CN104056277A

CN104056277A - Mlh1基因或其表达产物在dkk4高表达的结直肠癌中的应用

Info

Publication number: CN104056277A
Application number: CN201310092765.8A
Authority: CN
Inventors: 万涛; 方宏亮; 吴艳峰; 曹雪涛
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2013-03-21
Filing date: 2013-03-21
Publication date: 2014-09-24
Anticipated expiration: 2033-03-21
Also published as: CN104056277B

Abstract

本发明公开了一种MLH1基因或蛋白或其促进剂的用途，具体地，用于降低或抑制DKK4蛋白的表达量/或活性，并增加DKK蛋白高表达的结直肠癌对化疗的敏感性，以及抑制DKK4蛋白高表达的结直肠癌的生长/或结直肠癌细胞的增殖。本发明提供了一种新的靶向治疗结直肠癌以及结直肠癌耐药的方法，为结直肠癌的治疗提供了新途径。

Description

MLH1基因或其表达产物在DKK4高表达的结直肠癌中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学领域。更具体地，本发明涉及MLH1基因或蛋白或促进剂在DKK4高表达结直肠癌的治疗以及DKK4高表达结直肠癌的化疗耐药的治疗方面的应用。本发明还涉及MLH1抑制剂在制备肿瘤模型中的应用。

背景技术

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）是常见的恶性肿瘤之一，世界卫生组织最新的有关全球癌症状况的数据显示，结直肠癌的死亡率为实体肿瘤的第三位。近年来，随着经济的发展和生活水平的提高，我国发病率的上升速度达到国际平均增速的2倍，在上海等东部沿海城市，发病率达到实体肿瘤的第二位，成为导致人死亡的主要疾病之一。

错配修复功能（Mismatch Repair，MMR）的缺失是导致结直肠癌基因异质性的关键原因之一，而MMR蛋白表达缺失的结直肠癌患者，对5-FU为基础的辅助治疗方案获益减少。人MMR包括MSH2，MSH3，MSH4，MSH5，MSH6，MLH1，MLH3、PMSI和hPMS2等9个分子。

DKK4蛋白被研究认为是与肠炎、结直肠癌的发生以及5-FU耐受密切相关的因子，其上游因子TFAP2E也被认为与DKK4过表达相关。

由于肿瘤发生中各通路和蛋白之间的作用和反馈机制复杂，因此，本领域迫切需要研究MMR缺失导致结直肠癌发病及对化疗药耐药的机制，并开发特异性高，靶向明确的治疗药物。

发明内容

本发明提供了MLH1基因及其表达产物对DKK4高表达结直肠癌的治疗及其化疗耐药的治疗方法。

本发明的第一方面，提供了一种MutL同系物1（MutL homolog1，MLH1,）基因或蛋白或其促进剂的用途，用于降低或抑制Dickkopf同系物4蛋白（Dickkopfhomolog4protein，DKK4）的表达量/或活性，或用于制备降低或抑制Dickkopf同系物4蛋白（Dickkopf homolog4protein，DKK4）的表达量/或活性的组合物。

在另一优选例中，所述的促进剂包括MLH1基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、促进型靶向小分子化合物。

在另一优选例中，所述的MLH1基因表达产物为转染了MLH1编码序列的质粒。

在另一优选例中，所述的MLH1蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

在另一优选例中，所述的MLH1来源于哺乳动物，较佳地，来源于人、小鼠、大鼠，更佳地，来源于人。

本发明的第二方面，提供了一种MLH1基因或蛋白或其促进剂的用途，用于制备a）治疗高表达DKK4结直肠癌的药物组合物；和/或b）治疗高表达DKK4结直肠癌的化疗耐药的药物组合物。

在另一优选例中，所述的高表达DKK4指目标细胞DKK4表达量和/或活性显著高于对照细胞，其中所述的显著高于指DKK4在对照细胞检测值为X1，在目标细胞检测值为X2，X2/X1>1.5。

在另一优选例中，所述对照细胞包括未发生化疗耐药的结直肠癌患者的结直肠癌细胞或正常结直肠细胞；所述的目标细胞包括发生化疗耐药的结直肠癌患者的结直肠癌细胞或确诊结直肠癌患者的结直肠细胞。

