CN105802997B - 一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用，属于基因工程与基因治疗技术领域。本发明以pEGFP‑C1为出发载体构建含核基质结合区特征性序列(如SEQ ID NO:1所示)的附着体表达载体，并以EF‑1α启动子(如SEQ ID NO:2所示)替换pEGFP‑C1载体上原CMV启动子，得到的pEME载体能高效、持续、稳定表达外源目的基因。

Description

一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体、构建方法和应用
技术领域
本发明涉及一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体，同时还涉及该附着体表达载体的构建方法和应用，属于基因工程与基因治疗技术领域。
背景技术
基因治疗是指通过一定方式将正常基因或有治疗作用的DNA序列导入靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用从而达到疾病治疗目的的技术。自20世纪90年代初首次成功进行基因治疗临床试验以来，迄今已完成数千例临床样本。作为一种分子药物治疗形式，基因治疗为众多遗传性和获得性疾病提供了新的治疗方式，已从早期单基因遗传病的治疗，扩展到当前对人类健康威胁严重的多基因治疗，其中包括恶性肿瘤、心血管疾病、代谢性疾病、感染性疾病(如AIDS、乙型肝炎)等。
将外源基因导入生物细胞必须借助一定的载体，因此载体在基因治疗中起着关键的作用。基因治疗载体系统分为病毒与质粒两种，目前大多数临床基因治疗采用转染率较高的病毒载体，但是它使用的是病毒的复制起始点，外源基因稳定表达要整合到宿主染色体上，因此存在潜在的致癌性、自身免疫源性以及细胞病理改变等风险。与病毒载体相比，质粒载体的安全性较高，但也存在转染效率低、持续表达时间短(多为瞬时表达)的问题，并且外源基因稳定表达也要整合到宿主细胞基因组DNA中，同样存在整合带来的潜在危险。而理想的非病毒载体用于基因治疗时应不存在潜在的安全隐患，并应在有丝分裂期维持有丝分裂的稳定性，同时提供持续的转基因高表达水平。因此，为使外源基因高效、安全、稳定表达，亟需开发一种新的非病毒、非整合载体。
核基质结合区(matrix attachment region，MAR)，亦称核骨架结合区(scaffoldattachment region，SAR)序列，是真核生物细胞内染色质上可与细胞核基质结合的一段特殊DNA序列。作为真核生物一种新的顺式作用原件，MAR具有能提高外源基因表达、降低转基因沉默的作用。由β-干扰素MAR特征性序列介导的附着体表达载体(pEGFP-C1-MAR)是一种新型的哺乳动物细胞表达载体，能附着而非整合到CHO染色体上，克服传统载体整合效应带来的副作用，并能驱动转基因表达(Lin Y,Li Z,Wang T,et al.MAR characteristicmotifs mediate episomal vector in CHO cells.Gene,2015,559(2):137-143；专利：人类和哺乳动物细胞附着表达载体及其应用，ZL201210180788.X)。但是研究发现，载体pEGFP-C1-MAR自身所带的CMV启动子驱动外源基因表达不稳定，拷贝数低、基因表达水平低，并且启动子源自人巨细胞病毒，存在潜在的致癌风险。
发明内容
本发明的目的是提供一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体，该载体能驱动外源目的基因高效、持续、稳定表达。
同时，本发明还提供一种上述附着体表达载体的构建方法。
最后，本发明再提供一种上述附着体表达载体的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体，包含核基质结合区特征性序列(如SEQID NO:1所示，或者是与该序列95％以上同源的核苷酸序列)和EF-1α启动子序列(如SEQ IDNO:2所示，或者是与该序列95％以上同源的核苷酸序列)。
所述附着体表达载体的出发载体为人类和哺乳动物细胞表达载体。
人类及哺乳动物细胞附着体表达载体的构建方法，包括以下步骤：
1)构建pEGFP-C1-MAR载体
利用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切pEGFP-C1载体与上述核基质结合区特征性序列，回收酶切片段，连接、转化与鉴定，得到pEGFP-C1-MAR载体；
2)构建pEME载体
利用Ase Ⅰ、Nhe Ⅰ双酶切pEGFP-C1-MAR载体与上述EF-1α启动子序列，回收酶切片段，连接、转化与鉴定，得到pEME载体。
人类及哺乳动物细胞附着体表达载体的应用，具体为将外源目的基因克隆至附着体表达载体中，并将构建的重组载体转入宿主细胞中，随宿主细胞复制表达目的蛋白。
