CN105803068A

CN105803068A - 一种诊治肺腺癌的分子标记物

Info

Publication number: CN105803068A
Application number: CN201610201289.2A
Authority: CN
Inventors: 杨承刚; 王晓云; 任静
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Capitalbio Medlab Co ltd
Priority date: 2016-03-31
Filing date: 2016-03-31
Publication date: 2016-07-27

Abstract

本发明公开了一种诊治肺腺癌的分子标记物，本发明证明，PCSK1N基因在肺腺癌组织中呈高表达，抑制PCSK1N基因的表达可以促进肺腺癌细胞的凋亡、抑制肺腺癌细胞的迁移。本发明为肺腺癌的诊断和治疗提供了一种特异性手段。

Description

一种诊治肺腺癌的分子标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种诊治肺腺癌的分子标记物，所述分子标记物为PCSK1N。

背景技术

在癌症进程中，细胞经受了许多遗传和表观遗传变化，使增殖潜能、抵抗凋亡的能力及转移能力大大增加。肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，发病率在男性和女性分别居前列腺癌和乳腺癌之后，位列各类肿瘤第二位，而死亡率则位列第一。随着社会经济的发展、城市化进程的加速，环境污染日益严重，肺癌的发病率与死亡率也大幅度增加。

组织学上，将肺癌分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两大类，后者主要包括鳞状细胞癌、腺癌和大细胞肺癌亚型。其中，腺癌作为最常见的肺癌组织学亚型，约占全部肺癌的50％，发病率一直呈上升趋势，尤其是在女性人群中。肺腺癌有明显的临床、影像、分子和组织学异质性，经多年研究对肺腺癌的认识从肿瘤发生到治疗等多方面都有显著进展，但它仍是最常见的致死性肿瘤之一，生存率无显著提高。

肺腺癌早期临床症状隐匿，不易发现，大多患者在就诊时已到中晚期，失去了最佳手术时机，即使手术，多数患者仍会死于肺腺癌复发的侵袭或转移。近年来，随着对恶性肿瘤分子机制的深入研究和分子生物、生物信息技术的快速发展，不同个体遗传差异对肿瘤发生、发展、预后及治疗敏感性等肿瘤生物学行为的影响被逐渐揭示。因此寻找能评估和预警肺腺癌尤其是早期阶段术后复发和转移相关的临床病理乃至分子特征，成为目前肺腺癌基础研究和临床实践共同的目标。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诊治肺腺癌的分子标记物-PCSK1N基因。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种基因及其表达产物在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，其中，所述基因为PCSK1N。

进一步，上面所述的产品能够通过检测肺组织中PCSK1N基因的表达水平来诊断患者是否患有肺腺癌，PCSK1N基因在组织中的高表达与肺腺癌的发生发展相关。

进一步，所述检测PCSK1N基因的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PCSK1N基因及其表达产物的表达水平以诊断肺腺癌的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断肺腺癌的产品至少包括一对特异扩增PCSK1N基因的引物；所述用实时定量PCR诊断肺腺癌的产品至少包括一对特异扩增PCSK1N基因的引物；所述用免疫检测诊断肺腺癌的产品包括：与PCSK1N蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断肺腺癌的产品包括：与PCSK1N基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断肺腺癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PCSK1N蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PCSK1N基因的核酸序列杂交的探针。

进一步，所述基因芯片可用于检测包括PCSK1N基因在内的多个基因(例如，与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PCSK1N蛋白在内的多个蛋白质(例如与肺腺癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过同时检测多个肺腺癌的标志物，可大大提高肺腺癌诊断的准确率。

本发明提供了一种诊断肺腺癌的产品，所述产品能够通过检测肺组织中PCSK1N基因的表达水平来诊断肺腺癌。

进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PCSK1N基因转录水平的针对PCSK1N基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PCSK1N蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PCSK1N基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PCSK1N蛋白的特异性抗体。

进一步，所述试剂包括针对PCSK1N基因的引物和/或探针。

本发明所述的基因检测试剂盒可用于检测包括PCSK1N基因在内的多个基因(例如，与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括PCSK1N蛋白在内的多个蛋白质(例如与肺腺癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将肺腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肺腺癌诊断的准确率。

本发明中针对PCSK1N基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述PCSK1N蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PCSK1N蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与PCSK1N蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

本发明提供了PCSK1N基因及其表达产物在制备治疗肺腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括PCSK1N基因和/或其表达产物的抑制剂。所述抑制剂包括抑制PCSK1N基因表达的物质、抑制PCSK1N基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制PCSK1N基因表达产物活性的物质。

