酶中的荧光素，222酶蛋白种类多样，决定了荧光素也有不同的大小和形状。对发光系统进行分析发现荧光素或荧光素酶不是特定的分子，而是对于所有能够产生荧光的底物和其对应的酶的统称，虽然它们各不相同，不同的能够控制发光的生物体用不用的荧光素酶来催化不同的发光反应，最为人所知的发光生物是萤火虫，另外目前应用比较广泛的海肾荧光素酶的生物体海肾。在本发明中，所插入的海肾荧光素酶基因来源于pGMR-TK，其编码基因为936bp，萤火虫荧光素酶基因来源于pGL3-Basic，编码基因长度为1653bp。

在本发明中，在高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4-F112的全长感染性克隆骨架的ORF1b和ORF2a之间分别插入了海肾荧光素酶基因和萤火虫荧光素酶基因，获得了能够稳定表达这两个荧光素酶基因的重组PRRSV：pA-Rluc和pA-Flue，对其进行一系列病毒特性分析及遗传稳定性检测；并在病毒复制、转录、翻译水平对其与亲本病毒进行比较分析。并通过用这两个带有荧光素酶基因的突变病毒vA-Rluc和vA-Flue感染MARC-145和PAM之后，收取细胞裂解物对其进行荧光素酶活性检测的方法对病毒在细胞上的复制水平进行比较分析，对其作为指征病毒复制水平的一种指标进行评估。

发明内容：

本发明的目的在于，提供表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的构建方法。

本发明的构建表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒的方法，为根据pGMR-TK海肾荧光素酶报告基因载体和pGL3-Basic萤火虫荧光素报告基因载体中的两个荧光素酶基因序列(上述两个荧光素酶载体均购自上海吉满生物科技有限公司)以及高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前分别插入Renilla和Firefly Luciferase基因，并在外源基因3′端下游插入此病毒的转录调控序列6(TRS6)。将扩增出的两个嵌合片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了两个嵌合重组质粒pA-Rluc和pA-Flue。

本发明的嵌合海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的PRRSV的基因工程重组质粒，是能够稳定表达海肾荧光素酶(Renilla Luciferase)或萤火虫荧光素酶(fireflyLuciferase)的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞传代致弱株HuN4-F112的嵌合重组质粒。

本发明的表达Renilla Luciferase或firefly Luciferase的PRRSV基因工程重组质粒的构建方法包括以下步骤：首先通过SOE PCR的方法扩增出含有Renilla Lucifcrasc或fircfly Luciferase的PRRSV突变片段，然后将扩增出的PCR片段和高致病性蓝耳病细胞传代致弱疫苗株HuN4-F112进行Asc I和EcoRV酶切，最后将酶切后的突变PCR片段和HuN4-F112的双酶切片段进行连接，并转化TOP10感受态细胞，然后通过筛选获得基因工程重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc，从而提供了相应的构建方法。

使用本发明所构建的重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc，转染MARC-145细胞后所拯救出来的病毒具有和亲本病毒vHuN4-F112相似的病毒生物学特性。并且在至少连续15代次的传代过程中能够保持遗传稳定性。不同MOI感染MARC-145细胞或者PAM细胞不同时间点后，收集细胞，通过裂解细胞检测荧光素酶活性值可以对PRRSV在MARC-145或者PAM上的复制水平进行分析比较，评估其作为指征PRRSV复制水平的另外一种指标的可行性。结果证明这种方法是可行的。较之其他的方法有一定的简便性和优越性。

附图说明

图1是pA-Rluc和pA-Fluc嵌合重组质粒的构建示意图

图2是SOE PCR引物扩增Renilla Luciferase或firefly Luciferase不同的PCR片段的电泳检测结果，其中，图2a为由pHuN4-F112为模板，引物HF11559和Rluc-R1/Fluc-R1获得的长度约为450bp的两个PCR产物Rluc-SOE-1/Fluc-SOE-1和以pHuN4-F112为模板，引物Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090获得的长度约为1100bp的PCR片段Rluc-SOE-4/Fluc-SOE-4：图2a中另有为分别由pGMR-TK和pGL3-Basic为模板，Rluc-F2/Fluc-F2和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3为上下游引物所获得的分别为935bp和1700bp左右的PCR产物Rluc-SOE-2/Fluc-SOE-2；图2b为以SOE-1和SOE-2回收产物为模板，引物HF11559和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3为上下游引物扩增出的1440bp和2200bp长度的PCR产物R1uc-SOE-3/Fluc-SOE-3；图2c为由SOE-3和SOE-4的回收产物为模板，引物HF11559和HR13090扩增出的分别为2540bp和3300bp长度的PCR产物Rluc-SOE-5/Fluc-SOE-5；图2d为由SOE-5产物的EcoRV和Asc I双酶切电泳结果。

