CN101870987A - 一种山羊scd基因重组腺病毒载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：A1，构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD；A2，重组腺病毒载体Ad-SCD的构建，通过对SCD基因过表达，将可能引起乳腺或其它组织合成脂肪酸含量及组成的改变，进而提高山羊乳及其产品的营养价值。由于采用细菌重组的方法不仅可以最大程度上避免野生型腺病毒的产生，而且重组成功率较高。另外，本方法不需要进行多轮费时的病毒空斑化筛选，大大缩短了实验周期，提高了成功率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法。
背景技术
腺病毒载体具有转染效率高、感染细胞范围广、病毒滴度高等优点，可感染处于细胞周期中的静止期和分裂期细胞，同时可介导基因的体内外转移，是一种高效的基因转移载体。构建重组腺病毒载体并在293细胞中包装成熟病毒颗粒是应用腺病毒作为媒介表达目标基因的前提。绿色荧光蛋白(GFP)是试验中广泛应用的一种蛋白指示剂，可作为观察测定病毒感染和外源基因表达水平以及检测生物安全和载体示踪的标记蛋白。
SCD是一种膜结合蛋白，在牛、小鼠及人上的结构基本一致。目前，多个物种的SCD基因相继被分离，包括人、小鼠、大鼠、猪、鸡、绵羊和山羊等。山羊SCD基因cDNA全长5123bp，包含1080bp的开放阅读框，编码359个氨基酸，有6个外显子和5个内含子，位于山羊染色体26q21区域。SCD基因一共发现存在5种亚型，在脂质代谢中具有重要意义，对体内三酰甘油、胆固醇酯、磷脂和蜡酯等的合成起关键作用，SCD的调控对维持机体正常生理状态和体内脂质内环境的稳定意义重大。SCD的表达及活性受到多种因素的影响，包括饲粮的成分、激素的不平衡、动物发育阶段、温度变化、维生素、酚类化合物等。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法。
一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法，包括以下步骤：A1，构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD；A2，重组腺病毒载体Ad-SCD的构建。
所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行以下操作：
A11，连接反应：将pGEM-T-SCD质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Xho I双酶切，双酶切反应体系为50μL；1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收纯化SCD小片段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度计测定产物浓度，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜；
A12，连接产物转化及鉴定：取A11所得的连接产物10μL加入到含TOP10感受态细菌的离心管中，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速转移至冰上1-2min，加入800μL无抗性LB培养液，37℃温和震荡培养45min；取适量菌液涂布于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃孵育过夜；挑取小的单克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基中摇菌12-14h、200r/min，提取质粒，凝胶电泳检测后，进行Kpn I/Xho I双酶切鉴定。
所述的构建方法，所述步骤A11连接反应体系为回收SCD片段，7.0μL；回收pAdTrack-CMV片段，10.0μL；10×T4DNA Ligase Buffer，2.0μL；T4 DNA连接酶，1.0μL；总体积20.0μL。
所述的构建方法，所述步骤A2具体执行以下操作：A21，制备含骨架载体pAdEasy-1的感受态BJ5183菌；A22，穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化；A23，同源重组。
所述的构建方法，所述步骤A21具体执行以下操作：(1)取100μLBJ5183菌液加入到5mL无抗性液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3-0.4；(2)将菌液置冰上冰浴20min，4℃，4000r/min离心10min；(3)倒掉菌液，将离心管倒置于干净吸水纸上除去残液，加入0.5mL0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，补充至20mL，混匀后冰浴20min；(4)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，混匀后冰浴20min；(5)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，冰浴20min；(6)在感受态菌液中加入终浓度10％的甘油，每管200μL分装后-70℃保存备用。
所述的构建方法，所述步骤A22具体执行以下操作：将鉴定正确的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD质粒用Pme I酶切线性化，反应体系如下：10×NEB Buffer 4，5.0μL；质粒pAdTrack-CMV-SCD，≤2μg；100×BSA，0.5μL；Pme I酶，1.0μL；余量dd H2O至总体积50.0μL。
所述的构建方法，所述步骤A23具体执行以下操作：将穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化产物，直接转化含腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183，进行同源重组；而后接种于含卡那抗性的LB平板上，37℃孵育过夜，通过平板初步筛选鉴定具有重组子的菌落，进行小量培养后，制备质粒DNA，用内切酶Pac I酶切鉴定。
