CN114657213B - 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用。本发明利用Gibson组装将猪急性腹泻综合征冠状病毒基因组分段克隆到大肠杆菌的细菌人工染色体中，并将全长感染性克隆和辅助质粒共转染哺乳动物细胞快速拯救得到与野生型亲本基因相同的病毒。本发明绕过了传统方法繁琐的酶切位点设计和酶切连接操作，且病毒BAC在大肠杆菌中是稳定的，可以通过DNA同源重组工程和反向筛选系统进行进一步的基因操作。同时，本发明成功构建了毒株SADS‑CoV‑WT的感染性克隆并建立了基于DNA同源重组工程和ccdB反向筛选系统于辅助蛋白基因ORF3a和ORF7a/b位置进行敲除或插入外源基因的方法。

Description

一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构 建方法和应用
技术领域
本发明属于基因重组和疫苗技术领域，具体涉及克隆猪急性腹泻综合征冠状病毒SADS-CoV-WT基因组快速制备感染性BAC克隆的方法及感染性克隆pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA在构建重组猪急性腹泻综合征冠状病毒中的应用。
背景技术
SADS-CoV为具有包膜的单股正链RNA病毒，在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒属。SADS-CoV基因组大小约为27kb，包括5’-UTR、3’-UTR及9个编码框，其中SADS-CoV的辅助蛋白基因为病毒增殖与组装的非必需基因，可插入外源基因，作为活病毒载体应用，同时也可敲除相应基因研究其功能。但产生重组病毒来进行生物学研究及疫苗研发需要精确和有效的遗传操作方法。由于冠状病毒基因组较大、细菌载体的基因组稳定性、难以在体外驱动全长30 kb的RNA转录本、转染效率低和病毒基因组的感染性等因素的影响，冠状病毒的反向遗传系统很难实现。细菌人工染色体BAC是可以插入 100-300 kb 大片段DNA 的克隆载体；目前BAC载体已经发展为第二代BAC载体系pBeloBAC11商业化载体，大小为7507bp，其中F因子具有低拷贝性，在细胞内只有1-2个拷贝，从而可以限制细胞内质粒分子之间的重排。BAC技术已被证明是描述病毒基因组功能的重要工具。
传统的基因工程技术通过在体外反应体系中利用限制性内切酶和DNA连接酶获得重组DNA分子。还有一种方法则是利用具有末端转移酶活性，而不具有3’-5’外切酶校准活性的Taq、Tfl、Tth等耐热聚合酶，在PCR产物的两个3’末端加上单一腺嘌呤脱氧核苷酸（A）凸出尾；经处理的线性质粒载体3’末端则带有单一的单一胸腺嘧啶脱氧核苷酸（T）凸出尾，该载体能够直接与PCR产物高效连接形成重组DNA分子。1990年代末，新技术的出现，使得DNA修饰更加简化、快速。1998年，kenan murphy et al.将大肠杆菌的recBCD基因敲除，然后在突变株细胞内表达来源于λ噬菌体的重组酶Redα/Redβ，利用带有1kb同源臂的线性双链DNA分子成功进行了基因替换试验。之后不久，A. Francis Stewart和他的同事们证明，利用来源于Rac前噬菌体的RecE/RecT，只要40-60bp的同源臂就能得到很高的重组效率。后来，Redα/Redβ和RecE/RecT重组系统被不断优化，逐渐发展成为一种能在大肠杆菌细胞内高效的对DNA分子进行直接修饰的技术。
Daniel D Gibson等人开发了一种用于DNA大片段拼接的技术，称为Gibson组装策略，在合成生物学领域具有广泛的应用前景。该技术的主要思路是对两段具有末端同源序列的DNA片段，通过核酸外切酶降解，暴露出粘性末端，两段DNA片段同源的粘性末端互补配对，再通过DNA聚合酶聚合、连接酶连接，便可将任意两段合适大小的 DNA 片段拼接起来。
由此形成了传统的构建冠状病毒感染性克隆的方法，即通过在体外反应体系中利用限制性内切酶和DNA连接酶获得重组DNA分子，该方法需要寻找合适的酶切位点方可实现片段的无痕连接，但该方法操作繁琐费时。且冠状病毒基因组较大，是已知基因组最大的RNA病毒，构建全长感染性克隆时需连接的片段较多。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用，本发明采用DNA同源重组工程技术、Gibson组装技术和反向筛选操作系统，最终通过分段克隆SADS-CoV基因组快速制备得到了感染性BAC克隆。并在其基础上结合DNA同源重组工程与反向筛选操作系统进一步获得了缺失SADS-CoV辅助蛋白基因和替换了荧光报告基因的重组质粒和重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。这种构建和操作SADS-CoV感染性克隆的新方法对于构建具有较大基因组的其他RNA病毒的感染性克隆具有潜在的借鉴意义，也为后续重组载体疫苗的快速研发提供了支持，也克服了构建大片段RNA病毒基因组感染性克隆的繁琐耗时、稳定性差的缺陷。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，该重组载体包括通过分段扩增，并覆盖猪急性腹泻综合征冠状病毒全基因组序列的14个基因片段，以及供所述基因片段克隆组装的载体；
该基因片段由如SEQ ID NO.13~40所示的引物对猪急性腹泻综合征冠状病毒全基因组分段扩增得到。
一种上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体的构建方法包括以下步骤：
S1、以SADS-CoV-WT病毒全基因组反转录所得cDNA为模板，利用SEQ ID NO.13~40所示的引物，通过PCR分段扩增得到覆盖整个基因组序列的F1-F14共14个用于后续重组的片段；
S2、以pBeloBAC11-spect、p15A-amp和pBeloBAC11-cm载体为模板，利用SEQ IDNO.1~8所示的引物，通过PCR扩增，将CMV左同源臂和F6右同源臂、F7左同源臂和F10右同源臂、F11左同源臂和SV40polyA右同源臂、CMV左同源臂和SV40polyA右同源臂分别加载到pBeloBAC11-spect、pBeloBAC11-spect、p15A-amp和pBeloBAC11-cm载体的两端，得到带有相邻重组片段同源臂的载体线性片段；
S3、以pCI-neo载体为模板，利用SEQ ID NO.9~12所示的引物，通过PCR扩增，将F1左同源臂、HDVrz右同源臂分别加载到CMV+Intron的右端和SV40polyA的左端，得到带有相邻重组片段同源臂的线性片段；
S4、通过全基因合成得到左端带有F14右同源臂和28个A的HDVrz片段；
S5、以R6k-amp-ccdB质粒为模板，利用SEQ ID NO.41~42所示的引物，通过PCR扩增，将F3右同源臂和F5左同源臂分别加载到amp-ccdB的两端，得到带有相邻重组片段同源臂的线性片段；
S6、将步骤S2中带CMV左同源臂和F6右同源臂的pBeloBAC11-spect线性片段与步骤S1中得到的F1-F3、F5-F6片段、步骤S5中得到的amp-ccdB片段以及步骤S3中得到的CMV+Intron片段进行Gibson组装后转化E. coli DB3.1即得重组载体pBeloBAC11-spect-CI-SADS-CoV-WT-F1-F6-△F4-amp-ccdB；
S7、将步骤S2中带F7左同源臂和F10右同源臂的pBeloBAC11-spect线性片段与步骤S1中得到的F7-F10片段进行Gibson组装后转化E. coli GB2005，即得重组载体pBeloBAC11-spect-SADS-CoV-WT-F7-F10；
S8、将步骤S2中带F11左同源臂和SV40polyA右同源臂的p15A-amp线性片段与步骤S1中得到的F11-F14片段、步骤S4得到的HDVrz片段以及步骤S3中得到的SV40polyA片段进行Gibson组装后转化E. coli GB2005，即得重组载体p15A-amp-SADS-CoV-WT-F11-F14-HDVrz-SV40polyA；
S9、将步骤S6、S7、S8得到的重组载体分别通过载体两端预设的酶切位点切下中间目的片段并回收，随后将这三个回收片段与步骤S2所得的带有CMV左同源臂和SV40polyA右同源臂的pBeloBAC11-cm线性片段进行Gibson组装后转化E. coli DB3.1即得重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA；
S10、将步骤S9所得重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA通过预设的酶切位点切去amp-ccdB并回收，随后将回收片段与步骤S1所得F4片段进行Gibson组装后转化E. coli GB2005，即得重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA。
采用上述技术方案的有益效果为：
本发明选用真核表达常用的CMV启动子，其多应用于表达外源基因，且较容易通过PCR扩增得到，而添加了Intron的CMV+Intron相较于单独的CMV启动子可以大大提高转录效率，从而增强表达。
为了确保克隆的高保真性，在同源重组的每一步过程中都要进行PCR测序鉴定，以确保得到的是无突变的目的片段，尤其是同源臂部分，需要通过PCR验证在同源重组过程中是否发生碱基突变。另外，为了提高同源重组和阳性克隆筛选效率，减少碱基突变，本发明采用了两次重组得到全长感染性克隆的方式，先将4-6个小片段重组成一个较大的片段，测序筛选出序列完全正确的克隆后再重组为全长克隆。
一种含有上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体的重组菌。
上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，或重组菌在猪急性腹泻综合征冠状病毒拯救、非疾病治疗目的的猪急性腹泻综合征冠状病毒的致病机理和致病力研究以及制备猪急性腹泻综合征冠状病毒疫苗中的应用。
上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，或重组菌在抗猪急性腹泻综合征冠状病毒药物筛选中的应用。
一种重组猪急性腹泻综合征冠状病毒，包括上述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，以及表达SADS-CoV结构蛋白N的pCI载体的辅助质粒pCI-amp-SADS-CoV-N。
进一步地，辅助质粒pCI-amp-SADS-CoV-N由含SADS-CoV结构基因N同源臂的pCI-amp载体线性片段与SADS-CoV结构基因N片段通过Gibson组装后转化E. coli GB2005获得。
进一步地，含SADS-CoV结构基因N同源臂的pCI载体线性片段与SADS-CoV结构基因N片段通过SEQ ID NO.104~107所示的引物扩增得到。
进一步地，重组猪急性腹泻综合征冠状病毒中可缺失和/或替换SADS-CoV中的ORF3a、ORF7a和ORF7b中的至少一个基因。
进一步地，缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：
（1）利用SEQ ID NO：108~114所示的引物，通过PCR将同源臂加载到amp-ccdB两端得到两端分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的筛选标记片段；
（2）利用SEQ ID NO：115~121所示的引物，通过PCR将同源臂加载到插入片段两端得到两端分别带有相应插入位置同源臂的目的基因片段；
（3）将步骤（1）的线性片段与pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA感染性克隆通过DNA同源重组工程进行线环重组；
（4）利用预设的酶切位点切去amp-ccdB筛选标记片段，并与步骤（2）所得目的基因片段体外进行Gibson组装后即得到部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b基因的重组质粒和重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。
进一步地，上述缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：
S1、通过SEQ ID NO：108~114所示的引物进行PCR扩增，将ORF3a(all)、ORF3a(part)、ORF7a/b同源臂加载到amp-ccdB两端得到两端分别带有ORF3a(all)、ORF3a(part)、ORF7a/b同源臂的amp-ccdB筛选标记片段；
