CN104152417A - 表达gm-csf重组prrsv弱毒疫苗株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，该疫苗株包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还公开了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法和应用。本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达GM-CSF，具有遗传稳定性，而且该重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株，可促使DC细胞活化和成熟，进而增强APC的抗原呈递能力，明显提高PRRSV弱毒疫苗的细胞免疫水平。

Description

表达GM-CSF重组PRRSV弱毒疫苗株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达GM-CSF重组猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗株及其制备方法和应用。

背景技术

目前，猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)被认为是当今养猪业最严重的传染病，已经对我国乃至世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染后宿主产生中和抗体和细胞免疫应答比较迟缓，造成了一定程度的免疫抑制。PRRSV在宿主体内感染的靶细胞为肺泡巨噬细胞，在体外PRRSV也感染其他的免疫相关细胞，如单核源树突状细胞、类浆细胞源树突状细胞等。树突状细胞（DC）是专业的抗原呈递细胞(APC)，在先天性免疫和获得性免疫中发挥了重要的桥梁作用。有研究表明PRRSV感染DCs时能够干扰DCs的表面分子的表达，从而抑制DCs发挥抗原呈递的功能。亦或是通过感染单核源DCs阻碍IFN-alpha的翻译或其RNA的转运和加工，使得I型干扰素表达量下降。

目前针对PRRSV病毒感染最有效地预防和控制措施是疫苗接种，而现阶段临床应用针对PRRSV的疫苗主要有两大类，即灭活疫苗和弱毒疫苗。其中对于灭活疫苗其免疫效果尚存争议，有人认为PRRSV灭活疫苗安全性好，但是由于PRRSV存在抗体依赖增强作用，导致灭活疫苗在临床上的免疫效果低于期望值，也有人认为灭活疫苗能够针对同源PRRS毒株产生良好的免疫保护，但是由于PRRSV易发生变异，导致灭活疫苗对于PRRS的异源毒株防控效果较差。PRRSV弱毒疫苗在该病防控上发挥了重要作用，PRRSV弱毒疫苗不仅能提供高水平的体液免疫，而且还能提供良好的细胞免疫，具有免疫效率高，免疫持续期长等优势，相对于灭活疫苗而言弱毒疫苗在临床上应用更为普遍。但现有的PRRSV弱毒疫苗的使用依然存在诱导产生中和抗体和细胞免疫应答较为迟缓或者水平较低，导致对PRRSV感染早期有效控制做出快速免疫应答的效果不佳，从而影响了PRRS疫苗的免疫效果。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种具有多项潜能的造血生长因子，属于一种细胞因子。

发明内容

本发明要解决现有PRRSV弱毒疫苗普遍存在诱导产生中和抗体和细胞免疫应答较为迟缓或者水平较低、导致免疫效果不佳的技术问题，提供一种PRRSV弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株能稳定表达猪源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，显著提高了PRRSV弱毒疫苗的免疫效果。

此外，还需要提供一种上述PRRSV弱毒疫苗株的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述插入的GM-CSF序列还连接有转录调控序列；更优选的，所述插入的GM-CSF序列3’端还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列(TRS6)，该转录调控序列(TRS6)为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种核酸分子，包含连接有转录调控序列的GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选的，所述转录调控序列与GM-CSF序列3’端相连接，该转录调控序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种核酸分子，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORF1b和ORF2a之间插入连接有转录调控序列的GM-CSF序列。

在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸分子的重组载体。

在本发明的另一方面，还提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法，包括以下步骤：

构建包含一种核酸分子的重组载体，该核酸分子包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORF1b和ORF2a之间插入连接有转录调控序列的GM-CSF序列；

将所述重组载体线性化后，体外转录成病毒RNA，再将该病毒RNA转染细胞；

将转染的细胞进一步接种于细胞上培养，进行病毒拯救，获得重组表达GM-CSF的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了一种区分上述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与野毒株感染的检测试剂盒，包含：针对SEQ ID NO.1所示插入基因序列设计的引物对。

本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗株，不仅能够稳定表达GM-CSF，具有遗传稳定性，而且重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株，可促使DC细胞活化、成熟，进而增强APC的抗原呈递能力，明显提高PRRSV弱毒疫苗的细胞免疫水平。因此，本发明的PRRSV弱毒疫苗株有望成为今后新型疫苗开发和临床应用的候选弱毒疫苗株。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2拯救的病毒感染Marc-145细胞后的细胞病变图；