进一步，所述抑制剂包括：通过干扰RNA抑制PCSK1N基因表达的双链核糖核酸，或基于PCSK1N抗原蛋白的肿瘤疫苗，或用于抑制PCSK1N蛋白活性的蛋白质。

优选的，所述抑制剂是针对PCSK1N基因的siRNA。

本发明还提供了一种治疗肺腺癌的药物组合物，所述药物包含PCSK1N基因和/或其表达产物抑制剂。所述抑制剂包括抑制PCSK1N基因表达的物质、抑制PCSK1N基因表达产物稳定性的物质、和/或抑制PCSK1N基因表达产物活性的物质。

本发明的药物组合物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用，多种药物联合使用可以提高治疗的成功率。

进一步，上述药物组合物还包括药学上可接受的载体，所述载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

所述的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。

本发明药物的单位剂型可以使多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如丸剂、粉剂、片剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如悬浮液、溶液、乳状液、酏剂、糖浆等。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、肺内给药、直肠内给药、鼻内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药、肌内给药、静脉内给药。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有PCSK1N基因抑制剂的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有PCSK1N基因抑制剂的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

在本发明中，所述RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

在本发明的上下文中，“PCSK1N基因”包括人PCSK1N基因以及人PCSK1N基因的任何功能等同物的多核苷酸。PCSK1N基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PCSK1N基因(NC_000023.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，PCSK1N基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQIDNO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述PCSK1N基因的编码序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，PCSK1N基因表达产物包括人PCSK1N蛋白以及人PCSK1N蛋白的部分肽。所述PCSK1N蛋白的部分肽含有与肺腺癌相关的功能域。

“PCSK1N蛋白”包括PCSK1N蛋白以及PCSK1N蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PCSK1N蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物或其突变体。突变体包括等位变异体、天然突变体、诱导突变体、其氨基酸序列通过缺失、替代、增加和/或插入发生变异的突变体、在高或低的严紧条件下能与人PCSK1N的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，PCSK1N蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQIDNO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQIDNO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQIDNO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述PCSK1N蛋白是具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

氨基酸序列的修饰可以源自自发突变或遗传后修饰，也可以人工诱导天然基因产生。通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PCSK1N蛋白的融合蛋白。对于与PCSK1N蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PCSK1N蛋白的生物学活性即可。

本发明的PCSK1N蛋白也包括对SEQIDNO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PCSK1N蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“治疗肺腺癌”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈；从药物发挥的作用不同，可以包括抑制细胞生长、促进细胞凋亡。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了PCSK1N基因的表达水平与肺腺癌的发生发展相关，通过检测受试者肺组织中PCSK1N的表达，可以判断受试者是否患有肺腺癌，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种肺腺癌的新的分子标记物-PCSK1N基因，同传统的检测和治疗手段相比，更具有敏感性、特异性、无创性。

附图说明

图1显示利用QPCR检测PCSK1N基因在肺腺癌组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测siRNA对PCSK1N基因表达的影响；

图3显示Westernblot鉴定siRNA对PCSK1N蛋白的抑制作用；

图4显示软琼脂克隆形成实验检测siRNA对细胞增殖的影响；

图5显示利用Transwell小室抑制PCSK1N后对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与肺腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集8例肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织样本。上述样本为肺腺癌患者的手术切除标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用miRNAkit进行操作)

上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)RNA的分离：

A.组织匀浆或细胞中加入ReagentII1ml；

B.室温放置3min，加入0.2ml氯仿后剧烈摇动15s；

C.置于冰上防止10min；

D.12000g，4℃离心15min；

E.转移80％的水相进入新的2mlEP管中，加入1/2量的无水乙醇，振摇；

F.将小于700μl的上述液体转移至RNAMinicolumn，振摇后10000g室温离心60s。

2)RNA纯化：

A.向RNAMinicolumn加入500μlRWCWashBuffer，10000g离心30s；

B.加入500μlRWBWashBuffer，10000g离心30s，重复两次后采取最大离心完全干燥RNAMinicolumn；

C.向柱子加入15μl预热至70℃的DEPC水，室温放置2min后全速离心。

3、高通量转录组测序

1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHatv1.3.1将清洁片段与UCSCH.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiensUCSChg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinksv1.0.3处理，Cufflinksv1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3)差异表达基因的检测

将下载的EnsemblGTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，PCSK1N基因在肺腺癌组织中的表达量显著高于癌旁组织中的表达量。

