CN105886629B - 分子标志物在诊治食管鳞癌中的应用 - Google Patents

分子标志物在诊治食管鳞癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分子标志物在食管鳞癌诊治中的应用，该分子标志物为MYOC基因，本发明通过实验证明了MYOC基因在食管鳞癌组织中存在差异表达，可以作为早期诊断食管鳞癌的指标。本发明同时证明了通过调高MYOC基因的表达水平可以抑制食管鳞癌细胞的生长和增殖，可以作为食管鳞癌的潜在治疗靶标，用于指导新药的研发。

Description

分子标志物在诊治食管鳞癌中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标志物在诊治食管鳞癌中的应用，具体地该分子标志物为MYOC基因。
背景技术
食管癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，主要包括两大类，食管鳞癌和食管腺癌，而中国主要以食管鳞癌为主。目前食管鳞癌的发病率呈逐年增加的趋势，转移率高，预后不良。由于食管鳞癌在发病早期病人没有明显的症状，就诊时一般都处于中晚期，5年生存率仅为18-30％。在我国，尤其是食管鳞癌的高发地区，食管鳞癌已成为危害人民群众生命安全的重要原因。
食管鳞癌的癌变过程是一个多阶段的演进过程，其一般演进模式为：正常食管鳞癌上皮—食管上皮基底细胞过度增生—不典型增生—原位癌—食管鳞癌。食管鳞癌的发生和发展是一个涉及多因素多步骤的复杂的病理过程，其由包括遗传、环境、生活方式等多因素综合作用而致。诱发食管癌的危险因素有遗传易感性、吸烟、饮酒、喜食烫食等生活习惯，亚硝胺类化合物摄入，低水平社会经济条件，癌前病变等。
目前，手术治疗是食管鳞癌的主要有效治疗手段之一，但食管鳞癌就诊时多处于中晚期，相当部分的病人已不能进行手术治疗，总体5年生存率低于10％，如果早期食管鳞癌病人进行有效的手术治疗，10年生存率可达95％以上。因此，早期诊断，早期治疗，在食管鳞癌的治疗中显得格外重要。上消化道内镜检查仍是现阶段发现早期食管鳞癌的最常见的手段，但是由于其价格昂贵及有创性，限制了大规模的高危人群筛查。与肝癌、前列腺癌、肠癌等肿瘤相比，食管鳞癌的诊断和监测缺乏相对有效的肿瘤标志物。尽管临床上已经应用了诸如SCC、CEA、CA724和CA199等的标志物，但上述分子标志物在食管鳞癌的临床诊断的应用价值有限。因此寻找一种有效、可靠的肿瘤标志物对于食管鳞癌的诊断和治疗都有着比较重要的临床意义。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于诊治食管鳞癌的MYOC基因。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测MYOC基因表达的产品在制备诊断食管鳞癌的工具中的应用。
进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、dPCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MYOC基因的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增MYOC基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增MYOC基因的引物；所述用dPCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增MYOC基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与MYOC蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与MYOC基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MYOC蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MYOC基因的核酸序列杂交的探针。
进一步，所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的试剂至少包括的一对特异扩增MYOC基因的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
本发明中针对MYOC基因的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
本发明提供了一种诊断食管鳞癌的工具，所述工具能够通过检测食管组织中MYOC基因的表达水平来诊断食管鳞癌，MYOC基因在食管鳞癌组织中表达下调。
进一步，所述工具包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测MYOC基因转录水平的针对MYOC基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的MYOC蛋白的特异性抗体；所述基因检测试剂盒包括用于检测MYOC基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括MYOC蛋白的特异性抗体。
所述基因芯片可用于检测包括MYOC基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括MYOC蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与食管鳞癌的标志物同时检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。所述基因检测试剂盒可用于检测包括MYOC基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括MYOC蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。
在本发明中，所述MYOC蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述MYOC蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与MYOC蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。
本发明提供了MYOC基因和/或其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括增加MYOC基因表达、增强MYOC表达功能、和/或增强MYOC表达产物活性的试剂。
进一步，所述试剂包括：含有能编码功能性MYOC蛋白的核酸的试剂、MYOC蛋白的激活剂、含有MYOC蛋白质的试剂。
其中，所述含有能编码功能性MYOC蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的MYOC蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性MYOC蛋白，任何一种MYOC基因的携带方式均可。所述的MYOC蛋白激活剂是指刺激MYOC蛋白活性、增加MYOC蛋白活性、促进MYOC蛋白活性、增强MYOC蛋白激活、使MYOC蛋白活性敏感化或上调MYOC蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、MYOC启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、MYOC蛋白的激动剂(如激活抗体)等。
本发明还提供了一种治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括增加MYOC基因表达、增强MYOC表达功能、和/或增强MYOC表达产物活性的试剂。
进一步，上述药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
所述的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
所述缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。
稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。
抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。