图2是本发明实施例2重组病毒rHN4-GM-CSF的RT-PCR鉴定结果图；

图3是本发明实施例2重组病毒rHN4-GM-CSF的MluΙ酶切鉴定结果图；

图4是本发明实施例2重组病毒的间接免疫荧光鉴定结果图；

图5是本发明实施例2重组病毒的Westernblotting鉴定结果图；

图6是本发明实施例3重组病毒的生长曲线图；

图7是本发明实施例3重组病毒的蚀斑形态观察图；

图8是本发明实施例3的第5代、10代、15代和20代重组病毒的RT-PCR检测结果图；

图9是本发明实施例3重组病毒rHN4-GM-CSF遗传稳定性分析图；

图10是本发明实施例3第20代重组病毒表达GM-CSF的IFA鉴定结果图；

图11是本发明实施例4重组病毒rHN4-GM-CSF的功能分析柱状图。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

为了能进一步提高PRRSV弱毒疫苗的免疫效果，本发明通过分子生物学手段对PRRSV商品化弱毒疫苗株HuN-F112的基因组进行设计和改造。PRRSV弱毒疫苗株HuN-F112是本实验室通过将高致病性PRRSV强毒HuN4株体外传代致弱获得的减毒活疫苗株，之前的大量临床实验证实HuN4-F112弱毒疫苗株具有很好的免疫保护力（专利号为200810097546.8的中国发明专利）。本发明在PRRSV弱毒疫苗HuN-F112株感染性分子克隆（专利号为201010559005.X的中国发明专利）的基础上，通过融合PCR的方法在ORF1b和ORF2a之间插入猪源GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）和PRRSV ORF6转录调控序列(TRS6)，获得了重组表达载体pHuN4-F112-GM-CSF，将重组载体用限制性内切酶SwaΙ线性化后，通过体外转录获得病毒RNA，用脂质体法将病毒RNA转染BHK-21细胞，并在Marc-145细胞进行病毒拯救，获得的重组病毒利用间接免疫荧光试验（IFA）和Western blotting分析，结果表明本发明救获了一株能够表达猪源GM-CSF的重组病毒rHN4-GM-CSF。重组病毒rHN4-GM-CSF的生长曲线和蚀斑形态分析，结果表明，该重组病毒的生物学特性与亲本毒HuN4-F112基本一致，表明重组病毒表达猪源GM-CSF并不能影响病毒的复制。通过在Marc-145上连续传代分析其遗传稳定性，结果显示该重组病毒可以稳定遗传，引入的猪源GM-CSF未发生突变或缺失。进一步通过体外实验分析重组病毒表达猪源GM-CSF的生物学功能，结果显示重组病毒作用骨髓源DC细胞，能够引起DC细胞表面分子CD80/86、MHCI和MHCII的显著表达，而亲本毒HuN4-F112要明显低于重组病毒rHN4-GM-CSF，表明本发明获得的重组病毒rHN4-GM-CSF可促使DC细胞活化、成熟，进而有利于增强APC的抗原呈递能力，提高弱毒苗的免疫效果，该重组病毒rHN4-GM-CSF可以作为今后新型疫苗开发和临床应用的候选弱毒疫苗株。

实施例1重组表达GM-CSF病毒全长cDNA克隆的构建

1.材料与方法

1.1病毒株、细胞及载体

PRRSV疫苗株HuN4-F112由本实验室传代致弱并保存、感染性克隆载体pSK-Hun4-F112、含有HuN4-F112株基因组ABC片段的质粒和EDF片段的质粒(pSK-HuN4-F112-ABC和pSK-HuN4-F112-DEF)由本实验室构建并保存（TongGZetal.,2007;Zhou YJ et al.,2008；周艳君等2011；Zhang SR et al.,2011，质粒pGM-CSF、BHK-21细胞，Marc-145细胞、抗PRRSVN蛋白单抗均由中国农科院上海兽医研究所猪传染病研究室保存。