在另一优选例中，所述的结直肠癌包括结肠癌、直肠癌。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括MLH1促进剂、药学上可接受的载体以及任选的化疗剂。

在另一优选例中，所述的化疗剂包括（a）5-氟脲嘧啶(5-fluorourcil,5-Fu)；以及任选的（b）奥沙利铂（OXA）、伊力替康（Irinotecan）、酰胺(CTX)、异环磷酰胺(IFO)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、顺铂(CDDP)、卡铂(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)、卡培他滨片（Capecitabine）或其组合。

本发明的第三方面，提供了一种治疗DKK4高表达结直肠癌或治疗DKK4高表达结直肠癌的化疗耐药的药物组合物，所述的药物组合物包括a）MLH1基因或蛋白或其促进剂;b）药学上可接受的载体；以及任选的c）化疗剂。

本发明的第四方面，提供了一种筛选制备MLH1促进剂的候选化合物的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)测试组中，在DKK4的表达量和/或活性高的结直肠癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中DKK4的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中DKK4的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的DKK4的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是制备MLH1促进剂的候选化合物。

在另一优选例中，步骤（i）还包括对结直肠癌细胞进行DKK4表达量和/或活性的测定，并选取DKK4表达量和/或活性高的结直肠癌细胞进行培养以及进行化合物测试。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(ii)对于步骤(i)中获得的候选化合物，进一步测试其对DKK4高表达的结直肠癌细胞生长或增殖的抑制作用。

在另一优选例中，所述步骤(ii)中包括步骤：测试组中，在DKK4的表达和/或活性高的癌细胞培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；或，在对照组中，在相同培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是制备MLH1促进剂的候选化合物。

本发明的第五方面，提供了一种体外的非治疗性的抑制DKK4高表达肿瘤生长或增殖的方法，在MLH1基因或蛋白或其促进剂存在的情况下，培养DKK4高表达的结直肠癌细胞，从而抑制结直肠癌细胞的生长。

本发明的第六方面，提供了一种MLH1抑制剂的用途，用于a）升高或促进DKK4蛋白的表达量/或活性；b）促进DKK4高表达的结直肠癌细胞的生长或增殖；和/或c）促进DKK4高表达的结直肠癌细胞对化疗剂的耐药性。

在另一优选例中，所述的抑制剂包括MLH1的抗体、MLH1核酸的反义RNA、siRNA、shRNA以及MLH1的活性抑制剂。

本发明的第七方面，提供了一种治疗DKK4高表达的结直肠癌或治疗DKK4高表达且化疗耐药结直肠癌的方法，包括步骤：a）对确诊结直肠癌和/或结直肠癌化疗耐药的患者进行DKK4检测；b）对测得DKK4高表达的患者施用MLH1促进剂；从而治疗DKK4高表达的结直肠癌或治疗DKK4高表达结直肠癌的化疗耐药。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.显示了MLH1shRNA-pLVT515慢病毒转染SW480细胞及干扰克隆株建立。图1A为荧光显微镜检测慢病毒感染SW480细胞：左边图片为绿色荧光下细胞形态，右边为白光下细胞形态；图1B为WB检测慢病毒干扰SW480细胞MLH1表达。其中Ctr为空白病毒对照组，数字编号为慢病毒干扰细胞后不同克隆株编号。

图2显示了SW480细胞MLH1表达抑制后对5-Fu作用的抵抗效应。其中SW480细胞MLH1表达抑制后（knock down，KD）,对不同浓度5-Fu诱导的凋亡细胞（Annexin V⁺PI⁺）和死亡细胞数（Annexin V^-PI⁺）占总细胞数比例都显著降低。说明化疗药物5-Fu杀死MLH1KD的SW480细胞的能力明显降低，对5-Fu作用明显产生耐受。

图3显示了SW480MLH1KD克隆株中DKK4表达。图3A为Western-blot检测MLH1表达结果；图3B为Q-CPR检测DKK4mRNA表达差异；图3C为ELISA检测细胞上清中，24小时和48小时后DKK4的表达。

图4显示了SW620MLH1KD克隆株中DKK4表达。图4A为Western-blot检测MLH1表达结果；图4B为Q-CPR检测DKK4mRNA表达差异；图4C为ELISA检测细胞上清中，24小时和48小时后DKK4的表达。

