CN111500633B - 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法，利用CRISPR/Cas9技术，将荧光蛋白及CDV M蛋白基因插入金丝雀痘病毒基因组C5编码区，相较于传统的同源重组方法重组效率更高，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，经过3‑5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，大大减少了工作量，缩短了获得重组病毒的时间。

Description

基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法

技术领域

本发明涉及病毒学、分子生物学、基因编辑技术领域，具体涉及基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法。

背景技术

随着分子生物学的发展，基因编辑技术的更新换代，新一代的基因编辑工具CRISPR问世，该技术较上一代基因编辑技术TALEN具有更为广泛的作用靶点，更为有效的产生变化或突变，并具有非常精准、廉价、易于使用，且非常强大的特点。由于传统的重组病毒构建方法同源重组效率低，子代病毒中重组病毒所占比率不足0.1％，不易筛选获得重组病毒，因此提高病毒在复制过程中与同源片段进行重组的效率则成为构建重组病毒的关键所在。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法,依托于Cas9工具酶的CRISPR系统自发明以来主要应用于对细胞基因组DNA链的编辑，创造性地将其应用于对双链DNA病毒金丝雀痘病毒基因组的编辑，并进一步应用其包装犬瘟热病毒病毒样颗粒，相较于传统方法不仅提高了构建重组病毒的成功率，同时还减少了大量复杂繁琐的筛选、纯化过程。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法，包括如下步骤：

S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C5编码区发生断裂；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将CDV M基因及荧光标记蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C5编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C5L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白基因及CDV M蛋白基因、下游同源臂C5R构成；

S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。

进一步地，步骤S1的具体过程如下：

细胞铺至6孔板，利用脂质体lipo3000转染质粒Cas9-C5gRNA-NLS^-，培养后接种ALVAC-CDV,继续培养，其后继续转染包含同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；

其中，质粒Cas9-C5gRNA-NLS^-的获得过程如下：

1.1、确定小向导RNA C5-sgRNA及其引物序列：

C5-sgRNA-F：5’-CTCTTAGTCGAAAAAAAGAGTTAATTTGT-3’

C5-sgRNA-R：5’-CTCTAAAACACAAATTAACTCTTTTTTTC-3’

C5-sgRNA-F中的序列GAAAAAAAGAGTTAATTTGT、C5-sgRNA-R中的序列ACAAATTAACTCTTTTTTTC为小向导RNA C5-sgRNA的模板，此模板序列与重组金丝雀痘病毒基因组C5编码区的第161-180位碱基互补配对，Cas9可在C5-sgRNA的引导下将重组金丝雀痘病毒基因组在C5编码区的第177-178位碱基之间切断；

1.2、oligo二聚体的形成：

将C5-sgRNA-F、C5-sgRNA-R、Solution1、ddH₂O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃下保持3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后再在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；

1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH₂O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；

1.4、转化：将步骤1.3中得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C5gRNA；

1.5、改造Cas9-C5gRNA载体质粒：

1.5.1、利用限制性内切酶KpnI/NotI/BamHI对步骤1.4得到的测序鉴定正确的Cas9-C5gRNA载体质粒进行酶切消化，回收不包含Cas9基因序列的线性化载体；

1.5.2、分别针对切掉部分中包括Cas9基因的片段2以及片段2下游一段大小为786bp的片段1设计重组克隆引物并进行快速克隆：

1.5.2.1、针对片段2分别设计两对引物，第一对引物用于扩增编码Cas9的完整序列Fragment 2-01，第二对引物用于在获得的Cas9序列上下游加入快速重组克隆所需的重叠序列，所述重叠序列为Cas9-C5gRNA载体质粒上去除NLS基因后与Cas9紧邻的序列，获得片段命名为Fragment 2-02；

第一对引物的序列如下：

Fragment 2-01-F：

5’-ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC-3’

Fragment 2-01-R：

5’-TTAGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGG-3’

第二对引物的序列如下：

Fragment 2-02-F：5’-TTTTTGCAGGATCTGCCACCGGTACCGCCACCATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC-3’

Fragment 2-02-R：5’-TAATACGACTCACTATAGTTCTAGATTAGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGGTCG-3’

1.5.2.2、利用针对片段2设计的第一对引物PCR扩增片段Fragment 2-01；反应完成后，胶回收Fragment 2-01；

1.5.2.3、以Fragment 2-01为扩增模板，利用针对片段2设计的第二对引物继续进行PCR扩增；反应完成后，胶回收片段Fragment2-02；

1.5.2.4、PCR扩增片段1：

针对片段1设计的引物序列如下：

Fragment 1-F：5’-CTCACATGTCGAGCGGCCGCACGCG-3’

Fragment 1-R：5’-TCTAGAACTATAGTGAGTCGTATTA-3’

反应完成后，将片段1进行胶回收备用；

1.5.2.5、进行快速克隆，快速克隆后提取的载体质粒进行酶切鉴定,鉴定正确的质粒进行测序鉴定，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C5gRNA-NLS^-，保存于-20℃待用；快速克隆反应体系为步骤1.5.1回收得到的不包含Cas9基因序列的线性化载体1μL、步骤1.5.2.4回收得到的片段1 2μL、步骤1.5.2.3回收得到的片段Fragment 2-02 2μL、2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，用ddH₂O补足到10μL。

