CN105734159B - 食管鳞癌的分子标记物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食管鳞癌的分子标记物，本发明采用生物信息学方法对高通量测序结果进行分析，发现了食管鳞癌的候选基因CCKBR，CCKBR基因在食管鳞癌患者组织中呈低表达，上调CCKBR的表达水平可以抑制食管鳞癌细胞的增殖，上述研究结果表明CCKBR基因及其表达产物是食管鳞癌的潜在的治疗靶点。

Description

食管鳞癌的分子标记物

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及食管鳞癌的分子标记物，具体地该分子标记物为CCKBR基因。

背景技术

食管癌是食管黏膜上皮或食管腺上皮的恶性肿瘤，主要包括两种不同的临床病理类型：食管鳞癌和食管腺癌，两种病理类型的肿瘤发病机制和病理各不相同。在全球范围内，食管癌的发病率和死亡率分别位于恶性肿瘤的第九位和第八位。食管癌是我国的主要恶性肿瘤之一，发病率居各类恶性肿瘤第5位，死亡率居第4位。与欧美多发的食管腺癌不同，我国以食管鳞状细胞癌为主，其中90％以上的食管癌为食管鳞癌。其中河南、山西、河北等省份为高发区。在我国，尤其是在食管癌高发地区，食管鳞癌已成为危害人民群众生命安全的重要原因。

食管鳞癌的发病原因尚未完全清楚。热烫饮食、营养缺乏、使用酸菜和亚硝酸盐污染的食物、霉菌毒素、吸烟饮酒等在食管癌的发病中起重要作用。然而，只有部分暴露在这些环境中的个体最终会发生食管癌，另外，在我国食管癌的高发地区，其发病呈现出家族聚集现象，这说明除了环境因素外，遗传因素在食管癌的发病中也同样起着重要作用。揭示食管癌发病的内在遗传分子机制是一个迫切需要解决的问题。

手术治疗是食管鳞癌的主要有效治疗手段之一，然而食管鳞癌起病隐匿，具有较强的侵袭转移能力，多数患者确诊时已进入中晚期，相当部分的病人已不能进行手术治疗，其五年生存期往往不到10％。但是，早期诊断的食管癌手术治疗的五年生存期可达95％，早期发现是决定食管鳞癌五年生存率的重要因素。

目前可应用于食管鳞癌早期诊断的影像学方法有食管钡餐造影、计算机断层扫描和核磁共振，内镜技术有高放大倍数高分辨率内镜、色素内镜、窄谱成像内镜、自体荧光成像内镜、激光共聚焦内镜、光学连续X线断层扫描内镜、以及影像学与内镜相结合的内镜超声，病理细胞学方法有食管拉网脱落细胞学检查。尽管这些方法各有优点，但是对于实现食管鳞癌的早期诊断均具有一定的难度。

随着对肿瘤发生发展的分子机制研究的不断深入，已经发现一些与食管鳞癌发生发展相关的分子标记物，但是这些分子标记物在临床上的价值有限，因此，寻找更有价值的食管鳞癌相关分子标记物不管对于食管鳞癌的机制研究还是临床应用，都具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种食管鳞癌的分子标记物-CCKBR基因。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种诊断食管鳞癌的产品，所述产品能够通过检测食管组织中CCKBR基因的表达水平来诊断食管鳞癌。

进一步，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测CCKBR基因转录水平的针对CCKBR基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CCKBR蛋白的特异性抗体；所述基因检测试剂盒包括用于检测CCKBR基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括CCKBR蛋白的特异性抗体。

所述基因检测试剂盒可用于检测包括CCKBR基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白免疫检测试剂盒可用于检测包括CCKBR蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。将食管鳞癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。

本发明提供了CCKBR基因及其表达产物在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CCKBR基因的表达水平以诊断食管鳞癌的产品。

进一步，所述用RT-PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增CCKBR基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管鳞癌的产品至少包括一对特异扩增CCKBR基因的引物；所述用免疫检测诊断食管鳞癌的产品包括：与CCKBR蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管鳞癌的产品包括：与CCKBR基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管鳞癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与CCKBR蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与CCKBR基因的核酸序列杂交的探针。

