CN104857529A - Egr-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供EGR-1基因在制备抗癌药物中的应用，特别是EGR-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明通过构建EGR-1基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中EGR-1基因的mRNA显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性下降66.2％，最终出现死亡。本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
Description
技术领域：
本发明涉及EGR-1基因的新用途，具体是EGR-1基因在制备抗癌药物特别是抗膀胱癌药物中的应用。
背景技术：
EGR-1，是早期应答基因中的一员，别名有zif268，NGFI-A，Krox24和TIS8tl-Sl，为锌指结构的转录因子，对细胞的早期生长起到调节作用。该基因定位于染色体5q23-31上，mRNA全长3300bp，编码533个氨基酸，分子量约为59000Da。EGR-1在诱导分化、促进生长、参与细胞凋亡等多个方面发挥生物学功能。EGR-1受多种因素如激素、细胞因子、生长因子的刺激而通过蛋白激酶途径(如raS-Raf-MEK-ERK/JNK/p38-转录因子)而活化，其活化后在不同细胞中能引起不同的基因表达调控模式。在癌症相关方面，EGR-1在包括乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、白血病等肿瘤细胞中常呈现低表达。其高表达可能促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长。EGR-1基因在前列腺癌、Wilms肿瘤和淋巴肿瘤高表达而促进癌症的发生和发展，在胶质母细胞瘤和星状细胞瘤中参与细胞转移。但该基因在膀胱癌细胞中的功能还未见报道。
发明内容：
本发明的目的在于提供EGR-1基因的一种新用途。
本发明提供EGR-1基因在制备抗癌药物中的应用，特别是EGR-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。所述的EGR-1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1。
本发明通过构建EGR-1基因的超表达载体，转染膀胱癌细胞，结果表明：转染后的膀胱癌细胞中EGR-1基因的mRNA水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性显著降低，最终出现死亡。
本发明筛选得到一个高效抑制膀胱癌细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
附图说明：
图1：EGR-1超表达后mRNA水平表达：qPCR结果(pcDNA3.1为空载体；pcDNA3.1-EGR-1为带有EGR1基因的超表达载体
图2：超表达EGR-1后肿瘤细胞形态变化：A重组质粒pcDNA3.1-EGR-1转染到T24细胞24h后细胞形态；B重组质粒pcDNA3.1-EGR-1转染到T24细胞48h后细胞形态
图3：EGR-1超表达后细胞活性检测
具体实施方式：
实施例1：EGR-1基因抑制膀胱癌T24细胞
一、重组表达载体的构建
1、PCR产物的制备
以T24细胞RNA反转录的cDNA为模板，基于EGR-1基因的全长cDNA序列(Gene ID:1958)设计用带有酶切位点的表达引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸3min，共35个循环，72℃保温10min，引物序列见表1。PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。
表1EGR-1PCR引物
2、目的基因全长验证
将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上，送往北京奥科生物公司进行测序。
3、PCR产物及表达载体的双酶切反应
选取测序成功的质粒，在2个eppendorf管中分别进行PCR产物和pcDNA3.1双酶切反应，反应体系参照Hind III、EcoR I说明书(NEB)进行。
4、胶回收酶切产物
将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。
5、目的基因EGR-1与pcDNA3.1的连接
将含目的基因EGR-1的胶回收产物连接到pcDNA3.1上，在离心管中建立如下反应体系：
轻轻混匀，瞬时离心收集液体于管底，置于16℃过夜连接。
二、重组表达载体的转化
1、将Trans-T1Phage Resistant感受态细胞置于冰上；
2、在离心管中依次加入50μL感受态细胞核5μL的连接产物，轻轻混匀，置于冰上30min；
3、42℃水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min；
4、加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm振荡培养1h；
5、取200μL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37℃培养箱中氨苄抗性的平板上，过夜培养；
三、重组表达载体的验证
1、用灭菌的枪头小心挑取白色单菌落，将枪头置于1mL LB液体培养基(含有0.1％氨苄)中，在37℃、200rpm的振荡培养箱中培养1h。
2、菌液PCR检测(1)中菌液是否含有重组质粒，PCR体系为：
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃30s，60℃40s，72℃3min 30s，35个循环；72℃5min，4℃保存。之后，用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，将检测到目的片段的对应菌液送往北京奥科生物公司进行测序。
四、重组质粒转染T24细胞
取对数生长期细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔板中。实验分为2组，对照组：pcDNA3.1空质粒及EGFP-N1，实验组：pc DNA3.1-EGR-1及EGFP-N1。每组3个重复。采用英俊公司Lipofectamine 2000将构建好的质粒pcDNA3.1-EGR-1与EGFP-N1共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。
五、qPCR检测转染后EGR1mRNA表达水平
将pcDNA3.1-EGR-1与EGFP-N1共转染到T24细胞48h后，Trizol法提取总RNA，步骤按照RNAiso Plus(TaKaRa)说明书进行。反转录后Real-time PCR检测EGR-1mRNA表达水平(见图1)。
六、形态学观察
重组质粒转入T24细胞24h及48h后显微镜(OLYMPUS 1X71)观察细胞形态(见图2)。
七、MTT检测转染后细胞活性
转染24h后，对照组和处理组分别接种于96孔板中。每组设置3个复孔，继续培养。培养24h后，弃去培养液，加入180μL新鲜培养基，再加入20μL 5mg/mL MTT(终浓度为0.5mg/mL)，继续培养4h。待到时间后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μLDMSO，摇床低速振摇10min，使蓝紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm处读取吸光度值。处理数据，计算巴西苏木素对细胞的抑制率，绘制细胞生长曲线。每个样本均设置6个重复，取平均值为最终结果(见图3)。
Claims (2)
1.EGR-1基因在制备抗癌药物中的应用；所述的EGR-1基因，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1。
2.EGR-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用；所述的EGR-1基因，其核苷酸序列为SEQID NO：1。
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