CN103405784B - c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用，特别是c-Fos基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。本发明通过构建c-Fos基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中c-Fos基因的mRNA和蛋白水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性下降66.2%，最终出现死亡。本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
Description
技术领域
本发明涉及c-Fos基因的新用途，具体是c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
FOS基因家族包括4个成员，编码亮氨酸拉链的FOSL1，FOSL2和FOS，FOSB，他们与JUN家族结合形成转录因子复合物AP-1。原癌基因c-Fos是由FOS基因编码的转录因子，转录因子c-Fos一般与Jun家族聚合形成AP-1行使其功能，最常见的AP-1是由c-Fos和c-Jun构成，当它们形成二聚体AP-1后，与AP-1DNA识别位点结合来激活受到刺激的细胞的转录。大量研究发现，c-Fos原癌基因及其蛋白产物参与生物体内许多重要的生理过程，包括调控细胞的生长分化，细胞内信息传递过程和细胞的能量代谢过程，在生命活动中起着极为重要的作用。
原癌基因c-Fos是众所周知的具有致癌作用的基因，参与肿瘤的形成、增殖、血管生成、肿瘤的浸润和转移。因此，长久以来，c-Fos被认为是抗凋亡分子。如Wang等研究发现，当c-Fos在小鼠中过表达时，会导致小鼠在体内形成肉瘤。
发明内容
本发明的目的在于提供c-Fos基因的一种新用途。
本发明提供c-Fos基因在制备抗癌药物中的应用，特别是c-Fos基因在制备抗膀胱癌药物中的应用。所述的c-Fos基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。
本发明通过构建c-fos基因的超表达载体，转染肿瘤细胞，结果表明：转染后的肿瘤细胞中c-fos基因的mRNA和蛋白水平均显著上调，肿瘤细胞出现变圆，贴壁性变差，细胞活性显著降低，最终出现死亡。
本发明筛选得到一个高效抑制肿瘤细胞的基因，为新药靶的发现及肿瘤药物设计提供基础数据。
附图说明
图1：c-Fos超表达后mRNA及蛋白水平表达：A qPCR结果（PCDNA3.1为空载体；PCDNA3.1-c-Fos为带有c-Fos基因的超表达载体）；B western-blot结果（β-actin做为内参基因）
图2：超表达c-Fos后肿瘤细胞形态变化：A重组质粒PCDNA3.1-c-Fos转染到T24细胞24h后细胞形态；B重组质粒PCDNA3.1-c-Fos转染到T24细胞48h后细胞形态
图3：c-Fos超表达后细胞活性检测
具体实施方式
实施例1：c-Fos基因抑制膀胱癌T24细胞
一、重组表达载体的构建
1、PCR产物的制备
以T24细胞RNA反转录的cDNA为模板，基于c-Fos基因的全长cDNA序列（Gene ID:2353）设计用带有酶切位点的表达引物进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火40s，72℃延伸1min30s，共35个循环，72℃保温10min，引物序列见表5.3。PCR产物回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。
表1c-Fos表达引物
2、目的基因全长验证
将PCR获得的目的基因连接到Zero Vector上，送往北京奥科生物公司进行测序。
3、PCR产物及表达载体的双酶切反应
选取测序成功的质粒，在2个eppendorf管中分别进行PCR产物和PCDNA3.1双酶切反应，反应体系参照Hind III、BamH I说明书（NEB）进行。
4、胶回收酶切产物
将上述双酶切产物进行胶回收，回收过程严格按照OMEGA公司的Gel Extraction Kit的说明书进行。
5、目的基因c-Fos与PCDNA3.1的连接
将含目的基因c-Fos的胶回收产物连接到PCDNA3.1上，在离心管中建立如下反应体系：
轻轻混匀，瞬时离心收集液体于管底，置于4℃过夜连接。
二、重组表达载体的转化
1、将Trans-T1Phage Resistant感受态细胞置于冰上；
2、在离心管中依次加入50μL感受态细胞核5μL的连接产物，轻轻混匀，置于冰上30min；
3、42℃水浴热激30s，然后快速将管置于冰上，冰浴2min；
4、加入500μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃200rpm振荡培养1h；
5、取200μL重悬菌液，均匀涂布于提前放置在37℃培养箱中氨苄抗性的平板上，过夜培养；
三、重组表达载体的验证
1、用灭菌的枪头小心挑取白色单菌落，将枪头置于1mL LB液体培养基（含有0.1%氨苄）中，在37℃、200rpm的振荡培养箱中培养1h。
2、菌液PCR检测（1）中菌液是否含有重组质粒，PCR体系为：
PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃30s，60℃40s，72℃2min，35个循环；72℃5min，4℃保存。之后，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段，将检测到目的片段的对应菌液送往北京奥科生物公司进行测序。
四、重组质粒转染T24细胞
取对数生长期细胞，重悬于不含抗生素的RPMI1640培养基中，接种于6孔板中。实验分为2组，对照组：PCDNA3.1空质粒及EGFP-N1，实验组：PC DNA3.1-c-Fos及EGFP-N1。每组3个重复。采用英俊公司lipo2000将构建好的质粒PCDNA3.1-c-Fos与EGFP-N1共转染到T24细胞，具体操作参照说明书。
五、Real-time PCR检测转染后c-Fos mRNA表达水平
将PCDNA3.1-c-Fos与EGFP-N1共转染到T24细胞48h后，Trizol法提取总RNA，步骤按照RNAiso Plus(TaKaRa)说明书进行。反转录后Real-time PCR检测c-Fos mRNA表达水平。
六、Western blot检测转染后c-Fos的表达量
将PCDNA3.1-c-Fos与EGFP-N1共转染到T24细胞48h后，收集蛋白，western blot检测c-Fos的表达量。
七、形态学观察
重组质粒转入T24细胞24h及48h后显微镜（OLYMPUS1X71）观察细胞形态。
八、MTT检测转染后细胞活性
转染24h后，对照组和处理组分别接种于96孔板中。每组设置3个复孔，继续培养。培养24h后，弃去培养液，加入180μL新鲜培养基，再加入20μL5mg/mL MTT（终浓度为0.5mg/mL），继续培养4h。待到时间后，终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，摇床低速振摇10min，使蓝紫色结晶充分溶解，在酶标仪490nm处读取吸光度值。处理数据，计算巴西苏木素对细胞的抑制率，绘制细胞生长曲线。每个样本均设置6个重复，取平均值为最终结果。
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1.c-Fos基因在制备抗膀胱癌药物中的应用，所述的c-Fos基因，其核苷酸序列是SEQ IDNO：1。
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