所述基因芯片可用于检测包括CCKBR基因在内的多个基因(例如，与食管鳞癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括CCKBR蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管鳞癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与食管鳞癌的标志物同时检测，可大大提高食管鳞癌诊断的准确率。

进一步，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异性扩增CCKBR基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

本发明提供了一种治疗食管鳞癌的药物组合物，所述药物组合物包括增加CCKBR基因表达、增强CCKBR表达功能、和/或增强CCKBR表达产物活性的试剂。

进一步，所述试剂包括但不限于含有能编码功能性CCKBR蛋白的核酸的试剂、CCKBR蛋白的激活剂、含有CCKBR蛋白质的试剂

进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。所述载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等；粘合剂如淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸钠、月桂醇硫酸镁、十二烷基硫酸镁等；填充剂如甘露醇(粒状或粉状)、木糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、糊精、淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠等；崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧甲基纤维素钠、大豆多糖等。

所述的药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备，例如稳定剂、抑菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。

稳定剂包括人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及纤维素衍生物。L-氨基酸还可以包括甘氨酸、半胱氨酸及谷氨酸中的任意一个。糖类包括单糖，例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等；糖醇，例如甘露醇、纤维醇、木糖醇等；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、乳糖等；多聚糖，例如葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、透明质酸等及它们的衍生物。纤维素衍生物包括甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

抑菌剂包括但不限于有效浓度(例如<1％w/v)的苄醇、苯酚、间甲酚、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和/或对羟基苯甲酸丙酯。

表面活性剂包括离子或非离子表面活性剂，例如聚氧化乙烯烷基酯、山梨聚糖单酰基酯、脂肪酸甘油酯。

添加剂缓冲剂可以包括硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、谷氨酸及相应的盐(它们的碱金属或碱性稀土金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐及镁盐)。等渗剂包括氯化钾、氯化钠、糖及甘油。螯合剂包括乙二胺四乙酸钠及柠檬酸。

本发明的药物组合物可以用于补充内源性的CCKBR蛋白的缺失或不足，通过提高CCKBR蛋白的表达或增强CCKBR蛋白的功能，从而治疗因CCKBR蛋白减少导致的食管鳞癌。

本发明提供了CCKBR基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括增加CCKBR基因表达、增强CCKBR表达功能、和/或增强CCKBR表达产物活性的试剂。

进一步，所述试剂包括：含有能编码功能性CCKBR蛋白的核酸的试剂、CCKBR蛋白的激活剂、含有CCKBR蛋白质的试剂。

其中，所述含有能编码功能性CCKBR蛋白的核酸的试剂可以是在有利条件下翻译成活性形式的CCKBR蛋白的单链核酸(如mRNA)或双链核酸(如DNA)，所述的核酸可以连接在表达载体上或重组到宿主细胞里，只要能编码成活性CCKBR蛋白，任何一种CCKBR基因的携带方式均可。所述的CCKBR蛋白激活剂是指刺激CCKBR蛋白活性、增加CCKBR蛋白活性、促进CCKBR蛋白活性、增强CCKBR蛋白激活、使CCKBR蛋白活性敏感化或上调CCKBR蛋白活性的试剂，如去甲基化试剂、CCKBR启动子和/或增强子特异性的转录激活剂、CCKBR蛋白的激动剂(如激活抗体)等。

本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。病毒载体可以是慢病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、杆状病毒、甲病毒属、流感病毒及其他具有合适的细胞向性的重组病毒。

本发明中CCKBR蛋白或编码CCKBR蛋白的核酸可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。

本发明的药物导入组织或者细胞的方式可以分为体外或者体内的方式。体外方式包括将含有CCKBR基因的药物或者含有CCKBR蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或回输到体内。体内方式包括直接将含有CCKBR基因的药物或者含有CCKBR蛋白质的药物注入体内组织中。

本发明的药物还可与其他治疗食管鳞癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，CCKBR蛋白或编码所述蛋白的核酸)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如CCKBR蛋白或编码所述蛋白的核酸)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。