图3a是构建好的嵌合重组质粒pA-Rluc、pA-Fluc以及亲本质粒pHuN4-F112的EcoRV和Asc I双酶切鉴定结果，图3b是对嵌合重组质粒的Swa I线性化电泳结果，图3c是对线性化模板的体外转录RNA的电泳鉴定。

图4是用pA-Rluc、pA-Fluc重组质粒与亲本质粒pHuN4-F112转染细胞后出现的细胞病变结果。

图5是拯救的突变病毒的N蛋白的免疫荧光照片，其中，5a是vHuN4-F112的N蛋白免疫荧光照片；5b是被拯救病毒vA-Rluc P10代的N蛋白免疫荧光照片；5c是被拯救病毒vA-Fluc P10代的N蛋白免疫荧光照片；5d为阴性对照。

图6是对拯救的重组病毒株vA-Rluc和vA-Fluc与亲本病毒vHuN4-F112滴度比较结果，生长曲线的描绘。

图7是拯救的重组病毒vA-Rluc和vA-Fluc与亲本病毒vHuN4-F112的空斑形态学比较。

图8是P2-P10代的嵌合重组病毒vA-Rluc、vA-Fluc和vHuN4-F112用相同的MOI感染MARC-145细胞后60小时测定的荧光素酶活性值水平变化图。

图9是P5和P10代的嵌合重组病毒vA-Rluc、vA-Fluc各选取10个空斑感染MARC-145细胞后60小时测定的荧光素酶活性值水平变化图。

图10是P10代的vA-Rluc、vA-Fluc以相同MOI感染MARC-145细胞后，分别于24h、48h、60h、72h、96h、120h收取细胞裂解物测定到的荧光素酶活性值变化图。

具体实施方式

在本发明中，所述嵌合重组质粒指的是，利用反向遗传操作技术，将海肾荧光素酶编码基因或者萤火虫荧光素酶编码基因插入HuN4-F112基因组骨架中所获得的pA-Rluc和pA-Fluc。

在本发明中，所述嵌合重组病毒指的是，利用基因嵌合技术获得的全长重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc转染MARC-145细胞后拯救出的活病毒vA-Rluc和vA-Fluc。

在本发明中，所述的反向遗传操作指的是：相对于经典遗传学而言的，是在获得的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞致弱毒株HuN4-F112的感染性克隆骨架上，通过SOEPCR的方法或者定点突变的方法对病毒基因进行必要的加工和修饰，进行外源基因的插入，再按组成顺序构建全长病毒基因组，让其装配出具有生物活性的病毒粒子，研究突变病毒与亲本病毒在病毒生物学特性上的变化，以及外源基因插入可能对病毒的表型、性状有何种影响等方面的内容。

在本发明中，所述高致病性蓝耳病细胞致弱毒株HuN4-F112的Gcnbank登录号是EF635006。

在本发明中，所述细胞致弱毒株HuN4-F112指的是，参考文献Shanrui Zhang，Yanjun Zhou，Yifeng Jiang，Guoxin Li，Liping Yan，Hai Yu，Guangzhi Tong.Generationof an infectious clonc of HuN4-F 112，an attenuated live vaccine strain ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus的方法所构建的感染性克隆。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

在本发明的实施例中，使用的病毒和细胞：MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞系)

在本发明的实施例中，使用的质粒与菌株：pBlueScript II SK(+)载体购自Invitrogen公司，pBS-T载体、TOP10感受态细胞购自TIANGENE公司。

在本发明的实施例中，使用的其他试剂：QIAamp Viral RNA Mini Kit购自QIAGENE公司，pfu II DNAPolymerase购自Strategene公司，T7mMESSAGE High YieldCappcd RNA Transcription Kit购自Ambion公司，胶回收试剂盒和Quant ReverseTranscriptasc购自TIANGENE公司，rTaq DNA聚合酶，dNTP和限制性内切酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DMRIE-C转染试剂购自Invitrogen公司，Opti-MEM购自Invitrogen公司。

