CN112143756B

CN112143756B - 一种基于AdEasyTM系统的高效重组腺病毒载体的制备方法和应用

Info

Publication number: CN112143756B
Application number: CN202010974584.8A
Authority: CN
Inventors: 周明光; 邵伟; 汤细彪; 徐高原; 曾小燕; 郝根喜; 金建云; 陈章表
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2020-09-16
Filing date: 2020-09-16
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2040-09-16
Also published as: CN112143756A

Abstract

本发明涉及一种基于AdEasy^TM系统的高效重组腺病毒载体的制备方法和应用，所述重组腺病毒载体为含有prrn基因的穿梭载体pShuttle‑IRES‑hrGFP‑1，所述prrn基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明通过将序列经过优化的原核生物16S RNA启动子Prrn整合至穿梭载体pShuttle‑IRES‑hrGFP‑1上，使得pAdEasy‑1与穿梭载体重组成功的菌落会失去氨苄抗性并发绿光，可以轻易地实现成功重组的腺病毒重组子的筛选。本发明提供的重组腺病毒载体在应用于重组蛋白的表达时，可以在较大程度上提高腺病毒重组子的筛选效率，将筛选时间由2～3天缩短至即刻实现。

Description

一种基于AdEasyTM系统的高效重组腺病毒载体的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种基于AdEasy^TM系统的高效重组腺病毒载体的制备方法和应用。

背景技术

腺病毒载体已被广泛用作疫苗输送系统，用于治疗狂犬病、人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)、疟疾、丙型肝炎病毒(HCV)和流感等多种传染病。腺病毒载体也被用作治疗性癌症疫苗，它使免疫系统能够识别癌细胞并影响癌细胞的生长或抑制癌细胞的生长。它可以针对肿瘤特异性抗原的免疫，这可以通过腺病毒介导的肿瘤相关抗原(TAAs)或免疫调节分子来实现。

重组腺病毒载体已广泛应用于各种细胞和组织的体外和体内传递外源基因。它们可以很容易地生长到高滴度，并且可以有效地将基因转移到分裂和非分裂的细胞中。病毒基因组以附加体的形式存在于转化细胞的细胞核中。由于腺病毒介导的基因不在染色体外复制，很少整合到宿主染色体中，因此腺病毒介导的基因表达是可变的，并且依赖于诸如细胞转化和针对转基因细胞的免疫反应等因素。腺病毒载体不仅是一种很有前途的基因治疗载体，而且是哺乳动物细胞基因转移的重要工具。然而，构建腺病毒载体是一个耗时繁琐的过程。

常用的方法AdEasy^TM腺病毒载体构建系统，通过共转化腺病毒主干质粒载体pAdEasy-1和携带目的基因的穿梭载体pShuttle之间的双重组事件构建重组腺病毒。即将目的基因在大肠杆菌DH5α中与穿梭载体pShuttle重组，再将重组穿梭载体pShuttle与大肠杆菌BJ5183中携带腺病毒基因组的pAdEasy-1重组，最后将双重组载体线性化并转染HEK293细胞进行表达分析。这就不需要在体外操纵大的腺病毒DNA分子，而产生重组腺病毒所需的时间也缩短了几周。AdEasy^TM腺病毒载体构建系统将重组穿梭载体pShuttle与大肠杆菌BJ5183中携带腺病毒基因组的pAdEasy-1重组，但该系统在筛选重组腺病毒重组子方面仍存在诸多不便。传统的方法是从分离良好的最小菌落中挑选10个或更多菌落，然后用不同的限制性酶消化或双重PCR方法进行验证。这将需要大约2-3天，是一个相对耗时且劳动繁琐的流程(Dalibor Antolovic，et al.，2005)。