S2、通过SEQ ID NO：115~121所示的引物进行PCR扩增，将ORF3a同源臂加载到ORF3a(part)两端，将ORF7a/b同源臂加载到ORF7a、ORF7b、ORF7a/b-58bp片段两端得到两端分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的目的基因片段；
S3、将S1的片段分别与SADS-CoV感染性克隆pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA在大肠杆菌GB08-red-gyrA462感受态中通过DNA同源重组工程进行线环重组，得到重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(all)-amp-ccdB、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(part)-amp-ccdB、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-amp-ccdB；
S4、通过amp-ccdB两端预设的AscI酶切位点将其切去并乙醇沉淀回收片段。将pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(all)-amp-ccdB的回收片段在体外进行Gibson组装后转化E. coli GB2005；将S2所得的目的片段ORF3a(part)与pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(part)-amp-ccdB回收片段在体外进行Gibson组装后转化E. coli GB2005；ORF7a、ORF7b、ORF7a/b-58bp片段分别与pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-amp-ccdB回收片段Gibson组装，得到重组病毒的感染性克隆pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(all)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(part)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7b、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-58bp。
进一步地，重组猪急性腹泻综合征冠状病毒由荧光报告基因AcGFP分别替换SADS-CoV的ORF3a、ORF7a/b基因得到；所述荧光报告基因AcGFP替换ORF3a基因时在前端插入P2A序列间隔。
进一步地，替换ORF3a或ORF7a/b基因的荧光报告基因重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：
（1）利用SEQ ID NO：123~126所示的引物，通过PCR将同源臂加载到amp-ccdB两端得到两端分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的筛选标记片段；
（2）利用SEQ ID NO：127~131所示的引物，通过PCR将同源臂加载到AcGFP两端得到两端分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的荧光报告基因片段；
（3）将步骤（1）的线性片段与pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA感染性克隆通过DNA同源重组工程进行线环重组；
（4）利用预设的酶切位点切去amp-ccdB筛选标记片段，与步骤（2）所得荧光报告基因片段通过Gibson组装得到替换ORF3a或ORF7a/b基因的荧光报告基因重组质粒和重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。
上述替换ORF3a或ORF7a/b基因的荧光报告基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒的构建方法，包括以下步骤：
S1、通过SEQ ID NO：123~126所示的引物进行PCR扩增，将ORF3a、ORF7a/b同源臂加载到amp-ccdB两端得到两端分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的amp-ccdB筛选标记片段；
S2、通过SEQ ID NO：127~131所示的引物进行PCR扩增，将ORF3a和ORF7a/b同源臂分别加载到AcGFP两端，同时在ORF3a左同源臂后加入P2A序列；
S3、将S1的片段分别与SADS-CoV感染性克隆pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA在大肠杆菌GB08-red-gyrA462感受态中通过DNA同源重组工程进行线环重组，得到重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a-amp-ccdB、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-amp-ccdB；
S4、通过amp-ccdB两端预设的AscI酶切位点将其切去并乙醇沉淀回收片段。将pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a-amp-ccdB的回收片段与S2所得的带ORF3a同源臂和P2A序列的AcGFP片段在体外进行Gibson组装并转化E. coli GB2005；将pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-amp-ccdB回收片段与S2所得的带ORF7a/b同源臂的AcGFP片段重组，得到重组病毒的感染性克隆pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a-AcGFP(P2A)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-AcGFP。
采用上述技术方案的有益效果为：
本发明选择将构建好的SADS-CoV病毒BAC作为插入外源基因的载体，是由于SADS-CoV病毒载体的ORF3a和ORF7a/b两个辅助蛋白基因位置均可以成功插入并表达大小接近1kb的外源基因，理论上允许2个外源基因片段的同时插入，但是为了保证本发明相关的所有外源基因都能成功插入到SADS-CoV病毒载体上，且外源基因都能够成功表达，至少还需要克服以下困难：
（1）由于SADS-CoV的ORF3a与S基因表达框有部分重合，因此在ORF3a位置插入外源基因时为了不干扰到S基因只能选择在ORF3a内部插入，这就需要在ORF3a与插入的外源基因序列之间加入一个间隔序列以使得重组病毒能够单独表达出插入的外源基因的产物（例如蛋白）；（2）外源基因插入位点的选择：前期研究发现，外源基因的插入位点显著影响外源基因的表达效率。
本发明通过引入间隔序列2A 核糖体跳跃序列（P2A ribosomal skippingsequence），即可在ORF3a和外源基因序列之间引入P2A序列以实现外源基因蛋白的独立表达，并通过将荧光报告基因替换入选用的位点来验证其是否可以有效表达外源基因。
常用的2A核糖体跳跃序列来自猪Teschovirus-1（P2A）、口蹄疫病毒（F2A）、Thoseaasigna病毒（T2A）和马鼻炎A病毒（E2A）。所有短18~22 AA肽，介导核糖体在c末端甘氨酸和脯氨酸之间跳跃，从而产生分离的多肽。
本发明的有益效果：
1、传统的构建冠状病毒感染性克隆的方法多为通过在体外反应体系中利用限制性内切酶和DNA连接酶获得重组DNA分子，该方法需要寻找合适的酶切位点方可实现片段的无痕连接，但该方法操作繁琐费时。且冠状病毒基因组较大，是已知基因组最大的RNA病毒，构建全长感染性克隆时需连接的片段较多。因此，本发明利用Gibson组装快速高效地克隆冠状病毒基因组到BAC载体。
另外，重组所需各片段均为PCR获得，经过一次重组得到全长感染性克隆的突变概率较大，加大筛选正确阳性克隆的难度，因此，本发明通过两次重组得到SADS-CoV全长感染性克隆，且通过amp-ccdB替换病毒毒性序列，防止毒性片段的存在干扰重组，这样在方便快速构建得到SADS-CoV全长感染性克隆的同时也可以减少测序成本并提高重组效率和筛选成功率。
2、常规重组病毒外源基因的替换多需借助酶切位点和限制性内切酶的应用，但冠状病毒因为基因组较大，测序较为繁琐，因此使用常规的外源基因替换方法受限较多。本发明考虑到SADS-CoV基因组这一特点，采用了DNA同源重组工程和反向筛选操作系统相结合的方法进行外源基因的替换。该方法可以快速完成病毒基因的无痕操作以及外源基因的插入。
3、SADS-CoV基因组可在2周内克隆到大肠杆菌BAC载体中，这种方法绕过了繁琐且耗时的酶切连接和阳性克隆筛选过程；且病毒BAC在大肠杆菌中稳定复制，可通过 DNA同源重组工程和反向筛选操作系统非常方便地进行进一步的基因操作。
4、本发明成功构建了5种部分或全部缺失辅助蛋白NS3a或NS7a或NS7b基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒感染性克隆。
5、本发明构建的pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA感染性克隆的ORF3a和ORF7a/b基因位置可成功表达外源基因。
附图说明
图1 为本发明实施SADS-CoV全长感染性克隆构建的示意图；
图2为本发明用于构建SADS-CoV全长感染性克隆所需片段的PCR扩增图；泳道1~14分别为片段F1~F14，泳道15~18为带有CMV左同源臂和F6右同源臂的pBeloBAC11-spect片段，泳道19~21为带有F7左同源臂和F10右同源臂的pBeloBAC11-spect片段，泳道22~24为带有F11左同源臂和SV40polyA右同源臂的p15A-amp片段，泳道25~28为带有CMV左同源臂和SV40polyA右同源臂的pBeloBAC11-cm片段，泳道29~30为带有F1左同源臂的CMV+Intron片段，泳道31~32为带有HDVrz右同源臂的SV40polyA片段，泳道33~34为带有F3右同源臂和F5左同源臂的amp-ccdB片段；
图3为本发明构建SADS-CoV全长感染性克隆过程中的酶切鉴定图；其中，泳道1~8为pBeloBAC11-spect-CI-SADS-CoV-WT-F1-F6-△F4-amp-ccdB的PvuII酶切鉴定，泳道9~16为pBeloBAC11-spect-SADS-CoV-WT-F7-F10的PstI酶切鉴定，泳道17~19为p15A-amp-SADS-CoV-WT-F11-F14-HDVrz-SV40polyA的EcoRV酶切鉴定，泳道20~23为pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA的XmnI酶切鉴定，泳道24~30为pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA的XmnI酶切鉴定；
图4为本发明表达SADS-CoV结构蛋白N的辅助质粒的构建示意图；
图5为本发明构建表达SADS-CoV结构蛋白N的辅助质粒的BanI酶切鉴定图；其中，泳道1为辅助质粒pCI-SADS-N；
图6为本发明部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b的重组质粒的构建示意图；
图7为本发明部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b的重组质粒的PstI酶切鉴定图；其中，泳道1~6分别表示质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(all)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(part)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7b、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-58bp；