在本发明的实施例中，MARC-145单层细胞采用以下方法制备：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍后加入0.01MOI的病毒500微升吸附1小时后，弃吸附液，PBS洗两遍后加入维持液(2％FBS的DMEM)培养基，37℃5％CO2培养箱中培养。

实施例1表达海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶的PRRSV嵌合重组质粒的构建

根据GenBank登录号为EF635006的碱基序列，以及pGMR-TK中Renilla Luciferase和pGL3-Basic中的Firefly Luciferase的碱基序列，设计出6条引物，用来进行SOE PCR扩增，过程如图2所示，然后分别通过细胞转染实验，验证了获得的嵌合重组质粒的感染性，具体过程如下：

1.1引物设计

根据GenBank登录号为EF635006的HuN4-F112的碱基序列、pGMR-TK中RenillaLuciferase和pGL3-Basic中的Firefly Luciferase的碱基序列，设计SOE PCR引物，分别命名为：HF11559、HR13090、Rluc-F2、Rluc-R1、Rluc-F4、Rluc-R2/R3，Fluc-F2、Fluc-R1、Fluc-F4、Fluc-R2/R3其序列分别如下所示：

HF11559：5′-TCATACATCCGAGTTCCTGTT-3′(SEQ ID NO.1)

HR13090：5′-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3′(SEQ ID NO.2)

Rluc-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatgacttcgaaagtttatgatccag-3′(SEQ ID NO.3)

Rluc-R1：5′-tttgttctggatcataaactttcgaagtcaTTTCAATTCAGGCCTAAAG-3′(SEQID NO.4)

Rluc-F4：5′-caaatcgttcgttgagcgagttctcaaaaatgaacaataaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′(SEQ ID NO.5)

Rluc-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttattgttcatttttgagaact-3′(SEQ ID NO.6)

Fluc-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAatggaagacgccaaaaacataaag-3′(SEQ ID NO.7)

Fluc-R1：5′-ggcctttctttatgtttttggcgtcttccatTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-3′(SEQID NO.8)

Fluc-F4：5′-ctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaaGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′(SEQ ID NO.9)

Fluc-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACttacacggcgatctttccgcc-3′(SEQ ID NO.10)

具体构建步骤如下：

1.1.1扩增SOE-1PCR产物

以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和Rluc-R1/Fluc-R1分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增突变片段SOE-1，具体如下：

PCR反应体系为：pHuN4-F112质粒模板1μL，上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfuBuffer5μL，2.5mM dNTP 4μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸15s，共进行35个循环，然后72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为450bp。

1.1.2扩增SOE-2PCR产物

以pGMR-TK和pGL3-Basic质粒为模板，引物Rluc-F2/Fluc-F2和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增SOE-2，具体如下：

PCR反应体系为：pGMR-TK和pGL3-Basic质粒100倍稀释物1μL，上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小分别为935bp和1700bp。

1.1.3扩增SOE-4PCR产物

PCR反应体系为：以pHuN4-F112作为模板，以Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2a所示，根据检测结果，获得的目的片段大小为1100bp。

1.1.4扩增SOE-3PCR产物

PCR反应体系为：以SOE-1和SOE-2PCR回收产物作为模板，以HF11559和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu IITurbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2b所示，根据检测结果，获得的目的片段大小分别为1440bp和2200bp。

1.1.5扩增SOE-5PCR产物

PCR反应体系为：以SOE-3和SOE-4PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对(10μM)各1μL，10×pfu Buffer 5μL，2.5mM dNTP 2μL，pfu II Turbo DNA聚合酶5units，加水至50μL。

PCR反应参数为：95℃预变性2min，95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸45s，进行35个循环，再72℃延伸3min。

取PCR反应产物，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2c所示，根据检测结果，获得的目的片段大小分别为2540和3300bp。

2.2表达海肾荧光素酶或荧光虫荧光素酶重组PRRSV质粒的构建

将上述SOE-5的PCR产物使用Asc I/EcoRV进行双酶切，结果见图2d再与经过Asc I和EcoRV双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4-F112的大片段通过T4DNA连接酶连按，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA-Rluc(SEQ ID NO.11)和pA-Fluc(SEQ ID NO.12)，构建策略如图1所示。

具体步骤如下：

于37℃水浴中，用Asc I/EcoR V分别对SOE-5的PCR产物和亲本病毒全长质粒pHuN4-F112进行双酶切，反应体系为SOE-5突变片段41μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEBBuffer4 5μL：pHuN4-F112 15μL，Asc I 2μL，EcoR V 2μL，10×NEB Buffer4 5μL，ddH₂O26μL。

