CN105331691B - Pzp基因在胆管癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PZP基因在胆管癌诊断和治疗中的应用，PZP基因在胆管癌患者组织中呈低表达，增加PZP的表达可以抑制胆管癌细胞的生长和侵袭，本发明大大提高了胆管癌诊断的敏感性和特异性，同时为胆管癌的基因治疗提供了新的靶点。

Description

PZP基因在胆管癌诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及PZP基因在胆管癌诊断和治疗中的用途。

背景技术

胆管癌是指原发于左右肝管汇合部至胆总管下端的肝外胆管恶性肿瘤，其病因尚不清楚，与其发病可能有关的因素有：溃疡性结肠炎、胆结石、中华分枝睾吸虫感染、胆总管囊肿等，这些因素都能增加胆管癌发病的危险性。临床表现主要为伴有上腹部不适的进行性黄疸、食欲不振、消瘦、瘙痒等。如肿瘤破溃出血，可有黑便或大便潜血试验阳性、贫血等表现。

胆管癌的恶性程度极高，在欧美地区发病率很低，但在东南亚地区及我国的发病率成上升趋势，且整体治疗水平很不理想，迄今无满意的治疗方法。由于临床上出现症状较晚，早期诊断困难，同时由于胆管癌具有沿胆管壁局部浸润的生物学特性，易侵犯肝门部血管及二级胆管，根治性手术切除的机会不多(约15％～20％)，常规手术后导致局部复发，预后较差平均生存期为6～12个月，而5年存活率为2％～16.5％。由于其对化疗与放疗等非手术治疗不敏感，综合治疗手段目前仍无明确改善远期疗效的意义，早期预防、早期发现、早期治疗是提高人胆管癌手术根治率的关键。

目前临床上用于胆管癌诊断的方法包括：临床表现、血液检查、血清肿瘤标记物检查、胆管癌目前并没有发现特异性肿瘤标记物，仅CA-19、CA125、CEA有一定价值；影像学检查、ERCP和PTC、十二指肠镜、肠道母子镜、细胞学和组织学诊断。但是上述方法的使用不能提供一种特意和敏感的诊断。尽管现在临床上会使用一些肿瘤标记物进行检查，但由于这些肿瘤标记物相对于胆管癌是非特异性性的，其仅具有一定的参考价值，因此发现一种特异性的胆管癌标记物具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于胆管癌早期诊断的分子标志物-PZP基因。相比传统的胆管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断胆管癌具有及时性、特异性和灵敏性，使患者在癌症早期就能知晓癌症风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种PZP基因及其表达产物在制备诊断胆管癌的产品中的应用。

进一步，上面所提到的诊断产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PZP基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增PZP基因的引物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增PZP基因的引物；所述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与PZP蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断胆管癌的产品包括：与PZP基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PZP蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PZP基因的核酸序列杂交的探针。

本发明提供了一种诊断胆管癌的产品，所述的产品能够通过检测胆管组织中PZP基因的表达水平来诊断胆管癌。

进一步，上面所述的产品包括芯片、或试剂盒。其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PZP基因转录水平的针对PZP基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体上的PZP蛋白的特异性抗体；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PZP基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PZP蛋白的特异性抗体。

进一步，上面所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测PZP基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对PZP基因的引物和/或探针。

进一步，所述基因芯片可用于检测包括PZP基因在内的多个基因(例如，与胆管癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PZP蛋白在内的多个蛋白质(例如与胆管癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与胆管癌的标志物同时检测，可大大提高胆管癌诊断的准确率。

本发明还提供了PZP基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括能够促进PZP基因表达或增强PZP表达功能的试剂。

进一步，所述试剂包括：含有能编码功能性PZP蛋白的核酸的试剂、PZP蛋白的激活剂、含有PZP蛋白质的试剂。

其中，所述含有能编码功能性PZP蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的PZP蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性PZP蛋白，任何一种PZP基因的携带方式均可。所述的PZP蛋白激活剂是指刺激PZP蛋白活性、增加PZP蛋白活性、促进PZP蛋白活性、增强PZP蛋白激活、使PZP蛋白活性敏感化或上调PZP蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、PZP启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、PZP蛋白的激动剂(如激活抗体)等。

本发明还提供了上面所述的试剂在制备治疗胆管癌的药物组合物中的应用。

本发明还提供了一种治疗胆管癌的药物组合物，所述药物包括能够促进PZP基因表达或增强PZP表达功能的试剂。

本发明的药物可以用于补充内源性的PZP蛋白的缺失或不足，通过提高PZP蛋白的表达，从而治疗因PZP蛋白减少导致的胆管癌。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