图5显示了HT-29MLH1KD克隆株中DKK4表达。图5A为Western-blot检测MLH1表达结果；图5B为Q-CPR检测DKK4mRNA表达差异；图5C为ELISA检测细胞上清中，72小时后DKK4的表达。

图6显示了CCK8-检测5-Fu处理不同MLH1KD细胞的活性检测。

图7显示了MLH1过表达的HCT-116细胞株的建立和DKK4表达检测，图7A为Western-blot检测MLH1表达结果；图7B为Q-CPR检测DKK4mRNA表达差异。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，MLH1基因或蛋白通过下调其下游通路中的DKK4蛋白，抑制结直肠癌细胞的生长或增殖并增强结直肠癌细胞对化疗药物的敏感性；而在MLH1缺失的情况下，会造成DKK4表达上调，并最终增强了结直肠癌对化疗药物的耐药性。在此基础上，完成了本发明。

MMR缺失

MMR（错配修复功能，Mismatch Repair，MMR）的缺失为结直肠癌的发病机制之一。

MMR缺失主要由于MMR基因发生突变或启动子区甲基化引起失活，导致机体错配修复功能降低，使DNA复制精确性下降、整个基因组不稳定。MMR缺失最易观察到的表型即微卫星的不稳定（Microsatellite instability，MSI），MSI常被用做错配修复系统功能缺失的标志。现有的临床的统计结果估计大约有15%～20%左右的结直肠癌患者发生MMR缺失。

MLH1蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“本发明多肽”、“MLH1蛋白”、“MLH1多肽”可互换使用，都指具有人蛋白MLH1氨基酸序列的蛋白或多肽。应理解，所述术语还包括MLH1的活性片段和衍生物。

在本发明中，术语“本发明基因”、“本发明多核苷酸”指编码MLH1蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序列，包括正义和反义核酸。MLH1基因定位于细胞染色体3P21.3-23，cDNA全长为2484bp，编码长度为2268bp的开放阅读框架。人MLHI蛋白由756个氨基酸残基组成，与酵母的MLH1蛋白有41%的同源性，保守区同源性5l%。MLH1蛋白与其功能相对应均定位于细胞核，在正常细胞组织中表达良好。MLH1的基本功能是对DNA复制、基因重组过程中产生的以及外源性损伤造成的碱基错配进行修复，使DNA功能受影响。

人MLH1蛋白为可能引起错配修复功能（Mismatch Repair，MMR）缺失的9个分子之一。

MLH1基因的Genbank登录号GI:382544572，MLH1的cDNA序列NM_000249.3（SEQ ID NO.:1），以及其编码的氨基酸序列NP_000240.1（SEQID NO.:2）。

如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的MLH1蛋白或多肽”是指MLH1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化MLH1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。在本发明中，MLH1蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码MLH1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码MLH1蛋白的多核苷酸。

本发明的人MLH1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或MLH1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的MLH1蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人MLH1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人MLH1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

DKK4基因或蛋白

DKK4是Dickkopf家族蛋白的一种。目前发现的DKK家族蛋白有四种，分别为DKK1-DKK4，为225-350个氨基酸残基组成的可分泌蛋白。每种DKK分子都含有两段富含半胱氨酸的的区域组成，其中DKK1和DKK4主要是功能是调节细胞内Wnt/β-catenin信号通路，与Wnt竞争结合LRP5/LRP6(lowdensitylipoprotein receptor-related protein，低密度脂蛋白相关受体蛋白)，从而作为拮抗剂抑制了β-catenin及其下游通路的活化。而Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤发生发展密切相关。

在DKK家族蛋白的几个分子中，DKK4主要在人结直肠癌组织中表达，且DKK4分子与5-Fu为基础的化疗耐受密切相关，与其相关的肿瘤因子为其上游因子TFAP2E，目前认为TFAP2E的高甲基化导致DKK4增高，并对5-Fu化疗耐受。

DKK4基因的Genbank登录号GI:66346690，DKK4的cDNA序列号NM_014420.2（SEQ ID NO.3），以及其编码的氨基酸序列号NP_055235.1（SEQID NO.:4）。

如本文所用，术语“DKK4高表达的结直肠癌”、“高表达DKK4的结直肠癌”、“表达DKK4的结直肠癌”可以互换使用，均指DKK4表达量和/或活性较一般结直肠癌或正常组织显著增高的结直肠癌。