进一步地，构建所述包含同源重组模板的转移修复载体的具体过程为：

2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C5L、下游同源臂C5R、42k启动子、多克隆位点的基因的载体质粒,载体质粒命名为pGH-C5L+R；

2.2、将合成的基因片段C5L+R用PaeI/NheI双酶切从步骤2.1中得到pGH-C5L+R载体质粒上消化下来并回收；

2.3、用PaeI/NheI双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；

2.4、将步骤2.2中回收的C5L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；

2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C5，-20℃下保存待用；

2.6、PCR扩增得到荧光标记蛋白基因；

2.7、分别应用MssI/EcoRV双酶切消化步骤2.6回收得到的荧光标记蛋白基因片段和步骤2.5构建的质粒pCA-C5，分别得到荧光标记蛋白基因酶切消化片段和pCA-C5线性化质粒；

2.8、将荧光标记蛋白基因酶切消化片段连接至pCA-C5线性化质粒；

2.9、将步骤2.8最终的产物转化感受态后挑取单克隆进行质粒提取，得到酶切及测序鉴定正确的质粒；

2.10、PCR扩增得到CDV M基因；

2.11、分别用NotI/CpoI双酶切消化步骤2.10回收得到的CDV M片段和步骤2.9构建的质粒，回收得到CDV M片段酶切消化产物及线性化质粒；

2.12、将步骤2.11得到的CDV M片段酶切消化产物连接至步骤2.11得到的线性化质粒，得到酶切及测序鉴定正确的质粒，即为包含同源重组模板的转移修复载体。

进一步地，步骤S2的具体过程为：

S2.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；

S2.2、将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6；

S2.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤S2.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％青霉素-链霉素双抗、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；

S2.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养；

S2.5、72-120h内观察噬斑及荧光蛋白表达情况，吸取表达荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；

S2.6、将步骤S2.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤S2.2-S2.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，为预期获得的可以同时表达CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。

进一步地，所述荧光标记蛋白基因的序列选自红色荧光蛋白mCherry、绿色荧光蛋白EGFP或黄色荧光蛋白YFP。

本发明的有益效果在于：

本发明利用CRISPR/Cas9技术，将荧光蛋白及CDV M蛋白基因插入金丝雀痘病毒基因组C5编码区，相较于传统的同源重组方法重组效率更高，同时引入的荧光标记蛋白使病毒的筛选过程可视化，经过3-5轮病毒噬斑筛选，即可获得纯化的重组病毒，大大减少了工作量，缩短了获得重组病毒的时间。

本发明相较于原始病毒基因组增加了CDV M基因，构建的重组病毒可以同时表达CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs，应用于疫苗免疫时可以发挥其佐剂效应。

附图说明

图1为本发明实施例中重组病毒红色荧光蛋白表达结果示意图；

图2为本发明实施例中重组病毒CDV M蛋白Western Blot鉴定结果示意图；

图3为本发明实施例中重组病毒感染细胞形成的CDV VLPS电镜观察示意图。

具体实施方式

以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。

本实施例提供一种基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业渠道获得。

实验材料：DF-1细胞为鸡胚成纤维细胞系(ATCC ID：CRL-12203)；CEF细胞为分离自9-11日龄SPF鸡胚的原代鸡胚成纤维细胞；转移修复载体骨架质粒pCAGGS；TransStartFastPfu DNA Polymerase购自全式金生物技术有限公司(AP221)；T4 DNA Polymerase购自NEB(M0203L)；DH5α感受态细胞(Code:No 9057)、核酸分子量Marker DL10000/DL5000/DL2000(Code:No 3584A/3428A/3427A)均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒小提试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司(CW2106)；DNA凝胶回收试剂盒购自OMEGA(D2500-01)；EasyGeno快速重组克隆试剂盒购自天根生化科技公司(VI201-01)；家禽Cas9/gRNA构建试剂盒购自北京唯尚立德生物科技公司(VK001-08)；脂质体转染试剂lipofectamine3000购自Invitrogen(L3000008)。所有核酸内切酶、双抗(青霉素-链霉素)、DMEM粉末均购自ThermoFisher。低熔点琼脂糖购自LONZA(50100)；DMEM培养液购自Corning(10-013-CVR)；胎牛血清(FBS)购自BI(04-001-1A)。ALVAC-CDV分离自商品化疫苗

Ferret Distemper。同源重组模板以pCAGGS为载体，由上游同源臂C5L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白mCherry基因及CDV M蛋白基因、下游同源臂C5R构成，构成的转移修复载体命名为pCA-C5-mCherry-M。

上游同源臂C5L序列如SEQ ID NO.1所示，长度为486bp，位于C5编码区上游。

分别带有昆虫痘病毒42K启动子的荧光标记蛋白mCherry基因及CDV M蛋白基因序列如SEQ ID NO.2所示，其中昆虫痘病毒42K启动子的长度为32bp，荧光标记蛋白mCherry长度为789bp，CDV M蛋白序列长度为1008bp。