进一步，本发明中PZP蛋白或编码PZP蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。

进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的一种或多种载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂或填充剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素(如乙基纤维素、微晶纤维素)、糖胶、果胶、聚丙烯酸酯和/或磷酸氢钙、硫酸钙，润滑剂如硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸钙、金属硬脂酸盐、胶体二氧化硅、氢化植物油、玉米淀粉、苯甲酸钠和/或聚乙二醇，粘合剂如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮和/或羟丙基纤维素，崩解剂如淀粉(如马铃薯淀粉或淀粉钠)、乙醇酸盐(酯)、琼脂、褐藻酸或其钠盐、或起泡混合物，湿润剂如月桂基硫酸钠和/或吸收剂、着色剂、芳香剂和甜味剂。可以将本发明的化合物和药剂及它们生理学上可接受的盐及溶剂化物进行配制，用于通过任何合适的途径给药，包括吸入给药、局部给药、经鼻给药、经口给药、肠胃外给药或直肠给药。

药物组合物可以被配制成任何的给药类型，例如，利用注射器或其它装置的皮内注射、皮下注射、静脉内注射、腹膜内注射、胸膜内注射、膀胱内注射、冠状动脉内或肿瘤内注射、口服给药、直肠给药。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有PZP基因的药物或者含有PZP蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有PZP基因的药物或者含有PZP蛋白质的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗胆管癌的药物联用，示例性的有利的治疗性化合物包括全身和局部抗炎药、止疼药、抗组胺剂、麻醉化合物等。其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，PZP蛋白或编码所述蛋白的核酸)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如PZP蛋白或编码所述蛋白的核酸)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

可以在治疗过程中，根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

本发明中与PZP基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述PZP蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PZP蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰，例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与PZP蛋白的结合能力即可。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

在本发明的上下文中，“PZP基因”包括人PZP基因以及人PZP基因的任何功能等同物的多核苷酸。PZP基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PZP基因(NC_000012.12)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，PZP基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述PZP基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，PZP基因表达产物包括人PZP蛋白以及人PZP蛋白的部分肽。所述PZP蛋白的部分肽含有与胆管癌相关的功能域。

“PZP蛋白”包括PZP蛋白以及PZP蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括PZP蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人PZP的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，PZP蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述PZP蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PZP蛋白的融合蛋白。对于与PZP蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PZP蛋白的生物学活性即可。

本发明的PZP蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PZP蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

在本发明的上下文中，“诊断胆管癌”既包括判断受试者是否已经患有胆管癌、也包括判断受试者是否存在患有胆管癌的风险。

在本发明的上下文中，“治疗胆管癌”包括能消除、减轻、缓解、逆转或预防或延迟病症的任何症状的发生和复发，即包括对疾病的治疗性干预和预防性干预。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了PZP基因表达与胆管癌相关，通过检测受试者胆管黏膜中PZP的表达，可以判断受试者是否患有胆管癌、或者判断受试者是否存在患有胆管癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

本发明发现了一种胆管癌的新的分子标记物-PZP基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现胆管癌的早期诊断，从而降低胆管癌的死亡率。

附图说明

图1显示利用QPCR检测PZP基因在胆管癌组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测PZP基因在胆管癌细胞中的过表达情况；

图3显示利用MTT检测PZP基因表达对胆管癌细胞增殖能力的影响；

图4显示利用Transwell检测PZP基因表达对胆管癌细胞侵袭的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与胆管癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集8例正常胆管组织和胆管癌组织样本。上述样本为胆管癌患者的手术切除标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备(利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)

1)组织提取

在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研钵称取离体肺腺癌组织样本约20mg，用杵棒研磨至粉末状，然后将样本转移到一个不含RNA酶的2ml的离心管中。加入300μl裂解液，置于匀浆器内，充分研磨1-5min，12000g，4℃，离心10min，转移上清至新的1.5ml的离心管中。加入600μl不含RNA酶的水，用漩涡器混匀后，加入20μl蛋白酶K，在55℃温浴15min，不断涡旋混匀。14000g，室温离心1min，使细胞碎片沉淀于离心管底部，取上清转移到另外一个不含RNA酶的1.5ml离心管中，加入450μl的95％乙醇，涡旋混匀。

2)RNA吸附：

取650μl含乙醇的裂解液加到离心柱中，14000g离心1min，弃下层，将柱子重新置于收集管中；重复操作一次，然后加入400μl清洗液，14000g离心2min，弃下层，将柱子置于一新的收集管上。

3)DNase处理：

加入100μl Enzyme Incubation Buffer和15μl DNase I，14000g离心1min，将收集管中的溶液重新移入柱中，室温放置15min。

4)RNA洗涤：

加入400μl清洗液，14000g离心1min，弃下层，将柱子重置于收集管中，然后加入400μl清洗液，14000g离心2min，弃收集管。

5)RNA洗脱：

把柱子放入1.5ml Elution管中，加入30μl洗脱液，200g离心2min，使溶液充分与柱子结合，然后14000g离心1min。

3、高通量转录组测序

1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，PZP基因在胆管癌组织中的表达量显著低于正常胆管组织中的表达量。

