CN105838797B - 一种诊治食管癌的分子标志物 - Google Patents

一种诊治食管癌的分子标志物 Download PDF

Info

Publication number
CN105838797B
CN105838797B CN201610274305.0A CN201610274305A CN105838797B CN 105838797 B CN105838797 B CN 105838797B CN 201610274305 A CN201610274305 A CN 201610274305A CN 105838797 B CN105838797 B CN 105838797B
Authority
CN
China
Prior art keywords
depdc1b
gene
product
diagnosis
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610274305.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105838797A (zh
Inventor
杨承刚
肖枫
宋宏涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao Yangshen Biomedical Co Ltd
Original Assignee
Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd filed Critical Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority to CN201610274305.0A priority Critical patent/CN105838797B/zh
Publication of CN105838797A publication Critical patent/CN105838797A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105838797B publication Critical patent/CN105838797B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了DEPDC1B基因及其表达产物可作为食管癌早期诊断的分子标志物。本发明的实验表明DEPDC1B基因在食管癌患者和正常食管组织中存在差异表达，通过检测受试者食管组织中DEPDC1B基因的表达情况即可判断受试者是否患有食管癌。另外，本发明还公开了DEPDC1B基因及其表达产物可以作为食管癌治疗的靶标，用于指导新药的研发。