下游同源臂C5R序列如SEQ ID NO.3所示，长度为408bp，位于C5编码区下游。

所述C5编码区如SEQ ID NO.4所示。

实验步骤包括：

1、Cas9-C5gRNA共表达质粒的构建及改造。

1.1、小向导RNA C5-sgRNA及其引物序列：

C5-sgRNA-F：5’-CTCTTAGTCGAAAAAAAGAGTTAATTTGT-3’(SEQ ID NO.17)

C5-sgRNA-R：5’-CTCTAAAACACAAATTAACTCTTTTTTTC-3’(SEQ ID NO.18)

C5-sgRNA-F中的序列GAAAAAAAGAGTTAATTTGT、C5-sgRNA-R中的序列ACAAATTAACTCTTTTTTTC为C5-sgRNA的模板序列，此模板序列与重组金丝雀痘病毒(ALVAC)基因组C5编码区的第161-180位碱基互补配对，Cas9在C5-sgRNA的引导下可将ALVAC基因组在C5编码区的第177-178位碱基之间切断；

1.2、oligo二聚体的形成：

将C5-sgRNA-F 1μL、C5-sgRNA-R 1μL、Solution1 5μL、ddH₂O 3μL加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃下保持3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后再在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体。

1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH₂O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、家禽Cas9/gRNA构建试剂盒中提供的线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温(25℃)静置5min。

1.4、转化：

取5μL步骤1.3中得到的最终产物加入到刚解冻的50μL DH5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min后，直接涂于氨苄抗性的平板，平板放置于37℃温箱培养12h左右，观察菌落生长情况；然后挑取5-10个单菌落，接种至4mL无菌氨苄抗性LB培养液中，37℃摇床摇菌12h左右，按康为世纪质粒小提试剂盒说明书提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，送至测序公司进行测序鉴定，鉴定引物为sqprimer:TGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG。鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C5gRNA。构建好的Cas9-C5gRNA载体质粒能够同时通过pCAG启动表达Cas9蛋白及家禽的U6启动子表达gRNA，实现CRISPR技术进行目标基因的敲除和编辑。

1.5、改造Cas9-C5gRNA载体质粒

由于金丝雀痘病毒在细胞质中进行复制，而Cas9-C5gRNA载体质粒中编码Cas9蛋白的基因上下游均带有入核信号NLS的基因序列，因此需对Cas9/gRNA载体质粒进行改造，利用EasyGeno快速重组克隆试剂盒去除NLS信号序列：

1.5.1、利用限制性内切酶KpnI/NotI/BamHI对步骤1.4得到的测序鉴定正确的Cas9-C5gRNA载体质粒进行酶切消化，回收不包含Cas9基因序列的线性化载体(LinearizedCas9-C5gRNA vector)。酶切体系包括Cas9-C5gRNA载体质粒5μg、KpnI 5μL、NotI 5μL、BamHI5μL、10×buffer 5μL、ddH₂O补至50μL，置于37℃，酶切1h，琼脂糖凝胶电泳回收不包含Cas9的载体片段。

1.5.2、分别针对切掉部分中包括Cas9基因的片段(片段2，如SEQ ID NO.5所示)及片段2的下游一段大小为786bp的片段(片段1,SEQ ID NO.6所示)这两段序列设计重组克隆引物。

1.5.2.1、针对片段2分别设计两对引物，第一对用于扩增编码Cas9的完整序列Fragment 2-01，第二对用于在获得的Cas9序列上下游加入快速重组克隆所需的重叠序列(此上下游重叠序列为载体上去除NLS基因后与Cas9紧邻的序列)，获得片段命名为Fragment 2-02。

第一对引物的序列如下：

Fragment 2-01-F(SEQ ID NO.7)：

5’-ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC-3’

Fragment 2-01-R(SEQ ID NO.8)：

5’-TTAGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGG-3’

第二对引物的序列如下：

Fragment 2-02-F(SEQ ID NO.9)：5’-TTTTTGCAGGATCTGCCACCGGTACCGCCACCATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC-3’

Fragment 2-02-R(SEQ ID NO.10)：5’-TAATACGACTCACTATAGTTCTAGATTAGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGGTCG-3’

1.5.2.2、利用针对片段2设计的第一对引物PCR扩增片段Fragment 2-01，PCR反应体系为5×TransStart FastPfu Buffer 10μL、10mM dNTP Mixture 1μL、Fragment 2-01-F2μL(10mM)、Fragment2-01-R 2μL(10mM)、FastPfu DNA Polymerase 1μL、FastPfu DNAPolymerase 1μL、Cas9-C5gRNA载体质粒2μL、ddH₂O 32μL；PCR反应程序按照FastPfu DNAPolymerase说明书要求进行，反应完成后，胶回收Fragment 2-01，作为下一步PCR扩增的模板。

1.5.2.3、利用针对片段2设计的第二对引物继续进行PCR扩增，PCR反应体系为5×TransStart FastPfu Buffer 10μL、10mM dNTP Mixture 1μL、Fragment 2-02-F 2μL(10mM)、Fragment 2-02-R 2μL(10mM)、FastPfu DNA Polymerase 1μL、FastPfu DNAPolymerase 1μL、步骤1.5.2.2PCR扩增后回收的片段Fragment 2-01 2μL、ddH₂O 32μL；PCR反应程序按照FastPfu DNA Polymerase说明书要求进行，反应完成后，胶回收片段Fragment 2-02。

