CN111000858A - Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途 - Google Patents

Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111000858A
CN111000858A CN201910390748.XA CN201910390748A CN111000858A CN 111000858 A CN111000858 A CN 111000858A CN 201910390748 A CN201910390748 A CN 201910390748A CN 111000858 A CN111000858 A CN 111000858A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nupr1
bladder cancer
inhibitor
muscle
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910390748.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN111000858B (zh
Inventor
张力峰
左立
高林生
糜远源
陈加生
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changzhou Second Peoples Hospital
Affiliated Hospital of Jiangnan University
Original Assignee
Changzhou Second Peoples Hospital
Wuxi No 3 Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changzhou Second Peoples Hospital, Wuxi No 3 Peoples Hospital filed Critical Changzhou Second Peoples Hospital
Priority to CN201910390748.XA priority Critical patent/CN111000858B/zh
Publication of CN111000858A publication Critical patent/CN111000858A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111000858B publication Critical patent/CN111000858B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明提供了一种NUPR1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途，属于生物医药研究领域。本发明通过研究NUPR1在肌层浸润性膀胱癌中的表达水平，发现其与肌层浸润性膀胱癌肿瘤细胞的生长、增殖、分化、转移密切相关。通过使NUPR1基因沉默表达，可以显著抑制肌层浸润性膀胱癌肿瘤细胞的生长。本发明通过序列设计和大量实验验证，获得了一条特异性shRNA序列，采用慢病毒包装后，使NUPR1的表达降低95％～99％。