所述的构建方法，Pac I反应体系如下表：10×NEB Buffer 1，2.0μL；重组质粒Ad-SCD，≤1.0μg；100×BSA，0.2μL；Pac I，0.5μL；余量dd H2O至总体积20.0μL；酶切反应条件：放置37℃水浴酶切16h；1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
将pAdEasy-1病毒骨架先转化入大肠杆菌BJ5183，再用酶切线性化的穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD转化BJ5183进行同源重组，大大降低了非重组的穿梭质粒的背景，提高了成功率。另外，在设计引物时引入需要的酶切位点可使基因定向克隆的程序简化，本发明在引物的上下游分别引入KpnI和Xho I酶切位点，使目的基因按正确的方向插入穿梭载体，并与骨架载体同源重组，成功构建了重组腺病毒载体。
本发明选用的腺病毒系统是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架，穿梭载体pAdTrack-CMV携带有报告基因绿色荧光蛋白GFP，非常直观简便。首先构建含有SCD基因和GFP基因的穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD，然后将穿梭载体与腺病毒骨架pAdEasy-1载体在大肠杆菌BJ5183(重组酶缺陷型大肠杆菌)中同源重组，获得SCD基因和GFP基因共表达的重组腺病毒载体Ad-SCD，为进一步在细胞和个体水平上研究SCD基因对脂肪酸合成代谢的调控作用提供试验材料。通过对SCD基因过表达，将可能引起乳腺或其它组织合成脂肪酸含量及组成的改变，进而提高山羊乳及其产品的营养价值。
附图说明
图1为pAdTrack-CMV-SCD酶切鉴定，其中M1：λ-Hind III digest DNAMarker；1，2：pAdTrack-CMV-SCD酶切产物；M2：D 2000 Marker；
图2pAd-SCD酶切鉴定，其中M：λ-Hind III digest DNA Marker；1-4：Ad-SCD酶切产物。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
1.1.1腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的构建
1.1.1.1连接反应
由于目的基因片段两端带有Kpn I与Xho I酶切位点，将pGEM-T-SCD质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Xho I双酶切，双酶切反应体系为50μL。1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收纯化SCD小片段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度计测定产物浓度，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接反应体系如下表：
1.1.1.2连接产物转化及鉴定
取上述连接产物10μL加入到含TOP10感受态细菌的离心管中，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速转移至冰上1-2min，加入800μL无抗性LB培养液，37℃温和震荡培养45min。取适量菌液涂布于卡那霉素抗性(1∶1000)的LB平板上，37℃孵育过夜。挑取小的单克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性(1∶1000)的液体LB培养基中摇菌12-14h(200r/min)，提取质粒，凝胶电泳检测后，进行Kpn I/Xho I双酶切鉴定，从鉴定正确的质粒中选取2管，转化感受态TOP10扩增，并送测序。
1.1.2重组腺病毒载体Ad-SCD的构建
1.1.2.1感受态BJ5183菌(含骨架载体pAdEasy-1)的制备
BJ5183感受态细胞的制备方法如下：
(1)取100μL BJ5183菌液加入到5mL无抗性液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3-0.4；
(2)将菌液置冰上冰浴20min，4℃，4000r/min离心10min；
(3)倒掉菌液，将离心管倒置于干净吸水纸上除去残液，加入0.5mL0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，补充至20mL，混匀后冰浴20min；
(4)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/LCaCl2溶液重悬菌体，混匀后冰浴20min；
(5)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/LCaCl2溶液重悬菌体，冰浴20min；
(6)在感受态菌液中加入终浓度10％的甘油，每管200μL分装后-70℃保存备用。
1.1.2.2穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化
将鉴定正确的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD质粒用Pme I酶切线性化，反应体系如下表：
试剂Reagent 使用Volume
10×NEB Buffer 4 5.0μL
质粒pAdTrack-CMV-SCD ≤2μg
100×BSA 0.5μL
Pme I酶 1.0μL
dd H2O Up to 50.0μL
酶切反应条件：37℃温浴16h。
1.1.2.3同源重组
将穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化产物，直接转化含腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183，进行同源重组；而后接种于含卡那抗性(1∶1000)的LB平板上，37℃孵育过夜，通过平板初步筛选鉴定具有重组子的菌落，进行小量培养后(3mL含卡那抗性的液体LB培养基中摇菌12-14h)，制备质粒DNA，用内切酶Pac I酶切鉴定。
Pac I反应体系如下表：
试剂Reagent 使用量Volume
10×NEB Buffer 12.0μL
重组质粒Ad-SCD ≤1.0μg
100×BSA 0.2μL
Pac I 0.5μL