实施例2QPCR测序验证PCSK1N基因的差异表达

1、对PCSK1N基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织各50例。

2、RNA提取步骤如实施例1所述。

3、逆转录：

1)反应体系：

试剂	体积
		MgCl₂	2μl
10×RT Buffer	1μl
		无Rnase水	3.75μl
dNTP混合液	1μl
		Rnase抑制剂	0.25μl
AMV反转录酶	0.5μl
		寡聚dT适配子引物	0.5μl
实验样品	1μl

2)逆转录反应条件

按照RNAPCRKit(AMV)Ver.3.0中逆转录反应条件进行。

42℃～55℃60min，99℃2min，5℃5min。

3)聚合酶链反应

1)引物设计

根据Genebank中PCSK1N基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

PCSK1N基因：

正向引物为5’-ACGTCCAGAGCAACTTAC-3’(SEQIDNO.3)；

反向引物为5’-GCTTCAGATCATGTTTATTGT-3’(SEQIDNO.4)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQIDNO.5)；

反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQIDNO.6)。

2)按照表1配制PCR反应体系：

表1PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	0.5μl
反向引物	0.5μl
		Takara Ex Taq HS	12.5μl
模板	10μl
		去离子水	补足25μl

3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃30s，60℃40s)×40个循环。以SYBRGreen作为荧光标记物，在LightCycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图1所示，与肺腺癌癌旁组织相比，PCSK1N基因在肺腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3siRNA对PCSK1N基因表达的影响

1、细胞培养

人肺腺癌细胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的DMEM培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、siRNA设计

依据GenBank中PCSK1N基因(NC_000023.11)的序列，由生工生物工程股份有限公司设计并合成针对PCSK1N基因的2个siRNA的特异性靶序列。

将细胞按5×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO₂培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-PCSK1N、siRNA2-PCSK1N)，其中阴性对照组siRNA与PCSK1N基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别进行转染。

3、QPCR检测PCSK1N基因的转录水平

3.1细胞总RNA的提取

采用TRIzolReagent(InvitrogenCat.No.15596-018)总RNA提取试剂，按说明书提供方法提取A549细胞的总RNA。

1)取细胞，用浓度为0.01M的PBS冲洗3次。

2)加入适量TRIzol试剂，室温放置5min裂解细胞，吹打均匀。

3)以1ml/管分装至1.5mlEP管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min。

4)4℃、12000rpm离心15min。

5)将上层水相移至干净EP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10min。

6)4℃、7500rpm离心10min。

7)弃上清，75％乙醇洗涤RNA沉淀，7500rpm离心5min。

8)室温干燥RNA沉淀，5-10min后溶于适量DEPC水。

9)质量分数为1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA样本的完整性，应用Bio-Photometer对提取的RNA进行定量测定。

3.2逆转录步骤同实施例2。

3.3QPCR扩增步骤同实施例2。

4、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰PCSK1N基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2显示，相比A549，转染空载siRNA-NC、siRNA2-PCSK1N组，siRNA1-PCSK1N组能够显著降低PCSK1N基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4Westernblot鉴定PCSK1N蛋白的抑制作用

1、细胞收集：六孔板中转染过的细胞，弃去培养液，用PBS清洗两遍，胰酶消化，离心收集细胞。

2、细胞总蛋白的提取：向细胞沉淀中加入50μlRIPA缓冲液，混匀后冰上放置20min，每2-3min涡旋一次。4℃离心机中15000rpm离心10min，小心吸取上清移至新的EP管中。取5μl蛋白溶液用于浓度测定，余下部分加入1/4体积的5×SDS蛋白上样缓冲液，充分吹打混匀，沸水中放置10min，使蛋白变性，冰上3min，-20℃保存备用。

3、细胞蛋白测定：采用BCA法按试剂盒说明操作。BCA液配置：A液：B液＝50:1，现用现配。冰上配置15μl裂解液+5μl蛋白溶液+200μlBCA液，放37℃温箱孵育30min，多功能蛋白测定仪上测得蛋白在595nm吸光度的OD值。

4、SDS-PAGE

1)分别配制5％浓缩胶和12％分离胶。

2)取适量样品蛋白与5×SDS上样缓冲液，按照4:1的比例将其混匀，100℃，煮沸样品蛋白5min。

3)依据蛋白浓度，按每孔30μg计算出上样体积，将蛋白Marker和样品蛋白依次加入上样孔中。

4)接通电源，浓缩胶电压60V，30min；分离胶100V，120min。

5)根据样品蛋白分子量大小切胶，组装转膜装置，加入转膜液，用碎冰块将转膜设备覆盖，接通电源，100V，转膜60min。

6)转膜完成后，在摇床上用5％脱脂奶粉封闭PVDF膜2h。

7)将鼠抗PCSK1N抗体按1:500，鼠抗β-actin抗体按1：1000稀释后与PVDF膜一起封闭于塑料薄膜中，室温下放置1h，4℃冰箱过夜。

8)用适量TBST洗膜15min，重复3次，此步骤置于摇床上进行。

9)将羊抗鼠IgG二抗按1:2000稀释，与PVDF膜一起封闭于塑料薄膜中，室温下孵育1h。用TBST洗膜3次，每次10min。

10)滴加化学发光底物ECL于膜上，进行发光显像。

5、数据分析

运用Gel-ProAnalyzer软件分析目的蛋白相对表达量，用目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示，并用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为显著差异。