将SOE-5的PCR产物和相应的载体的Asc I/EcoR V双酶切片段以摩尔比3∶1的比例，以T4DNA连接酶连接，转化TOP10，挑取独立的菌落进行纯培养，提取质粒DNA，1％凝胶电泳，挑取大小为18kb的质粒进行测序，筛选阳性克隆。

对所获得的待鉴定质粒进行Asc I/EcoR V双酶切检测酶切条带是否正确，酶切体系参照如上，37℃水浴酶切过夜。对酶切产物进行电泳鉴定，结果见图3a所示，

1.3病毒RNA的制备

1.3.1质粒的SwaI线性化

于37℃水浴中，用SwaI分别对嵌合重组质粒pA-Rluc、pA-Fluc以及亲本质粒pHuN4-F112进行线性化酶切(反应体系为：突变质粒41.5μL，Swa I 3μL，ddH2O 0μL，100×BSA 0.5μL，10×NEB Buffer35μL)，酶切过夜。参考说明书的方法，用QIAquick PCRPurification Kit纯化酶切产物，分别获得纯化的线性化质粒，见图3b。

1.3.2、体外转录

参考说明书的方法，使用T7mMESSAGE High Yield Capped RNA TranscriptionKit(购自Ambion公司)体外转录纯化后的线性化质粒，并采用RNA电泳鉴定，根据鉴定结果，见图3c，获得了pA-Rluc、pA-Fluc的体外转录RNA。

1.4表达海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶的PRRSV重组质粒的检测

1.4.1RNA的转染

接种MARC-145细胞(非洲绿猴肾细胞系，购自美国ATCC)于六孔板中培养，待细胞密度为80-90％时，向每孔中分别加入pA-Rluc、pA-Fluc的in vitro RNA和2μL DMRIE-C转染试剂，在1mL的Opti-MEM中振荡混匀，然后根据转染试剂说明书的方法，转染MARC-145细胞，并且逐日观察细胞病变。

待出现如图4所示的细胞病变(CPE)后，收取上清并传代，上清收取及传代过程具体如下：

MARC-145细胞在含有10％FBS的DMEM培养基的六孔板中贴壁长满单层后，弃培养基，PBS洗两遍，吸取转染过后五天的上清液，将其与维持液(含2％FBS的DMEM)按照1∶10的比例接种上清液200μL，置37℃继续培养并采用上述方法继续传代，并收取第五代的病毒上清，然后按照QIAGEN公司RNA提取试剂盒中的操作方法提取上清病毒RNA，获得病毒vA-Rluc、vA-Fluc。

根据上述结果，获得的重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc具有感染性，能够从单一的基因组序列成功转变为具有活性的病毒粒子并具有相应的病毒感染性。

1.4.2、间接免疫荧光检测

按照实施例1.4.1中的RNA转染步骤，分别以纯化后1000倍稀释的病毒vA-Rluc、vA-Fluc，感染单层MARC-145细胞，然后于感染36h后弃去培养基，用冰甲醇固定10min，1％BSA室温封闭30min，用PRRSV核衣壳蛋白的特异性单抗(1∶800稀释)室温孵育2h，再加入罗丹明标记的羊抗鼠的二抗室温孵育1h，PBS洗五遍后，在荧光显微镜下观察，结果如图5所示。

根据图4的结果：vA-Rluc和vA-Fluc于转染后第5天出现了明显的CPE，以无限稀释法传代纯化嵌合病毒vA-Rluc和vA-Flue，并且以间接免疫荧光分别检测感染嵌合病毒vA-Rluc和vA-Fluc 36h后的MARC-145细胞，结果出现了抗N蛋白的特异性荧光。

同时，利用RT-PCR技术检测原代(P0)和子代(P5和P10)病毒，结果显示，这两个荧光素酶基因能够分别稳定存在于PRRSV基因组中。

上述结果说明：利用反向遗传操作系统获得了和亲本毒vHuN4-F112具有相似生长特性的表达海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的PRRSV嵌合全长重组质粒，同时证明在外源基因的插入不影响整个病毒的生长，是可行的。