Description

一种诊治食管癌的分子标志物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及DEPDC1B基因在食管癌的诊断、治疗中的用途。
背景技术
食管癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。中国是食管癌的高发国家，食管癌在肿瘤相关的死因中排名第四。在河北省磁县，食管癌的发病率和死亡率均排名在所有肿瘤的首位。由于食管癌早期缺乏特异症状，大部分患者在就诊时已处于疾病的中晚期。另外，尽管手术水平不断提高，食管癌细胞对放疗、化疗的耐受使食管癌患者五年生存率仍维持在较低水平。因此，及早发现食管癌的高危人群，高危人群定期接受食管内镜检查，才能早期发现、早期诊断、早期治疗食管癌患者，最终才能提高食管癌患者的生存率，改善患者的生存质量，保存劳动力，更好地创造社会效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于食管癌早期诊断的分子标志物。相比现有的食管癌的诊断方法，使用基因标志物来诊断食管癌的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测DEPDC1B基因表达的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用。
进一步，所述检测DEPDC1B基因表达的产品包括检测DEPDC1B基因mRNA水平的产品、和/或检测DEPDC1B蛋白水平的产品。
进一步，所述检测DEPDC1B基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测DEPDC1B基因表达以诊断食管癌的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增DEPDC1B基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增DEPDC1B基因的引物；所述用免疫检测诊断食管癌的产品包括：与DEPDC1B蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管癌的产品包括：与DEPDC1B基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与DEPDC1B蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与DEPDC1B基因的核酸序列杂交的探针。
所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括的一对特异扩增DEPDC1B基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述检测DEPDC1B基因表达的产品可以是检测DEPDC1B基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
所述诊断食管癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断食管癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知DEPDC1B基因的异常与食管癌相关也属于DEPDC1B基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断食管癌的工具，所述工具包括检测DEPDC1B基因表达的试剂；所述试剂包括检测DEPDC1B基因mRNA的引物和/或探针、检测DEPDC1B蛋白的抗体。
所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测DEPDC1B基因转录水平的针对DEPDC1B基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的DEPDC1B蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括DEPDC1B基因在内的多个基因(例如，与食管癌相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括DEPDC1B蛋白在内的多个蛋白质(例如与食管癌相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与食管癌的标志物同时检测，可大大提高食管癌诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测DEPDC1B基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括DEPDC1B蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测DEPDC1B基因表达水平过程中所需的试剂。优选地，所述试剂包括针对DEPDC1B基因的引物和/或探针。根据DEPDC1B基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测DEPDC1B基因表达水平的引物和探针。
所述试纸包括检测DEPDC1B基因表达的试剂。
所述高通量测序平台包括检测DEPDC1B基因表达的试剂。
与DEPDC1B基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述DEPDC1B蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述DEPDC1B蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与DEPDC1B蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述检测DEPDC1B基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
本发明还提供了DEPDC1B基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗食管癌的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制DEPDC1B基因表达的试剂、和/或抑制DEPDC1B基因表达产物的试剂。
进一步，所述抑制DEPDC1B基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制DEPDC1B基因表达产物的试剂包括抑制DEPDC1B基因mRNA的试剂、抑制DEPDC1B蛋白的试剂。所述抑制DEPDC1B基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制DEPDC1B蛋白的试剂包括抑制DEPDC1B蛋白稳定性的试剂、抑制DEPDC1B蛋白活性的试剂、抑制DEPDC1B蛋白功能的试剂。
进一步，抑制DEPDC1B基因mRNA的试剂包括针对DEPDC1B基因mRNA的双链核糖核酸；抑制DEPDC1B蛋白功能的试剂包括DEPDC1B抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制DEPDC1B蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对DEPDC1B基因mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为了确保DEPDC1B基因能够被高效剔除或沉默，根据DEPDC1B基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al 2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al 2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram ofWhitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&Sullivan Excellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种用于治疗食管癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的DEPDC1B基因和/或其表达产物的抑制剂。
本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，其中该载体可为赋形剂、稀释剂、增稠剂、填充剂、结合剂、崩解剂、润滑剂、油脂或非油脂的基剂、表面活性剂、悬浮剂、胶凝剂、辅助剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂、着色剂或香料其中之一或两者以上的混合。
本发明的药物组合物可用于制造治疗食管癌的药剂。
本发明的药物组合物首选应用于哺乳动物，其中该哺乳动物优选为人类病患。
本发明的药物组合物可例如以口服、注射等方式给予至该人类病患体内。
本发明的药物组合物还可与其他治疗食管癌的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“DEPDC1B基因”包括DEPDC1B基因以及DEPDC1B基因的任何功能等同物的多核苷酸。DEPDC1B基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中DEPDC1B基因(NC_000005.10)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
优选地，DEPDC1B基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述DEPDC1B基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，DEPDC1B基因表达产物包括DEPDC1B蛋白以及DEPDC1B蛋白的部分肽。所述DEPDC1B蛋白的部分肽含有与食管癌相关的功能域。
“DEPDC1B蛋白”包括DEPDC1B蛋白以及DEPDC1B蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括DEPDC1B蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与DEPDC1B的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，DEPDC1B蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述DEPDC1B蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是DEPDC1B蛋白的融合蛋白。对于与DEPDC1B蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留DEPDC1B蛋白的生物学活性即可。
本发明的DEPDC1B蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留DEPDC1B蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断食管癌”既包括判断受试者是否已经患有食管癌、也包括判断受试者是否存在患有食管癌的风险。
在本发明的上下文中，“治疗食管癌”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈，还包括用于评价疾病的治疗效果。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了DEPDC1B基因表达与食管癌相关，通过检测受试者组织中DEPDC1B的表达，可以判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-DEPDC1B基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现食管癌的早期诊断，从而降低食管癌的死亡率。
附图说明
图1显示利用基因芯片检测DEPDC1B基因在食管癌组织与正常组织中的表达情况；
图2显示利用Western blot检测DEPDC1B蛋白在食管癌组织与正常组织中的表达情况；
图3显示利用QPCR检测siRNA对DEPDC1B基因的干扰效率；
图4显示利用Western blot检测siRNA对DEPDC1B蛋白表达的影响；
图5显示抑制DEPDC1B蛋白功能对食管癌细胞增殖的影响。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 DEPDC1B基因的差异表达
1、实验材料：
食管癌组织为医院胸外科手术切除的标本，正常食管组织为胃镜室镜下取出的标本，手术切除的食管肿瘤组织离体后立即取材，取材时均佩戴一次性无菌手套，应用高压灭菌的手术刀片切取。
所有病例均经病理确诊。包括食管癌组织40例，正常食管组织30例。其中食管鳞癌34例，食管腺癌6例。以正常食管组织作为对照组。所有患者术前均病理证实，术前均未行放疗、化疗等治疗，且无其他部位的肿瘤等。所有组织均在手术半小时内液氮保存后，移入-80度冰箱冻存。
2、组织RNA的高密度人类基因表达谱芯片分析
依托博奥生物公司提供的基因芯片分析平台的技术服务，选择AFFX人类基因组表达谱芯片(AFFX Human Genome U133Plus2.0Array，Affimetrix公司)，完成了RNA标本的基因芯片筛查分析，其工作原理及全部操作流程参照该公司常规的基因芯片分析方法，主要细节如下：
2.1组织RNA样品的制备
利用RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen公司)制备组织RNA，保存于超低温冰箱-80℃；
2.2取以上人类基因组表达谱芯片与组织RNA进行杂交实验；
2.3利用LuxScan10KA双通道激光扫描仪，对杂交后的基因芯片进行扫描分析；
2.4利用SAM软件，并以正常食管组织为对照，对食管癌组织的芯片扫描数据进行处理与统计分析，其聚类分析(gene cluster analysis)；
2.5以两倍异常绝对值差异作为量化比较的界限，获得食管癌组织与正常食管组织之间差异表达候选基因；
3、结果
结果如图1所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中DEPDC1B基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 DEPDC1B蛋白的差异表达
1、研究对象同实施例1。
2、组织总蛋白的提取
按照EpiQuik全细胞/组织蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
3、Western blot检测
总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40℃过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
4、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将DEPDC1B蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
5、结果
结果如图2所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中DEPDC1B蛋白的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 抑制DEPDC1B基因表达
1、siRNA设计合成
针对DEPDC1B的siRNA序列：
siRNA1-DEPDC1B：
正义链为5’-UGGAAAUUUAAUAACAUCCUU-3’(SEQ ID NO.7)；
反义链为5’-GGAUGUUAUUAAAUUUCCAGA-3’(SEQ ID NO.8)，
siRNA2-DEPDC1B：
正义链为5’-AUAAGUGACGAUUGUCUUCAA-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链为5’-GAAGACAAUCGUCACUUAUAC-3’(SEQ ID NO.10)，
siRNA3-DEPDC1B：
正义链为5’-UGAACUUCGAAUUGACAAGUU-3’(SEQ ID NO.11)；
反义链为5’-CUUGUCAAUUCGAAGUUCAUC-3’(SEQ ID NO.12)
以上siRNA序列与阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)由上海吉玛制药技术有限公司提供。
2、食管癌细胞的培养与转染
2.1细胞培养
食管癌细胞系ECA109接种于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中、将其放置于37℃、5％CO2培养箱内培养，待细胞达80％融合时，用0.25％胰蛋白酶消化传代。
2.2细胞转染
将食管癌细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为、阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA与DEPDC1B基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
2、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率。
2.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
2.2逆转录
利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
2.3QPCR
采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管。配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM)1μl，反向引物(5μM)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl；扩增DEPDC1B基因的正向引物序列为5’-GATTACTATGGTCACTTG-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列为5’-CATCATCCTCATCAATAG-3’(SEQ ID NO.4)；扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-AAAGGGTCATCATCTCTG-3’(SEQ ID NO.5)，反向引物序列为5’-GCTGTTGTCATACTTCTC-3’(SEQ ID NO.6)，各项操作均于冰上进行。扩增程序为：95℃5min，(95℃10s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
2.4统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰DEPDC1B基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
2.5结果
结果如图3所示，与siRNA2-DEPDC1B、siRNA3-DEPDC1B相比，siRNA1-DEPDC1B能够更有效的抑制DEPDC1B基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，使用siRNA1-DEPDC1B进行后续的实验。
3、Western blot实验检测siRNA1-DEPDC1B的干扰效率
步骤同实施例2。
结果如图4所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA1-DEPDC1B的细胞中DEPDC1B蛋白的含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 DEPDC1B基因的表达对食管癌细胞增殖能力的测定
使用Cell Counting kit-8(cck-8)试剂盒用于检测食管癌细胞增殖
1、步骤
按照前面实施例的方法进行食管癌细胞的培养和转染，细胞分为二个实验组：
组1：转染siRNA-NC细胞组；
组2：转染siRNA1-DEPDC1B细胞组。
转染24h后，以2.5×105/ml密度接种于96孔细胞培养板中，每个实验组设计三复孔，每孔加入10μl的CCK-8溶液，37℃，5％CO2培养箱中孵育4h；然后按照试剂盒说明，选择450nm波长，在酶标仪上测定各孔吸光度值(OD值)。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如表1所示，与转染siRNA-NC组相比，转染siRNA1-DEPDC1B细胞组细胞增殖缓慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，DEPDC1B基因表达促进了食管癌细胞的增殖。
表1 食管癌细胞OD值
实验组 OD值(光密度)
siRNA-NC 1.498±0.112
siRNA-DEPDC1B 0.712±0.035
实施例5 食管癌细胞抗体中和实验
1、步骤：
将食管癌细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/孔/200μl，细胞贴壁后进行如下处理：
实验组1(对照组)：食管癌细胞中加入无关单抗(1:50)；
实验组2：食管癌细胞中加入抗人DEPDC1B单抗(1:50)。
将细胞在37℃、5％CO2培养箱孵育24小时后，加入3H-TdR(1μCi/孔)，再培养24小时，收集细胞，加液体闪烁液，β计数仪检测cpm值。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如图5所示，相比于对照组，加入抗人DEPDC1B单抗的细胞组细胞增殖减缓。上述实验结果表明，抑制DEPDC1B蛋白的功能可以抑制食管癌细胞增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (12)