所述外源目的基因为神经生长因子基因(NGF)。
所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
含神经生长因子的附着体表达载体，除包含上述核基质结合区特征性序列和EF-1α启动子序列外，还包含神经生长因子基因序列(GenBank登录号：AF150960.1)。
本发明的有益效果：
本发明以pEGFP-C1为出发载体构建含核基质结合区特征性序列的附着体表达载体，并以EF-1α启动子替换pEGFP-C1载体上原CMV启动子，得到的pEME载体能高效、持续、稳定表达外源目的基因。
附图说明
图1为重组质粒pEGFP-C1-MAR的结构示意图；
图2为重组质粒pEME的结构示意图；
图3为含不同启动子的载体转染CHO细胞EGFP表达水平；
图4为含不同启动子的载体转染CHO细胞EGFP表达稳定性；
图5为质粒还原酶切电泳图；
图6为荧光原位杂交显微图；
图7为ELISA检测NGF基因在转染CHO细胞中的表达水平。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
人类及哺乳动物细胞附着体表达载体的构建方法，包括：
1、MAR序列的合成
将人β-干扰素MAR序列(GenBank登录号：M83137.1)和人β-珠蛋白MAR序列(GenBank登录号：L22754.1)的特征性元件(富含AT序列)剪切拼接，得到核基质结合区特征性序列(MAR，如SEQ ID NO:1所示)。
2、EF-1α启动子序列的合成
EF-1α启动子序列(如SEQ ID NO:2所示)由通用生物系统(安徽)有限公司合成，为实现定向克隆，在序列的两端分别引入Ase Ⅰ酶切位点(5′-ATTAAT-3′)和Nhe Ⅰ酶切位点(5′-GCTAGC-3′)。
3、pEGFP-C1-MAR载体的构建
1)酶切反应
利用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切核基质结合区特征性序列和pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司，含报告基因EGFP)，酶切完成后凝胶电泳检测，回收酶切后的核基质结合区特征性片段和线性pEGFP-C1质粒。
核基质结合区特征性序列的双酶切体系和pEGFP-C1质粒的双酶切体系如下：核基质结合区特征性序列或质粒10μL(1μg)，10×K buffer 2μL，Kpn Ⅰ/BamH Ⅰ酶(20U/μL)各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，37℃水浴酶切4h。
2)连接
将回收的线性pEGFP-C1质粒与酶切后的核基质结合区特征性片段按照摩尔比1:5连接，连接体系10μL，T4连接酶1μL，16℃过夜连接。
3)转化与鉴定
在感受态细胞E.coli DH5α中加入10μL连接产物进行转化，后接种在含卡那霉素的LB培养基(LK)中37℃过夜，挑取单菌落接种在LK培养基中，37℃、225r/min摇菌过夜；采用SDS碱裂解法提取重组质粒pEGFP-C1-MAR；取10μL重组DNA用Kpn Ⅰ、BamH Ⅰ双酶切，同时取6μL重组DNA用Kpn Ⅰ单酶切鉴定，测序结果表明构建的表达载体正确，命名pEGFP-C1-MAR。重组质粒pEGFP-C1-MAR的结构示意图见图1。
4、pEME载体的构建
1)酶切反应
利用Ase Ⅰ、Nhe Ⅰ双酶切合成的EF-1α启动子序列和pEGFP-C1-MAR质粒，酶切结束后，于1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切情况，确定酶切开后，凝胶回收酶切后的EF-1α启动子片段和线性pEGFP-C1-MAR质粒。
EF-1α启动子序列的双酶切体系如下：EF-1α启动子(1μg/μL)10μL，20×NEBbuffer1μL，Ase Ⅰ/Nhe Ⅰ酶(10U/μL)各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，37℃水浴酶切6h。
pEGFP-C1-MAR质粒的双酶切体系如下：pEGFP-C1-MAR质粒(0.8μg/μL)10μL，20×NEB buffer 1μL，Ase Ⅰ/Nhe Ⅰ酶(10U/μL)各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，37℃水浴酶切6h。
2)连接
连接体系如下：线性pEGFP-C1-MAR质粒(1μg/μL)1μL，酶切后的EF-1α启动子片段(1μg/μL)3μL，T4ligase buffer 1μL，T4连接酶(350U/μL)0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，16℃过夜连接。
3)转化与鉴定