1.2主要试剂

RNA提取试剂盒RNeasy Plus Mini Kit购自QIAGEN公司；质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒购自上海华舜生物科技有限公司；DNA纯化回收试剂盒购置Omega公司；PfuUltra ⅡFusion HS DNA Polymerase购自Stratagene公司;goat anti-mouse lg G(H+L)和脂质体DMRIE-C购自Invitrogen公司；T4DNA连接酶、限制性内切酶购自NEB公司；体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit;AMV反转录酶RNA酶抑制剂、Taq酶、dNTP、DL-2000DNAMarker、DL-15000DNA Marker均购自TaKaRa公司；胎牛血清、培养基和高糖的DMEM培养基购自Gibco公司；其他化学试剂均为进口或国产分析纯。

1.3引物设计

根据PRRSV HuN4株（GenBank登录号：EF635006）基因序列，用Primer5.0软件设计了3对引物F1/R1、F2/R2以及F3/R3(见表1)。

表1：实验中用到的引物

1.4重组表达GM-CSF病毒全长cDNA克隆的构建

1.4.1GM-CSF-TRS6基因的PCR扩增

利用质粒小提试剂盒提取含有GM-CSF基因的质粒，然后以pGM-CSF质粒为模板，利用特异性引物F2/R2和高保真酶Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase，通过变性、退火、延伸三个过程的循环，将序列GM-CSF与TRS6融合连接形成基因片段2，即GM-CSF-TRS6。反应体系和反应条件如下：

反应体系：

反应过程：95℃2min预变性；95℃20s，60℃20s，72℃15s，共18个循环；最后72℃延伸3min，4℃保存。

1.4.2基因片段1(DEF-F1)和基因片段3(DEF-F3)的PCR扩增

分别以pSK-HuN4-F112-DEF为模板，利用特异性引物F1/R1和F3/R3，通过融合PCR的方法扩增基因片段1(即：DEF-F1)和基因片段3(DEF-F3)，反应体系和反应条件如下：

反应体系：

反应过程：95℃2min预变性；95℃20s，55℃20s，72℃15s，共18个循环；最后72℃延伸3min，4℃保存。

1.4.3基因片段GM-CSF-TRS6-DEF-F3的PCR扩增

分别以基因片段GM-CSF-TRS6和DEF-F3共同为模板，利用特异性引物F2/R3，在高保真酶Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase的作用下，通过融合PCR的方法扩增基因片段GM-CSF-TRS6-DEF-F3，其反应体系和反应条件如下：

反应体系：

反应过程：95℃2min预变性；95℃20s，51℃20s，72℃15s，共18个循环；最后72℃延伸3min，4℃保存。

1.4.4基因片段DEF-GM-CSF-TRS6的PCR扩增

以基因片段DEF-F1和GM-CSF-TRS6-DEF-F3共同为模板，利用特异性引物F1/R3，在高保真酶Pfu Ultra Ⅱ Fusion HS DNA Polymerase的作用下，通过融合PCR的方法扩增基因片段DEF-GM-CSF-TRS6(SEQ ID NO.3)，其反应体系和反应条件如下：

反应体系：

反应过程：95℃2min预变性；95℃20s，55℃20s，72℃15s，共18个循环；最后72℃延伸3min，4℃保存。

1.4.5质粒pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF的构建

首先利用限制性内切酶BspEI和BglII双酶切消化基因片段DEF-GM-CSF-TRS6和pSK-HuN4-F112-DEF质粒，反应体系和反应条件如下：

反应体系：

反应条件：将上述各组分混匀后，在37℃水浴作用5h。

然后利用DNA胶回收试剂盒回收经BspEI和BglII双酶切消化后的基因片段DEF-GM-CSF-TRS6和pSK-HuN4-F112-DEF质粒，将回收到的两个目的片段用T4DNA Ligase进行连接，连接体系和反应条件如下：

连接体系：

连接条件：将上述组分混合均匀后于22℃作用4.5h。

将连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单个菌落接种于5mLLB液体培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃摇床震荡培养3～4h，利用引物F1/R3进行菌液PCR鉴定，筛选为阳性的克隆，进行测序鉴定。阳性质粒命名为pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF。

1.4.6重组表达GM-CSF病毒全长cDNA克隆的构建

双酶切Cla I和Pac I消化pSK-HuN4-F112-ABC质粒和pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF质粒。

反应体系：

反应条件：将上述各组分混匀并瞬时离心，在37℃水浴5h。扩增完毕后，将全部反应产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