实施例2QPCR测序验证PZP基因的差异表达

1、对PZP基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择胆管癌组织和正常胆管组织各80例。

2、QPCR具体操作步骤如下所示：

(1)RNA提取

收集样本后冻存于液氮，取出后把组织放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本成粉末状后：

1)加入Trizol，室温放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；

3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。

(2)逆转录

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

(3)QPCR扩增检验

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增PZP基因的正向引物序列为5’-CAGGACAGACAGTAAGATT-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-CTCAAGGTATATCAGTGGAA-3’(SEQ ID NO.4)；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃10min，(95℃15s，60℃45s)×30个循环。以SYBR

Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与正常胆管组织相比，PZP基因在胆管癌组织中下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3PZP基因过表达

1、人胆管癌细胞株QBC939，以含10％小牛血清的DMEM(高糖)培养基在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％胰蛋白酶常规消化传代。

2、PZP基因的过表达

2.1PZP基因表达载体的构建

根据PZP基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：正向引物为5’-CCGGGATCCGCCACCATGCGGAAAGACAGA-3’(SEQ ID NO.7)，反向引物为5’-CGGCTCGAGAACATTTCCATGCTC-3’(SEQ ID NO.8)。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的PZP基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切后插入到经限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-PZP用于后续实验。

2.2转染

将胆管癌细胞株QBC939分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和PZP过表达组(转染pcDNA3.1-PZP)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-PZP的工作浓度均为0.5μg/ml。

2.3RT-PCR检测

具体步骤同实施例2。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

如图2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-PZP的细胞中PZP的含量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4PZP基因对胆管癌细胞增殖的影响

采用MTT实验检测PZP基因对胆管癌细胞增殖能力影响。

1、步骤：各组细胞转染12h后胰酶消化，制成单细胞悬液，以每孔6000个细胞接种于96孔培养板中，每组分7个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测：每孔加入5g/L的MTT液20μl，继续培养4h后，吸去培养基，加入DMSO 150μl，细心吹打，使紫蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值)。然后每12h检测1次，连续测72h，共7次。本实验重复3次。

2、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

图3所示的结果显示：转染pcDNA3.1-PZP组的细胞生长速度明显低于转染pcDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明PZP表达能够抑制胆管癌细胞的生长。

实施例5PZP基因对胆管癌细胞增殖、迁移的影响

1、将QBC939细胞平铺于六孔板中，每孔密度为5×10⁵个，加入含10％胎牛血清的DMEM培养，37℃，5％CO2条件下培养24h。

2、转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为对照组(pcDNA.1)和实验组(pcDNA3.1-PZP)。

3、用10μl移液枪头在单层细胞上画“一”字痕，用PBS溶液缓慢冲洗3次。选取培养48h的细胞置于倒置显微镜下观察拍照。计算划痕愈合率＝(0h划痕宽度-48h划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。

4、结果

转染pcDNA3.1-PZP的划痕愈合率为(21.17±0.97)％，转染pcDNA3.1的划痕愈合率为(47.17±0.24)％，pcDNA3.1-PZP组的划痕愈合率明显低于pcDNA.1组，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，促进PZP的表达可以抑制胆管癌细胞的迁移增殖，PZP抑制胆管癌细胞的迁移和增殖。

实施例5PZP基因对胆管癌细胞侵袭的影响

按照BD Bioscience公司的BD BioCoat^TM Growth Factor Reduced MATRIGEL^TMinvasion Chamber的说明书进行穿孔(Transwell)测定。

1、取六个小室分两组置于24孔板内，每个小室内加入500μl无血清培养基置于细胞培养箱内水花2h。

2、分别收集用0.25％胰蛋白酶消化的生长状态良好的转染pcDNA3.1-PZP和转染pcDNA3.1的细胞，用无血清DMEM培养基重悬使细胞浓度为5×10⁴/ml，每个小室内加入细胞悬浮液500μl，下室内加入750μl以10％FBS的DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h。

3、弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上尚未穿过膜的细胞。95％乙醇固定10min，HE染色10min，PBS洗涤3次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下观察穿过膜的细胞。

4、结果

如图4所示，转染pcDNA3.1-PZP的细胞的侵袭能力明显低于转染空载的细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，促进PZP的表达可以抑制胆管癌细胞的侵袭，PZP抑制胆管癌细胞侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.检测PZP基因及其表达产物的试剂在制备诊断胆管癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PZP基因及其表达产物的表达水平以诊断胆管癌的产品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增PZP基因的引物；所述用实时定量PCR诊断胆管癌的产品至少包括一对特异扩增PZP基因的引物；所述用免疫检测诊断胆管癌的产品包括：与PZP蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断胆管癌的产品包括：与PZP基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断胆管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PZP蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PZP基因的核酸序列杂交的探针。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒。

5.PZP基因及其表达产物在制备治疗胆管癌的药物组合物中的应用。

6.促进PZP基因表达或增强PZP表达功能的试剂在制备治疗胆管癌的药物组合物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂包含：含有能编码功能性PZP蛋白的核酸的试剂、PZP蛋白的激活剂、含有PZP蛋白质的试剂。