表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。
等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。
本发明的药物还可包括药学上可接受的涂层材料包括(但不限于)，快速分解涂层材料、染色剂、肠溶性聚合物、增塑剂、水溶性聚合物、水不溶性聚合物、染料、色素、其他崩散剂。常见快速分解涂层材料包括OPADRY；肠溶性聚合物包括甲基内烯酸聚合物、磷羟丙甲基纤维素苯二甲酸酯、羟丙甲基纤维素乙酸酯、羟丙甲基纤维素琥珀酸酯、羟甲乙基纤维素、乙酰磷苯二甲酸纤维素；增塑剂包括聚乙二醇(PEG)、丙二醇等。
本发明的药物可以用于补充内源性的MYOC蛋白缺失或不足，通过提高MYOC蛋白的表达或增强MYOC蛋白的功能，从而治疗因MYOC蛋白减少导致的食管鳞癌。
本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
本发明药物的单位剂型可以是多种形式，代表性的剂型包括固体剂型如片剂、丸剂、粉剂、干粉剂、颗粒、胶囊等；液态剂型如溶液、悬浮液、乳状液、糖浆、酏剂等。
本发明所述药物可以通过任何途径给予受体，只要能达到目标组织，其可通过口服或非口服的多种途径，如口服给药、鼻内给药、腹腔内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、肺内给药、直肠内给药、静脉内给药。
本发明中MYOC蛋白或编码MYOC蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。
本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有MYOC基因的药物或者含有MYOC蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有MYOC基因的药物或者含有MYOC蛋白质的药物注入体内组织中。
本发明的药物还可与其他治疗食管鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，MYOC蛋白或编码所述蛋白的核酸)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如MYOC蛋白或编码所述蛋白的核酸)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。
在疾病治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。
在本发明的上下文中，“MYOC基因”包括人MYOC基因以及人MYOC基因的任何功能等同物的多核苷酸。MYOC基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中MYOC基因(NC_000001.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，MYOC基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA 分子。
在本发明的具体实施方案中，所述MYOC基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，MYOC基因表达产物包括人MYOC蛋白以及人MYOC蛋白的部分肽。所述MYOC蛋白的部分肽含有与食管鳞癌相关的功能域。
“MYOC蛋白”包括MYOC蛋白以及MYOC蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括MYOC蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人MYOC的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，MYOC蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述MYOC蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是MYOC蛋白的融合蛋白。对于与MYOC蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留MYOC蛋白的生物学活性即可。
本发明的MYOC蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留MYOC蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“治疗食管鳞癌”包括能消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟病症的任何症状的发生和复发，即包括对疾病的治疗性干预和预防性干预，也可以包括抑制食管鳞癌细胞的生长、促进食管鳞癌细胞的凋亡。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了MYOC基因在食管鳞癌的发生发展中起着重要的作用，通过检测受试者食管组织中MYOC的表达水平，可以判断受试者是否患有食管鳞癌，从而指导临床医师给受试者提供个性化预防方案或者治疗方案，同时本发明的研究为揭示食管鳞癌的发病机理提供了理论和实验依据。
附图说明
图1显示利用QPCR检测MYOC基因在食管鳞癌组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测MYOC基因在食管鳞癌细胞中的表达情况；
图3显示利用MTT检测MYOC基因表达对食管鳞癌细胞增殖能力的影响；
图4显示利用软克隆琼脂形成实验检测MYOC基因表达对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选与食管鳞癌相关的基因标志物
1、样品收集
各收集6例食管鳞癌癌旁组织和食管鳞癌组织样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备(利用miRNA kit进行操作)
上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：
1)RNA的分离：
A.组织匀浆或细胞中加入Reagent II 1ml；
B.室温放置3min，加入0.2ml氯仿后剧烈摇动15s；
C.置于冰上防止10min；
D.12000g，4℃离心15min；
E.转移80％的水相进入新的2ml EP管中，加入1/2量的无水乙醇，振摇；
F.将小于700μl的上述液体转移至RNA Mini column，振摇后10000g室温离心60s。
2)RNA纯化：
A.向RNA Mini column加入500μl RWC Wash Buffer，10000g离心30s；
B.加入500μl RWB Wash Buffer，10000g离心30s，重复两次后采取最大离心完全干燥RNA Mini column；
C.向柱子加入15μl预热至70℃的DEPC水，室温放置2min后全速离心。
3、高通量转录组测序
1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，MYOC基因在食管鳞癌组织中的表达量显著低于正常垂体组织中的表达量。
实施例2QPCR测序验证MYOC基因的差异表达
1、对MYOC基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择食管鳞癌癌旁组织和食管鳞癌组织各50例。
2、RNA提取步骤同实施例1。
3、逆转录：使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
(1)取总RNA 1μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μl，充分混匀。70℃水浴5min后立即冰浴2min。
(2)构建25μl反应体系，其中包括5×逆转录缓冲液5μl，dNTP(2.5mM)5μl，RNasin40U/μl，M-MLV 200U/μl，补无核酸酶水至预期体积。
(3)42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M-MLV。
(4)-20℃储存备用。
4、QPCR扩增
(1)引物设计
根据Genebank中MYOC基因和β-actin基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
β-actin的引物序列：
