CN116656731B - 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法 - Google Patents

一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116656731B
CN116656731B CN202310594369.9A CN202310594369A CN116656731B CN 116656731 B CN116656731 B CN 116656731B CN 202310594369 A CN202310594369 A CN 202310594369A CN 116656731 B CN116656731 B CN 116656731B
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
swine fever
african swine
sgrna
cas9
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202310594369.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116656731A (zh
Inventor
高玉伟
冯娜
王欣慧
孟宪踊
王铁成
夏咸柱
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Original Assignee
Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences filed Critical Military Veterinary Research Institute Academy Of Military Medical Sciences
Priority to CN202310594369.9A priority Critical patent/CN116656731B/zh
Publication of CN116656731A publication Critical patent/CN116656731A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116656731B publication Critical patent/CN116656731B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法，依托于Cas9工具酶的CRISPR系统，成功构建出高效串联表达非洲猪瘟病毒P30、P62、P54及P72四种蛋白的重组金丝雀痘病毒，不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时使病毒的筛选过程可视化，大大减少了大量复杂繁琐的筛选、纯化过程，提高效率。通过本发明方法构建的重组金丝雀痘病毒，相较于原始病毒基因组增加了串联表达的基因，可以同时表达非洲猪瘟病毒P30、P62、P54及P72四种蛋白，连续传代后仍稳定表达，为非洲猪瘟免疫预防提供候选疫苗株，拓展了CRISPR/Cas9技术的应用范围，为非洲猪瘟病毒疫苗研发提供新的方向。

Description

一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构 建方法
技术领域
本发明涉及病毒学、分子生物学、基因编辑技术领域，尤其涉及一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的一种急性、广泛出血性、高传染性的猪致命疾病，发病率和病死率可高达100％。患非洲猪瘟的病猪表现为呼吸困难、体温升高、心跳加速等，口鼻流出大量脓性分泌物，内脏器官、淋巴结出现不同程度的出血情况，最终可导致生猪死亡。目前，国内外还没有任何商品化疫苗批准上市，该病的防控仍以预防为主，所以急需研制安全有效的非洲猪瘟疫苗。
金丝雀痘病毒(Canarypox virus,CNPV)是痘病毒科(Poxviridae)、脊椎动物痘病毒亚科(Chordopoxvirinae,ChPV)、禽痘病毒属(Avipoxvirus,APV)的重要成员之一，其所在的禽痘病毒属是唯一仅感染非哺乳动物宿主的病毒属。禽痘病毒属能在哺乳动物细胞中引发一过性感染，可以高效表达外源基因编码的抗原，进而安全的产生细胞、体液和保护性免疫应答，使用ALVAC作为载体可以很好的利用该优点。金丝雀痘病毒有很高的种属特异性与安全性。它严格来说只能在禽类中表达，而不在哺乳动物细胞中复制。用金丝雀痘病毒作为载体生产的重组疫苗，不会产生病毒载体的扩散，包括非接种物和环境的影响。金丝雀痘病毒作为载体，在制备疫苗方面是十分有效的，通过与禽痘病毒作为载体相比，在诱导保护性免疫方面，金丝雀痘病毒比其高100倍。
目前传统的重组病毒构建方法同源重组效率低，子代病毒中重组病毒所占比率不足0.1％，不易筛选获得重组病毒。基因编辑工具CRISPR具有非常精准、廉价、易于使用，且非常强大的特点，可以增加病毒在复制过程中与同源片段的重组效率，进而快速构建重组病毒。
依托于Cas9工具酶的CRISPR系统自发明以来，主要应用于对细胞基因组DNA链的编辑，将其应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒目前鲜有报道。本申请人此前研究一种基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法(专利号ZL 202010265661.2)，创造性地将CRISPR系统应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒基因组的编辑，成功地同时表达出犬瘟热病毒CDV M、F、H三种蛋白，建立了能够包装形成犬瘟热病毒病毒样颗粒CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。然而本申请人经过反复试验发现，该构建方法对于构建同时表达非洲猪瘟的多种蛋白并不适用。
鉴于目前还没有关于高效同时表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒，需要针对非洲猪瘟病毒开发出一种新的构建方法以及新的重组金丝雀痘病毒。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一是提供了一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其中，所述非洲猪瘟病毒多种蛋白为P30、P62、P54和P72蛋白，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗Ferret Distemper，所述重组金丝雀痘病毒为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将荧光蛋白及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白基因插入所述金丝雀痘病毒的基因组C6编码区而得。