1.5.2.4、PCR扩增片段1：

针对片段1设计的引物序列如下：

Fragment 1-F(SEQ ID NO.11)：5’-CTCACATGTCGAGCGGCCGCACGCG-3’

Fragment 1-R(SEQ ID NO.12)：5’-TCTAGAACTATAGTGAGTCGTATTA-3’

PCR反应体系为5×TransStart FastPfu Buffer 10μL、10mM dNTP Mixture 1μL、Fragment 1-F 2μL(10mM)、Fragment 1-R 2μL(10mM)、FastPfu DNA Polymerase 1μL、FastPfu DNA Polymerase 1μL、Cas9-C5gRNA载体质粒2μL、ddH₂O 32μL；PCR反应程序按照FastPfu DNA Polymerase说明书要求进行，反应完成后，将片段1进行胶回收备用。

1.5.2.5、进行快速克隆：

快速克隆反应体系为步骤1.5.1回收得到的不包含Cas9基因序列的线性化载体1μL、步骤1.5.2.4回收得到的片段1 2μL、步骤1.5.2.3回收得到的片段Fragment 2-02 2μL、2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，用ddH₂O补足到10μL。

将快速克隆反应体系置于50℃反应1h，反应结束后，瞬时离心并将离心管置于冰上冷却，进行后续的常规转化反应。挑取5-10个培养的单菌落，接种至4mL无菌氨苄抗性LB培养液中，37℃摇床摇菌12h左右，使用康为世纪质粒小提试剂盒抽提载体质粒。提取的载体质粒进行酶切鉴定(KpnI/NotI/BamHI),鉴定正确的质粒送测序公司测序，测序结果正确的载体质粒命名为Cas9-C5gRNA-NLS^-，保存于-20℃待用。

2、转移修复载体的构建

2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C5L、下游同源臂C5R、42k启动子、多克隆位点的基因的载体质粒,载体质粒命名为pGH-C5L+R。

2.2、将合成的基因片段C5L+R用PaeI/NheI双酶切从步骤2.1中得到pGH-C5L+R载体质粒上消化下来并回收：

酶切体系包括pGH-C5L+R载体质粒5μg、PaeI 5μL、NheI 5μL、10×buffer 5μL、ddH₂O补足至50μL；置于37℃，酶切1h，琼脂糖凝胶电泳回收C5L+R片段；

2.3、用PaeI/NheI双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；酶切体系为pCAGGS载体质粒5μg、PaeI 5μL、NheI 5μL、10×buffer 5μL，用ddH₂O补足至50μL；

2.4、将步骤2.2中回收的C5L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；连接反应体系为线性化pCAGGS载体2μL、C5L+R片段6μL、T4连接酶1μL、T4连接酶buffer 1μL；连接条件为25℃下反应2h；

2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C5，-20℃下保存待用。

2.6、PCR扩增得到mCherry基因；

mCherry扩增引物序列如下：

mCherry(MssI)-F(SEQ ID NO.13):

5’-GCGTTTAAACGCCACCATGGTGAGCAAGGG-3’

mCherry(EcoRV)-R(SEQ ID NO.14):

5’-GCGATATCTTATCTAGATCCGGTGGATC-3’

PCR反应体系包括5×TransStart FastPfu Buffer 10μL、10mM dNTP Mixture 1μL、mCherry(MssI)-F 2μL、mCherry(EcoRV)-R 2μL、ddH₂O 33μL；

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收mCherry片段。

2.7、分别应用MssI/EcoRV双酶切消化步骤2.6回收得到的mCherry片段和步骤2.5构建的质粒pCA-C5；

mCherry片段的酶切反应体系包括mCherry片段5μg、MssI 5μL、EcoRV 5μL、10×buffer 5μL，用ddH₂O补足至50μL；

pCA-C5质粒的酶切反应体系包括pCA-C5质粒5μg、MssI 5μL、EcoRV 5μL、10×buffer 5μL，用ddH₂O补足至50μL。

置于37℃水浴锅酶切1h后进行琼脂糖凝胶电泳，分别回收mCherry酶切消化片段及pCA-C5线性化质粒。

2.8、将mCherry酶切消化片段连接至pCA-C5线性化质粒，连接反应体系为pCA-C5线性化载体质粒2μL、mCherry酶切消化片段6μL、T4连接酶1μL、T4连接酶buffer 1μL；连接条件为25℃下反应2h；

2.9、将步骤2.8最终的产物转化感受态后挑取单克隆进行质粒提取，酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C5-mCherry。

2.10、PCR扩增得到CDV M基因，引物序列如下：

CDV-M(NotI)-F(SEQ ID NO.15)：

5’-TTGCGGCCGCATGACTGAGGTGTACGAC-3’

CDV-M(CpoI)-R(SEQ ID NO.16)：

5’-CATCGGACCGTTAGAGAATTTTGAAAAGACC-3’