Description

NUPR1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途
技术领域
本发明涉及生物医药研究领域，尤其是涉及一种NUPR1抑制剂及其在制备膀胱癌治疗药物中的用途。
背景技术
NUPR1(Nuclear protein-1)分子主要定位在细胞核上，是一个含有82个氨基酸的无稳定性二级机构的转录调节因子。剪切后形成两个亚基，a型和b型。1997年，在最初研究大鼠胰腺炎胰腺损伤时发现NUPR1基因，由于它的相对分子量为8872.7Da，因此也被命名为p8。NUPR1具有转录活性，并已证实在多种肿瘤的发生、发展和转移过程中具有重要作用。
研究表明，NUPR1与多种非肿瘤性疾病过程有关，如胰腺炎、糖尿病及其并发症、心肌病变、神经系统的应激性损伤等。在肿瘤方面，NUPR1参与了乳腺癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌等肿瘤的发展与转移。针对NUPR1的研究为恶性肿瘤提供了一个新的方向和依据。
目前对于NUPR1应用于肿瘤治疗的研究方法包括基因敲除、基因沉默等。李俊进行了NUPR1基因敲低后的U251和U87细胞检测(Nupr1调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究，大连医科大学博士论文，2017年3月)；邓跃林等检测了NUPR1基因沉默后非小细胞肺癌细胞A549细胞体外迁移、侵袭能力的变化(Nupr1调控非小细胞肺癌细胞迁移、凋亡机制的研究，现代生物医学进展，2017年第19期)。对于NUPR1的研究和相关产品的开发可以促进肿瘤治疗的发展。
膀胱癌(bladder cancer)在全世界恶性肿瘤中排在第十位，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。近年来，我国膀胱癌的发病率和死亡率呈上升趋势。膀胱浅表性尿路上皮癌(NMIBC)通过早期发现，后续行经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)及术后规律膀胱化疗药物灌注治疗，预后较好。而对于肌层浸润性膀胱癌(MIBC)，因较早出现疾病进展、术后复发及转移，且对辅助放化疗不敏感或易出现耐药性，术后5年存活率只有47％。
CN108498800A提供了一种COPB2抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途中，其中COPB2慢病毒转染膀胱癌6537细胞干扰效率为70％；通过定量PCR与Western blot检测，COPB2干扰效率为60-75％。由于临床治疗情况复杂，病例体质差异很大，因此这一效率还无法达到临床的治疗要求。
《沉默NUPR1对人多发性骨髓瘤细胞自噬的影响及机制研究》(李星欣，重庆医科大学硕士学位论文，2018年5月)公开了一组最佳干扰序列为：5’-CCAAGCTGCAGAATTCAGA-3’，对照病毒序列为5’-TTCTCCGAACGTGT CACGT-3’。结果表明NUPR1-shRNA慢病毒转染U266和PRMI8226的转染效率为90％。但是该干扰序列对于肿瘤细胞的干扰效率并不高，并且也不适于与膀胱癌肿瘤细胞的干扰。
因此，需要开发一种干扰效率更高、靶向作用于肌层浸润性膀胱癌肿瘤细胞的新型药物。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种NUPR1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种NUPR1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途，所述NUPR1抑制剂为含有shRNA序列的干扰核酸构建体；所述shRNA序列为：
5’-AAGAAAGCTACAGAAGAAACT-3’。
进一步的，所述干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。所述干扰慢病毒载体为pFU-GW-009。
进一步的，所述膀胱癌为肌层浸润性膀胱癌。
进一步的，所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子有：
糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醉、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
本发明有益的技术效果在于：
本发明通过研究NUPR1在肌层浸润性膀胱癌中的表达水平，发现其与肌层浸润性膀胱癌肿瘤细胞的生长、增殖、分化、转移密切相关。通过使NUPR1基因沉默表达，可以显著抑制肌层浸润性膀胱癌肿瘤细胞的生长。本发明通过序列设计和大量实验验证，获得了一条特异性shRNA序列，采用慢病毒包装后，使NUPR1的表达降低95％～99％。
本发明提供的NUPR1抑制剂可以使NUPR1的基因不转录，或降低NUPR1的基因的转录活性，或者使NUPR1的基因不表达，或降低NUPR1的基因的表达活性。其可以作为治疗肌层浸润性膀胱癌的靶向药物的有效成分之一，抑制膀胱癌细胞增殖；抑制膀胱癌细胞克隆形成的能力，治疗膀胱癌，为膀胱癌治疗开辟新的方向。
附图说明
图1为基于TCGA数据库NUPR1临床相关性分析；
图2为携带NUPR1干扰靶点的工具载体质粒；
图3为实施例3Western blot实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1：NUPR1在膀胱癌细胞中的表达
本发明通过TCGA数据库分析，表明NUPR1在高级别膀胱癌组织中表达高于低级别组，差异具有统计学意义(图1A：高级别膀胱癌组织中NUPR1表达量高于低级别癌组织，P<0.01)，且随着肿瘤分期升高，表达水平呈正相关增高，差异具有统计学意义(图1B：分期组中，NUPR1表达量：IV期高于III期高于II期，差异具有统计学意义(P＝0.003))。上述分析提示NUPR1具备临床相关性，对后续细胞功能机制则需要进一步深入研究。
实施例2：制备NUPR1干扰慢病毒