其中，P30是ASFV病毒早期表达的一种蛋白，是参与ASFV病毒进入的蛋白质，在ASFV疫苗的开发中是十分重要的。P54和P30蛋白已经被证明是重要的抗原结构蛋白，P54蛋白为内囊膜蛋白，作为ASFV重要的结构蛋白，在病毒感染的晚期表达，对病毒膜蛋白的形成是必须的。p62蛋白序列在ASFV不同毒株中具有较高的保守性，且具有较高的免疫原性。P62蛋白作为结构蛋白p35和p15的前体蛋白，是非洲猪瘟病毒免疫学诊断的重要靶标之一，并在非洲猪瘟病毒的致病及免疫机制等基础研究中具有重要的意义。P72是ASFV的主要结构蛋白，是病毒十二面体衣壳的重要组成部分，存在于病毒衣壳表面，具有良好的免疫原性和抗原性。
进一步地，上述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，包括如下步骤：
S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将荧光蛋白EGFP及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C6编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白基因、下游同源臂C6R构成；上游同源臂C6L的序列如SEQ IDNo.1所示，分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示，下游同源臂C6R的序列如SEQ ID No.3所示；
S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达荧光蛋白及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白的重组金丝雀痘病毒。
进一步地，上述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，步骤S1的具体过程如下：
细胞铺至六孔板，利用CRISPR MAXTM Cas9转染质粒Cas9-C6gRNA，培养后接种金丝雀痘病毒继续培养，其后继续转染含有同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；
其中，质粒Cas9-C6gRNA的获得过程如下：
其中，质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2的获得过程如下：
1.1、确定小向导RNA C6gRNA及其引物序列：
小向导RNA C6-sgRNA-1及其引物序列：
C6-sgRNA-1-F：5’-CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC-3’
C6-sgRNA-1-R：5’-CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC-3’
C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-1-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA-1的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNA C6-sgRNA-2及其引物序列：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’
C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；
1.2、C6gRNA oligo二聚体的形成：
将C6gRNA-F、C6gRNA-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；
1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；
1.4、转化：将步骤1.3得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2。
进一步地，上述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，所述包含同源重组模板的转移修复载体的构建过程为：
2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光标记蛋白EGFP、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pGH-C6L+R；
2.2、将合成的基因片段C6L+R用SacⅠ/BgIⅡ双酶切从步骤2.1中得到pGH-C6L+R载体质粒上消化下来并回收；
2.3、用SacⅠ/BgIⅡ双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；
2.4、将步骤2.2中回收的C6L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；
2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6，-20℃下保存待用；
2.6、PCR扩增得到含非洲猪瘟病毒P30与P62、非洲猪瘟病毒P54与P72蛋白的基因片段；用NotⅠ单酶切步骤2.5构建的质粒pCA-C6通过无缝克隆连接含非洲猪瘟病毒P30与P62的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒；
2.7、用MssⅠ与CpoⅠ双酶切步骤2.6的质粒，通过无缝克隆连接含非洲猪瘟病毒P54与P72的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒，即为包含同源重组模板的转移修复载体。
进一步地，上述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法中，步骤S2的具体过程为：
S2.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；
S2.2、将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；
S2.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤S2.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％青霉素-链霉素双抗、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；
S2.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养；
S2.5、48-72h内观察噬斑及荧光蛋白表达情况，吸取表达荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；
S2.6、将步骤S2.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤S2.2-S2.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，即可以同时表达非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72四种蛋白的重组金丝雀痘病毒。
本发明的另一目的是提供一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒，其通过上述任一项所述的构建方法获得。
现有技术相比，本发明的技术效果：