图8为本发明部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b的重组质粒的PCR鉴定图；其中，泳道1~7分别表示质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA的ORF3a位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA的ORF7a/b位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(all) 的ORF3a位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(part) 的ORF3a位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a的ORF7a/b位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7b的ORF7a/b位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-58bp的ORF7a/b位置；
图9为本发明在ORF3a和ORF7a/b表达荧光报告基因的重组质粒的构建示意图；
图10为本发明在ORF3a和ORF7a/b表达荧光报告基因的重组质粒的PstI酶切鉴定图；其中，泳道1~3分别表示质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA 、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a-AcGFP(P2A)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-AcGFP；
图11为本发明在ORF3a和ORF7a/b表达荧光报告基因的重组质粒的PCR鉴定图；其中，泳道1~4分别表示质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA的ORF3a位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA的ORF7a/b位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a-AcGFP(P2A)的ORF3a位置、质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-AcGFP的ORF7a/b位置；
图12为拯救病毒接种Vero细胞12h病变图；
图13为替换入荧光报告基因的重组病毒F3代荧光蛋白表达检测图；
图14为SADS-CoV重组病毒F5代PCR检测图； 其中，1~9泳道均分别对应病毒rSADS-CoV-WT的ORF3a位置、病毒rSADS-CoV-WT的ORF7a/b位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF3a(all)的ORF3a位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF3a(part) 的ORF3a位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF7a的ORF7a/b位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF7b的ORF7a/b位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF7a/b-58bp的ORF7a/b位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF3a-AcGFP(P2A)的ORF3a位置、病毒rSADS-CoV-WT-△ORF7a/b-AcGFP的ORF7a/b位置；
图15为表达荧光蛋白的拯救病毒连续于IPI-2I细胞上传代15代后目的基因的PCR扩增图和荧光蛋白的表达检测图；A代表对rSADS-CoV-WT-△ORF3a-AcGFP(P2A)的ORF3a位置进行检测，泳道1~6分别对应检测病毒rSADS-CoV-WT-△ORF3a-AcGFP(P2A)的F3、F6、F9、F12、F15以及对照病毒rSADS-CoV-WT的F15；B代表对rSADS-CoV-WT-△ORF7a/b-AcGFP的ORF7a/b位置进行检测，泳道1~6分别对应检测病毒rSADS-CoV-WT-△ORF7a/b-AcGFP的F3、F6、F9、F12、F15以及对照病毒rSADS-CoV-WT的F15；C代表对插入SADS-CoV ORF3a和ORF7a/b位置的荧光蛋白表达进行检测。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1 SADS-CoV全长感染性克隆的构建
引物设计原则：设计引物时在载体pBeloBAC11-cm的两端预设NotI和ApaI酶切位点，在载体pBeloBAC11-spect(F1-F6)的两端预设NotI和XbaI酶切位点，在载体pBeloBAC11-spect(F7-F10)的两端预设EcoRV酶切位点，在载体p15A-amp(F11-F14)的两端预设EcoRV酶切位点。在各个扩增引物序列之间设计同源臂，引物之间有30~60bp的重叠，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物具体序列如SEQ ID NO.1~42所示。
PCR扩增程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，45~60 ℃ 5 s，72 ℃ 5~90 s（根据目的片段大小，延伸速度10 s/kb），设定32个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存。
PCR扩增反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 25 μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.5 μL，模板 0.5 μL，加ddH2O补齐至50 μL。
通过PCR扩增得到构建SADS-CoV全长感染性克隆所需线性片段。上述得到的所有线性片段进行胶回收备用。
胶回收扩增产物：将各PCR产物放置于1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳仪上的电压与时间分别设置为125 V，30 min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外灯照射下，小心切下目的片段条带处的凝胶，并将其放置于已灭菌处理的2 mL EP管中，按照胶回收试剂盒（TIANGEN，DP214-03）说明书回收DNA片段。
1、病毒基因组各分片段的制备
以SEQ ID NO.13~40给出的引物（依次为引物SADS-CoV-F1-F、SADS-CoV-F1-R、SADS-CoV-F2-F、SADS-CoV-F2-R、SADS-CoV-F3-F、SADS-CoV-F3-R、SADS-CoV-F4-F、SADS-CoV-F4-R、SADS-CoV-F5-F、SADS-CoV-F5-R、SADS-CoV-F6-F、SADS-CoV-F6-R、SADS-CoV-F7-F、SADS-CoV-F7-R、SADS-CoV-F8-F、SADS-CoV-F8-R、SADS-CoV-F9-F、SADS-CoV-F9-R、SADS-CoV-F10-F、SADS-CoV-F10-R、SADS-CoV-F11-F、SADS-CoV-F11-R、SADS-CoV-F12-F、SADS-CoV-F12-R、SADS-CoV-F13-F、SADS-CoV-F13-R、SADS-CoV-F14-F、SADS-CoV-F14-R），通过PCR扩增得到F1-F14共14段覆盖SADS-CoV基因组的片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
2、载体及表达组件片段的制备
以SEQ ID NO.1~12给出的引物（依次为引物BAC-cm-SADS-CoV-F、BAC-cm-SADS-CoV-R、BAC-SPEC-1-6-F、BAC-SPEC-1-6-R、BAC-SPEC-7-10-F、BAC-SPEC-7-10-R、P15A-amp-11-14-F、P15A-amp-11-14-R、SADS-CMV+Intron-F、SADS-CMV+Intron-R、SADS-CoV-SV40polyA-F、SADS-CoV-SV40 polyA-R），通过PCR扩增得到pBeloBAC11-cm、pBeloBAC11-spect(F1-F6)、pBeloBAC11-spect(F7-F10)、p15A-amp(F11-F14)、CMV+Intron、SV40polyA片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
另外，通过全基因合成制备得到HDVrz片段，水溶干粉备用。
3、其他线性片段的制备
利用SEQ ID NO.41和42的引物（包括引物△F4-amp-ccdB-F、△F4-amp-ccdB-R）扩增得到片段△F4-amp-ccdB，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
4、第一次重组所得中间载体的构建
（1）pBeloBAC11-spect-CI-SADS-CoV-WT-F1-F6-△F4-amp-ccdB
将步骤1、2、3扩增所得片段pBeloBAC11-spect(F1-F6)、CMV+Intron、F1、F2、F3、F5、F6、△F4-amp-ccdB经Gibson组装后转化E. coli DB3.1得到pBeloBAC11-spect-CI-SADS-CoV-WT-F1-F6-△F4-amp-ccdB，扩增后每个片段两端均带有同源臂。
（2）pBeloBAC11-spect-SADS-CoV-WT-F7-F10
将步骤1、2扩增所得片段pBeloBAC11-spect(F7-F10)、F7、F8、F9、F10经Gibson组装后转化E. coli GB2005得到pBeloBAC11-spect-SADS-CoV-WT-F7-F10，扩增后每个片段两端均带有同源臂。
（3）p15A-amp-SADS-CoV-WT-F11-F14
将步骤1、2扩增/合成所得片段p15A-amp(F11-F14)、F11、F12、F13、F14、HDVrz、SV40polyA经Gibson组装后转化E. coli GB2005中得到p15A-amp-SADS-CoV-WT-F11-F14，扩增后每个片段两端均带有同源臂。
（4）中间载体的制备具体过程为：
a、将上述所需的胶回收或合成得到的各个线性片段先用T4聚合酶进行连接处理，PCR程序为：25 ℃ 60 min；75 ℃ 20 min；50 ℃ 30 min；4 ℃保存。PCR体系：T4聚合酶0.13 μL，T4 Buffer 2.1 2 μL，各线性片段 200 ng，ddH2O补齐至20 μL。T4聚合酶处理后，将PCR产物过除盐膜，进行除盐30 min；
b、同时制备E. coli DB3.1和E. coli GB2005感受态。前一天于平板挑取单克隆菌落于含1 mL LB培养基的1.5 mL 离心管中，30 ℃ 950 rpm过夜培养。取扩摇好的70 μL菌液转接于含1.3 mL LB培养基的1.5 mL 离心管中，30 ℃ 950 rpm 扩摇2 h。添加35 μL的L-Arabinaose诱导重组酶的表达，30 ℃ 950 rpm 摇菌40 min；9500 rpm离心1 min收集菌体，1 mL ddH2O 9600 rpm，离心1 min，弃上清；1 mL ddH2O 9700 rpm，离心1 min，弃废液得到所需菌体。
c、将除盐后的PCR产物加入菌体中，吹打均匀后，将其加入处理好的电转杯，1350V电转。向电转杯中加入1 mL LB培养基，轻轻吹打均匀后转移至新的1.5 mL离心管，30 ℃950 rpm复苏1 h。再将其置于离心机中，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬菌体，划线并涂布在分别含spect+amp、spect和amp抗性的LB平板上。正面朝上放置在30℃培养箱中1 h后，翻板，过夜培养18~24 h。挑取上述平板中的单菌落分别于1.7 mL含spect+amp、spect和amp抗性LB培养液的2 mL EP管中，30 ℃ 950 rpm 过夜培养。根据TIANGEN试剂盒小提质粒的说明书进行操作，提取质粒。37 ℃酶切2 h，进行凝胶电泳检测，酶切结果符合的PCR测序确认序列，序列符合预期的即构建成功的中间载体质粒。