PCR反应体系包括5×TransStart FastPfu Buffer 10μL、10mM dNTP Mixture 1μL、CDV-M(NotI)–F 2μL、CDV-M(CpoI)–R 2μL、FastPfu DNA Polymerase 1μL、CDV基因组5μL、ddH₂O 29μL。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收CDV M片段。

2.11、分别用NotI/CpoI双酶切消化步骤2.10回收得到的CDV M片段和步骤2.9构建的质粒pCA-C5-mCherry。

CDV-M片段的酶切体系包括CDV M片段5μg、NotI 5μL、CpoI 5μL、10×buffer 5μL，用ddH₂O补足至总体积为50μL；

pCA-C5-mCherry的酶切体系包括pCA-C5-mCherry 5μg、NotI 5μL、CpoI 5μL、10×buffer 5μL，用ddH₂O补足至总体积为50μL；

分别置于37℃酶切1h，进行琼脂糖凝胶电泳，回收CDV M片段酶切消化产物及pCA-C5-mCherry线性化质粒。

2.12、将CDV M片段酶切消化产物连接至pCA-C5-mCherry线性化质粒，酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C5-mCherry-M。

3、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C5编码区发生断裂；利用细胞内同源重组的基因修复机制，向细胞中提供步骤2.12得到的质粒pCA-C5-mCherry-M，将金丝雀痘病毒C5编码区替换为mCherry和CDV-M基因。

具体过程为：DF-1细胞铺至6孔板，24h后利用脂质体lipo3000转染Cas9-C5gRNA-NLS^-，37℃培养24h后接种ALVAC-CDV,37℃吸附1h，补加细胞维持液(5％FBS DMEM)1mL，37℃继续培养2h后，继续转染pCA-C5-mCherry-M，6h后弃去转染液，补加2mL细胞维持液，37℃继续培养72h，-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒。

4、利用噬斑纯化技术，将步骤3收获的重组金丝雀痘病毒接种至CEF细胞，将表达红色荧光蛋白的噬斑接种CEF细胞，继续进行5轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒ALVAC-mCherry-CDV-MFH/C5^-，为预期获得的可以同时表达CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒；

噬斑纯化的具体步骤如下：

4.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层。

4.2、将步骤3中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。

4.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤4.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％双抗(青霉素-链霉素)、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用。

4.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养。

4.5、72-120h内观察噬斑及红色荧光蛋白表达情况，吸取表达红色荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次。

4.6、将步骤4.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤4.2-4.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，命名为ALVAC-mCherry-CDV-MFH/C5^-，为预期获得的可以同时表达CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。

图1为重组病毒红色荧光蛋白表达结果(黑色为背景颜色，颜色较浅的区域为红色荧光区域)。其中，(a)为构建重组病毒时获得的子代病毒进行第一轮噬斑纯化时筛选到的荧光斑，(b)为纯化后的重组病毒在CEF细胞上扩增得到的荧光图。

图2为重组病毒CDV M蛋白Western Blot鉴定结果。

图3为重组病毒感染细胞形成的CDV VLPS电镜观察(箭头指示)，Bar＝200nm。

对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所

<120> 基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法

<130> 123

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 486

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctttactcc tttgtgtttg gcagcttacc ttaacaaagt taatttggtt aaacttctat 60

tggctcattc ggcggatgta gatatttcaa acacggatcg gttaactcct ctacatatag 120

ccgtatcaaa taaaaattta acaatggtta aacttctatt gaacaaaggt gctgatactg 180

acttgctgga taacatggga cgtactcctt taatgatcgc tgtacaatct ggaaatattg 240

aaatatgtag cacactactt aaaaaaaata aaatgtccag aactgggaaa aattgatctt 300

gccagctgta attcatggta gaaaagaagt gctcaggcta cttttcaaca aaggagcaga 360

tgtaaactac atctttgaaa gaaatggaaa atcatatact gttttggaat tgattaaaga 420

aagttactct gagacacaaa agaggtagct gaagtggtac tctcaaaatg cagaacgatg 480

actgcg 486

<210> 2

<211> 1928

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcaaaattga aaatatataa ttacaatata aaagcgctgc caccatggtg agcaagggcg 60

aggaggataa catggccatc atcaaggagt tcatgcgctt caaggtgcac atggagggct 120

ccgtgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc tacgagggca 180

cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gtggccccct gcccttcgcc tgggacatcc 240

tgtcccctca gttcatgtac ggctccaagg cctacgtgaa gcaccccgcc gacatccccg 300

actacttgaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg aacttcgagg 360

acggcggcgt ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcgag ttcatctaca 420

aggtgaagct gcgcggcacc aacttcccct ccgacggccc cgtaatgcag aagaagacca 480

tgggctggga ggcctcctcc gagcggatgt accccgagga cggcgccctg aagggcgaga 540

tcaagcagag gctgaagctg aaggacggcg gccactacga cgctgaggtc aagaccacct 600

acaaggccaa gaagcccgtg cagctgcccg gcgcctacaa cgtcaacatc aagttggaca 660

tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgaacgcgcc gagggccgcc 720

actccaccgg cggcatggac gagctgtaca agtccggact cagatctcga gctcaagctt 780

cgaattctgc agtcgacggt accgcgggcc cgggatccac cggatctaga taagatatca 840

taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tattcaaaat tgaaaatata taattacaat 900