采用二代自失活型慢病毒包装系统进行病毒包装，包括三个质粒：
(1)携带NUPR1干扰靶点的工具载体质粒(载体GV277：pFU-GW-009-hU6-MCS-EGFP-IRES-puromycin，如图2所示，内插入干扰NUPR1mRNA：5’-AAGAAAGCTACAGAAGAAACT-3’序列)；
(2)病毒包装辅助质粒Helper1.0(含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子)；
(3)Helper2.0(含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白)。
上述三种质粒共转染293T细胞，收集细胞上清，离心获取病毒，再次离心去除杂质后进行病毒浓缩与纯化，最后进行病毒质量检测。滴度至少为1×108TU/ml。本实验中转染效率在95％以上。
实施例3：NUPR1干扰慢病毒对肌层浸润性膀胱癌肿瘤细胞的抑制作用
(1)为了评价NUPR1在膀胱癌中的功能作用，本发明设计如下功能实验进行验证。首先进行平板克隆实验，实验分NUPR1干扰组，对照组(对照病毒序列为：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)和正常5637组，培养2周后观察克隆数，结果如表1所示。从表1可以看到NUPR1干扰组克隆数最少，说明能抑制细胞克隆形成的能力
表1克隆细胞数据
实验组 实验初期 2周后克隆数 干扰率
ShNUPR1 1000个细胞 28±12 99％
ShCtrl 1000个细胞 58±22 0
Normal 1000个细胞 78±13 0
(2)其次进行CCK8细胞生长实验，实验分NUPR1干扰组和对照组，设1、2、3、4、5天5个检测时间点，结果如表2所示。从表2可以看到NUPR1干扰组6537细胞生长受到显著抑制，差异具有统计学意义。
表2 OD450检测数据
ShNUPR1 ShCtrl
1天 0.116±0.0074 0.13±0.0091
2天 0.132±0.0058 0.175±0.0059
3天 0.223±0.0124 0.294±0.0114
4天 0.291±0.0234 0.477±0.0247
5天 0.488±0.0076 0.807±0.0329
Real-time PCR检测两组中NUPR1的表达量，结果如表3所示，从表中可以看到NUPR1干扰组干扰效率可达99％。
表3定量PCR检测NUPR1mRNA表达量
ShNUPR1 ShCtrl 干扰率
mRNA NUPR1 35.326±1.452 31.639±1.138 99％
mRNA GAPDH 18.818±0.897 17.752±0.786
Relative mRNA NUPR1/GAPDH 0.162±0.083 1.023±0.276
上述两个功能实验均提示干扰NUPR1基因能抑制膀胱癌5637细胞的增殖能力，NUPR1扮演类癌蛋白的角色。
(3)功能实验提示NUPR1参与5637细胞增殖，下一步进行机制探索的验证。Westernblot实验证实NUPR1干扰组中，细胞凋亡标记物BCL-2显著下调、细胞周期标记物cyclin-D1和CDK2显著下调、上皮间质转化(EMT)中的间质标记物Vimentin与N-cadherin显著下调(如图3所示)，提示NUPR1参与膀胱癌细胞5637的增殖和侵袭。
Western blot实验检测两组中NUPR1表达，如表4所示，从表中可以看到NUPR1干扰组NUPR1干扰达99％。
表4 Western blot实验中NUPR1表达量
ShNUPR1 ShCtrl 干扰率
NUPR1蛋白条带灰度值 80388±2786 169500±4567 99％
GAPDH蛋白条带灰度值 181602±3465 185328±7652
从上面的实验结果可以看到，本发明选择的NUPR1抑制剂对肌层浸润性膀胱癌具有精确的靶向作用和高度的抑制效率，效果远优于CN108498800A在其实施例2提供的60-75％的干扰效率。本发明抑制剂用于制备肌层浸润性膀胱癌治疗药物有极高的临床价值。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种NUPR1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途，其特征在于所述NUPR1抑制剂为含有shRNA序列的干扰核酸构建体；所述shRNA序列为：
5’-AAGAAAGCTACAGAAGAAACT-3’。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述干扰慢病毒载体为pFU-GW-009。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述膀胱癌为肌层浸润性膀胱癌。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述药物还包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
CN201910390748.XA 2019-05-10 2019-05-10 Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途 Active CN111000858B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910390748.XA CN111000858B (zh) 2019-05-10 2019-05-10 Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910390748.XA CN111000858B (zh) 2019-05-10 2019-05-10 Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111000858A true CN111000858A (zh) 2020-04-14
CN111000858B CN111000858B (zh) 2021-04-09