5、缺失F4的全长重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA的构建
将步骤4构建成功的携带有中间载体质粒的菌分别接菌于100 mL含spect+amp、spect和amp抗性LB培养液的锥形瓶中，30℃ 200 rpm过夜培养。根据TIANGEN试剂盒大提质粒的说明书进行操作，提取质粒。分别使用NotI+XbaI、EcoRV、EcoRV于37 ℃酶切2 h切除载体片段，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀得到切除了载体的CI-F1-F6-△F4-amp-ccdB、F7-F10和F11-F14-HDVrz-SV40polyA线性化片段。将上述沉淀所得片段CI-F1-F6-△F4-amp-ccdB、F7-F10和F11-F14-HDVrz-SV40polyA与步骤2扩增所得片段pBeloBAC11-cm经Gibson组装后转化E. coli DB3.1感受态中得到缺失F4的全长重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA。
载体的制备具体过程同步骤4。
6、全长重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-HDVrz-SV40polyA的构建
将步骤5构建成功的携带有中间载体质粒的菌接菌于100 mL含cm+amp抗性LB培养液的锥形瓶中，30℃ 200 rpm过夜培养。根据TIANGEN试剂盒大提质粒的说明书进行操作，提取质粒。使用AscI于37 ℃酶切2 h切除amp-ccdB片段，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀得到切除了amp-ccdB的pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-HDVrz-SV40polyA线性化片段。将上述沉淀所得片段pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-HDVrz-SV40polyA与步骤1扩增所得片段F4经Gibson组装后转化E. coli GB2005得到全长重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-HDVrz-SV40polyA。
载体的制备具体过程同步骤4。
上述SADS-CoV全长感染性克隆的构建示意图如图1所示。上述PCR扩增的结果如图2所示。上述构建得到的质粒的酶切结果如图3所示。上述SADS-CoV载体 PCR验证及测序使用引物如SEQ ID NO.43~103所示。
PCR程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，设定32个循环；72℃延伸10 min，4 ℃ 保存。PCR体系：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 15 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，模板 1 μL，加ddH2O补齐至30 μL。
实施例2 表达SADS-CoV结构蛋白N的辅助质粒的构建
设计引物时分别在各个扩增引物序列之间设计同源臂，引物之间有30~60bp的重叠，引物具体序列如SEQ ID NO.104~107所示，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
PCR扩增程序：同实施例1。
PCR扩增反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 25 μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.5 μL，模板 0.5 μL，加ddH2O补齐至50 μL。
胶回收扩增产物：将各PCR产物放置于1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳仪上的电压与时间分别设置为125 V，30 min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外灯照射下，小心切下目的片段条带处的凝胶，并将其放置于已灭菌处理的2 mL EP管中，按照胶回收试剂盒（TIANGEN，DP214-03）说明书回收DNA片段。
1、线性片段的扩增
a、pCI-amp载体片段的制备
以SEQ ID NO.104和105所示的引物（包括引物pCI-amp-F、pCI-amp-R），以酶切线性化后的pCI-amp-neo质粒为模板，通过PCR扩增得到带有SADS-CoV N基因同源臂的pCI-amp载体片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
b、SADS-CoV-N基因片段的制备
以SEQ ID NO.106和107的引物（包括引物SADS-COV-N-F、SADS-CoV-N-R），以SADS-CoV核酸逆转录所得cDNA为模板，扩增得到N基因片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
2、表达SADS-CoV结构蛋白N的辅助质粒的构建
将步骤1所得片段pCI-amp和SADS-CoV-N经Gibson组装后转化E. coli GB2005，随后挑单菌落进行酶切和测序验证，挑选其中正确的单克隆即得到表达SADS-CoV结构蛋白N的辅助质粒pCI-amp-SADS-CoV-N。
上述表达SADS-CoV结构蛋白N的辅助质粒的构建示意图如图4所示。上述辅助质粒的酶切鉴定图如图5所示。
实施例3 部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b位置的重组质粒的构建
引物设计原则：设计引物时在amp-ccdB的两端预设AscI酶切位点。在各个扩增引物序列之间设计同源臂，引物之间有30~60bp的重叠，引物具体序列如SEQ ID NO.108~121所示，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
PCR扩增程序：同实施例1。
PCR扩增反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 25 μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.5 μL，模板 0.5 μL，加ddH2O补齐至50 μL。
胶回收扩增产物：将各PCR产物放置于1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳仪上的电压与时间分别设置为125 V，30 min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外灯照射下，小心切下目的片段条带处的凝胶，并将其放置于已灭菌处理的2 mL EP管中，按照胶回收试剂盒（TIANGEN，DP214-03）说明书回收DNA片段。
1、线性片段的扩增
a、amp-ccdB片段的制备
以SEQ ID NO.108~141所示的引物（依次为引物△NS3a(all)-ampccdB-F、△NS3a(all)-ampccdB-R、△NS3a(part)-ampccdB-F、△NS3a(part)-ampccdB-R、△NS7a/b-ampccdB-F、△NS7a/b-58bp-ampccdB-F、△NS7-ampccdB-R），通过PCR扩增得到分别带有ORF3a(all)、ORF3a(part)、ORF7a/b、ORF7a/b-58bp同源臂的amp-ccdB片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
b、ORF3a/ORF7a/ORF7b缺失后基因片段的制备
以SEQ ID NO.115~119所示的引物（依次为引物△NS3a(part)-F、△NS3a(part)-R、△NS7a-F、△NS7b-F、△NS7-R），以SADS-CoV 10代毒核酸逆转录所得cDNA为模板，扩增得到缺失部分序列的ORF3a（参照PEDV CV777的缺失）、缺失ORF7a的ORF7a/b（点突变缺失起始密码子）、缺失ORF7b的ORF7a/b（点突变缺失起始密码子）；以SEQ ID NO.120和121所示的引物（包括引物△NS7a/b-58bp-F、△NS7a/b-58bp-R），以SADS-CoV 83代毒核酸逆转录所得cDNA为模板，扩增缺失58bp的ORF7a/b（于Vero细胞连续传代产生的自然缺失），经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
2、大肠杆菌GB08-red-gyrA462感受态的制备
接种大肠杆菌GB08-red-gyrA462于1 mL的LB培养基中，30 ℃ 950 rpm过夜培养。第二天转接70ul至新的含1.3 mL LB培养基1.5 mL EP管中，于30 ℃ 950 rpm 扩摇2 h。9500 rpm离心1 min收集菌体，1 mL ddH2O 9600 rpm，离心1 min，弃上清；1 mL ddH2O 9700rpm，离心1 min，弃废液得到制备的感受态。
3、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA质粒重转化于E. coliGB08-red-gyrA462感受态
将200 ng pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA质粒加入GB08-red-gyrA462感受态中，轻柔吹打混合均匀后转移至电转杯中，1350 V电转。30 ℃ 950 rpm复苏1 h，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬菌体。取50 μL重悬后的菌液，划线并涂布在含cm抗性的LB平板上。正面朝上放置在30 ℃培养箱中1 h后，倒置，过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证。
4、amp-ccdB替换ORF3a和ORF7a/b位置的基因
过夜培养前一步中酶切验证正确的单克隆，转接后30 ℃ 950 rpm 摇菌2 h。添加35 μL L-Arabinaose诱导40 min后离心收集菌体，清洗菌体。分别加入200 ng步骤1制备得到的用于缺失SADS-CoV基因组上ORF3a(all)、ORF3a(part)、ORF7a/b、ORF7a/b-58bp基因的amp-ccdB片段，1350 V电转后，30 ℃ 950 rpm复苏1 h，收集菌体重悬，涂布于cm+amp抗性的LB平板上，30 ℃过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，PCR验证。
5、利用ccdB反向筛选获得缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b的重组质粒
将步骤4构建得到的带有含amp-ccdB质粒的菌分别接菌于100 mL含cm+amp抗性LB培养液的锥形瓶中，30℃ 200 rpm过夜培养。根据TIANGEN试剂盒大提质粒的说明书进行操作，提取质粒。使用AscI于37 ℃酶切2 h切除amp-ccdB，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀得到切除了amp-ccdB的线性化片段。将上述沉淀所得片段与步骤1扩增所得相应片段经体外Gibson组装后转化E. coli GB2005得到部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b的重组质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(all)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a(part)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7b、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-58bp（△ORF3a(all)质粒仅沉淀所得片段自身重组）。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，PCR验证。