1.检测DEPDC1B基因表达的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测DEPDC1B 基因表达以诊断食管癌的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增DEPDC1B基因的引物；所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增DEPDC1B基因的引物；所述用免疫检测诊断食管癌的产品包括：与DEPDC1B蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断食管癌的产品包括：与DEPDC1B基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断食管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，蛋白芯片包括与DEPDC1B蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与DEPDC1B基因的核酸序列杂交的探针。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括的一对特异扩增DEPDC1B基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测DEPDC1B基因表达的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测DEPDC1B基因mRNA的引物和/或探针、检测DEPDC1B蛋白的抗体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测DEPDC1B基因mRNA的引物包括SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
9.DEPDC1B基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗食管癌的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述抑制剂包括抑制DEPDC1B基因表达的试剂、和/或抑制DEPDC1B基因表达产物的试剂。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述抑制DEPDC1B基因表达产物的试剂包括针对DEPDC1B基因的siRNA、和/或DEPDC1B蛋白的抗体。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述针对DEPDC1B基因的siRNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
CN201610274305.0A 2016-04-28 2016-04-28 一种诊治食管癌的分子标志物 Active CN105838797B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610274305.0A CN105838797B (zh) 2016-04-28 2016-04-28 一种诊治食管癌的分子标志物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610274305.0A CN105838797B (zh) 2016-04-28 2016-04-28 一种诊治食管癌的分子标志物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105838797A CN105838797A (zh) 2016-08-10
CN105838797B true CN105838797B (zh) 2019-08-13