无菌状态下取200μL新鲜制备的E.coli JM109感受态细菌，转移至灭菌的1.5mLEP管中，加入10μL上述连接好的反应溶液进行转化，后接种在含卡那霉素的琼脂平板表面，置于37℃培养箱中过夜；从培养的平板上挑取阳性转化子于盛有3mL LK液体培养基的试管中，于37℃摇床培养过夜；提取重组质粒，酶切验证，选取酶切验证正确的质粒，测序验证，验证正确的表达载体命名pEME，结构示意图见图2。
试验例1
一、含不同启动子的载体转染CHO细胞后EGFP表达情况
1、含不同启动子pEGFP-C1-M-Promoter载体的构建
1)启动子序列的合成与克隆
用不同启动子替换pEGFP-C1-MAR载体中CMV启动子，其中RSV(GenBank登录号：KC262216.1，4161～4392位)、SV40(GenBank登录号：AF525447.1，2388～2617位)启动子由通用生物系统(安徽)有限公司合成，为实现定向克隆，在序列的两端分别引入Ase Ⅰ、Nhe Ⅰ酶切位点，合成的启动子序列经测序分析与GenBank登录的序列完全一致。根据PGK(GenBank登录号：KT351864.1，3109～3628)、UBC(GenBank登录号：EU048696.1，2368～3545)、β-globin(GenBank登录号：AF286077.1，4142～4507)启动子序列设计引物，为实现定向克隆，引物的5’端分别引入Ase Ⅰ、Nhe Ⅰ酶切位点(见下划线处)。
PGK启动子的引物序列(如SEQ ID NO:3～4所示)为：
P1：5′-CTGATTAATTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAG-3′；
P2：5′-TTAGCTAGCGCGCACCGTGGGCTTGTAC-3′。
UBC启动子的引物序列(如SEQ ID NO:5～6所示)为：
P3：5′-AAGATTAATGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGC-3′；
P4：5′-CCTGCTAGCTTTACTAGTCTAACACTGAAAA-3′。
β-globin启动子的引物序列(如SEQ ID NO:7～8所示)为：
P5：5′-ACGATTAATGCTTTGCTTCTCAATTTCTT-3′；
P6：5′-ATGGCTAGCCAACACAAACTATGTCAGAAG-3′。
分别提取人外周血基因组DNA、鼠基因组DNA作为模板，PCR扩增PGK、UBC、β-globin启动子，PCR扩增程序为：95℃3min，94℃40s，56℃30s，72℃40s，30个循环，72℃3min。
2)含不同启动子pEGFP-C1-M-Promoter载体的构建
a.酶切反应
利用Ase Ⅰ、Nhe Ⅰ双酶切合成或克隆的启动子序列和pEGFP-C1-MAR质粒，酶切结束后，于1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切情况，确定酶切开后，凝胶回收酶切后的启动子片段和线性pEGFP-C1-MAR质粒。
启动子序列的双酶切体系如下：启动子序列(1μg/μL)10μL，20×NEB buffer 1μL，Ase Ⅰ/Nhe Ⅰ酶(10U/μL)各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，37℃水浴酶切6h。
pEGFP-C1-MAR质粒的双酶切体系如下：pEGFP-C1-MAR质粒(0.8μg/μL)10μL，20×NEB buffer 1μL，Ase Ⅰ/Nhe Ⅰ酶(10U/μL)各0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，37℃水浴酶切6h。
b.连接
连接体系如下：线性pEGFP-C1-MAR质粒(1μg/μL)1μL，酶切后的启动子片段(1μg/μL)4μL，T4ligase buffer 1μL，T4连接酶(350U/μL)0.5μL，补三蒸水至20μL；充分混匀，16℃过夜连接。
c.转化与鉴定
无菌状态下取200μL新鲜制备的E.coli JM109感受态细菌，转移至灭菌的1.5mLEP管中，加入10μL上述连接好的反应溶液进行转化，后接种在含卡那霉素的琼脂平板表面，置于37℃培养箱中过夜；从培养的平板上挑取阳性转化子于盛有3mL LK液体培养基的试管中，于37℃摇床培养过夜；提取重组质粒，酶切验证，选取酶切验证正确的质粒，测序验证，验证正确的载体分别命名为pEMR、pEMS、pEMU、pEMP和pEMβ。
2、含不同启动子附着体表达载体转染CHO细胞表达系统的建立