上述PCR验证及测序使用引物如SEQ ID NO.91、92、122和100所示。
PCR程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，设定32个循环；72℃延伸10 min，4 ℃ 保存。PCR体系：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 15 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，模板 1 μL，加ddH2O补齐至30 μL。
部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b位置的重组质粒的构建示意图如图6所示。部分或全部缺失ORF3a或ORF7a或ORF7b位置的重组质粒的酶切分析和PCR扩增图如图7和图8所示。
实施例4 ORF3a或ORF7a/b位置表达荧光报告基因的重组质粒的构建
引物设计原则：设计引物时在amp-ccdB的两端预设AscI酶切位点。在各个扩增引物序列之间设计同源臂，引物之间有30~60bp的重叠，引物由SEQ ID NO.123~131所示，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
PCR扩增程序：同实施例1。
PCR扩增反应体系为：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 25 μL，上下游引物(10pmol/μL)各0.5 μL，模板 0.5 μL，加ddH2O补齐至50 μL。
胶回收扩增产物：将各PCR产物放置于1%琼脂糖凝胶上电泳，电泳仪上的电压与时间分别设置为125 V，30 min。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外灯照射下，小心切下目的片段条带处的凝胶，并将其放置于已灭菌处理的2 mL EP管中，按照胶回收试剂盒（TIANGEN，DP214-03）说明书回收DNA片段。
1、线性片段的扩增
a、amp-ccdB片段的制备
以SEQ ID NO.123~126所示的引物（依次为引物△NS3a(GFP)-ampccdB-F、△NS3a(GFP)-ampccdB-R、△NS7a/b(GFP)-ampccdB-F、△NS7a/b(GFP)-ampccdB-R），通过PCR扩增得到分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的amp-ccdB片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用。
b、荧光报告基因AcGFP片段的制备
以SEQ ID NO.127~131所示的引物（依次为引物△NS3a(P2A)-GFP-F1、△NS3a(P2A)-GFP-F2、△NS3a-GFP-R、△NS7a/b-GFP-F、△NS7a/b-GFP-R），以pAcGFP1-C1载体为模板，扩增得到分别带有ORF3a、ORF7a/b同源臂的荧光报告基因AcGFP片段，经凝胶电泳后，胶回收线性片段备用（带有ORF3a同源臂的AcGFP序列前加P2A序列，因此需要使用两条不同的上游引物PCR两次）。
2、大肠杆菌GB08-red-gyrA462感受态的制备
接种大肠杆菌GB08-red-gyrA462于1 mL的LB培养基中，30 ℃ 950 rpm过夜培养。第二天转接70ul至新的含1.3 mL LB培养基1.5 mL EP管中，于30 ℃ 950 rpm 扩摇2 h。9500 rpm离心1 min收集菌体，1 mL ddH2O 9600 rpm，离心1 min，弃上清；1 mL ddH2O 9700rpm，离心1 min，弃废液得到制备的感受态。
3、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA质粒重转化于E. coliGB08-red-gyrA462感受态
将200 ng pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA质粒加入GB08-red-gyrA462感受态中，轻柔吹打混合均匀后转移至电转杯中，1350 V电转。30 ℃ 950 rpm复苏1 h，10000 rpm离心1 min，弃上清，重悬菌体。取50 μL重悬后的菌液，划线并涂布在含cm抗性的LB平板上。正面朝上放置在30 ℃培养箱中1 h后，倒置，过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证。
4、amp-ccdB替换ORF3a和ORF7a/b位置的基因
过夜培养前一步中酶切验证正确的单克隆，转接后30 ℃ 950 rpm 摇菌2 h。添加35 μL L-Arabinaose诱导40 min后离心收集菌体，清洗菌体。分别加入200 ng步骤1制备得到的用于缺失SADS-CoV基因组上ORF3a、ORF7a/b基因的amp-ccdB片段，1350 V电转后，30℃ 950 rpm复苏1 h，收集菌体重悬，涂布于cm+amp抗性的LB平板上，30 ℃过夜培养。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，PCR验证。
5、利用ccdB反向筛选获得表达荧光报告基因AcGFP的重组质粒
将步骤4构建得到的带有含amp-ccdB质粒的菌分别接菌于100 mL含cm+amp抗性LB培养液的锥形瓶中，30℃ 200 rpm过夜培养。根据TIANGEN试剂盒大提质粒的说明书进行操作，提取质粒。使用AscI于37 ℃酶切2 h切除amp-ccdB，通过酚氯仿抽提和乙醇沉淀得到切除了amp-ccdB的线性化片段。将上述沉淀所得片段与步骤1扩增所得带有相应同源臂的AcGFP片段经体外Gibson组装后转化E. coli GB2005得到ORF3a或ORF7a/b位置表达荧光报告基因的重组质粒pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF3a-AcGFP(P2A)、pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA-△ORF7a/b-AcGFP。挑取单菌落，小提质粒，进行酶切验证，PCR验证。
上述PCR验证及测序使用引物如SEQ ID NO.91、92、122和100所示。
PCR程序：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s，设定32个循环；72℃延伸10 min，4 ℃ 保存。PCR体系：PrimeSTAR Max DNA Polymearse 15 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，模板 1 μL，加ddH2O补齐至30 μL。
ORF3a或ORF7a/b位置表达荧光报告基因重组质粒的构建示意图如图9所示。ORF3a或ORF7a/b位置表达荧光报告基因重组质粒的酶切分析和PCR扩增图如图10和图11所示。
实施例5 重组质粒的病毒拯救
1、试剂盒提取质粒：将构建好的重组质粒接种于200 mL的培养基中，过夜培养，使用Aidlab BAC/PAC大型质粒提取试剂盒提取质粒。
2、重组质粒与辅助质粒共转染于Vero细胞：检测重组质粒和辅助质粒的浓度后，使用Lipofectamin 3000试剂盒(Lipofectamine®3000 Reagent 购自 invitogen 公司)进行转染试验。
3、拯救病毒传代培养：将转染后获得的病毒液于Vero细胞上传代培养。待Vero细胞长满后，弃上清，PBS清洗两遍，加入病毒液及含8ug/mL胰酶的DMEM培养液，摇晃均匀，37℃，5% CO2培养箱孵育1 h，后弃掉上清，重新加入适量含8ug/mL胰酶的DMEM培养液，接毒后48 h收毒，放置在-80℃冰箱中冻融一次，收取病毒液，按此方法进行病毒传代培养，观察病毒病变情况，其代次依次记为F1、F2和F3等。重组病毒分别命名为rSADS-CoV-WT、rSADS-CoV-WT-△ORF3a(all)、rSADS-CoV-WT-△ORF3a(part)、rSADS-CoV-WT-△ORF7a、rSADS-CoV-WT-△ORF7b、rSADS-CoV-WT-△ORF7a/b-58bp、rSADS-CoV-WT-△ORF3a-AcGFP(P2A)、rSADS-CoV-WT-△ORF7a/b-AcGFP。
4、拯救病毒的荧光/PCR检测：连续传代后出现稳定病变，细胞膜融合呈合胞体，且出现空泡（图12）。替换入荧光报告基因的重组病毒同时检测荧光蛋白的表达验证替换修饰的成功，结果见图13。将拯救成功的重组病毒以0.1MOI的剂量接毒Vero和IPI-2I细胞，接毒后24小时于荧光倒置显微镜观察荧光蛋白的表达情况，结果符合预期，替换了荧光报告基因的重组病毒均表达了相应的荧光蛋白，说明各重组病毒均为成功替换了荧光报告基因的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒。同时，冻融接毒样品后收取上清液，使用AxyPrep体液病毒DNA/RNA小量试剂盒（Axygen公司产品）提取重组病毒的RNA，反转录为cDNA后设计引物进行PCR检测，检测重组病毒的ORF3a或ORF7a/b基因，结果见图14。各泳道结果均符合预期，且不同于未经修饰的拯救病毒rSADS-CoV-WT，说明经过对ORF3a或ORF7a/b位置基因进行缺失或替换修饰操作后，该位置均成功进行相应操作。PCR检测引物序列如SEQ ID NO.91、92、122和98所示，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
5、插入外源基因拯救病毒的稳定性评价：将拯救病毒持续传代，于IPI-2I细胞上连续传代15代，观察其病变情况，通过PCR和荧光倒置显微镜观察荧光蛋白表达情况鉴定目的基因是否稳定存在。其中，PCR检测引物序列如SEQ ID NO.91、92、122和98所示，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
PCR扩增及荧光表达结果见图15，图中，A代表对SADS-CoV的ORF3a位置进行检测，可以看出F15代重组病毒均具有与F3代相同的条带，且目的片段大小符合预期，说明在ORF3a位置，插入的荧光报告基因AcGFP能稳定存在。B代表对SADS-CoV的ORF7a/b位置进行检测，可以看出F15代重组病毒均具有与F3代相同的条带，且目的片段大小符合预期，说明在ORF7a/b位置，插入的荧光报告基因AcGFP能稳定存在。C代表对插入SADS-CoV ORF3a和ORF7a/b位置的荧光蛋白进行检测，可以看出F3和F15代重组病毒均观察到较明显的荧光，说明在ORF3a和ORF7a/b位置插入的荧光报告基因能稳定存在。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用
<160> 131
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagatgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta gcggccgcgg 60
gcccctctag agtcgacctg cagg 84
<210> 2
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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tgcagg 66
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctatataacc aatgaataat atggctaatg gccaatattg agcggccgcg ggccccgggt 60
accgagctcg aattc 75
<210> 5
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
attaatggat ttatacgtga aaaacttgcg cttggtggcg cgatatcctc tagagtcgac 60
ctgcagg 67
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtttacca gcctgcaacc taacagtagc acctatgtag gatatccggg taccgagctc 60