Family

ID=56589652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610274305.0A Active CN105838797B (zh) 2016-04-28 2016-04-28 一种诊治食管癌的分子标志物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105838797B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520925A (zh) * 2016-10-14 2017-03-22 浙江大学 一种用于检测食道癌的引物组及检测方法
CN110512004B (zh) * 2019-10-11 2020-11-24 新乡医学院 一种用于检测食管癌细胞迁移和侵袭能力的分子标志物及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6041297B2 (ja) * 2012-08-24 2016-12-07 国立大学法人山口大学 犬リンパ腫の診断方法及び診断キット

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A putative novel protein, DEPDC1B,is overexpressed in oral cancer patients, and enhanced anchorage-independent growth in oral cancer cells that is mediated by Rac1 and ERK;Su等;《Journal of Biomedical Science》;20140805;第21卷(第1期);第1-10页
DEPDC1B enhances migration and invastion of non-small cell lung cancer cells via activating Wnt/β-catenin signaling;Yi Yang等;《Biochemical and biophysical research communications 》;20140624;第2014卷(第450期);第899-905页

Also Published As

Publication number Publication date
CN105838797A (zh) 2016-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105132575B (zh) 骨质疏松症的分子标志物及其应用
CN105886625B (zh) Chka基因在制备食管癌诊治产品中的应用
CN105132550B (zh) 检测muc21基因表达的试剂在制备骨关节炎诊治产品中的应用
CN105838797B (zh) 一种诊治食管癌的分子标志物
CN106947809B (zh) C6orf58基因在制备舌鳞癌诊治产品中的应用
CN103003445A (zh) 确定肿瘤转移可能性的方法
CN105200137B (zh) Cers2基因及其表达产物作为骨质疏松症的诊治靶标
CN105648076B (zh) Nudt11基因及其表达产物作为子宫肌瘤的诊治靶标
CN105603085B (zh) 椎间盘退行性病变的诊治靶标
CN105400894B (zh) 椎间盘退行性病变诊治标志物
CN109562121A (zh) 转移性癌症的诊断和治疗方法
CN105861741B (zh) Senp3基因及其表达产物作为食管癌的诊治靶标
CN105506169B (zh) 子宫肌瘤诊治标志物
CN105886627B (zh) 食管癌的诊治标志物
CN105087821B (zh) 一种诊治骨质疏松症的分子标志物
CN105039577B (zh) Cyp2f1基因在骨关节炎诊治中的应用
CN105755154A (zh) 区分转移性与非转移性肺鳞癌的分子标志物
CN105648103B (zh) Vsig10l基因作为肺鳞癌转移诊治标志物的用途
CN105861740B (zh) Ablim3基因作为食管癌诊治标志物的用途
CN105296622B (zh) Lmnb2基因及其表达产物作为鼻咽癌的诊治靶标
CN105400895B (zh) Shisa4基因作为椎间盘退行性病变诊治标志物的用途
CN104789689A (zh) 作为肺腺癌诊治靶标的clec9a基因
CN105200150B (zh) 作为骨关节炎诊治靶标的plac1基因
CN108624696A (zh) 分子标记在制备静脉内平滑肌瘤病诊断检测产品中的应用
CN105950721B (zh) Itm2a基因作为食管癌诊治标志物的用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 1210, Building 3, Ronghua Xintai Building, 10 Ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

Address before: 100080 Beijing city Haidian District Shanyuan Street No. 1 cubic court building room 3103

Applicant before: Beijing Yang Shen biology information technology company limited

CB02 Change of applicant information
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211119

Address after: 266000 room 2503, Qianshan building, D2, Qingdao International Innovation Park Phase II, No.1 Keyuan Weiyi Road, Laoshan District, Qingdao City, Shandong Province

Patentee after: Qingdao Yangshen biomedical Co.,Ltd.

Address before: Room 1210, building 3, Ronghua Xintai building, 10 ronghua South Road, Yizhuang Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Patentee before: BEIJING MEDINTELL BIOMED Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right