取pEGFP-C1-MAR载体、含不同启动子pEGFP-C1-M-Promoter载体转染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞，细胞于37℃、5％CO2条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，根据实验设计转染共分为8组：未转染组，转染pEGFP-C1-MAR载体组，转染含不同启动子pEGFP-C1-M-Promoter载体组(EF-1α、RSV、SV40、PGK、UBC和β-globin)。
细胞转染前处理：转染前1d细胞进行传代，吸去旧培养基，加2.5mL 0.25％胰酶消化液(2～3mL均可)，37℃培养箱放置4min(3～5min均可)，随后在显微镜下观察细胞形态，80％细胞由多角形变为圆形时，吸去消化液，加3mL完全培养基，接种于24孔培养板，用吸管轻轻吹打细胞使其悬浮，按所需量吸取细胞悬液(1.5×106cells/66mm培养皿)，移至一新的培养皿中，加培养基5mL，于37℃、5％CO2饱和湿度下培养细胞，待细胞融合达75％时进行转染(70％～80％均可)。
转染方法按照脂质体2000转染试剂盒说明书进行，取上述载体0.9μg加到50μL不含血清和抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀，2μL脂质体2000试剂稀释于50μL不含血清和抗生素的DMEM培养基中，轻轻混匀，室温放置5min；50μL脂质体2000稀释液滴加到质粒DNA稀释液中，一边滴加一边混匀，室温孵育18min(15～20min均可)，接着将约100μL脂质体2000/DNA复合物加到每个皿中并轻轻摇动使其混合，6h后将无血清培养基换为含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基。
细胞稳定转染筛选：转染48h后，用终浓度为800μg/ml的G418培养液加压筛选，每3d更换培养液(3～4d均可)，一周后G418培养液改为维持浓度400μg/ml持续筛选2周，同样每3d更换一次培养液，待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25％胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，最后分至96孔培养板继续培养，培养7d后转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达85％时(80％～90％均可)，通过细胞计数调整每组细胞为相同浓度(1×106个/mL)，收集细胞并用流式细胞术检测转染后不同时间EGFP的表达量。
转染后35d流式细胞术分析EGFP表达，结果显示，转染pEME载体的EGFP表达量明显高于含其他启动子的载体，亦明显高于pEGFP-C1-MAR(见图3)，经G418抗性稳定筛选120d后，报告基因EGFP表达量仍较高(见图4)。对不同载体转染后稳定传代120天EGFP衰减率来看，pEME载体的衰减率明显低于含其他启动子的载体。说明pEME载体能在CHO细胞中高效、稳定表达。
二、质粒还原试验
采用Hirt裂解法提取转染pEME载体CHO细胞中的附着体质粒：向收集的细胞中加入2mL Hirt裂解缓冲液，室温静置20min，使充分裂解；加入1/4体积(0.5mL)5mol/L NaCl，放入4℃过夜(8～20h均可)；次日，15000rpm离心40min，取上清，加RNase A(2g/L)125μL，于37℃水浴60min；用25:24:1的酚/氯仿/异戊醇抽提2次，再次用氯仿抽提1次；取上清，加入5mL-20℃预冷的异丙醇于10mL离心管中，置于-20℃过夜；次日，12000rpm离心30min，加入1mL无水乙醇吹打白色沉淀使其悬浮于1.5mL EP管内，无水乙醇洗涤2次，空气中干燥后，加入20μL Elution Buffer缓冲液溶解附着体质粒。
无菌状态下取新鲜制备的感受态细胞250μL，转移至灭菌的4mL离心管中，加入10μL提取的附着体质粒进行转化，将转化的菌液均匀涂布于整个含卡那霉素的琼脂平板表面，置37℃培养箱中过夜培养，直至阳性转化子长出，从培养的平板上挑取阳性转化子置于装有3mL LK液体培养基的试管中，37℃摇床过夜培养，常规方法提取质粒，酶切鉴定。从转染pEME的CHO细胞中还原出的质粒经Kpn Ⅰ单酶切、Kpn Ⅰ/BamH Ⅰ和Ase Ⅰ/Nhe Ⅰ双酶切能切出大小为5813bp的线性质粒片段、插入的387bp的核基质结合区特征性片段和1335bp的启动子EF-1α片段(见图5，M：DL5000，1：还原质粒，2：转染pEME质粒的CHO细胞中还原质粒KpnⅠ单酶切，3：转染pEME质粒的CHO细胞中还原质粒Kpn Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切，4：转染pEME质粒的CHO细胞中还原质粒Ase Ⅰ/Nhe Ⅰ双酶切)。
三、荧光原位杂交