ataaagcggc cgcatgactg aggtgtacga cttcgatcag tcctcttggg acaccaaagg 960

ctcattggcc cctattttgc ctaccactta tcccgatggt aggctcatac cccaagtcag 1020

agtaatagat ccaggactcg gcgatcggaa agatgaatgc ttcatgtata tttttttact 1080

gggtataata gaagacaatg atggcctcgg acccccaatt ggaagaacat ttggatcgct 1140

gcctttagga gttgggcgta ctacagccag acctgaggag ttattgaaag aagccaccct 1200

gttggatatt gtggtaaggc gaactgcagg tgtcaaggaa caactggtat tttataataa 1260

caccccattg cacatcttaa ctccgtggaa aaaggtcctt acgagtggaa gtgtgttcag 1320

tgcaaatcaa gtctgtaacg cagtcaatct aataccatta gacatagcac aaagattcag 1380

ggtggtatat atgagcatca ctcgactatc agacgatgga agttacagaa ttccccgcgg 1440

gatgtttgaa ttccgctcca ggaatgcttt agcatttaac attttagtca ccattcaagt 1500

tgagggagat gtcgattcaa gccgaggtaa tttgagcatg ttcaaagatc accaagcgac 1560

attcatggta catatcggca atttcagccg caagaaaaac caagcctact ctgctgatta 1620

ttgtaaactg aaaattgaaa agatgggatt agtgtttgct ctaggaggga taggaggaac 1680

gagtcttcac atacgatgta ctggtaagat gagcaaggcc ttgaatgccc agctaggttt 1740

caagaaaatc ctgtgttacc cgctcatgga gatcaatgaa gatttgaatc aatttctatg 1800

gagatcagag tgcaaaatag taagaatcca agcagtcctg caaccatcag tcccacaaga 1860

tttcagagtt tataatgatg ttatcatcag cgatgatcag ggtcttttca aaattctcta 1920

acggaccg 1928

<210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcataatttc taaataatga aaaaaagtac atcatgagca acgcgttagt atattttaca 60

atggagatta acgctctata ccgttctatg tttattgatt cagatgatgt tttagaaaag 120

aaagttattg aatatgaaaa ctttaatgaa gatgaagatg acgacgatga ttattgttgt 180

aaatctgttt tagatgaaga agatgacgcg ctaaagtata ctatggttac aaagtataag 240

tctatactac taatggcgac ttgtgcaaga aggtatagta tagtgaaaat gttgttagat 300

tatgattatg aaaaaccaaa taaatcagat ccatatctaa aggtatctcc tttgcacata 360

atttcatcta ttcctagttt agaatacttt tcattatatt tgtttaca 408

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcagaacg atgactgcga agcaagaagt agagaaataa cactttatga ctttcttagt 60

tgtagaaaag atagagatat aatgatggtc ataaataact ctgatattgc aagtaaatgc 120

aataataagt tagatttatt taaaaggata gttaaaaata gaaaaaaaga gttaatttgt 180

agggttaaaa taatacataa gatcttaaaa tttataaata cgcataataa taaaaataga 240

ttatacttat taccttcaga gataaaattt aagatattta cttatttaac ttataaagat 300

ctaaaatgca taatttctaa ataa 324

<210> 5

<211> 4107

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatactca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980

cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520

atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag caggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agactaa 4107

<210> 6

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcacatgtc gagcggccgc acgcgtgcac ttgttgctag cgatcaaaaa aagcaccgac 60

tcggtgccac tttttcaagt tgataacgga ctagccttat tttaacttgc tatttctagc 120

tctaaaactc attatatctc tatcttttga ctaagagcat cgagactgcg gtatttaaag 180

gctcattctg caagttcttt tagaacacag tgactactcc atttcttccc accaaaaggc 240

tccgcttaat agcacatctt gttaactctt aggcccgctt agccgatttg taacgcgatt 300

cggcgtaata tttccatatt agaagcccct ttttgcccgt ttccgcgcgc gagggctcct 360

gggtagttct ttatgcaaat ttagcgccgg cgctcaggac ctccgcctgg gctgtcgtcg 420

gcagtgcctg aaggagcggc cgcgcggctg tgcgctgtac gcgcggtctg tgcgcactca 480

gagtgctgtg gagctcttgc gctcttactc agtccaggct tagaaagcct gacgtctgtc 540

tgcaattcgc cctagggaat taaaaaacct cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa 600

aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 660

caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttt 720

gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatctac gtaatacgac tcactatagt 780

tctaga 786

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggacaaga agtactccat tgggc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttagtctcca ccgagctgag agagg 25

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttttgcagg atctgccacc ggtaccgcca ccatggacaa gaagtactcc attgggc 57

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taatacgact cactatagtt ctagattagt ctccaccgag ctgagagagg tcg 53

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ctcacatgtc gagcggccgc acgcg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tctagaacta tagtgagtcg tatta 25

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gcgtttaaac gccaccatgg tgagcaaggg 30

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gcgatatctt atctagatcc ggtggatc 28