在疾病治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

本发明中针对CCKBR基因的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明中所述CCKBR蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述CCKBR蛋白的特异性抗体包括但不限于全长或完整的抗体、抗原结合片段、任何上述物质的衍生物、嵌合分子、任何上述物质与另一种多肽的融合物、或为了选择性结合CCKBR功能的目的而掺入任何上述物质的任何可选结构或组成，“完整”抗体或“全长”抗体指包含两条重链和两条轻链的蛋白。用于检测蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体，如所述的片段可以通过化学法从头合成或利用重组DNA技术合成。

在本发明的上下文中，“CCKBR基因”包括人CCKBR基因以及人CCKBR基因的任何功能等同物的多核苷酸。CCKBR基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中CCKBR基因(NC_000011.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

优选地，CCKBR基因的编码序列包括以下任一种DNA分子：

(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的具体实施方案中，所述CCKBR基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

在本发明的上下文中，CCKBR基因表达产物包括人CCKBR蛋白以及人CCKBR蛋白的部分肽。所述CCKBR蛋白的部分肽含有与食管鳞癌相关的功能域。

“CCKBR蛋白”包括CCKBR蛋白以及CCKBR蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括CCKBR蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人CCKBR的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

优选地，CCKBR蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：

(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。

(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的具体实施方案中，所述CCKBR蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

通常，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CCKBR蛋白的融合蛋白。对于与CCKBR蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留CCKBR蛋白的生物学活性即可。

本发明的CCKBR蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留CCKBR蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。

本发明中术语“治疗”指减缓、中断、阻滞、缓解、停止、降低、或逆转已存在的症状、病症、病况或疾病的进展或严重性。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了CCKBR与食管鳞癌的发生发展有关，在食管鳞癌患者体内CCKBR呈低表达，CCKBR有望成为诊断食管鳞癌的分子标志物。

本发明提供了一种靶向治疗食管鳞癌的手段，通过控制CCKBR的表达水平，从而治疗患者。

附图说明

图1显示利用QPCR检测CCKBR基因在食管鳞癌组织中的表达情况；

图2显示利用QPCR检测CCKBR基因在食管鳞癌细胞中的表达情况；

图3显示利用利用软琼脂克隆形成实验检测CCKBR基因表达对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 筛选与食管鳞癌相关的基因标志物

1、样品收集

各收集6例食管鳞癌癌旁组织和食管鳞癌组织样本。上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备((利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行操作)

取出冻存于液氮中的组织样本，把组织样本放入已预冷的研钵中进行研磨，按照试剂盒中的说明书提取分离RNA。具体如下：

1)加入Trizol，室温放置5min；

2)加入氯仿0.2ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5-10min；

3)12000rpm离心15min，将上层水相移到另一新的离心管中(注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质)，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10min；

4)12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液，按1ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混匀，4℃，12000rpm离心5min；

5)弃去乙醇液体，室温下放置5min，加入DEPC水溶解沉淀；

6)用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃冰箱。

3、高通量转录组测序

1)RNA-seq读段定位

首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。

2)转录丰度评估

匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。

3)差异表达基因的检测

将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。

4、结果

RNA-seq结果显示，CCKBR基因在食管鳞癌组织中的表达量显著低于正食管癌癌旁组织中的表达量。

实施例2 QPCR测序验证CCKBR基因的差异表达

1、对CCKBR基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择食管鳞癌癌旁组织和食管鳞癌组织各50例。

2、RNA提取步骤同实施例1。

3、逆转录：

采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mM dNTP，0.1mM DTT，30μM Oligo dT，200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃ 10min，短暂离心。

(3)QPCR扩增检验

引物设计

CCKBR基因的引物序列为：

正向引物：5’-TTGGTTGCCAGTTTATAG-3’(SEQ ID NO.3)

反向引物：5’-AAGTGAATGAAGGAGATAG-3’(SEQ ID NO.4)

管家基因GAPDH的引物序列为：

正向引物：5’-CTCTGGTAAAGTGGATATTGT-3’(SEQ ID NO.5)

反向引物：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。各项操作均于冰上进行。

扩增程序为：95℃ 10min，(95℃ 15s，60℃ 45s)×30个循环。

以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图1所示，与食管鳞癌癌旁组织相比，CCKBR基因在食管鳞癌组织中下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同RNA-sep结果一致。

实施例3 CCKBR基因的过表达

1、细胞培养

人食管鳞癌细胞株KYSE 150，以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、CCKBR基因的过表达