本发明提供的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，依托于Cas9工具酶的CRISPR系统，将其应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒基因组的编辑，并成功构建出高效串联表达非洲猪瘟病毒P30、P62、P54及P72四种蛋白的重组金丝雀痘病毒，该方法相较于传统的同源重组方法不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，大大减少了大量复杂繁琐的筛选、纯化过程，缩短了获得重组病毒的时间。
通过本发明方法构建的重组金丝雀痘病毒，相较于原始病毒基因组增加了串联表达的基因，可以同时表达非洲猪瘟病毒P30、P62、P54及P72四种蛋白，并连续传代后对获得的重组金丝雀痘病毒分别进行病毒滴定和Western blot鉴定，证明重组病毒可以稳定表达P30、P62、P54、P72四种蛋白，可为非洲猪瘟免疫预防提供候选疫苗株。综上，本发明不仅拓展了CRISPR/Cas9技术的应用范围，同时也为非洲猪瘟病毒疫苗药物研发提供了新的方向。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒绿色荧光蛋白表达结果(黑色为背景颜色，颜色较浅的区域为绿色荧光区域)。图中，(a)为构建重组金丝雀痘病毒时获得的子代病毒进行第一轮噬斑纯化时筛选到的荧光斑，(b)为纯化后的重组金丝雀痘病毒在CEF细胞上扩增得到的荧光图。
图2为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒表达的非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72四种蛋白Western Blot鉴定结果。M：蛋白相对分子质量预染marker，1：重组金丝雀痘病毒接种CEF细胞裂解液，2：金丝雀痘病毒接种CEF细胞裂解液，3：CEF细胞裂解液。
图3为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒的稳定性检测结果。图中，(a)为片段P30/P62的稳定性检测；(b)为片段P54/P72的稳定性检测。
图4为本发明实施例提供的重组金丝雀痘病毒感染细胞形成的电镜观察示意图。图中，左为电镜下观察到的单个重组金丝雀痘病毒，右为电镜下观察到的多个重组金丝雀痘病毒。电镜下观察到的重组病毒直径均在200～300nm之间，结构复杂，呈椭圆形的病毒粒子，大小形状均符合痘病毒的典型特征。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步的详细介绍。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验材料：DF-1细胞为鸡胚成纤维细胞系(ATCC ID：CRL-12203)；CEF细胞为分离自9-11日龄SPF鸡胚的原代鸡胚成纤维细胞；转移修复载体骨架质粒pCAGGS；T4 DNAPolymerase购自NEB(M0203L)；DH5α感受态细胞(Code:No 9057)、核酸分子量MarkerDL10000/DL5000/DL2000(Code:No 3584A/3428A/3427A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司(CW2106)；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA(D2500-01)；ClonExpress II One Step Cloning Kit、2×Phanta Max MasterMix(Dye Plus)购自诺唯赞公司；家禽Cas9/gRNA构建试剂盒购自北京唯尚立德生物科技公司(VK001-08)；超保真DNA聚合酶购自NEB公司；LipofectamineTMCRISPRMAXTMCas9转染试剂、限制性内切酶CpoI(RsrII)、限制性内切酶MssI、限制性内切酶NotI、双抗(青霉素-链霉素)、DMEM粉末、/>West Dura持久性化学发光底物购自Thermo Scientific公司；病毒DNA提取试剂盒购自天根公司；Anti-DDDDK tag antibody、Anti-HA tag antibody、Anti-6X His/>antibody、Anti-V5tagantibody、Goat Anti-Rabbit购自abcam公司；低熔点琼脂糖购自LONZA(50100)；DMEM培养液购自Corning(10-013-CVR)；胎牛血清(FBS)购自BI(04-001-1A)。本发明所使用的的金丝雀痘病毒(ALVAC)分离自商品化疫苗/>Ferret Distemper。同源重组模板以pCAGGS为载体，由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白EGFP基因、下游同源臂C6R构成，构成的转移修复载体命名为pCA-C6-EGFP。
上游同源臂C6L序列如SEQ ID NO.1所示，长度为482bp，位于C6编码区上游。
分别带有昆虫痘病毒42K启动子的荧光标记蛋白EGFP基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中昆虫痘病毒42K启动子的长度为32bp，荧光标记蛋白EGFP长度为905bp。
下游同源臂C6R序列如SEQ ID NO.3所示，长度为500bp，位于C6编码区下游。
实验步骤如下：
1、Cas9-C6gRNA共表达质粒的构建及改造。
1.1、小向导RNAC6-sgRNA及其引物序列：
小向导RNA C6-sgRNA-1及其引物序列：
C6-sgRNA-1-F：CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC
C6-sgRNA-1-R：CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC
C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒(ALVAC)基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下可将ALVAC基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNA C6-sgRNA-2及其引物序列：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’
C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；
1.2、oligo二聚体的形成：
将C6-sgRNA-F 1μL、C6-sgRNA-R 1μL、Solution1 5μL、ddH2O 3μL加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃下保持3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后再在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体。
1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、家禽Cas9/gRNA构建试剂盒中提供的线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温(25℃)静置5min。