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<210> 7
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta gatatcgcgg ccgcgcgcta 60
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgccaccaag cgcaagtttt tcacgtataa atccattaat gatatcgcgg ccgcttacca 60
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<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaatattgg ccattagcca tatt 24
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
actctatcgg cagatagatt atatctttaa gtccccatgt cctatagtga gtcgtattaa 60
gt 62
<210> 11
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gacgtcgtcc actcggatgg ctaagggaga gctcggatcc agacatgata agatacattg 60
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
taccacattt gtagaggttt tac 23
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acatggggac ttaaagatat aatc 24
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aacatcagca tcagccataa ac 22
<210> 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtctgatgg ctattatagg 20
<210> 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ttaatatcgg cgtccttaac 20
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aacaccattg acacaatagt tg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gcgtaactac cattacggat aac 23
<210> 19
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<400> 19
cttgtggctt cctcagttgt 20
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tgagcatgcc agtccataaa tg 22
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gttcgcaaca cgtttgacac 20
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gtgctctgta tgttaacacc 20
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gaggttgtta ggcaaatgta tg 22
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tctgtttacc agcctgcaac c 21
<210> 25
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ctacataggt gctactgtta g 21
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<400> 26
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<210> 27
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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acgcacttta cgctatgaca aag 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tagaccaata acacaatgtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gacctcctgg tagtggcaaa tc 22
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gaattaatag gctgtttgtc 20
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gcgccaccaa gcgcaagttt ttc 23
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attaatggat ttatacgtg 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtttaatgc tagttacgca c 21
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tgtgtatcac tgtcaaagaa tc 22
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tctagatgag catgccagtc cataaatgtg tcaaacgtgt tgcgaacggt gtggtagctc 60
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acatggggac ttaaagatat aatc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggcactcgtt attatcgtgt gtg 23
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtaagacaca taatgtgctg ccatc 25
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
actgtagtgg atgctgtgtc g 21
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
caatgttatg tgcaacaatg tcacc 25
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ggcttcctca gttgttatcc gt 22
<210> 56
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cacgcattct gaacctgaga c 21
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttaccgcatc ttttctggtg ac 22
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
caccaggtac aacacgtcca g 21
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gacacattta tggactggca tgc 23
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gcctcattag cgctaccact gt 22
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gagcgtctta tcaatagcac tagt 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
ctactagtct tagtgctctg tatg 24
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tacagagact tgccactggt c 21
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ctattagctg cgatattcat gttgg 25
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ctgatcttaa gtgtgccaat gttg 24
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gcacctctac gcaaattgtt aag 23
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gactattgaa cttgaacctc cattg 25
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
ggatcatacc agaccttgtt atc 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gatgagcgca attgtgagac tct 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
cctattaaga gggtaaccag cac 23
<210> 71
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
gtggtacagc gttattttga gtgc 24
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ggtacggcaa ataataatca ccatc 25
<210> 73
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
tcgaagaaga tttgtctgtc gg 22
<210> 74
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gctcttggtt ggcaatagta gg 22
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
tcactgctaa gcttgttcct gg 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tcttggtgcg tgtaatagca ac 22
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
gtggactctg cgcaaggtag 20
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
acggatatgt gatagaccag tc 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
caggtgacgc tattatgact ag 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gtcaaagcaa gtacacacgt cc 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
gactatgatg ctgacagacc ct 22
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
caacgattat tgcatcgtca gg 22