除了腺病毒载体系统外，重组杆状病毒(Bacmid)由于既能像质粒一样在E.coli中复制，也能像病毒一样感染昆虫细胞，常常也被用来进行目的蛋白的表达。Bacmid为一包含有mini-F复制子、卡那霉素抗性筛选标记和细菌转座子Tn 7的靶序列attTn7e及LacZ片段的重组病毒。转移载体的作用在此被贡献质粒所取代。贡献质粒设计为含抗庆大霉素基因和多角体蛋白启动子控制的外源基因两侧分别为tn7的左臂和右臂。同时为了产生位点特异的转座，还需有一个辅助质粒(该质粒为四环素抗性筛选标志)提供转座蛋白。因此，当将bacmi d、贡献质粒、辅助质粒转化同一个菌株时，由辅助质粒产生的转座蛋白，将抗庆大霉素基因和多角体蛋白启动子控制的外源基因转座到bacmid的attTn7序列上，同时破坏了Lac-Z的阅读框架，这样只要将转化上述质粒的菌株在含卡那霉素、四环素、庆大霉素及X-gal和IP TG的LB培养基上筛选白斑即可得到复合Bacmid。将复合Bac midDN A纯化后转染昆虫细胞，就得到了纯的重组病毒，在昆虫细胞中外源基因在多角体启动子的控制下进行表达。该系统是目前重组病毒筛选系统中中最为方便、快捷的系统，但是为了避免假阳性重组子，在筛选过程中，长出的白斑需要进行2-3轮的划线纯化。因此，该系统也耗时耗物，存在诸多不便。整个重组病毒筛选的周期为7-10d左右。

原核生物16S RNA启动子Prrn是一个组成型强启动子，它只能在原核细胞中表达，在高等真核细胞细胞核中则不能被转录复合物中的特异性启动子识别因子σ因子识别，不能起作用。该特点使Prrn启动子在植物叶片叶绿体中表达毒性蛋白或对细胞生长有影响的外源蛋白时有独特的应用。比如当小分子佐剂大肠杆菌肠毒素B亚基(LTB)通过烟草核基因组表达时，LTB积累在叶片可溶性有效蛋白在蛋白总量的0.01％以下。而当整合到叶绿体基因组进行表达时，叶片中可溶性有效蛋白的量提高了14倍。(Daniell H.,Lee S B.,Panchal T.,Wi ebe P O.(2001))。

发明内容

为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种基于AdEasy^TM系统的高效重组腺病毒载体的制备方法和应用。

第一方面，本发明提供一种基于AdEasy^TM系统的高效重组腺病毒载体，所述高效重组腺病毒载体为含有prrn基因的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1，所述prrn基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

进一步地，所述所述prrn基因位于所述穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中IRES和hrGFP之间。

本发明进一步提供用于鉴定所述高效重组腺病毒载体的引物对，包括如下核苷酸序列的引物：

prrn-F：5’-GCCACAACCATGGTGGCTCCCCCGCCGTCGTTCAATGAGA-3’，

prrn-R：5’-TTAAATCTAGAGAGTCGACCGGCATGGACGAGCTGTACAA-3’。

穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1本身是本领域AdEasy^TM系统常用的载体，可市售购得。本发明通过将原核生物16S RNA启动子Prrn序列进行改造(将其中的taa突变为caa，tag突变tac)，然后插入到AdEasy^TM系统穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1的IRES和hrGFP之间。突变改造后的Prrn在原核细胞中时保留其启动子功能，转入真核细胞后启动子功能不发挥作用，但是在真核细胞CMV启动子的启动下，作为融合蛋白与hrGFP一起表达而不发生断码。

利用本发明，将目的基因插入到穿梭载体pShuttle-IRES-prrn-hrG FP-1上，然后在大肠杆菌BJ5183中与携带腺病毒基因组的pAdEasy-1重组。在Prrn的启动下，pAdEasy-1与穿梭载体重组成功的菌落会失去氨苄抗性并发绿光，此时挑发绿光且不能再氨苄抗生素平板上生长的菌落即可。