2.1CCKBR基因表达载体的构建

根据CCKBR基因的编码序列(如SEQ ID NO.1所示)设计扩增引物，引物序列如下：

正向引物：5’-CCGAAGCTTGCCACCATGGAGCTGCTAAAG-3’(SEQ ID NO.7)

反向引物：5’-CGGGCGGCCGCGCCAGGGCCCAGTGTGCTA-3’(SEQ ID NO.8)

从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的CCKBR基因的编码序列，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和NotI双酶切后插入到经限制性内切酶HindIII和NotI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CCKBR用于后续实验。

2.2转染

将食管鳞癌细胞分为两组，分别为对照组(转染pcDNA3.1空载体)、和CCKBR过表达组(转染pcDNA3.1-CCKBR)。使用脂质体2000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行。pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-CCKBR的转染浓度均为0.5μg/ml。

2.3RT-PCR检测

具体步骤同实施例2。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

如图2所示，与转染pcDNA3.1空载体的细胞相比，转染pcDNA3.1-CCKBR的细胞中CCKBR的含量显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 CCKBR基因对食管鳞癌细胞凋亡的影响

使用流式细胞仪检测CCKBR基因对细胞凋亡的影响。

1、细胞培养步骤同实施例3。

2、细胞转染步骤同实施例3。

3、步骤

细胞转染72h后，使用预冷PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶消化细胞，中止消化，将离心收集的细胞使用PBS重悬，将细胞定量为1×10⁶个/ml，取200μl上述细胞悬液放置到Eppendorf管中，加入10μl Annexin-V-FITC混匀，室温暗处孵育染色15min，上机前5min加入10mg/L碘化丙锭(PI)染色5μl。未转染siRNA的细胞分别用Annexin-V-FITC和PI染色用于标准定量。用FACS流式细胞仪进行双色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比。

3、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用的t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果：

转染pcDNA3.1-CCKBR组的细胞凋亡率为(24.36±0.012)％，转染pcDNA3.1空载体组的细胞凋亡率为(6.78±0.009)％，上述差异具有统计学意义(P<0.05)，上述结果表明，CCKBR基因的过表达促进食管鳞癌细胞的凋亡。

实施例5 软琼脂克隆形成实验

1、用0.25％胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞，轻轻吹打使之成为单细胞悬液，离心收集细胞沉淀。

2、用含20％胎牛血清的DMEM完全培养基重悬，适当稀释后计数，调整细胞浓度为5×10³个/ml。

3、制备两个浓度分别为1.2％和0.7％的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃水浴中。

4、1.2％的琼脂糖和2×DMEM培养基1:1混合，加入2×抗生素和20％的小牛血清，取3ml混合液注入直径6cm平皿中放置5min冷却凝固，作为底层琼脂置于CO₂温箱中备用。

5、在无菌试管中1:1混合0.7％的琼脂糖和2×DMEM培养基，再向管中加入0.2ml浓度为5×10³个/ml的稳定感染细胞悬液，充分混匀，注入上述平皿中，逐渐形成双琼脂层，每个实验组重复4个样本。

6、待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5％CO₂温箱中培养，每3天加培养基1.5ml。

7、培养14天后取出培养皿，用1ml浓度为0.005％的龙胆紫染色90min。把平皿放置在倒置显微镜下观察，每组细胞随机选取10个低倍视野，镜下技术形成的细胞克隆数。

8、结果

结果如图3所示，与其他组相比，转染pcDNA3.1-CCKBR的细胞组单细胞克隆集落形成数显著降低。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.CCKBR基因及其表达产物在制备诊断食管鳞癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CCKBR基因的表达水平以诊断食管鳞癌。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异性扩增CCKBR基因的引物，所述引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、或试剂盒；其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白免疫检测试剂盒。

5.CCKBR基因及其表达产物在制备治疗食管鳞癌的药物组合物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括增加CCKBR基因表达、增强CCKBR表达功能、和/或增强CCKBR表达产物活性的试剂。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂包括：含有能编码功能性CCKBR蛋白的核酸的试剂、CCKBR蛋白的激活剂、含有CCKBR蛋白质的试剂。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。