通常，“显著增高”指：DKK4在对照细胞检测值为X1，在目标细胞检测值为X2，X2/X1>1.5。其中，所述的目标细胞为发生化疗耐药的结直肠癌患者的结直肠癌细胞时，所述的对照细胞则为未发生化疗耐药的结直肠癌患者的结直肠癌细胞；所述的目标细胞为确诊结直肠癌患者的结直肠细胞时，所述的对照细胞则为正常结直肠细胞。

促进剂和药物组合物

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与MLH1蛋白发生相互作用的物质，尤其是促进剂等。

本发明MLH1蛋白的促进剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进MLH1蛋白的表达和/或活性，进而抑制结直肠癌细胞的生长或增殖。通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明MLH1蛋白或其促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

筛选方法

本发明还提供了基于MLH1进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(促进)MLH1表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对DKK4的表达和/或活性有无抑制作用。

具体的步骤为：

其中，如果测试组中细胞的DKK4的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对DKK4的表达和/或活性有抑制作用的MLH1促进剂的候选化合物。

步骤（i）还包括对结直肠癌细胞进行DKK4表达量和/或活性的测定，并选取DKK4表达量和/或活性高的结直肠癌细胞进行培养以及进行化合物测试。一种筛选方法可基于MLH1的mRNA的表达水平。

此外，还可以有任选的步骤(ii)即对于步骤(i)中获得的候选化合物，进一步测试其对DKK4高表达的癌细胞生长或增殖的抑制作用。

步骤(ii)中还包括步骤：测试组中，在DKK4的表达和/或活性高的癌细胞培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况或；在对照组中，在相同培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是对DKK4的表达和/或活性有抑制作用的MLH1促进剂的候选化合物。

本发明的有益效果：

1.本发明MLH1基因或蛋白或其促进剂可以有效地抑制DKK4蛋白的表达量和/或活性。

2.本发明MLH1基因或蛋白或其促进剂可以增强DKK4高表达结直肠癌对化疗药物的敏感性，从而预防或治疗DKK4高表达结直肠癌的耐药。

3.本发明MLH1基因或蛋白或其促进剂可以抑制或治疗高表达DKK4的结直肠癌的增殖。

实施例1构建MLH1的shRNA干扰慢病毒和SW480MLH1knock down细胞株

方法：

1.1设计并合成针对MLH1启动区带有loop环的重复反向的29个碱基的发夹结构的shRNA序列，干扰序列见SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6。

SEQ ID NO.5为TTGGT GTTCT CAGGT TAGGT GAGCC AGCA；

SEQ ID NO.6为GCTTA GTGAA GAACT GTTCT ACCAG ATAC；

1.2酶切插入至慢病毒干扰载体pMagic7.1（购自Lenti-Center），测序验证序列正确插入至hU6启动区；

1.3将干扰质粒pMagic7.1与Pcd/NL*DDD包装质粒（购自Addgene）通过Trans-EZ（购自Sunbio公司）转染至293T细胞中进行慢病毒的包装，收集上清进行干扰慢病毒的浓缩和纯化；

1.4Q-PCR验证得到shRNA-pLVT515干扰的慢病毒总的滴度在108TU以上。

1.5将干扰慢病毒感染SW480细胞ATCC（American Type CultureCollection），并将空白病毒做对照（有效感染复数MOI值为20），细胞感染结果见图1A。

1.6通过嘌呤霉素的压力筛选出阳性的细胞克隆，再通过western-blot检测MLH1干扰效果较好的细胞株即SW480MLH1knock down细胞株（SW480MLH1KD细胞株）。

结果：图1A显示了荧光显微镜检测慢病毒感染SW480细胞：左边图片为绿色荧光下细胞形态，右边为白光下细胞形态；由图可见经过慢病毒感染24小时后，SW480细胞几乎都表达绿色荧光蛋白，说明慢病毒载体成功转染进入细胞并开始表达GFP蛋白和shRNA干扰序列。

图1B显示了与空白对照组相比，各克隆株的有效干扰效果达到90%以上，其中，Ctr为空白病毒对照组，数字编号为慢病毒干扰细胞后不同克隆株编号。。

实施例2SW480MLH1KD细胞株对5-Fu的耐药性实验

方法：采用不同浓度（0μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，50μg/ml，100μg/ml）5-FU别刺激SW480空载体对照细胞(Ctr)及实施例1中制备的SW480MLH1KD细胞，48小时后收集细胞，Annexin V/PI双染后经FACS检测细胞的凋亡情况。