回收经Cla I和Pac I消化后ABC片段和线性化的pSK-HuN4-F112-DEF-GM-CSF质粒，将回收到的两个目的片段用T4DNA Ligase进行连接，连接体系和反应条件如下：

连接体系：

连接条件：将上述组分混合均匀后于22℃作用4.5h。

将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)，37℃摇床震荡培养3～4h，利用引物F1/R3进行菌液PCR鉴定，筛选为阳性的克隆，进行测序鉴定。

2.结果

利用融合PCR方法将TRS6融合在GM-CSF基因3’端，并利用双酶切等将GM-CSF-TRS6基因引入到PRRSV基因组ORF1b和ORF2a之间，经酶切、PCR鉴定和测序鉴定证实，获得了重组GM-CSF基因PRRSV全长cDNA克隆，本发明把含GM-CSF基因PRRSV全长cDNA克隆阳性质粒命名为pHuN4-F112-GM-CSF。

实施例2重组表达GM-CSF病毒的拯救及鉴定

1.RNA的体外合成与转染

利用3’末段的SwaI酶切位点将包含病毒基因组全长cDNA的质粒pHuN4-F112-GM-CSF进行线性化，根据体外转录试剂盒mMessage High Yield Capped RNA Transcription kit操作说明合成病毒RNA，同时培养BHK21细胞使其密度达到70%～90%，将上述合成的病毒RNA根据DMRI-C转染试剂说明书转染BHK21细胞。转染后的细胞置于37℃CO₂培养箱中培养48小时。

2.重组表达GM-CSF病毒株的拯救

收获上述转染的细胞保存于-80℃，经反复冻融后，接种于预先培养好的Macr-145细胞单层上于37℃CO₂培养箱中感作1小时，加入细胞维持液于37℃CO₂培养箱中继续培养，进行病毒的拯救，并观察细胞病变(CPE)。

结果显示救获的重组病毒在感染Marc-145细胞72小时后，出现明显的细胞病变(CPE)，细胞表现为聚集、圆缩和脱落等，与其亲本毒HuN4-F112产生的CPE基本一致，将该拯救的重组表达GM-CSF病毒命名为rHN4-GM-CSF（图1）。图1中，A：rHN4-GM-CSF；B：亲本病毒HuN4-F112；C：正常的细胞。图1中箭头所指的地方即为出现明显细胞病变的区域。重组病毒rHN4-GM-CSF的全长基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3.救获插入GM-CSF基因重组病毒的RT-PCR鉴定

提取救获的重组表达GM-CSF的PRRSV弱毒疫苗株rHN4-GM-CSF和亲本毒HuN4-F112的RNA，经反转录，利用上述引物F1/R3进行RT-PCR扩增，并将产物连接pMD18-T载体进行测序。

结果：

引物F1/R3的RT-PCR扩增结果显示，rHN4-GM-CSF的PCR条带大于其亲本的病毒，与预期结果相一致（图2）。对PCR克隆后测序结果显示引入GM-CSF基因位置与实验设计相符。图2中，M:DL-2000DNAmarker；1：rHN4-GM-CSF；2：亲本病毒HuN4-F112；3：阴性对照。

4.重组病毒克隆标记Mlu Ι酶切鉴定

提取救获的重组病毒rHN4-GM-CSF的RNA，用上述引物F4/R4进行RT-PCR扩增，获得的PCR产物用MluΙ酶切进行酶切鉴定，结果显示亲本病毒PCR产物不能被MluΙ识别，而我们拯救的重组病毒rHN4-GM-CSF可以被MluΙ切成2个片段（图3）。图3中，M:DL-2000DNAmarker；1：亲本病毒HuN4-F112；2：rHN4-GM-CSF。

5.救获重组GM-CSF基因病毒的间接免疫荧光（IFA）鉴定

将拯救的重组病毒rHN4-GM-CSF株接种Macr-145细胞单层，感染后48h弃去培养液，用80%的冷已醇固定20min，分别加入稀释后的针对PRRSVN蛋白的单克隆抗体和抗猪源GM-CSF的单抗，室温孵育1h，PBS洗涤3遍，再加入FITC标记羊抗鼠的二抗，室温孵育1h,，PBS洗涤3遍，于荧光显微镜下观察结果。