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
ccactaccat gtgtgttcct c 21
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
ctcataaact gccaccacct ac 22
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
gttctggtgc aggcggctat 20
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
actctcatac agcacaccct g 21
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
cgtttgtgag agtaatcccg aag 23
<210> 88
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gcctagcgtt acagaagcag c 21
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
gctcagtacc ataatggtat acttg 25
<210> 90
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
ataagcagcc actgccacca ag 22
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
gctcataacg tctctaacat gcg 23
<210> 92
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gcatggttca acttccatat aagac 25
<210> 93
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
gatacttgtt ctcttggtgg ct 22
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
gcgtgaggac cagtaccaag 20
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cgacaggtaa aggcactcca g 21
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
gcataacagc acatcataca cag 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
atcctgcttt tcttgaggag gag 23
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
tgtgtatcac tgtcaaagaa tc 22
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
attaagttgg gtaacgccag 20
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
gtgacactat agaatactca agcttg 26
<210> 101
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ggcagtacat ctacgtatta gtcat 25
<210> 102
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gctggtttat tgctgataaa tctgg 25
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
atcctgtatc acatattctg ctga 24
<210> 104
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
tcttgaggag gaggttgaga tggtggatga gattattaat tagttccctt tagtgagggt 60
taatg 65
<210> 105
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
ccgcctgttc aacagcgtca ccccaattaa cagtggccat attcgtttag tcctatagtg 60
agtcg 65
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
atggccactg ttaattgg 18
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
attaataatc tcatccacca tct 23
<210> 108
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
acttcaatca tacgagattg aaaaggtcca cgtccaataa gaaactcaac taaactatgt 60
ttctgaagat tgttgaggat ggcgcgcctc aagaagatcc tttgatct 108
<210> 109
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
atcctcaaca atcttcagaa acatagttta gttgagtttc ggcgcgccgg tgtggtagct 60
cgcgtatt 68
<210> 110
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gaattgctat gtttgtttct aagttgctcg taatctttgc tggcgcgcct caagaagatc 60
ctttgatct 69
<210> 111
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
atcctcaaca atcttcagaa acatagttta gttgagtttc ggcgcgccgg tgtggtagct 60
cgcgtatt 68
<210> 112
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
tgaggaggag gttgagatgg tggatgagat tattaattag ggcgcgcctc aagaagatcc 60
tttgatct 68
<210> 113
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
aaaatctacc cagatttctt gagcaagtct cggcttactc taaacccagt ggcgcgcctc 60
aagaagatcc tttgatct 78
<210> 114
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
taggactcaa tataattata ctctactcat actagcataa ggcgcgccgg tgtggtagct 60
cgcgtatt 68
<210> 115
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
gaattgctat gtttgtttct aagttgctcg taatctttgc tgactatatt gctctctatg 60
gtggtgctg 69
<210> 116
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
catcctcaac aatcttcaga aacatagttt agttgagttt ctcaaacagc accaccatag 60
agagcaata 69
<210> 117
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
tgaggaggag gttgagatgg tggatgagat tattaattag ttcaactaaa catcaaccag 60
cttatctttt tcctgtgtat catctgctgt tatgctattt tttttgat 108
<210> 118
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
tgaggaggag gttgagatgg tggatgagat tattaattag ttcaactaaa catgaaccag 60
cttatctttt tcctgtgtat gatgtgctgt tacgctattt tttttgattg gctt 114
<210> 119
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
taggactcaa tataattata ctctactcat actagcataa ttacgtgctt accattgtgt 60
at 62
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
aaaatctacc cagatttctt gagca 25
<210> 121
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
aaacaaatct gcaaaatctg ccaac 25
<210> 122
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
caagaagcag agctgtctca c 21
<210> 123
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
gacgtggcag aattgctatg tttgtttcta agttgctcgt aatctttgct ggcgcgcctc 60
aagaagatcc tttgatct 78
<210> 124
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
tccttcttac ctctaatagc aacatagagt gagtccttgt gcgcaaattc ggcgcgccgg 60
tgtggtagct cgcgtatt 78
<210> 125
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gaggaggagg ttgagatggt ggatgagatt attaattagt tcaactaaac ggcgcgcctc 60
aagaagatcc tttgatct 78
<210> 126
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
gacctggcaa gcgtaaaaga agagattaaa aagccaatca aaaaaaatag ggcgcgccgg 60
tgtggtagct cgcgtatt 78
<210> 127
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
ggaagcggag ccacgaactt ctctctgtta aagcaagcag gagatgttga agaaaacccc 60
gggcccatgg tgagcaaggg cgccga 86
<210> 128
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
gaattgctat gtttgtttct aagttgctcg taatctttgc tgactatatt gctctctatg 60
gtggtgctgt tggaagcgga gccacgaact tc 92
<210> 129
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
ttacctctaa tagcaacata gagtgagtcc ttgtgcgcaa attcttactt gtacagctca 60
tccatgccg 69
<210> 130
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