正向引物：5’-CCTGGGCATGGAGTCCTGTG-3’(SEQ ID NO.3)
反向引物：5’-TCCTTCTGCATCCTGTCG-3’(SEQ ID NO.4)
MYOC的引物序列：
正向引物：5’-ATTGTCCTCTCCAAACTGA-3’(SEQ ID NO.5)，
反向引物：5’-TGACTGCTTACGGATGTT-3’(SEQ ID NO.6)
以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃30s，60℃60s)×40个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示，与食管鳞癌癌旁组织相比，MYOC基因在食管鳞癌组织中下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。
实施例3MYOC基因的过表达
1、细胞培养
人食管鳞癌细胞株KYSE 150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、MYOC基因的过表达
2.1MYOC基因表达载体的构建
根据MYOC基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：
正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGAGGTTCTTCTGTGCACGT-3’(SEQ ID NO.7)
反向引物：5’-CGGGCGGCCGCCATCTTGGAGAGCTTGATGTCATA-3’(SEQ ID NO.8)
从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的MYOC基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后插入到经限制性内切酶HindIII和NotI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-MYOC用于后续实验。
2.2转染
将食管鳞癌细胞分为三组，分别为KYSE 150组、空载组(转染pcDNA3.1空载体)、和MYOC过表达组(转染pcDNA3.1-MYOC)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-MYOC的工作浓度均为0.5μg/ml。
2.3RT-PCR检测
具体步骤同实施例2。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
如图2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-MYOC的细胞中MYOC的含量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4MYOC基因对食管鳞癌细胞增殖的影响
采用MTT实验检测MYOC基因对食管鳞癌细胞增殖能力影响。
1、细胞培养与转染步骤同实施例3。
2、步骤：
(1)将对数增殖期的KYSE 150细胞接种于96孔板中，每孔约4×103个。
(2)设三个pcDNA3.1-MYOC组，分别是pcDNA3.1-MYOC组、空载和KYSE 150对照组，每组细胞设三个复孔，其中pcDNA3.1-MYOC组、pcDNA3.1组进行瞬时转染。
(3)分别在转染后24h，48h，72h，在各组细胞中加入20μl MTT溶液(5mg/L)，室温下静置4h后，停止培养，吸弃培养基。
(4)往各孔中加入150μl DMSO，轻轻晃动96孔板，充分溶解残留的甲瓒结晶。
(5)在570nm处记录吸光值，注意设置含培养基和MTT但不含细胞的调零孔。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
图3所示的结果显示：KYSE 150组同空载组无明显差异，而转染pcDNA3.1-MYOC组的细胞生长速度明显低于转染pcDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明MYOC的表达能够抑制食管鳞癌细胞的生长。
实施例5MYOC基因对食管鳞癌细胞凋亡的影响
使用流式细胞仪检测MYOC基因对细胞凋亡的影响。
1、细胞培养步骤同实施例3。
2、细胞转染步骤同实施例3。
3、步骤
细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×106个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μl Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染质粒的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果：
转染pcDNA3.1-MYOC组的细胞凋亡率为(27.19±0.007)％，转染pcDNA3.1空载体组的细胞凋亡率为(6.78±0.004)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，MYOC基因的过表达促进食管鳞癌细胞的凋亡。
实施例6软琼脂克隆形成实验
1、用0.25％胰蛋白酶消化经转染的处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。
2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×103个/ml。
3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。
4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO2温箱中备用。
5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×103个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。
6、待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。
7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。
8、结果
结果如图4所示，与其他组相比，pcDNA3.1-MYOC组单细胞克隆集落形成数显著降低，说明MYOC的过表达抑制了食管鳞癌细胞的增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.检测MYOC基因表达的产品在制备诊断食管鳞癌的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、dPCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测MYOC基因的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增MYOC基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增MYOC基因的引物；所述用dPCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增MYOC基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与MYOC蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与MYOC基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与MYOC蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与MYOC基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括的一对特异扩增MYOC基因的引物如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括芯片、试剂盒和/或试纸。
6.MYOC基因和/或其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，药物组合物包括含有能编码功能性MYOC蛋白的核酸的试剂。
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