1.4.3病毒细胞半数感染量(TCID₅₀)测定

参照Pizzi，M.，Sampling variation of the fiftypercent end-point，dctcrmincdby the Reed-Muench(Behrens)method，Hum Biol，1950.22(3)：p 151-90.中的方法，用96孔组织培养板方法进行感染性滴度的测定。将上述感染细胞后收取的病毒上清用维持液(2％FBS的DMEM)作10倍系列稀释后，将10^-1-10^-9连续稀释的病毒接种96孔细胞培养板上的MARC-145单层细胞，每稀释度接种8孔，每孔0.1mL，再设2列对照(即用维持液代替病毒液)，置37℃5％的二氧化碳培养箱中培养，6-7天后观察感染细胞，记录出现细胞病变的孔数，并按Reed-Muench法计算TCID₅₀。

1.4.4病毒多步生长曲线的绘制

分别以低剂量(0.01MOI)病毒(vA-Rluc、vA-Fluc和vHuN4-F112)感染MARC-145细胞，分别在感染后不同的时间段(0h、2h、8h、19h、24h、44h、56h、80h、104h)收取细胞培养上清，并进行病毒滴度的测定，收取的每个时间点病毒用TCID₅₀计算滴度，并根据不同时间点病毒的滴度，绘制病毒多步生长曲线，结果如图6所示，根据该图，在感染19h后病毒形成第一个复制高峰期，随后在第60h左右出现第二个复制高峰期；亲本病毒株vHuN4-F112与嵌合病毒vA-Rluc、vA-Fluc之间的差异不显著。只是在病毒复制周期的早期阶段(8hpi以内)滴度明显低于亲本毒。结果说明利用反向遗传操作技术，获得的全长海肾荧光素酶或萤火虫荧光素酶嵌合重组质粒拯救出来的病毒和亲本毒株在病毒的增殖各个时间点的病毒滴度，指数增长期，平台期等生长曲线方面具有相似的生物学活性，见图6。

根据实施例2，本发明在高致病性蓝耳病细胞传代致弱株全长感染性克隆pHuN4-F112的骨架上，利用SOE PCR的方法，在ORF1b和ORF2之间插入海肾荧光素酶RcnillaLucifcrase或者萤火虫荧光素酶基因Firefly Luciferase，获得了两个嵌合质粒pA-Rluc和pA-Fluc，经病毒拯救，获得了活病毒，经RT-PCR鉴定，嵌合病毒目前已能够稳定传代10次而不发生缺失和突变，具有遗传稳定性。

将在MARC-145细胞上系列传代至P10代的嵌合突变病毒vA-Fluc和vA-Rluc、亲本病毒vHuN4-F112以相同的感染量(0.01MOI)接种到约90％细胞密度的MARC-145细胞单层上，37C孵育1h后，弃掉病毒液，加入等比例的2％浓度的低熔点琼脂糖与2×MEM以及4％FBS混合加入到六孔板中(至终浓度为2％FBS)，5mL/孔铺到细胞板中。待室温至低熔点胶凝固后放于37℃、5％CO2培养箱中培养4-5天。观察待空斑大小适中时，取出六孔板，并用4％甲醛固定1h后将胶甩除，再用5％结晶紫染色即可观察空斑形态。

将上述两个嵌合病毒vA-Rluc、vA-Fluc的不同代次感染MARC-145细胞后，在不同的时间点裂解感染细胞，测定裂解物中的荧光素酶活性值，然后通过GraphPad软件绘制活性值曲线图。以分析其作为病毒复制水平指征的应用价值。具体操作如下：

将P2-P10代的vA-Rluc、vA-Fluc以及亲本病毒vHuN4-F112以相同的感染量(0.01MOI)感染新鲜长好的细胞密度达到90％的MARC-145细胞，在感染后60h分别用荧光素酶活性测定试剂盒(Luciferase Assay System with Reporter Lysis Buffer，PromegaE4030)和海肾荧光素酶检测试剂盒(Renilla Luciferase Assay System，Promega E2810)中的裂解液裂解相应的细胞，注意裂解液的储存液为5×，使用时需配置成1×的使用浓度方可。取10μL的细胞裂解物加入相应的白色96孔板中，再于其中加入试剂盒中的反应液，底物等孵育，于荧光素酶活性测定仪(modulus 9300-001)中读取荧光素酶活性数值，每一个样品分别读取三次，然后通过GraphPad软件绘制活性值曲线图。

将0.01MOI的P5代和P10代的vA-Rluc、vA-Fluc感染细胞密度约为90％的MARC-145细胞，进行空斑实验，具体步骤参照如上，待出现明显的空斑时，用1mL的枪头吸取空斑垂直上方的胶液，每个突变病毒需挑取10个空斑，然后将这些空斑继续感染新的MARC-145细胞，待感染后60h，裂解细胞测定荧光素酶活性值，通过GraphPad软件绘制活性值曲线图。