结果显示，重组病毒rHN4-GM-CSF感染的Marc-145细胞两种单抗均能检测到特异性荧光，而亲本病毒仅被抗N蛋白的特异性单抗所识别，不能被抗GM-CSF的单克隆抗体所识别（图4）。表明本发明重组病毒rHN4-GM-CSF引入的GM-CSF基因能够获得表达。

6.救获重组GM-CSF基因病毒的Western blotting鉴定

将拯救的重组病毒rHN4-GM-CSF株接种Macr-145细胞单层，感染后24h分别收集病毒感染细胞的上清和感染细胞，经SDS-PAGE电泳和NC膜转印后，用抗GM-CSF的特异性单克隆抗体进行Western blotting鉴定。

结果显示，重组病毒感染后的Marc-145细胞，在培养上清液和细胞裂解液中均能检测到GM-CSF蛋白的表达，而亲本病毒均不能检测到GM-CSF蛋白（图5）。

实施例3重组表达GM-CSFPRRS病毒生物学特性分析

1.重组病毒多步生长曲线的绘制

将重组病毒rHN4-GM-CSF和亲本毒HuN4-F112分别按100TCID₅₀的感染剂量感染Macr-145细胞，在感染后每隔12h(12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h)收取300μL病毒感染的细胞上清液，采用96孔组织培养板法进行病毒滴度测定，按Reed-Muench法计算病毒的计算半数感染量(TCID₅₀/0.1mL)，绘制病毒多步生长曲线。

利用第五代重组病毒绘制病毒的多步生长曲线，结果显示重组病毒rHN4-GM-CSF在感染后48h至60h即达到复制高峰期，其整个增殖过程与其亲本病毒HuN4-F112的增殖特性基本一致(图6)。

2.重组病毒蚀斑形态观察

将重组病毒rHN4-GM-CSF和亲本毒HuN4-F112分别经10倍系列稀释后接种预先在6孔板中准备好的Marc-145细胞，在37℃感作1h后，弃去病毒感染上清液，每孔加入低熔点琼脂糖凝胶，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养3-5天，然后去除低熔点琼脂糖凝胶，经4%甲醛室温固定1h后，用5%结晶紫染色观察蚀斑形态。

结果显示重组病毒在Marc-145细胞上形成蚀斑的形态和大小与其亲本毒形成蚀斑基本一致（图7）。

3.重组病毒遗传稳定性检测

将重组病毒rHN4-GM-CSF在Marc-145细胞上连续传代至20代，选取不同代次的重组病毒，利用RT-PCR方法对其插入GM-CSF区域进行鉴定，并对扩增的基因片段进行了测序分析，同时对不同代次病毒分别进行IFA鉴定以确定插入基因能否稳定表达。

结果：

将重组病毒rHN4-GM-CSF在Marc-145细胞上连续传代至20代，选取其中的5、10、15和20代毒进行RT-PCR扩增、克隆测序和序列分析，结果显示，重组病毒rHN4-GM-CSF连续传至20代均能检测到引入的基因（图8）；测序结果显示插入的外源基因GM-CSF没有发生突变、缺失等，能够稳定遗传（图9）；同时IFA鉴定结果显示，第20代重组病毒能够稳定表达GM-CSF蛋白（图10）。

实施例4重组表达GM-CSF弱毒疫苗株rHN4-GM-CSF的体外功能分析

1.方法

1.1骨髓细胞的分离与培养

选取6周龄的SPF猪，无菌条件下取出股骨和胫骨，去尽附着的肌肉及结缔组织。用含肝素(100U/ml)的RPMI1640液(gibico)冲洗骨髓腔,收集细胞悬液。并用ACK Lysis Buffer裂解红细胞，于4℃，作用10min，获取的骨髓细胞（BMHC）用PBS洗涤两次，再以2×10⁶细胞培养于10cm培养皿中，加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基10ml(含青霉素100U/ml,链霉素100mg/ml)，在37℃，5%CO₂恒温箱中培养，备用。

1.2BMDC的分化处理

在上述预先制备好的BMHC中添加猪源GM-CSF蛋白(终浓度20ng/ml)，在37℃，5%CO₂恒温箱中培养，培养3天后，补充新鲜培养基，继续培养至第7天，收集非贴壁细胞即为分化的骨髓源DC细胞（BMDC细胞）。