培养细胞中期染色体制备：当细胞系的融合达到约85％时(75％～90％均可)，于每5mL的培养基细胞中加入40μL秋水仙素，继续培养2h收集细胞；加入10mL 37℃水浴预热的0.075mol/L KCl溶液于15mL离心管中，用力吹打散开，37℃水浴低渗30min，每8min用吸管吹打一次，使细胞充分分散悬浮于溶液中；向离心管中加1.5mL固定液并用吸管轻轻吹匀，预固定10min；2000rpm离心5min，弃上清液；固定Ⅰ：沿管壁慢慢加入固定液6mL，用吸管吹打成细胞悬液后，37℃水浴20min；1000rpm离心10min，弃上清液；固定Ⅱ：操作步骤同固定Ⅰ；1000rpm离心10min，弃部分上清液，留下上清液的量使得细胞保持牛奶状细胞团(一般为0.5～1mL)，用吸管吹打成细胞悬液；滴片：用吸管吸取少量细胞悬液，高度35cm(30～40cm均可)垂直滴在预冷的载玻片上，室温晾干；老化：染色体片子于37℃老化4d(1～7d均可)；使用前玻片于60℃温箱孵育3.5h(3～4h均可)。
将4mL(3～5mL均可)变性液置于74±1℃水浴或杂交仪平衡40min(至少30min，此时需注意容器内和实际温度)，将玻片浸入杂交液中4min(依据玻片的制备时间每增加一周，时间增加2min)；梯度脱水：立即放入冰冷的70％酒精中3min，然后依次置于85％、100％酒精缸中脱水，各1min；使用前置于40℃(37～45℃均可)温箱中备用。
将探针置于PCR仪内变性，程序设为：77℃5min，37℃2min，将变性后的探针加在完全干燥的玻片上(注意避光)，Rubber胶封片，杂交过夜15h(12～18h均可)；准备2缸洗液，1缸置于72℃，另一缸置于室温；将玻片置于72℃缸40min(至少30min)，轻轻揭去玻片上的胶(如果不好揭开或者避免干燥，可以先放在常温洗液里)；将玻片放入72℃缸洗涤2min，常温缸洗涤2min；再将玻片依次放入75％、85％、100％酒精缸中脱水，各1min，脱水后空气中干燥；复染并观察结果，加二氨基苯基吲哚(DAPI)20μL复染，加盖玻片，置于暗处20min，荧光显微镜观察结果并采集图像。结果表明：pEME载体在CHO细胞的有丝分裂期以附着于染色体外的形式存在(见图6)。
实施例2
含神经生长因子(NGF)的pEME-NGF表达载体的构建，包括：
1、PCR扩增NGF目的片段
根据人的NGF基因cDNA序列(GenBank登录号：AF150960.1)设计PCR引物P7和P8(如SEQ ID NO:9～10所示)，为实现定向克隆，引物的5’端分别引入HindⅢ、Kpn Ⅰ酶切位点(见下划线处)，NGF基因的引物序列为：
P7：5′-GCCAAGCTTATGTCCATGTTGTTCTACACTCT-3′；
P8：5′-TTAGGTACCTCAGGCTCTTCTCACAGCCTTCCT-3′。
取人外周血液，用DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA作为模板，采用常规PCR扩增方法进行扩增，PCR体系如下：ddH2O 17.0μL，P7、P8(10μmol/L)各1.0μL，10×PCRbuffer 2.5μL，dNTP(25μmol/L)2.0μL，DNA模板(100ng/μL)1.0模板DNA，Taq酶(5U/μL)0.5μL，共计25μL；PCR条件如下：95℃3min，94℃40s，60℃30s，72℃40s，30个循环，72℃3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证，结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的NGF基因cDNA序列完全一致。
2、pEME-NGF载体的构建
a.酶切反应
利用HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切PCR扩增的NGF基因，同时用HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切pEME载体，酶切体系为：质粒(0.8μg/μL)10μL，10×M buffer 2μL，HindⅢ/Kpn Ⅰ(10U/μL)各0.5μL，补三蒸水至20μL，充分混合均匀，37℃水浴6h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的NGF基因片段和线性pEME质粒。
b.连接
酶切回收后的NGF基因片段与线性pEME质粒按照摩尔比4:1连接，连接体系为：线性pEME质粒(1μg/μL)1μL，酶切后的NGF基因片段(1μg/μL)4μL，10×DNA ligase buffer1μL，T4连接酶(350U/μL)0.5μL，补三蒸水至20μL，充分混合均匀，16℃反应过夜。
c.转化与鉴定