结果：如图2所示，与转染慢病毒空载体对照组相比，SW480细胞MLH1表达抑制后,对不同浓度5-Fu诱导的凋亡细胞（Annexin V⁺PI⁺）和死亡细胞数（Annexin V^-PI⁺）都显著降低，可见通过shRNA慢病毒干扰SW480细胞MLH1的表达后，SW480对不同浓度的5-FU刺激诱导的凋亡明显产生耐受。同时说明用shRNA慢病毒干扰SW480MLH1表达的细胞模型建立成功。

实施例3SW480空载体组表达的细胞株中DKK4表达量的检测

本实施例采用：

不同SW480细胞克隆5×10⁵/1ml铺24孔板，在细胞培养箱中分别培养24h、48h后，吸取细胞培养上清准备ELISA检测DKK4表达（购自R&D公司），再分别抽提细胞总蛋白和总RNA用于WB检测和Q-PCR检测。

3.1PCR(Q-PCR)随机检测4株SW480空载体对照株中结果显示SW480空载体对照株不表达或仅极少量高表达DKK4。

3.2ELISA检测细胞上清中的DKK4表达，结果显示SW480空载体对照株不高表达DKK4。

由此可见，在未将MLH1KD的结直肠癌细胞株中，MLH1抑制了DKK4的表达。

实施例4SW480空载细胞株与SW480MLH1KD细胞株中DKK4表达量的检测比较

4.1随机选择SW480空载细胞株（C1、C2、C3、C6）和MLH1KD细胞株各4种（S3、S6、S7、S9），通过WB检测细胞内MLH1的表达水平，验证在四个MLH1KD细胞株中MLH1表达与对照组相比都明显降低。

4.2采用PCR(Q-PCR)检测上述对照组与KD细胞组中的DKK4mRNA表达。

4.3采用ELISA，分别在5×105个/ml细胞接种于6孔细胞培养板，37℃，5%CO2细胞培养箱常规培养后24h、48h分别收集细胞培养上清，检测对照组与KD细胞组上清中的DKK4表达。

其中，S3细胞株的MLH1抑制率为65%，S7细胞株的MLH1抑制率为65%.在抑制率相同或相近的情况下比较DKK4的表达量，可见，S7为SW480MLH1KD DKK4^high细胞株，S3为SW480MLH1KD DKK4^low细胞株。

结果如图3所示：

在mRNA检测方面，在空载细胞对照组中，未见DKK4表达；而与空载体对照株相比，SW480MLH1KD细胞组最高mRNA表达上调了320多倍(见图3B)

在ELISA检测方面，发现SW480空载体对照株不高表达DKK4，而在MLH1KD细胞株48小时培养上清中DKK43223pg/ml。

由此说明，在MLH1表达降低后，DKK4的表达显著上升，因此，MLH1的表达缺失可以引起DKK4介导的结直肠癌发生通路异常。

实施例5SW620MLH1KD细胞株中DKK4表达量的检测

方法同实施例3，区别在于KD细胞株为SW620（S2、S4、S6、S7），对照组为C1、C2、C3、C4。

结果如图4所示，在空载细胞对照组中，未见DKK4表达；SW620MLH1KD细胞组中DKK4表达显著上调。

其中，S6细胞株的MLH1抑制率为77%，S4细胞株的MLH1抑制率为75%，在抑制率相同或相近的情况下比较DKK4的表达量，可见，S6为SW620MLH1KD DKK4^high细胞株；S4为SW620MLH1KD DKK4^low细胞株；

实施例6HT-29MLH1KD细胞株中DKK4表达量的检测

结果如图5所示，在空载细胞对照组中，未见DKK4表达；HT-29MLH1KD细胞组中DKK4表达显著上调。

其中，S13细胞株的MLH1抑制率为86%，S12细胞株的MLH1抑制率为90%，在抑制率相同或相近的情况下比较DKK4的表达量，可见，S13为HT-29MLH1KD DKK4^high细胞株；S12为SW480MLH1KD DKK4^low细胞株。