6、结果

结果如图3所示，转染siRNA的两个干预组细胞PCSK1N蛋白表达与对照相比明显降低，且siRNA1-PCSK1N的沉默抑制作用效果更好。

实施例5软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO₂温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图4所示，与其他组相比，siRNA1-PCSK1N组单细胞克隆集落形成数显著降低。

实施例6划痕实验检测转染siRNA后肺腺癌细胞增殖、迁移能力

1、将A549细胞平铺于六孔板中，每孔密度为5×10⁵个，加入含有10％胎牛血清和1％P/S的DMEM培养基培养，37℃，5％CO₂条件下培养24h。

2、转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(20nM)(siRNA1-PCSK1N)以及空白对照组。

3、用10μl移液枪头在单层细胞上画“一”字痕，用PBS溶液缓慢冲洗3次。分别选取培养24、48、72h的细胞置于倒置显微镜下观察拍照。计算划痕愈合率＝(0h划痕宽度-24h(或48h或72h)划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。

4、结果

结果如表2所示，随着培养时间的增长，siRNA1-PCSK1N组的划痕愈合率明显低于siRNA-NC组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，抑制PCSK1N的表达可以抑制肺腺癌细胞的迁移增殖，PCSK1N促进肺腺癌细胞的迁移和增殖。

表2siRNA1-PCSK1N对A549迁移增殖的影响

实施例7Transwell细胞体外侵袭实验

1、向Transwell小室的上孔中加入100μl的无血清培养液Matrigel浸泡30min。

2、用胰酶消化处于对数生长期的稳定感染后各组细胞，PBS清洗细胞3次，用含有10％血清的培养液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml。

3、向包被有Matrigel的Transwell小室的上室中加入细胞悬液200μl。

4、Transwell小室的下室中加入600μl含20％FBS的DMEM培养液。

5、37℃，5％CO₂温箱内培养24h。

6、除去上室和下室中的培养液，用棉签刮除上室中的Matrigel和存留的细胞，用PBS清洗2次。

7、用1％结晶紫染色液染色45min，PBS清洗1次。

8、随机选取4个100倍视野，在显微镜下分别计数侵袭细胞数，每种不同类型的细胞设3个复孔，共重复3次。

9、数据处理

用SPSS18.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用均数±标准差表示。多个样本均数比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为显著差异。

10、结果

结果如图5所示，A549、siRNA-NC和siRNA1-PCSK1N组细胞在transwell小室中培养24h后，A549-siRNA1-PCSK1N组聚碳酸酯膜下室面的细胞数显著减少。

实施例8PCSK1N基因对肺腺癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测PCSK1N基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

1)细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞。

2)用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×10⁶个/ml。

3)取200μl细胞悬液加入到EP管中，加入10μlAnnexin-V-FITC混匀。

4)室温暗处孵育染色15min。

5)上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。

6)未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

转染siRNA1-PCSK1N组的细胞凋亡率为(25.12±0.011)％，转染siRNA-NC组的细胞凋亡率为(7.67±0.015)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，PCSK1N基因的表达有利于肺腺癌细胞存活，通过抑制PCSK1N基因的表达可以促进肺腺癌细胞的凋亡。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种基因及其表达产物在制备诊断肺腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述基因为PCSK1N。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品能通过检测PCSK1N基因的表达水平来诊断肺腺癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测PCSK1N基因的表达水平的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测。

4.一种诊断肺腺癌的产品，其特征在于，所述产品能够通过检测肺组织中PCSK1N基因的表达水平来诊断肺腺癌。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测TMIGD2基因转录水平的针对PCSK1N基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PCSK1N蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PCSK1N基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PCSK1N蛋白的特异性抗体。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述试剂包括针对PCSK1N基因的引物和/或探针。

7.PCSK1N基因及其表达产物在制备治疗肺腺癌的药物组合物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括PCSK1N基因和/或其表达产物的抑制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抑制剂是针对PCSK1N的siRNA。

10.一种治疗肺腺癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求8或9所述的抑制剂。