aggaggaggt tgagatggtg gatgagatta ttaattagtt caactaaaca tggtgagcaa 60
gggcgccga 69
<210> 131
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
gacctggcaa gcgtaaaaga agagattaaa aagccaatca aaaaaaatag ttacttgtac 60
agctcatcca tgccg 75

Claims (8)

1.一种猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）人工染色体重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、以猪急性腹泻综合征冠状病毒病毒全基因组反转录所得cDNA为模板，利用SEQ IDNO.13~40所示的引物，通过PCR分段扩增得到覆盖整个基因组序列的F1-F14共14个用于后续重组的片段；
S2、以pBeloBAC11-spect、p15A-amp和pBeloBAC11-cm载体为模板，利用SEQ ID NO.1~8所示的引物，通过PCR扩增，将CMV左同源臂和F6右同源臂、F7左同源臂和F10右同源臂、F11左同源臂和SV40polyA右同源臂、CMV左同源臂和SV40polyA右同源臂分别加载到pBeloBAC11-spect、pBeloBAC11-spect、p15A-amp和pBeloBAC11-cm载体的两端，得到带有相邻重组片段同源臂的载体线性片段；
S3、以pCI-neo载体为模板，利用SEQ ID NO.9~12所示的引物，通过PCR扩增，将F1左同源臂、HDVrz右同源臂分别加载到CMV+Intron的右端和SV40polyA的左端，得到带有相邻重组片段同源臂的线性片段；
S4、通过全基因合成得到左端带有F14右同源臂和28个A的HDVrz片段；
S5、以R6k-amp-ccdB质粒为模板，利用SEQ ID NO.41~42所示的引物，通过PCR扩增，将F3右同源臂和F5左同源臂分别加载到amp-ccdB的两端，得到带有相邻重组片段同源臂的线性片段；
S6、将步骤S2中带CMV左同源臂和F6右同源臂的pBeloBAC11-spect线性片段与步骤S1中得到的F1-F3、F5-F6片段、步骤S5中得到的amp-ccdB片段以及步骤S3中得到的CMV+Intron片段进行Gibson组装后转化E. coli DB3.1即得重组载体pBeloBAC11-spect-CI-SADS-CoV-WT-F1-F6-△F4-amp-ccdB；
S7、将步骤S2中带F7左同源臂和F10右同源臂的pBeloBAC11-spect线性片段与步骤S1中得到的F7-F10片段进行Gibson组装后转化E. coli GB2005，即得重组载体pBeloBAC11-spect-SADS-CoV-WT-F7-F10；
S8、将步骤S2中带F11左同源臂和SV40polyA右同源臂的p15A-amp线性片段与步骤S1中得到的F11-F14片段、步骤S4得到的HDVrz片段以及步骤S3中得到的SV40polyA片段进行Gibson组装后转化E. coli GB2005，即得重组载体p15A-amp-SADS-CoV-WT-F11-F14-HDVrz-SV40polyA；
S9、将步骤S6、S7、S8得到的重组载体分别通过载体两端预设的酶切位点切下中间目的片段并回收，随后将这三个回收片段与步骤S2所得的带有CMV左同源臂和SV40polyA右同源臂的pBeloBAC11-cm线性片段进行Gibson组装后转化E. coli DB3.1即得重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA；
S10、将步骤S9所得重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-F1-F14-△F4-amp-ccdB-HDVrz-SV40polyA通过预设的酶切位点切去amp-ccdB并回收，随后将回收片段与步骤S1所得F4片段进行Gibson组装后转化E. coli GB2005，即得重组载体pBeloBAC11-cm-CI-SADS-CoV-WT-HDVrz-SV40polyA。
2.一种如权利要求1所述的方法制备得到的猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体。
3.一种含有权利要求2所述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体的重组菌。
4.权利要求2所述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，或权利要求3所述的重组菌在如下（1）或（2）中的应用：
（1）在猪急性腹泻综合征冠状病毒拯救中的应用；
（2）在制备猪急性腹泻综合征冠状病毒疫苗中的应用。
5.权利要求2所述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，或权利要求3所述的重组菌在抗猪急性腹泻综合征冠状病毒药物的体外筛选中的应用。
6.一种重组猪急性腹泻综合征冠状病毒，其特征在于，包括权利要求2所述猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体，以及表达SADS-CoV结构蛋白N的pCI载体的辅助质粒。
7.根据权利要求6所述的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒，其特征在于，所述重组猪急性腹泻综合征冠状病毒中缺失和/或替换SADS-CoV中的ORF3a、ORF7a和ORF7b中的至少一个基因。
8.根据权利要求6所述的重组猪急性腹泻综合征冠状病毒，其特征在于，所述辅助质粒含SADS-CoV结构基因N同源臂的pCI-amp载体线性片段与SADS-CoV结构基因N片段通过Gibson组装后转化E. coli GB2005获得；所述含SADS-CoV结构基因N同源臂的pCI载体线性片段与SADS-CoV结构基因N片段通过SEQ ID NO.104~107所示的引物扩增得到。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116445528A (zh) * 2023-04-14 2023-07-18 扬州大学 重组猪流行性腹泻病毒感染性克隆的构建方法及其感染性克隆和应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139589A (zh) * 2005-03-08 2008-03-12 浙江大学 表达传染性法氏囊病毒vp2基因编码蛋白永生化细胞制备方法
CN107574138A (zh) * 2017-07-28 2018-01-12 湖南师范大学 一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用
CN107630109A (zh) * 2017-10-27 2018-01-26 华南农业大学 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒
CN110331171A (zh) * 2019-07-11 2019-10-15 华中农业大学 一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法
CN110468155A (zh) * 2019-07-17 2019-11-19 浙江大学 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用
CN111471709A (zh) * 2020-03-10 2020-07-31 浙江大学 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
CN111875678A (zh) * 2020-07-07 2020-11-03 华南农业大学 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3/gp5/m基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用
CN112852873A (zh) * 2021-02-04 2021-05-28 华中农业大学 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法
WO2021188915A1 (en) * 2020-03-19 2021-09-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for treatment of coronavirus infection

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101139589A (zh) * 2005-03-08 2008-03-12 浙江大学 表达传染性法氏囊病毒vp2基因编码蛋白永生化细胞制备方法
CN107574138A (zh) * 2017-07-28 2018-01-12 湖南师范大学 一株大肠杆菌抗肿瘤靶向工程菌株及其构建方法与应用
CN107630109A (zh) * 2017-10-27 2018-01-26 华南农业大学 一种检测新型猪急性腹泻综合征冠状病毒的荧光定量pcr引物及试剂盒
CN110331171A (zh) * 2019-07-11 2019-10-15 华中农业大学 一种高效快速构建猪肠道冠状病毒重组病毒的方法
CN110468155A (zh) * 2019-07-17 2019-11-19 浙江大学 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用
CN111471709A (zh) * 2020-03-10 2020-07-31 浙江大学 一种基于dna质粒转染的拯救pedv zju/g2/2013株的反向遗传系统
CN111593073A (zh) * 2020-03-18 2020-08-28 苏州奥特铭医药科技有限公司 双报告基因骨架载体、四质粒假病毒包装系统、包装新冠肺炎假病毒
WO2021188915A1 (en) * 2020-03-19 2021-09-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for treatment of coronavirus infection
CN111875678A (zh) * 2020-07-07 2020-11-03 华南农业大学 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒gp3/gp5/m基因的重组伪狂犬病毒、构建方法和应用
CN112852873A (zh) * 2021-02-04 2021-05-28 华中农业大学 一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of a novel bat-HKU2-like swine enteric alphacoronavirus (SeACoV) infection in cultured cells and development of a SeACoV infectious clone;Yong-Le Yang 等;《Virology》;20190809;第536卷;第110-118页 *
Swine acute diarrhea syndrome coronavirus replication in primary human cells reveals potential susceptibility to infection;Caitlin E. Edwards 等;《PNAS》;20201012;第117卷(第43期);第26915-26925页 *
新型猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展;秦俣 等;《病毒学报》;20220106;第1-6页 *
猪急性腹泻综合征冠状病毒核衣壳蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备;周芝海 等;《中国兽医科学》;20190620;第49卷(第9期);第1179-1186页 *

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