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttgcggccgc atgactgagg tgtacgac 28

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

catcggaccg ttagagaatt ttgaaaagac c 31

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctcttagtcg aaaaaaagag ttaatttgt 29

<210> 18

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctctaaaaca caaattaact ctttttttc 29

Claims (4)

1.基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法，其特征在于，金丝雀痘病毒分离自商品化疫苗

Ferret Distemper，

Ferret Distemper是一种以金丝雀痘病毒为载体能够同时表达犬瘟热病毒CDV H蛋白和F蛋白的疫苗，重组金丝雀痘病毒构建方法包括如下步骤：

S1、利用CRISPR/Cas9基因编辑技术使金丝雀痘病毒基因组C5编码区发生断裂，使用的小向导RNA C5-sgRNA序列为GAAAAAAAGAGTTAATTTGT；利用金丝雀痘病毒基因组自身的修复机制，向金丝雀痘病毒复制的细胞中提供包含同源重组模板的转移修复载体，使得病毒在复制的过程中，通过与转移修复载体中包含的同源片段发生同源重组完成基因链的修复，并将犬瘟热病毒CDV M基因及荧光标记蛋白基因在金丝雀痘病毒基因组C5编码区的断裂位置引入金丝雀痘病毒基因组中，得到重组金丝雀痘病毒；所述包含同源重组模板的转移修复载体中，所述同源重组模板以pCAGGS为载体，主要由上游同源臂C5L、分别带有昆虫痘病毒启动子42K的荧光标记蛋白基因及犬瘟热病毒CDV M蛋白基因、下游同源臂C5R构成；上游同源臂C5L的序列如SEQ ID NO.1所示，分别带有昆虫痘病毒42K启动子的荧光标记蛋白mCherry基因及CDV M蛋白基因的序列如SEQ ID NO.2所示，下游同源臂C5R的序列如SEQ IDNO.3所示，位于C5编码区下游，所述C5编码区的序列如SEQ ID NO.4所示；

S2、利用噬斑纯化技术，将步骤S1收获的重组金丝雀痘病毒进行多轮噬斑纯化筛选，获得纯净的重组金丝雀痘病毒，即为可以同时表达犬瘟热病毒CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成犬瘟热病毒病毒样颗粒CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。

2.根据权利要求1所述的基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法，其特征在于，步骤S1的具体过程如下：

细胞铺至6孔板，利用脂质体lipo3000转染质粒Cas9-C5gRNA-NLS^-，培养后接种金丝雀痘病毒继续培养，其后继续转染包含同源重组模板的转移修复载体，培养后-80℃反复冻融三次收获重组金丝雀痘病毒；

其中，质粒Cas9-C5gRNA-NLS^-的获得过程如下：

1.1、确定小向导RNA C5-sgRNA及其引物序列：

C5-sgRNA-F：5’-CTCTTAGTCGAAAAAAAGAGTTAATTTGT-3’

C5-sgRNA-R：5’-CTCTAAAACACAAATTAACTCTTTTTTTC-3’

C5-sgRNA-F中的序列GAAAAAAAGAGTTAATTTGT、C5-sgRNA-R中的序列ACAAATTAACTCTTTTTTTC为小向导RNA C5-sgRNA的模板，此模板序列与金丝雀痘病毒基因组C5编码区的第161-180位碱基互补配对，Cas9可在C5-sgRNA的引导下将金丝雀痘病毒基因组在C5编码区的第177-178位碱基之间切断；

1.2、oligo二聚体的形成：

将C5-sgRNA-F、C5-sgRNA-R、Solution1、ddH₂O加入样品管中混合，混匀后，先将样品管在95℃下保持3min，然后将样品管放在95℃水中，自然冷却至室温，最后再在16℃下保持5min，最终得到oligo二聚体；

1.3、oligo二聚体插入到Cas9/gRNA载体质粒中：将ddH₂O、步骤1.2中获得的oligo二聚体、线性化载体Cas9/gRNA混合，充分混合后，室温静置5min；

1.4、转化：将步骤1.3中得到的最终产物进行转化，提取转化后的Cas9/gRNA载体质粒，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C5gRNA；

1.5、改造Cas9-C5gRNA载体质粒：

1.5.1、利用限制性内切酶KpnI/NotI/BamHI对步骤1.4得到的测序鉴定正确的Cas9-C5gRNA载体质粒进行酶切消化，回收不包含Cas9基因序列的线性化载体；

1.5.2、分别针对切掉部分中包括Cas9基因的片段2以及片段2下游一段大小为786bp的片段1设计重组克隆引物并进行快速克隆：

1.5.2.1、针对片段2分别设计两对引物，第一对引物用于扩增编码Cas9的完整序列Fragment 2-01，第二对引物用于在获得的Cas9序列上下游加入快速重组克隆所需的重叠序列，所述重叠序列为Cas9-C5gRNA载体质粒上去除NLS基因后与Cas9紧邻的序列，获得片段命名为Fragment 2-02；

第一对引物的序列如下：

Fragment 2-01-F：

5’-ATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC-3’

Fragment 2-01-R：

5’-TTAGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGG-3’