dd H2O Up to 20.0μL
酶切反应条件：放置37℃水浴酶切16h；1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。从鉴定正确的质粒中选取2管，转化感受态TOP10扩增，同时送阳性克隆测序二次鉴定。
1.2结果与分析
1.2.1腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的构建
取重组质粒pAdTrack-CMV-SCD用Kpn I/Xho I双酶切鉴定，切下约1.1kb的目的条带和9kb的pAdTrack-CMV空载体两条带，与预期结果相符(如图1所示)。测序结果显示，腺病毒穿梭载体中所插入的序列与设计序列完全一致，证明pAdTrack-CMV-SCD重组腺病毒穿梭载体构建成功。
1.2.2重组腺病毒Ad-SCD的构建
取重组腺病毒质粒Ad-SCD用Pac I酶切鉴定，切下30kb和4.5kb两条带，与预期结果相符(如图2所示)。测序结果显示，重组腺病毒载体中所插入序列与设计序列完全一致，证明Ad-SCD重组腺病毒载体构建成功。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (8)
1.一种山羊SCD基因重组腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A1，构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD；A2，重组腺病毒载体Ad-SCD的构建。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A1具体执行以下操作：
A11，连接反应：将pGEM-T-SCD质粒和pAdTrack-CMV穿梭质粒同时进行Kpn I/Xho I双酶切，双酶切反应体系为50μL；1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收纯化SCD小片段和pAdTrack-CMV大片段后，紫外分光光度计测定产物浓度，用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜；
A12，连接产物转化及鉴定：取A11所得的连接产物10μL加入到含TOP10感受态细菌的离心管中，轻吹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，快速转移至冰上1-2min，加入800μL无抗性LB培养液，37℃温和震荡培养45min；取适量菌液涂布于卡那霉素抗性的LB平板上，37℃孵育过夜；挑取小的单克隆菌落，在3mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基中摇菌12-14h、200r/min，提取质粒，凝胶电泳检测后，进行Kpn I/Xho I双酶切鉴定。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A11连接反应体系为回收SCD片段，7.0μL；回收pAdTrack-CMV片段，10.0μL；10×T4 DNA Ligase Buffer，2.0μL；T4 DNA连接酶，1.0μL；总体积20.0μL。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A2具体执行以下操作：A21，制备含骨架载体pAdEasy-1的感受态BJ 5183菌；A22，穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化；A23，同源重组。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A21具体执行以下操作：(1)取100μL BJ5183菌液加入到5mL无抗性液体LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3-0.4；(2)将菌液置冰上冰浴20min，4℃，4000r/min离心10min；(3)倒掉菌液，将离心管倒置于干净吸水纸上除去残液，加入0.5mL 0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，补充至20mL，混匀后冰浴20min；(4)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，混匀后冰浴20min；(5)4℃，4000r/min离心10min，倒掉菌液，加入10mL 0.1mol/L CaCl2溶液重悬菌体，冰浴20min；(6)在感受态菌液中加入终浓度10％的甘油，每管200μL分装后-70℃保存备用。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A22具体执行以下操作：将鉴定正确的重组穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD质粒用PmeI酶切线性化，反应体系如下：10×NEB Buffer 4，5.0μL；质粒pAdTrack-CMV-SCD，≤2μg；100×BSA，0.5μL；Pme I酶，1.0μL；余量dd H2O至总体积50.0μL。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述步骤A23具体执行以下操作：将穿梭载体pAdTrack-CMV-SCD的Pme I酶切线性化产物，直接转化含腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183，进行同源重组；而后接种于含卡那抗性的LB平板上，37℃孵育过夜，通过平板初步筛选鉴定具有重组子的菌落，进行小量培养后，制备质粒DNA，用内切酶Pac I酶切鉴定。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，Pac I反应体系如下表：10×NEB Buffer 1，2.0μL；重组质粒Ad-SCD，≤1.0μg；100×BSA，0.2μL；Pac I，0.5μL；余量dd H2O至总体积20.0μL；酶切反应条件：放置37℃水浴酶切16h；1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
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