1.3重组病毒刺激BMDC的成熟和活化

将收集的BMDC细胞以2×10⁶培养于6孔板中，重组病毒以0.1TCID₅₀/cell剂量感染DC细胞，感染后48h，收集细胞，用于流式分析DC表面分子标记。再取BMHC细胞以2*10⁶培养于6孔板中，重组病毒以1TCID₅₀持续作用，分别在24h、48h、72h和96h收集细胞和培养上清。

1.4活化的BMDC细胞分泌细胞因子检测

重组病毒作用BMDC的细胞后，培养上清分别在24h、48、72h，96h收集后，通过ProcartaPlex^TMMultiplex Immunoassays(Affymetrix,eBioscience)从蛋白质水平检测细胞因子表达，同时利用Real-Time PCR相对定量方法，从mRNA水平检测相关细胞因子表达。

1.5活化的BMDC细胞表面分子的检测

取1×10⁶个上述经过48h活化处理的BMDC细胞，分别加入5μL不同标记的抗CD80/86-PE、MHCI-FITC和MHCII-FITC分子的特异性单抗，4℃避光孵育30min，细胞用含3%的灭活血清和0.09%NaN3的DPBS洗涤两次，通过流式缓冲液悬浮，利用流式细胞仪进行检测，同时设同型对照，数据通过Beckman FC500流式细胞仪和FlowJo software进行收集、分析和处理。

2.结果

重组病毒作用BMDC后，可以促进BMDC的分化和成熟；分别以0.1TCID50/cell剂量的重组病毒和亲本毒作用BMDC细胞，48h后收集细胞，进行流式细胞分析，结果显示重组病毒作用的BMDC细胞的表面分子CD80/86和MHCI分子共同阳性细胞比例为77%，明显高于亲本毒作用共阳性细胞比例（66.5%），二者间差异极显著（p<0.01）。而且CD80/86和MHCII分子共阳性细胞比例（73.5%）也明显高于亲本毒作用共阳性细胞比例（68.8%），二者间呈显著性差异(p<0.05)（图11A）。重组病毒与亲本毒分别以1TCID50/cell剂量作用BMHC48小时，流式细胞分析结果显示，重组病毒作用后，CD80/86和MHCI分子共阳性细胞为11.3%，显著高于亲本病毒作用后的3.72%，二者间差异极显著，而且CD80/86和MHCII分子共阳性细胞为4.79%也显著高于亲本毒作用后的2.88%（图11B）。表明重组病毒rHN4-GM-CSF不仅可以表达GM-CSF，而且表达的GM-CSF具有促进DC细胞成熟和活化的功能。图11A是重组病毒与亲本毒株分别作用骨髓源DC（BMDC）细胞48小时后的流式细胞分析结果图；图11B是重组病毒与亲本毒株分别持续作用骨髓细胞(BMHC)48小时后的流式细胞分析结果图。图11中的LPS是脂多糖（Lipopolysaccharides），在实验中作为阳性对照，其作用是可以促进未成熟的DC细胞分化成熟。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组核酸，在该HuN4-F112基因组的ORF1b和ORF2a之间插入有GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述插入的GM-CSF序列3’端还连接有猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF6转录调控序列，该转录调控序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株，其特征在于，所述HuN4-F112基因组还包含标记性的MluI限制性内切酶位点。

4.一种核酸分子，其特征在于，包含连接有转录调控序列的GM-CSF序列，该GM-CSF序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的核酸分子，其特征在于，所述转录调控序列与GM-CSF序列3’端相连接，该转录调控序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

6.一种核酸分子，其特征在于，包含猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株HuN4-F112的基因组多核苷酸序列，在该HuN4-F112基因组序列的ORF1b和ORF2a之间插入有权利要求4所述核酸分子的核苷酸序列。

7.一种包含权利要求4或6所述核酸分子的重组载体。

8.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建包含权利要求6所述核酸分子的重组载体；

将所述重组载体线性化后，体外转录成病毒RNA，再将该病毒RNA转染细胞；

将转染的细胞进一步接种于细胞上培养，进行病毒拯救，获得重组表达GM-CSF的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株。

9.权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株在制备预防或治疗高致病性猪繁殖与呼吸综合征的疫苗中的应用。

10.一种区分权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗株与野毒株感染的检测试剂盒，其特征在于，包含：针对SEQ ID NO.1所示插入基因序列设计的引物对。