由实施例3～6可见，在MMR功能正常的结直肠癌细胞中，MLH1的表达能够抑制细胞中DKK4的表达，而抑制MLH1的表达后，细胞中的DKK4表达会显著上调。

实施例7MLH1KD中，DKK4高表达和DKK4低表达的细胞株对化疗药物5-Fu的化疗耐受实验

方法：分别将MLH1KD的DKK4高表达（DKK4^high）以及DKK4低表达（DKK4^low）的SW480、SW620以及HT29细胞株以及空载体对照细胞株，取2×10⁴/100μl铺96孔板，经5-Fu（10～100μg/ml）处理48小时后，加入10μl CCK8混合孵育2～4小时，450nm检测细胞的OD值并计算细胞的存活率。

结果如图6所示：在这三个细胞株细胞模型中，MLH1KD DKK4^high克隆株的存活率明显高于MLH1KD DKK4^low克隆株，说明MLH1KD DKK4^high克隆株对5-Fu化疗耐受性更强（*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001）。

由此可见，即使MLH1基因敲除后，低的DKK4表达并不会引起结直肠癌细胞对5-Fu化疗产生耐药性，只有提高DKK4的表达才能导致MLH1缺失的结直肠癌细胞对5-Fu化疗产生耐药。因此，MLH1缺失导致的DKK4高表达为造成5-Fu耐药的原因。

实施例7过表达MLH1时对结直肠癌细胞中DKK4的表达量的影响

MLH1过表达的HCT-116细胞株的建立和DKK4表达检测：将包装好的MLH1的过表达病毒（购自Sunbio公司）感染HCT-116细胞，并将空白载体做对照（有效感染复数MOI值为20）。

通过嘌呤霉素的压力筛选出阳性的细胞克隆，再通过western-blot检测MLH1表达效果。结果如图7A所示，HCT-116C(空载体对照)不表达MLH1蛋白，而HCT-116M表达MLH1蛋白。进一步检测细胞中DKK4的表达，结果如图7B所示，在过表达MLH1分子后，HCT-116细胞中DKK4的mRNA表达水平显著降低。（**表示P<0.01）。

本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种MutL同系物1（MutL homolog1，MLH1,）基因或蛋白或其促进剂的用途，其特征在于，用于降低或抑制Dickkopf同系物4蛋白（Dickkopf homolog4protein，DKK4）的表达量/或活性，或用于制备降低或抑制Dickkopf同系物4蛋白（Dickkopf homolog4protein，DKK4）的表达量/或活性的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的促进剂包括MLH1基因表达产物、促进型miRNA、促进型转录调控因子、促进型靶向小分子化合物。

3.一种MLH1基因或蛋白或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备a）治疗高表达DKK4结直肠癌的药物组合物；和/或b）治疗高表达DKK4结直肠癌的化疗耐药的药物组合物。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的高表达DKK4指目标细胞DKK4表达量和/或活性显著高于对照细胞，其中所述的显著高于指DKK4在对照细胞检测值为X1，在目标细胞检测值为X2，X2/X1>1.5。

5.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物包括MLH1促进剂、药学上可接受的载体以及任选的化疗剂。

6.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的化疗剂包括（a）5-氟脲嘧啶(5-fluorourcil,5-Fu)；以及任选的（b）奥沙利铂（OXA）、伊力替康（Irinotecan）、酰胺(CTX)、异环磷酰胺(IFO)、丝裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、顺铂(CDDP)、卡铂(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)、卡培他滨片（Capecitabine）或其组合。

7.一种治疗DKK4高表达结直肠癌或治疗DKK4高表达结直肠癌的化疗耐药的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括a）MLH1基因或蛋白或其促进剂;b）药学上可接受的载体；以及任选的c）化疗剂。

8.一种筛选制备MLH1促进剂的候选化合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)中包括步骤：测试组中，在DKK4的表达和/或活性高的癌细胞培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；或，在对照组中，在相同培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞的数量和/或生长情况；其中，如果测试组中癌细胞的数量或生长速度小于对照组，就表明该测试化合物是制备MLH1促进剂的候选化合物。

11.一种体外的非治疗性的抑制DKK4高表达肿瘤生长或增殖的方法，其特征在于，在MLH1基因或蛋白或其促进剂存在的情况下，培养DKK4高表达的结直肠癌细胞，从而抑制结直肠癌细胞的生长。