1.4、转化：
取5μL步骤1.3中得到的最终产物加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min后，直接涂于氨苄抗性的平板，平板放置于37℃温箱培养12h左右，观察菌落生长情况；然后挑取5-10个单菌落，接种至4mL无菌氨苄抗性LB培养液中，37℃摇床摇菌12h左右，按康为世纪质粒小提试剂盒说明书提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，送至测序公司进行测序鉴定，鉴定引物为sqprimer：TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG。鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1。构建好的Cas9-C6gRNA-1载体质粒能够同时通过pCAG启动表达Cas9蛋白及家禽的U6启动子表达gRNA，实现CRISPR技术进行目标基因的敲除和编辑。
同理提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-2。
2、转移修复载体的构建
2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光蛋白基因EGFP、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pGH-C6。
2.2、将合成的基因片段C6用SacⅠ/BgIⅡ双酶切从步骤2.1中的pGH-C6载体质粒上消化下来并回收：
酶切体系包括pGH-C6载体质粒5μg、SacⅠ5μL、BgIⅡ5μL、10×buffer 5μL、ddH2O补足至50μL；置于37℃，酶切1h，琼脂糖凝胶电泳回收C6片段；
2.3、用SacⅠ/BgIⅡ双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；酶切体系为pCAGGS载体质粒5μg、SacⅠ5μL、BgIⅡ5μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至50μL；
2.4、将步骤2.2中回收的C6片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；连接反应体系为线性化pCAGGS载体2μL、C6片段6μL、T4连接酶1μL、T4连接酶buffer 1μL；连接条件为25℃下反应2h；
2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-EGFP，-20℃下保存待用；
2.6、利用pUC57载体质粒合成包含标签蛋白HA、非洲猪瘟病毒P30蛋白基因、剪切蛋白2A、标签蛋白6×his、非洲猪瘟病毒P62蛋白基因的载体质粒，载体命名为pUC57-ASFV-P30/P62。
ASFV-P30/P62(NotI)-F：5’-AAACAGCTGGGGCCCGCGGCCGC-3’
ASFV-P30/P62(NotI)-R：5’-GCGGCCGCTGATTTTTATGGATCGGG-3’
利用pUC57载体质粒合成包含标签蛋白V5、非洲猪瘟病毒P54蛋白基因、剪切蛋白2A、标签蛋白FLAG、非洲猪瘟病毒P72蛋白基因的载体质粒，载体命名为pUC57-ASFV-P54/P72。
ASFV-P54/P72(MssI)-F：5’-AATATAAACCGCGGGTTTAAAC-3’
ASFV-P54/P72(CpoI)-R：5’-CGGACCGTAATTTTTATCCCGGGTTT-3’
其中，剪切蛋白2A与HA、His、V5、FLAG标签用于后续对相关蛋白的检测。
2.7、PCR反应体系包括5×Phusion HF缓冲液10μL、10mM dNTPs 1μL、ASFV-P30/P62(NotI)-F 2.5μL、ASFV-P30/P62(NotI)-R 2.5μL、Phusion DNA聚合酶0.5μL、pUC57-ASFV-P30/P62 2.5μL、ddH2O补至50μL。PCR反应条件为：98℃预变性30s；98℃变性5s，退火55℃10s，72℃延伸2min，30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物由1％的琼脂糖凝胶电泳观察是否正确后胶回收。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收ASFV-P30/P62片段。
2.8、用NotI酶切消化步骤2.5构建的质粒pCA-C6-EGFP。pCA-C6-EGFP的酶切体系包括pCA-C6-EGFP 5μg、NotI 10μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至总体积为50μL；置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收pCA-C6-EGFP线性化质粒。
2.9、利用无缝克隆将片段ASFV-P30/P62连接至线性化质粒pCA-C6-EGFP。连接体系包括5×CEⅡbuffer 4μL、线性化载体2μL、插入片段1μL、ExnaseⅡ2μL、ddH2O补至20μL；连接条件为37℃反应30min，冰上放置3min后转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62。
2.10用MssⅠ/CpoⅠ双酶切消化步骤2.9构建的质粒pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62。酶切体系包括pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P625μg、MssⅠ5μL、CpoⅠ5μL、10×buffer 5μL，用ddH2O补足至总体积为50μL；置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62线性化质粒。
2.11利用无缝克隆将片段ASFV-P54/P72连接至线性化质粒pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62，连接体系包括5×CEⅡbuffer 4μL、线性化载体2μL、插入片段1μL、ExnaseⅡ2μL、ddH2O补至20μL；连接条件为37℃反应30min，冰上放置3min后转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72。
3、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；利用细胞内同源重组的基因修复机制，向细胞中提供步骤2.11得到的质粒pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72，将金丝雀痘病毒C6编码区替换为ASFV的P30、P62、P54、P72基因。
具体过程为：DF-1细胞铺至6孔板，24h后利用Thermo LipofectamineTM CRISPRMAXTM Cas9转染Cas9-C6gRNA，37℃培养24h后接种ALVAC，37℃吸附1h，补加细胞维持液(5％FBS DMEM)1mL，37℃继续培养2h后，继续转染pCA-C6-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72，6h后弃去转染液，补加2mL细胞维持液，37℃继续培养72h，-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒。