第二对引物的序列如下：

Fragment 2-02-F：

5’-TTTTTGCAGGATCTGCCACCGGTACCGCCACCATGGACAAGAAGTACTCCATTGGGC-3’Fragment2-02-R：

5’-TAATACGACTCACTATAGTTCTAGATTAGTCTCCACCGAGCTGAGAGAGGTCG-3’

1.5.2.2、利用针对片段2设计的第一对引物PCR扩增片段Fragment 2-01；反应完成后，胶回收Fragment 2-01；

1.5.2.3、以Fragment 2-01为扩增模板，利用针对片段2设计的第二对引物继续进行PCR扩增；反应完成后，胶回收片段Fragment 2-02；

1.5.2.4、PCR扩增片段1：

针对片段1设计的引物序列如下：

Fragment 1-F：5’-CTCACATGTCGAGCGGCCGCACGCG-3’

Fragment 1-R：5’-TCTAGAACTATAGTGAGTCGTATTA-3’

反应完成后，将片段1进行胶回收备用；

1.5.2.5、进行快速克隆，快速克隆后提取的载体质粒进行酶切鉴定,鉴定正确的质粒进行测序鉴定，测序鉴定正确的载体质粒命名为Cas9-C5gRNA-NLS^-，保存于-20℃待用；快速克隆反应体系为步骤1.5.1回收得到的不包含Cas9基因序列的线性化载体1μL、步骤1.5.2.4回收得到的片段1 2μL、步骤1.5.2.3回收得到的片段Fragment 2-02 2μL、2×EasyGeno Assembly Mix 5μL，用ddH₂O补足到10μL。

3.根据权利要求1或2所述的基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法，其特征在于，构建所述包含同源重组模板的转移修复载体的具体过程为：

2.1、利用pGH载体质粒合成包含上游同源臂C5L、下游同源臂C5R、42k启动子、多克隆位点的基因的载体质粒,载体质粒命名为pGH-C5L+R；

2.2、将合成的基因片段C5L+R用PaeI/NheI双酶切从步骤2.1中得到pGH-C5L+R载体质粒上消化下来并回收；

2.3、用PaeI/NheI双酶切消化回收线性化pCAGGS载体质粒；

2.4、将步骤2.2中回收的C5L+R片段连接至步骤2.3得到的线性化pCAGGS载体；

2.5、将步骤2.4最终的产物进行转化后挑取细菌单克隆进行质粒提取；酶切及测序鉴定正确的质粒命名为pCA-C5，-20℃下保存待用；

2.6、PCR扩增得到荧光标记蛋白基因；

2.7、分别应用MssI/EcoRV双酶切消化步骤2.6回收得到的荧光标记蛋白基因片段和步骤2.5构建的质粒pCA-C5，分别得到荧光标记蛋白基因酶切消化片段和pCA-C5线性化质粒；

2.8、将荧光标记蛋白基因酶切消化片段连接至pCA-C5线性化质粒；

2.9、将步骤2.8最终的产物转化感受态后挑取单克隆进行质粒提取，得到酶切及测序鉴定正确的质粒；

2.10、PCR扩增得到犬瘟热病毒CDV M基因；

2.11、分别用NotI/CpoI双酶切消化步骤2.10回收得到的犬瘟热病毒CDV M片段和步骤2.9构建的质粒，回收得到犬瘟热病毒CDV M片段酶切消化产物及线性化质粒；

2.12、将步骤2.11得到的犬瘟热病毒CDV M片段酶切消化产物连接至步骤2.11得到的线性化质粒，得到酶切及测序鉴定正确的质粒，即为包含同源重组模板的转移修复载体。

4.根据权利要求1所述的基于基因编辑技术的重组金丝雀痘病毒构建方法，其特征在于，步骤S2的具体过程为：

S2.1、将CEF细胞铺至6孔板直到长满单层；

S2.2、将步骤S1中收获的重组金丝雀痘病毒混合后用无血清DMEM进行10倍系列稀释，分别稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6；

S2.3、吸弃6孔板中的培养液，用无血清DMEM清洗细胞2次，加入步骤S2.2中稀释好的病毒液，每孔500μL；37℃吸附2h，期间将置于75℃融化的3％低熔点琼脂糖与含2％青霉素-链霉素双抗、4％FBS的2×DMEM按体积比1:1混合，得到半固体培养基，37℃保温待用；

S2.4、吸弃6孔板中的病毒液，用无血清DMEM清洗一次，之后每孔加入2mL半固体培养基，室温放置30min，待半固体培养基充分凝固后，将6孔板倒置于37℃细胞培养箱培养；

S2.5、72-120h内观察噬斑及荧光蛋白表达情况，吸取表达荧光蛋白的单个噬斑吹打入500μL含1％双抗的无血清DMEM，反复冻融两次；

S2.6、将步骤S2.5中挑取的噬斑接种至新鲜的6孔板CEF细胞，重复步骤S2.2-S2.5，重复进行3-5轮噬斑筛选获得纯化的重组金丝雀痘病毒，为预期获得的可以同时表达犬瘟热病毒CDV M、F、H三种蛋白，并包装形成犬瘟热病毒病毒样颗粒CDV-VLPs的重组金丝雀痘病毒。

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