将连接产物加入到E.coli JM109感受态细胞悬液中进行转化，后接种在含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，用HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切重组质粒，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，目的基因序列完全正确的载体命名为pEME-NGF。
实施例3
pEME-NGF载体转染CHO细胞表达系统的建立，包括：
CHO细胞于37℃、5％CO2条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，转染方法按照脂质体2000转染试剂盒说明书进行(操作同上述试验例)，转染24h后，用800μg/mL的G418培养液加压筛选2周，待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25％胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，分至96孔培养板继续培养，培养7d后转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达85％时(80％～90％均可)，收集细胞即可。
试验例2
含不同启动子的载体转染CHO细胞后NGF表达情况
1、含神经生长因子(NGF)的pEGFP-C1-M-NGF表达载体的构建，包括：
1)PCR扩增NGF目的片段
操作同实施例2。
2)pEGFP-C1-M-NGF载体的构建
利用HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切NGF基因PCR扩增产物和pEGFP-C1-MAR载体，凝胶电泳鉴定后回收酶切后的NGF基因片段和线性pEGFP-C1-MAR质粒，按照摩尔比15:51连接，16℃反应过夜，将连接产物加入到E.coli JM109感受态细胞悬液中转化，后接种在含卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取单菌落继代培养，用HindⅢ、Kpn Ⅰ双酶切重组质粒，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，目的基因序列完全正确的载体命名为pEGFP-C1-M-NGF。
3)pEGFP-C1-M-NGF载体转染CHO细胞表达系统的建立
操作同实施例3。
4)NGF蛋白表达量的检测
采用ELISA检测pEME-NGF、pEGFP-C1-M-NGF载体在CHO细胞中表达NGF蛋白的水平。结果显示，转染pEME-NGF、pEGFP-C1-M-NGF载体的NGF蛋白的表达量均明显高于未转染组(未转染组NGF蛋白的表达量设为1)(见图7，*P<0.05)，同时转染pEME-NGF载体的NGF蛋白的表达量是pEGFP-C1-M-NGF载体的2.6倍(见图7，#P<0.05)。
实施例及试验例中涉及工具酶、质粒载体、细胞系及试剂等均为市售商品。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞购自中国科学院上海细胞库。
Figure IDA0000976236510000011
Figure IDA0000976236510000021
Figure IDA0000976236510000031
Figure IDA0000976236510000041

Claims (4)

1.一种人类及哺乳动物细胞附着体表达载体，其特征在于：包含核基质结合区特征性序列和EF-1α启动子序列；核基质结合区特征性序列如SEQ ID NO:1所示；EF-1α启动子序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的附着体表达载体，其特征在于：其出发载体为人类和哺乳动物细胞表达载体。
3.如权利要求1或2所述附着体表达载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)构建pEGFP-C1-MAR载体
利用KpnⅠ、BamHⅠ双酶切pEGFP-C1载体与核基质结合区特征性序列，回收酶切片段，连接、转化与鉴定，得到pEGFP-C1-MAR载体；
2)构建pEME载体
利用AseⅠ、NheⅠ双酶切pEGFP-C1-MAR载体与EF-1α启动子序列，回收酶切片段，连接、转化与鉴定，得到pEME载体。
4.含神经生长因子的附着体表达载体，其特征在于：包含核基质结合区特征性序列、EF-1α启动子序列和神经生长因子基因序列；核基质结合区特征性序列如SEQ ID NO:1所示；EF-1α启动子序列如SEQ ID NO:2所示；神经生长因子基因序列在GenBank登录号为AF150960.1。
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