4、利用噬斑纯化技术，将步骤3收获的重组金丝雀痘病毒接种至CEF细胞，将表达绿色荧光蛋白的噬斑接种CEF细胞，继续进行5轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72，即获得的可以同时表达ASFV的P30、P62、P54、P72四种蛋白的重组金丝雀痘病毒。
噬斑纯化的具体步骤如下：
4.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层。
4.2、将步骤3中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
4.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤4.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％双抗(青霉素-链霉素)、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用。
4.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板置于37℃5％CO2细胞培养箱培养。
4.5、48-72内观察噬斑及绿色荧光蛋白表达情况，吸取25μL胰酶，将表层的半固体培养基戳碎，范围不超过枪头尖部大小，吹打表达绿色荧光蛋白的单个噬斑，轻柔吹打2-3次即可，打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次。
4.6、将步骤4.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤4.2-4.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，命名为ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72，即获得的可以同时表达ASFV的P30、P62、P54、P72四种蛋白重组金丝雀痘病毒。
5、用Anti-HA、Anti-FLAG、Anti-his、Anti-P54抗体作为一抗，Goat Anti-RabbitIgG(H+L)-HRP作为二抗，经Western blot检测，在约28kd、50kd、80kd和37kd左右的位置可见特异性的曝光条带(图2)，而未感染细胞无特异性蛋白条带，进一步证明P30、P62、P54和P72蛋白在重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72感染CEF细胞中得到有效表达。
5.1、CEF细胞铺至六孔板，直至长满单层。
5.2、将纯化成功的重组ALVAC病毒ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72接种至长满单层的CEF细胞中，72h后每孔加入200μL的RIPA裂解液，细胞裂解充分后加入一定比例的SDS上样缓冲液，95℃加热十分钟。
5.3、取步骤5.2的样品进行Western blot检测在约28kd、50kd、80kd和37kd左右的位置可见特异性的曝光条带(图2)，而未感染细胞无特异性蛋白条带，进一步证明P30、P62、P54和P72蛋白在金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72感染CEF细胞中得到有效表达。重组病毒感染细胞电镜观察结果如图4所示。
6、对纯化的重组金丝雀痘病毒ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72进行病毒稳定性检测，将重组金丝雀痘病毒
ALVAC-EGFP-ASFV-P30/P62/P54/P72扩增十代，每一代都进行病毒稳定性检测，结果显示扩增的每一代毒中非洲猪瘟病毒串联表达的关键抗原基因P30与P62、P54与P72均稳定表达(图3)。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。

Claims (5)

1.一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒多种蛋白为P30、P62、P54和P72蛋白，所述金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗Ferret Distemper，所述重组金丝雀痘病毒为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将荧光蛋白及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白基因插入所述金丝雀痘病毒的基因组C6编码区而得；所述重组金丝雀痘病毒的构建方法，包括如下步骤：
S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C6编码区发生断裂；靶向C6编码区的小导向RNA组合包括小向导RNA C6-sgRNA-1和小向导RNA C6-sgRNA-2，小向导RNAC6-sgRNA-1的引物序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，小向导RNA C6-sgRNA-2的引物序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将荧光蛋白EGFP及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C6编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C6L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白基因、下游同源臂C6R构成；上游同源臂C6L的序列如SEQ ID No.1所示，分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白的基因序列如SEQ ID No.2所示，下游同源臂C6R的序列如SEQ ID No.3所示；
S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达荧光蛋白及非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72蛋白的重组金丝雀痘病毒。
2.根据权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，步骤S1的具体过程如下：
细胞铺至六孔板，利用CRISPR MAXTM Cas9转染质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2，培养后接种金丝雀痘病毒继续培养，其后继续转染含有同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；
其中，质粒Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2的获得过程如下：