Family

ID=70111460

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910390748.XA Active CN111000858B (zh) 2019-05-10 2019-05-10 Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111000858B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1252837A (zh) * 1997-02-25 2000-05-10 科里克萨有限公司 用于前列腺癌免疫疗法的化合物及其用途
CN1315998A (zh) * 1998-07-14 2001-10-03 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断前列腺癌的组合物和方法
CN102641508A (zh) * 2012-05-01 2012-08-22 浙江大学 靶向上调par-4基因小rna在制备抗膀胱癌药物中的应用
CN103405785B (zh) * 2013-08-15 2014-10-08 山西大学 GADD45β基因在制备抗膀胱癌药物中的应用
CN104857529A (zh) * 2015-05-20 2015-08-26 山西大学 Egr-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用
CN108498800A (zh) * 2018-05-24 2018-09-07 常州市第二人民医院 Copb2抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1252837A (zh) * 1997-02-25 2000-05-10 科里克萨有限公司 用于前列腺癌免疫疗法的化合物及其用途
CN1315998A (zh) * 1998-07-14 2001-10-03 科里克萨有限公司 用于治疗和诊断前列腺癌的组合物和方法
CN102641508A (zh) * 2012-05-01 2012-08-22 浙江大学 靶向上调par-4基因小rna在制备抗膀胱癌药物中的应用
CN103405785B (zh) * 2013-08-15 2014-10-08 山西大学 GADD45β基因在制备抗膀胱癌药物中的应用
CN104857529A (zh) * 2015-05-20 2015-08-26 山西大学 Egr-1基因在制备抗膀胱癌药物中的应用
CN108498800A (zh) * 2018-05-24 2018-09-07 常州市第二人民医院 Copb2抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XI GUO等: "ISYNA1 is overexpressed in bladder carcinoma and regulates cellproliferation and apoptosis", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111000858B (zh) 2021-04-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101842095B (zh) 肿瘤治疗的配方,方法和靶目标
WO2021032213A1 (zh) 靶向组织微环境中衰老细胞的抗衰老药物d/s及其应用
CN109477107B (zh) 一种抑制EGFR基因表达的siRNA及其前体和应用
US20210254069A1 (en) Combination therapies comprising c/ebp alpha sarna
US20220243282A1 (en) Compositions and Methods for Monitoring, Diagnosis, Detection and Treatment of Cancer
CN111000858B (zh) Nupr1抑制剂在制备膀胱癌治疗药物中的用途
KR101853731B1 (ko) Linc-ASEN 발현 억제제를 유효성분으로 포함하는 세포 노화 유도용 조성물
Wang et al. Nifuroxazide inhibits the growth of glioblastoma and promotes the infiltration of CD8 T cells to enhance antitumour immunity
Huang et al. Effects of hTERT antisense oligodeoxynucleotide on cell apoptosis and expression of hTERT and bcl-2 mRNA in keloid fibroblasts.
CN111170980B (zh) 一种毛蕊异黄酮衍生物及其合成方法和应用
CN111419832A (zh) 药物组合物及其在制备治疗肿瘤药物中的用途
CN105617401B (zh) miRNA的肿瘤辐射增敏及减弱辐射旁效应作用、实施方法及用途
CN110151748A (zh) 一种用于治疗前列腺癌的药物组合物
CN114306608B (zh) 一类适应低氧或缺氧微环境的肿瘤的治疗靶点及其应用
CN112587524B (zh) 一种表观遗传因子抑制剂40569z在制备肝癌药物中的应用
DiGiulio Early Data for a Novel MiRNA Therapy Yield Promising Results
Zhao et al. Mechanism of Quercetin as a Multidrug-resistant Reversing Compound in Oxaliplatin-resistant Gastric-cancer Cell Lines.
US20090131511A1 (en) Palmarumycin based inhibitors of thioredoxin and methods of using same
US20230226018A1 (en) Application of compound using intra-cyclic peroxo-bridged sesquiterpenes as parent nucleus in metabolism-related fatty liver diseases
CN111450231B (zh) 靛玉红衍生物在制备他克莫司或环孢素的增效剂药物中的用途
CN117398464B (zh) circRERE的抑制剂在制备缺血性心脏病治疗药物中的应用
CN118286239A (zh) 麦冬皂苷d在制备治疗糖尿病及其相关疾病的药物中的应用
Ye et al. Liensinine improves cognitive function of gastric cancer under dexmedetomidine anesthesia by inhibiting neuron apoptosis through synuclein
CN106466486A (zh) miR-133小分子核酸药物在制备抗胃癌药物中的应用
Liu et al. Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal miR-126 Inhibits Colon Cancer by Targeting PLEXIN-B2

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Zhang Lifeng

Inventor after: Zuo Li

Inventor after: Gao Shenglin

Inventor after: Mi Yuanyuan

Inventor after: Chen Jiasheng

Inventor before: Zhang Lifeng

Inventor before: Zuo Li

Inventor before: Gao Linsheng

Inventor before: Mi Yuanyuan

Inventor before: Chen Jiasheng

CB03 Change of inventor or designer information
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210901

Address after: No.29 Xinglong lane, Changzhou City, Jiangsu Province

Patentee after: CHANGZHOU NO.2 PEOPLE'S Hospital

Patentee after: AFFILIATED HOSPITAL OF JIANGNAN University

Address before: No.29 Xinglong lane, Changzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: CHANGZHOU NO.2 PEOPLE'S Hospital

Patentee before: WUXI NO.3 PEOPLE'S Hospital

TR01 Transfer of patent right