第二方面，本发明进一步提供所述高效重组腺病毒载体的制备方法，包括：

获得prrn基因的基因片段，通过同源重组将所述prrn基因的基因片段构建至穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中；所述prrn基因包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明进一步提供含有所述高效重组腺病毒载体的生物材料，所述生物材料为质粒、转基因细胞或试剂盒。

第三方面，本发明提供一种筛选含有目的蛋白的腺病毒重组子的方法，包括：通过将所述目的蛋白的编码基因构建至所述高效重组腺病毒载体进行所述目的蛋白的表达，在腺病毒重组子的筛选过程中选择发绿光且不抗氨苄的菌落。

第四方面，本发明提供一种腺病毒表达系统，所述腺病毒表达系统通过所述方法进行含有目的蛋白的腺病毒重组子的筛选。

本发明进一步提供所述高效重组腺病毒载体或所述腺病毒表达系统在重组蛋白的表达中的应用。

本发明具备如下有益效果：

本发明对原核组成型表达启动子16S RNA启动子prrn进行了改造，该启动子原本在原核细胞中能高效启动转录，而在真核生物中则失去作用。而在改造后，本发明将prrn插入到AdEasy^TM系统穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1的IRES和hrGFP之间，使得突变改造后的Prrn在原核细胞中时保留其启动子功能，转入真核细胞后启动子功能不发挥作用，但是在真核细胞CMV启动子的启动下，作为融合蛋白与hrGFP一起表达而不发生断码。

本发明将prrn插入到的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1的IRES和hrGFP之间后，在大肠杆菌BJ5183中与携带腺病毒基因组的pAdEasy-1重组。在Prrn的启动下，pAdEasy-1与穿梭载体重组成功的菌落会失去氨苄抗性并发绿光，因此，在腺病毒重组子的筛选过程中挑发绿光且不能再氨苄抗生素平板上生长的菌落即可。这是一种快速，便捷，可视化的高效筛选重组腺病毒的新方法。

附图说明

图1为本发明实施例提供的重组腺病毒载体的构建和实际应用的流程图，其中A为重组腺病毒载体的构建过程，B为重组腺病毒载体转化大肠杆菌BJ5183，C为重组腺病毒载体转染HEK-293T细胞；

图2为本发明实施例1提供的16S RNA启动子Prrn突变体筛选过程示意图；

图3为本发明实施例2提供的A.pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1腺病毒重组子转染HEK-293T细胞后的检测结果；

图4为本发明实施例3提供的猪瘟病毒E2蛋白腺病毒重组子的PCR和酶切验证结果图；其中A为pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1腺病毒重组子中E2蛋白基因PCR检测，B为pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1腺病毒重组子Pac1酶切检测；

图5为本发明实施例4提供的pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1腺病毒重组子转染HEK-293T细胞后，E2蛋白表达检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

本发明实施例通过将原核生物16S RNA启动子Prrn序列进行改造(通过将序列中的taa突变为caa，tag突变tac)，然后插入到AdEasy^TM系统穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1的IRES和hrGFP之间。突变改造后的Prrn在原核细胞中时保留其启动子功能，转入真核细胞后启动子功能不发挥作用，但是在真核细胞CMV启动子的启动下，作为融合蛋白与hrGFP一起表达而不发生断码。

利用本发明，将猪瘟病毒E2蛋白基因插入到穿梭载体pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1上，然后在大肠杆菌BJ5183中与携带腺病毒基因组的pAdEasy-1重组。在Prrn的启动下，pAdEasy-1与穿梭载体重组成功的菌落会失去氨苄抗性并发绿光，因此，直接挑选发绿光且不能再氨苄抗生素平板上生长的菌落即可。

本发明的工作原理如图1所示。

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施本例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂，如未特别说明，均为商业化或是已公开的实际材料。

实施例1:原核组成型表达启动子16S RNA启动子prrn的突变体筛选

1、原核组成型表达启动子16S RNA启动子prrn基因序列的获得

参照文献(Daniell H.,Lee S B.,Panchal T.,Wiebe P O.(2001)中的Prrn启动子序列人工合成Prrn启动子基因序列(SEQ ID NO:2)。该基因由生工生物工程(武汉)股份有限公司合成。