1.1、确定小向导RNA C6gRNA及其引物序列：
小向导RNA C6-sgRNA-1及其引物序列：
C6-sgRNA-1-F：5’-CTCTTAGTCGCCTAACCGTCTCAAGGATC-3’
C6-sgRNA-1-R：5’-CTCTAAAACGATCCTTGAGACGGTTAGGC-3’
C6-sgRNA-1-F中的序列GCCTAACCGTCTCAAGGATC、C6-sgRNA-1-R中的序列GATCCTTGAGACGGTTAGGC为C6-sgRNA-1的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第383-402位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-1的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第399-400位碱基之间切断；
小向导RNAC6-sgRNA-2及其引物序列：
C6-sgRNA-2-F：5’-CTCTTAGTCGCCCACTTTTGAACTCCGGA-3’
C6-sgRNA-2-R：5’-CTCTAAAACTCCGGAGTTCAAAAGTGGGC-3’
C6-sgRNA-2-F中的序列GCCCACTTTTGAACTCCGGA、C6-sgRNA-2-R中的序列TCCGGAGTTCAAAAGTGGGC为C6-sgRNA-2的模板序列，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C6编码区的第3912-3931位碱基互补配对，Cas9在C6-sgRNA-2的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C6编码区的第3928-3929位碱基之间切断；
1.2、C6gRNA oligo二聚体的形成：
将C6gRNA-F、C6gRNA-R、Solution1、ddH2O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃保持下3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；
1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH2O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；
1.4、转化：将步骤1.3得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C6gRNA-1、Cas9-C6gRNA-2。
3.根据权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，所述包含同源重组模板的转移修复载体的构建过程为：
2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C6L、下游同源臂C6R、42k启动子、荧光标记蛋白EGFP、多克隆位点的基因的载体质粒，载体质粒命名为pGH-C6L+R；
2.2、将合成的基因片段C6L+R用SacⅠ/BgIⅡ双酶切从步骤2.1中得到pGH-C6L+R载体质粒上消化下来并回收；
2.3、用SacⅠ/BgIⅡ双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；
2.4、将步骤2.2中回收的C6L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；
2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C6，-20℃下保存待用；
2.6、PCR扩增得到含非洲猪瘟病毒P30与P62、非洲猪瘟病毒P54与P72蛋白的基因片段；用NotⅠ单酶切步骤2.5构建的质粒pCA-C6通过无缝克隆连接含非洲猪瘟病毒P30与P62的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒；
2.7、用MssⅠ与CpoⅠ双酶切步骤2.6的质粒，通过无缝克隆连接含非洲猪瘟病毒P54与P72的基因片段，得到酶切及测序正确的质粒，即为包含同源重组模板的转移修复载体。
4.根据权利要求1所述的表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒的构建方法，其特征在于，步骤S2的具体过程为：
S2.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；
S2.2、将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6；
S2.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤S2.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％青霉素-链霉素双抗、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；
S2.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养；
S2.5、48-72h内观察噬斑及荧光蛋白表达情况，吸取表达荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；
S2.6、将步骤S2.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤S2.2-S2.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，即可以同时表达非洲猪瘟病毒P30、P62、P54、P72四种蛋白的重组金丝雀痘病毒。
5.一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒，其特征在于，通过权利要求1-4任一项所述的构建方法获得。
CN202310594369.9A 2023-05-25 2023-05-25 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法 Active CN116656731B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310594369.9A CN116656731B (zh) 2023-05-25 2023-05-25 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310594369.9A CN116656731B (zh) 2023-05-25 2023-05-25 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116656731A CN116656731A (zh) 2023-08-29
CN116656731B true CN116656731B (zh) 2024-04-12

Family

ID=87727196