将0.01MOI的P10代的vA-Rluc和vA-Fluc分别感染细胞密度为90％的MARC-145细胞，分别于感染后24h、48h、60h、72h、96h、120h收集细胞裂解物测定其荧光素酶活性值，通过GraphPad软件绘制活性值曲线图。

Claims (1)

1.一种表达海肾或萤火虫荧光素酶基因的PRRSV重组质粒，所述重组质粒为pA-Rluc和pA-Fluc，其制备方法为利用SOE PCR制备嵌合重组质粒，所述方法具体为：根据pGMR-TK海肾荧光素酶报告基因载体和pGL3-Basic萤火虫荧光素报告基因载体中的两个荧光素酶基因序列以及高致病性蓝耳病细胞致弱疫苗株HuN4-F112的基因序列设计SOE PCR引物，在HuN4-F112的ORF1b和ORF2之前分别插入Renilla和Firefly Luciferase基因，并在外源基因3′端下游插入此病毒的转录调控序列6，将扩增出的两个嵌合片段通过Asc I和EcoR V双酶切，然后回收PCR产物连接到HuN4-F112的Asc I和EcoR V双酶切载体上，从而获得了两个嵌合重组质粒pA-Rluc和pA-Fluc；所述方法中使用的引物为：

HF11559：5′-TCATACATCCGAGTTCCTGTT′-3′(SEQ ID NO.1)

HR13090：5′-GAAATATTGTCATGGCGAGGC-3′(SEQ ID NO.2)

RLUC-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGACTTCGAAAGTTTATGATCCAG-3′(SEQID NO.3)

RLUC-R1：5′-TTTGTTCTGGATCATAAACTTTCGAAGTCATTTCAATTCAGGCCTAAAG-3′(SEQ IDNO.4)

RLUC-F4：5′-CAAATCGTTCGTTGAGCGAGTTCTCAAAAATGAACAATAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′(SEQ ID NO.5)

RLUC-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTATTGTTCATTTTTGAGAACT-3′(SEQ ID NO.6)

FLUC-F2：5′-TCATTGAACCAACTTTAGGCCTGAATTGAAATGGAAGACGCCAAAAACATAAAG-3′(SEQID NO.7)

FLUC-R1：5′-GGCCTTTCTTTATGTTTTTGGCGTCTTCCATTTCAATTCAGGCCTAAAGTT-3′(SEQ IDNO.8)

FLUC-F4：5′-CTCATAAAGGCCAAGAAGGGCGGAAAGATCGCCGTGTAAGTTCCGTGGCAACCCCTTTAACCAGATG-3′(SEQ ID NO.9)

FLUC-R2/R3：5′-CATTGTTCCGCTGAAACTCTGGTTAAAGGGGTTGCCACGGAACTTACACGGCGATCTTTCCGCC-3′(SEQ ID NO.10)；

具体构建步骤如下：

1.1.1扩增SOE-1PCR产物

以pHuN4-F112作为模板，引物HF11559和Rluc-R1/Fluc-R1分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增突变片段SOE-1；

1.1.2扩增SOE-2PCR产物

以pGMR-TK和pGL3-Basic质粒为模板，引物Rluc-F2/Fluc-F2和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3分别作为上游引物和下游引物，PCR扩增SOE-2；

1.1.3扩增SOE-4PCR产物

以pHuN4-F112作为模板，以Rluc-F4/Fluc-F4和HR13090上下游引物对10μM，PCR扩增SOE-4；

1.1.4扩增SOE-3PCR产物

以SOE-1和SOE-2PCR回收产物作为模板，以HF11559和Rluc-R2/R3/Fluc-R2/R3上下游引物对PCR扩增SOE-3；

1.1.5扩增SOE-5PCR产物

以SOE-3和SOE-4PCR回收产物作为模板，以HF11559和HR13090上下游引物对10μM，PCR扩增SOE-5；

1.2表达海肾荧光素酶或荧光虫荧光素酶重组PRRSV质粒的构建

将上述SOE-5的PCR产物使用Asc I/EcoR V进行双酶切，再与经过Asc I和EcoR V双酶切的亲本病毒全长质粒pHuN4-F112的大片段通过T4 DNA连接酶连按，经测序鉴定后筛选出阳性克隆，获得pA-Rluc(SEQ ID NO.11)和pA-Fluc(SEQ ID NO.12)。