2、16S RNA启动子prrn突变体的筛选。

2.1引物设计及PCR

首先设计引物(表1)通过PCR的方式(表2)分别得到prrn序列和穿梭载体序列，经同源重组将prrn基因序列插入到AdEasy^TM系统穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1的IRES和hrGFP之间构件新穿梭载体pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1。经测序验证，插入序列与位置均无误。且转化后的BJ5183菌株发绿光，表明prrn启动子启动功能正常。经分析，当该载体转入真核细胞中有CMV启动子启动转录时，prrn序列中含有2个终止密码子taa和tag(图2)。为了防止断码，遂设计引物(表1)通过反扩载体将其进行逐个突变使其能无中断，连续编码。

表1 prrn序列和穿梭载体序列引物及突变prrn序列引物

表2 PCR反应体系

相关的正向引物和反向引物为融合基因的首位引物。模板为重组质粒。PCR反应条件为：

98℃预变性5min，98℃变性15Sec，58℃退火15Sec，72℃延伸25Sec，25个循环4℃∞。PCR结束后，取2ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。PCR电泳结果显示，PCR结果得到预期大小基因片段。

2.2大肠杆菌BJ5183转化

重组质粒pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1及其突变体转化大肠杆菌BJ5183

在含转化质粒的EP管冰上放置5min，并加大肠杆菌BJ5183感受态细胞50μL，轻柔混匀，冰浴30min。42℃热激45s，迅速冰浴2-3min。加入200μL NZY液体培养基，37℃，250rpm摇床培养1h。取菌液涂于添加了四环素的LB平板，37℃倒置培养。

结果显示，当将第1个终止密码子taa突变为caa时，转化后的BJ5183菌株发绿光，表明该突变不影响prrn启动子的启动功能。将第2个终止密码子突变为cag、ttg、tcg、tat时，转化后的BJ5183菌株均不发绿光，只有将其突变为tac时，转化后的BJ5183菌株才发绿光(图2)。结果表明，只有将第2个终止密码子tag突变为tac时，prrn启动子才有启动转录功能。因此，得到的有功能的16S RNA启动子prrn突变体，序列如下(SEQ ID NO:1)：

Prrn:5’-gctcccccgccgtcgttcaatgagaatggacaagaggctcgtgggattgacgtgagggggcagggatggctatatttctgggagcgaactccgggcgaatacgaagcgcttggataccttcacttgtacagctcgtccatgccggtcgact-3’。

实施例2：筛选到的prrn突变体插入穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1且载体在原核和真核细胞中均具备hrGFP绿色荧光指示功能。

1、由实施例1可知，筛选到的prrn突变体在原核细胞中仍具有启动转录的功能，能转录表达hrGFP绿色荧光蛋白。

2、为了验证新穿梭载体pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1在真核细胞293T中是否正常表hrGFP并发光，我们进行了细胞验证试验，步骤如下：

2.1重组腺病毒的抽提

(1)挑取发绿光且在氨苄抗生素上不生长的单菌落到5ml LB培养基(卡那：50μg/ml)，250rpm，37℃生长12h。

(2)去1.5-3ml培养物加到EP管，14000g室温离心1min。

(3)用移液枪吸去残留液，向沉淀中加入250μg的溶液一(普通质粒抽提试剂盒)，重悬沉淀。

(4)加入250μg的溶液二(普通质粒抽提试剂盒)，轻轻混匀。

(5)加入350μg的溶液三(普通质粒抽提试剂盒)，轻轻混匀。此时会出现白色沉淀，将EP管冰上放置5min。

(6)4℃，14000g离心10min，将上清轻轻转移至含有异丙醇的离心管中，不要将白色沉淀进去，轻轻倒转离心管数次，混匀，冰上放置5-10min。

(7)室温14000g离心15min，弃上清，离心管内加70％乙醇0.5ml，反转离心管数次，清洗沉淀，室温14000g离心5min，重复一次。

(8)尽可能地移去上清，室温下将离心管空气干燥5-10min，待沉淀变成无色透明之后每管加适量TE溶解,并测其浓度。

2.2重组腺病毒转染293T细胞

(1)转染前一天将293T细胞细胞密度(0.8×106cell/ml)铺一个6孔板，铺两个孔，一个为转染组，一个为对照组，培养基为DMEM+10％FBS，1％Glutamax，1％青霉素-链霉素。

(2)第二天，镜下检查细胞。六孔板内细胞密度大概90％，分布均匀。

(3)转染前1小时，取出细胞板，去除原有细胞培养基，每孔加入1ml的Opti-MEM培养基，将细胞送回培养箱。

(4)取两支无菌的EP离心管，均加入100μl Opti-MEM培养基，其中一支中加入Pac1线性化后的pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1载体质粒2μg，另一支中加入转染试剂Lippo20005μl。轻弹EP管底部混匀，室温放置5min。5min后将两EP管内容物加到其中一个EP管中，轻弹EP管底部混匀，室温孵育30min。将室温孵育30min的大概200μl溶液加入铺细胞6孔板中的一个孔，上下左右晃动混匀。对照孔操作一样，只是不加pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1载体质粒。

(5)5小时后，移去细胞上清，更换为2ml的DMEM完全培养基。

转染后一天用荧光显微镜观察细胞是否带有荧光的。结果显示(图3)，转染组有细胞发绿光，而对照组细胞不发光。表明穿梭载体pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1在真核细胞293T中能正常表达hrGFP并发光。

实施例3：重组猪瘟病毒E2蛋白腺病毒的筛选

1、pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1穿梭载体的构建及大肠杆菌BJ5183转化

设计引物(表3)通过PCR的方式分别得到E2蛋白基因序列和穿梭载体序列，经同源重组将E2基因序列(SEQ ID NO:3)插入到AdEasy^TM系统穿梭载体pShuttle-IRES-prrn-hrGFP-1中，构建重组载体pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1。

表3 E2蛋白引物序列和穿梭载体引物序列

重组质粒pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1及其突变体转化大肠杆菌BJ5183，在含转化质粒的EP管冰上放置5min，并加大肠杆菌BJ5183感受态细胞50μL，轻柔混匀，冰浴30min。42℃热激45s，迅速冰浴2-3min。加入200μLNZY液体培养基，37℃，250rpm摇床培养1h。取菌液涂于添加了四环素的LB平板，37℃倒置培养。

2、猪瘟病毒E2蛋白腺病毒重组子筛选

根据实施例2，挑选发绿光且在氨苄抗生素上不生长的单菌落即为猪瘟病毒E2蛋白腺病毒重组子。

3、猪瘟病毒E2蛋白腺病毒重组子的PCR验证和酶切验证

3.1重组腺病毒的抽提

(1)挑取发绿光且在氨苄抗生素上不生长的单菌落到5ml LB培养基(卡那霉素：50μg/ml)，250rpm，37℃生长12h。

(2)取1.5-3ml培养物加到EP管，14000g室温离心1min。

(4)加入250μg的溶液二(普通质粒抽提试剂盒)，轻轻混匀。

3.2猪瘟病毒E2蛋白腺病毒重组子的PCR验证

设计猪瘟病毒E2蛋白基因引物(表3)做PCR，以抽提的重组腺病毒基因组为模板，进行PCR验证。结果显示(图4中的A)，E2蛋白基因已经整合到腺病毒基因组中。

3.3猪瘟病毒E2蛋白腺病毒重组子的酶切验证

用PacⅠ限制酶酶切重组腺病毒质粒DNA进行验证时，如果重组成功，可得到约30kb的大片段，而较小的片段则为3.0kb(如果重组发生在左臂之间)或4.5kb(如果重组发生在复制起点)。未发生重组的腺病毒基因组Pac1酶切只产生30kb大小的一条带。结果显示(图4中的B)，抽提的腺病毒基因组酶切后产生两条带，表明pShuttle-E2-I RES-prrn-hrGFP-1和腺病毒基因组重组成功。

4、猪瘟病毒E2蛋白重组腺病毒蛋白表达验证

4.1重组腺病毒转染293T细胞

(4)取两支无菌的EP离心管，均加入100μl Opti-MEM培养基，其中一支中加入Pac1线性化后的pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1载体质粒2μg，另一支中加入转染试剂Lippo2000 5μl。轻弹EP管底部混匀，室温放置5min。5min后将两EP管内容物加到其中一个EP管中，轻弹EP管底部混匀，室温孵育30min。将室温孵育30min的大概200μl溶液加入铺细胞6孔板中的一个孔，上下左右晃动混匀。对照孔操作一样，只是不加pShuttle-E2-IRES-prrn-hrGFP-1载体质粒。

(5)5小时后，移去细胞上清，更换为2ml的DMEM完全培养基。

4.2免疫荧光分析

为了检测CSFV-E2蛋白的表达，转染的HEK293细胞在感染后24小时用无水乙醇浸泡20分钟，然后用PBS洗涤。然后，加入抗E2单克隆抗体(MAb)，在37℃下孵育2h。用PBS洗涤3次后，将细胞与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG(Sigma Aldrich，USA)在37℃下孵育1h，并用PBS洗涤。用PBS洗涤后，用荧光显微镜观察感染细胞中的荧光信号。对照孔的HEK293细胞作为阴性对照。

结果显示(图5)，实验组细胞有荧光信号，而对照组没有。表明转染猪瘟病毒E2蛋白重组腺病毒的293T细胞成功表达猪瘟病毒E2蛋白。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种基于AdEasy™系统的高效重组腺病毒载体的制备方法和应用

<130> KHP201115088.6

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga caagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 60

cagggatggc tatatttctg ggagcgaact ccgggcgaat acgaagcgct tggatacctt 120

cacttgtaca gctcgtccat gccggtcgac t 151

<210> 2

<211> 151

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 60

cagggatggc tatatttctg ggagcgaact ccgggcgaat acgaagcgct tggatagctt 120

cacttgtaca gctcgtccat gccggtcgac t 151

<210> 3

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtattaa gagggcagat cgtgcaaggt gtgatatggc tgctactagt aactggggca 60

caaggccggc tagcctgcaa ggaagattac aggtacgcaa tatcatcaac caatgagata 120

gggctactcg gggccggagg tctcactacc acctggaaag aatacagcca cgatttgcag 180

ctgaatgacg ggaccgttaa ggccatttgc gtggcaggtt cctttaaagt cacagcactt 240

aatgtggtca gtaggaggta tttggcatca ttgcataagg gggctttact cacttccgtg 300

acattcgagc tcctgttcga cgggaccaac ccatcaaccg aagaaatggg agatgacttc 360

gggttcgggc tgtgcccgtt tgatacgagt cctgttgtca agggaaagta caatacaacc 420

ttgttgaacg gtagtgcttt ctaccttgtc tgcccaatag ggtggacggg tgttatagag 480

tgcacagcag tgagcccaac aactctgaga acagaagtgg taaagacctt caggagagag 540

aagccttttc cacacagaat ggattgtgtg accaccacag tggaaaatga agatctattc 600

tactgtaagt tggggggcaa ctggacatgt gtgaaaggtg aaccagtggt ctacacaggg 660

gggcaagtaa aacaatgcaa atggtgtggc ttcgacttca acgaacctga cggacttccc 720

ccccctttcc ccataggtaa gtgcattttg gcaaatgaga caggttacag aatagtagat 780

tcaacggact gtaacagaga tggcgttgta atcagcgcag aggggagtca tgagtgcttg 840

atcggcaaca caactgtcaa ggtgcatgca tcagatgaga gactgggccc tatgccatgc 900

agacctaaag agattgtctc tagtgcagga cctgtaagga aaacttcctg tacattcaac 960

tacgcaaaaa ctttgaagaa caagtactat gagcccaggg acagctactt ccagcaatat 1020

atgctcaagg gcgagtatca gtactggttt gacctggacg tgacagaccg ccactcagat 1080

tacttcgcag aatttgtcgt cttggtggtg gtagcactgt taggaggaag atatgtcctg 1140

tggctgatag tgacctacat agttctaaca gaacaactcg ccgctggtta a 1191

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gccacaacca tggtggctcc cccgccgtcg ttcaatgaga 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttaaatctag agagtcgacc ggcatggacg agctgtacaa 40

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gactctctag atttaagaag gagatataca tc 32

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caccatggtt gtggccatta tcatcgtgtt tttc 34

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aatggacaag aggctcgtgg gattgacgtg aggggg 36

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cctcttgtcc attctcattg aacgacg 27

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggatatctt cacttgtaca gctcgtccat gccggtcgac tctagagg 48

<210> 11

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtgaagat atccaagcgc ttcgtattcg cccggagttc gctcccag 48

<210> 12

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggatacctt cacttgtaca gctcgtccat gccggtcgac tctagagg 48

<210> 13

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aagtgaaggt atccaagcgc ttcgtattcg cccggagttc gctcccag 48

<210> 14

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcttggattg cttcacttgt acagctcgtc catgccggtc gactctag 48

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaagcaatc caagcgcttc gtattcgccc ggagttcgct cccagaaa 48

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcttggatcg cttcacttgt acagctcgtc catgccggtc gactctag 48

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgaagcgatc caagcgcttc gtattcgccc ggagttcgct cccagaaa 48

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcttggacag cttcacttgt acagctcgtc catgccggtc gactctag 48

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgaagctgtc caagcgcttc gtattcgccc ggagttcgct cccagaaa 48

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

agagatctgc ggccgcatgg tattaagagg gcagatcgtg 40

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tcgaccgatc ggatatctta accagcggcg agttgttctg tt 42

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gatatccgat cggtcgaccc cctctccctc ccc 33

<210> 23

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcggccgcag atctctagcg gatctgacgg tt 32

Claims

1.一种基于AdEasy^TM系统的高效重组腺病毒载体，其特征在于，所述高效重组腺病毒载体为含有prrn基因的穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1，所述prrn基因为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的高效重组腺病毒载体，其特征在于，所述prrn基因位于所述穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中IRES和hrGFP之间。

3.用于鉴定权利要求1或2所述高效重组腺病毒载体的引物对，其特征在于，所述引物对包括如下核苷酸序列的引物：

prrn-F：5’-GCCACAACCATGGTGGCTCCCCCGCCGTCGTTCAATGAGA-3’，

prrn-R：5’-TTAAATCTAGAGAGTCGACCGGCATGGACGAGCTGTACAA-3’。

4.权利要求1或2所述高效重组腺病毒载体的制备方法，其特征在于，包括：

获得prrn基因的基因片段，通过同源重组将所述prrn基因的基因片段构建至穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1中；所述prrn基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.含有权利要求1或2所述高效重组腺病毒载体的生物材料，其特征在于，所述生物材料为质粒、转基因细胞或试剂盒。

6.一种筛选含有目的蛋白的腺病毒重组子的方法，其特征在于，包括：通过将所述目的蛋白的编码基因构建至权利要求1或2所述高效重组腺病毒载体进行所述目的蛋白的表达，在腺病毒重组子的筛选过程中选择发绿光且不抗氨苄的菌落。

7.一种腺病毒表达系统，其特征在于，所述腺病毒表达系统通过权利要求6所述方法进行含有目的蛋白的腺病毒重组子的筛选。

8.权利要求1或2所述的高效重组腺病毒载体在快速筛选腺病毒重组子中的应用。

9.权利要求1或2所述的高效重组腺病毒载体或权利要求7所述腺病毒表达系统在重组蛋白的表达中的应用。