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310594369.9A Active CN116656731B (zh) 2023-05-25 2023-05-25 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116656731B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117511968A (zh) * 2023-11-06 2024-02-06 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904127A (zh) * 2018-09-18 2020-03-24 瓦赫宁恩研究基金会 非洲猪瘟病毒疫苗
CN111500633A (zh) * 2020-04-07 2020-08-07 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法
CN113897390A (zh) * 2020-07-06 2022-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
CN113897394A (zh) * 2020-07-06 2022-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
WO2022007800A1 (zh) * 2020-07-06 2022-01-13 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0512421B8 (pt) * 2004-06-25 2022-06-28 Merial Ltd Recombinantes de avipox expressando genes do vírus da doença febre aftosa
US8168200B2 (en) * 2008-10-24 2012-05-01 Merial Limited Vaccine against african horse sickness virus
EP4262865A2 (en) * 2020-12-21 2023-10-25 VST LLC dba Medgene Labs African swine fever (asf) virus vaccines

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904127A (zh) * 2018-09-18 2020-03-24 瓦赫宁恩研究基金会 非洲猪瘟病毒疫苗
CN111500633A (zh) * 2020-04-07 2020-08-07 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法
CN113897390A (zh) * 2020-07-06 2022-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
CN113897394A (zh) * 2020-07-06 2022-01-07 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法
WO2022007800A1 (zh) * 2020-07-06 2022-01-13 嘉兴安宇生物科技有限公司 一种非洲猪瘟的重组腺病毒疫苗及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
基于CRISPR/Cas9技术的犬瘟热重组金丝雀痘病毒的构建及其免疫原性研究;宫语晨;万方数据;全文 *
重组金丝雀痘病毒载体疫苗研制进展;李文桂等;生物技术进展;第第12 卷卷(第第1 期期);36~43 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN116656731A (zh) 2023-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1340203C (en) Recombinant apivoxvirus
CN107190022B (zh) 一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法
WO2021051906A1 (zh) 一种针对ii类vii型流行ndv株dhn3的感染性重组克隆方法
CN116656731B (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒多种蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法
CN104152416B (zh) 伪狂犬病毒基因缺失弱毒株及其制备方法和应用
CN111500633B (zh) 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法
CN107227311B (zh) 重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用
CN110079541A (zh) 一种构建冠状病毒感染性克隆的方法及其应用
CN106967748B (zh) 无需噬斑克隆和筛选标签的山羊痘病毒重组系统及双表达pprv h/f蛋白疫苗的构建
CN109321534A (zh) 一种重组基因viii型新城疫病毒弱毒株
CN116656730B (zh) 一种表达狂犬病病毒g、m蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法
CN108866240B (zh) 用于鉴别DAdV-3和DAdV-A的引物和酶及其应用
CN110951778A (zh) 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用
WO2021051907A1 (zh) 一种全基因组表达载体pBR322-DHN3的制备方法
CN114657213B (zh) 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用
CN107384961B (zh) Tk基因缺失型的山羊痘病毒及其制备方法与应用
US20230147673A1 (en) Recombinant herpesvirus of turkeys (hvt) and preparation method and use thereof
CN113336858B (zh) 单一位点嵌合巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备和应用
CN112891528B (zh) 一种鸡传染性支气管炎疫苗株
CN105132437B (zh) 表达鼠伤寒沙门菌OmpL蛋白的重组猪痘病毒载体疫苗
CN110804627B (zh) 一种表达E2-crimson的重组伪狂犬病毒及其制备方法和应用
EP0404576A2 (en) Recombinant avipoxvirus
CN114196683A (zh) 鸭坦布苏病毒感染性cDNA的制备方法、重组病毒rDTMUV-QY21的制备方法
CN117511968A (zh) 表达SARS-CoV-2的S、E和M蛋白的重组金丝雀痘病毒及其构建方法和应用
US5286639A (en) Recombinant avipoxvirus

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant