CN105200150B - 作为骨关节炎诊治靶标的plac1基因 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了PLAC1基因可以作为骨关节炎早期诊断的分子标志物。本发明从转录水平和蛋白水平上均证明了PLAC1基因在正常人和骨关节炎患者的滑膜组织中表达存在差异，因此可以通过鉴定PLAC1基因的表达水平来判断受试者的患病风险及疾病的状态。另外，本发明实验证明干扰PLAC1基因表达或者抑制PLAC蛋白的功能能够抑制滑膜细胞增殖，为临床上骨关节炎治疗药物的开发提供了一种新的靶标。

Description

作为骨关节炎诊治靶标的PLAC1基因
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及人PLAC1基因在骨关节炎的诊断、治疗中的用途。
背景技术
骨关节炎(Osterarthritis，OA)是一组由多种原因导致的以关节软骨退行性变为主要病理特征的临床综合征，是一种常见病，多发生于中年以后，是一种慢性、进展性关节病变。主要发生在关节软骨。其表现主要是关节软骨受到破坏，软骨表面失去均质性、中断、斑片凹陷、断裂和溃疡。近来一些研究表明骨关节炎的发生与遗传因素有关。滑膜对于维持关节的正常功能，并且在骨关节炎疾病的发生发展过程中起着重要的作用。
OA有着复杂的发病机制，多种环境和遗传因素作用下导致了疾病的发生和发展。发病机制目前还不清楚，不过相关的研究已经展开。众所周知，早在60年前，学者们就已经证明遗传因素在家族性OA中的作用。当时发现，如果一个女性其姐妹掌间关节和指间关节患有Heberden结节(OA结节)，其患OA的机率是普通人群的3倍。迄今，已有多个研究证据表明遗传异常能够导致OA早发。但是研究OA遗传基因仍是比较困难的，好在已经有研究结果显示，OA易感性编码基因的鉴别将推进对于OA病因的了解是毫无疑问的，也能提供新的治疗干预靶点且将能协助对个体的预测和直接手术或药物治疗。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于骨关节炎(Osterarthritis，OA)早期诊断的分子标志物。相比传统的骨关节炎的诊断方法，使用基因标志物来诊断骨关节炎的具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测PLAC1基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。
进一步，所述检测PLAC1基因表达的产品包括检测PLAC1基因mRNA水平的产品、和/或检测PLAC1蛋白水平的产品。
进一步，所述检测PLAC1基因表达的产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片检测PLAC1基因表达以诊断骨关节炎的产品。
进一步，所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PLAC1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PLAC1基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与PLAC1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与PLAC1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PLAC1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PLAC1基因的核酸序列杂交的探针。
所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括的一对特异扩增PLAC1基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所述检测PLAC1基因表达的产品可以是检测PLAC1基因表达的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
所述诊断骨关节炎的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断骨关节炎的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PLAC1基因的异常与骨关节炎相关也属于PLAC1基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断骨关节炎的工具，所述工具包括检测PLAC1基因表达的试剂；所述试剂包括检测PLAC1基因mRNA的引物和/或探针、检测PLAC1蛋白的抗体。
所述工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测PLAC1基因转录水平的针对PLAC1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的PLAC1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括PLAC1基因在内的多个基因(例如，与骨关节炎相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括PLAC1蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨关节炎相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；所述基因检测试剂盒包括用于检测PLAC1基因转录水平的试剂；所述蛋白免疫检测试剂盒包括PLAC1蛋白的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测PLAC1基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对PLAC1基因的引物和/或探针。根据PLAC1基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测PLAC1基因表达水平的引物和探针。
所述试纸包括检测PLAC1基因表达的试剂。
所述高通量测序平台包括检测PLAC1基因表达的试剂。
与PLAC1基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
进一步，所述PLAC1蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PLAC1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与PLAC1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述检测PLAC1基因mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。
本发明还提供了PLAC1基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用。所述抑制剂包括抑制PLAC1基因表达的试剂、和/或抑制PLAC1基因表达产物的试剂。
进一步，所述抑制PLAC1基因表达的试剂包括抑制基因转录的试剂、抑制基因翻译的试剂；所述抑制PLAC1基因表达产物的试剂包括抑制PLAC1基因mRNA的试剂、抑制PLAC1蛋白的试剂。所述抑制PLAC1基因mRNA的试剂包括抑制mRNA稳定性的试剂、抑制mRNA翻译活性的试剂。所述抑制PLAC1蛋白的试剂包括抑制PLAC1蛋白稳定性的试剂、抑制PLAC1蛋白活性的试剂、抑制PLAC1蛋白功能的试剂。
进一步，抑制PLAC1基因mRNA的试剂包括针对PLAC1基因mRNA的双链核糖核酸；抑制PLAC1蛋白功能的试剂包括PLAC1抗原蛋白的肿瘤疫苗、抑制PLAC1蛋白功能的抗体。所述抗体可以是多克隆抗体，或是单克隆抗体。
在本发明的具体实施方案中，所述针对PLAC1基因mRNA的双链核糖核酸是siRNA。为了确保PLAC1基因能够被高效剔除或沉默，根据PLAC1基因的mRNA序列设计了siRNA特异性片段。siRNA的设计根据已发表的通用设计原则(Elbashir et.al 2001，Schwarz et.al2003，Khvorova et.al 2003，Reynolds et.al 2004，Hsieh et.al 2004，Ui-Tei et.al2004)，通过在线工具完成设计，该在线工具为：siRNASelectionProgram of WhiteheadInstitute(BingbingYuan et.al 2004，http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)和BLOCK-iTTM RNAi Designer ofINVITROGEN(winner of the 2004Frost&SullivanExcellence in Research Award，https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。为了进一步提高siRNA片断的有效性，综合两个在线设计工具的优点来设计用于筛选的siRNA片断。最后，通过同源性比对(NCBI BLAST)来过滤siRNA序列，以提高siRNA片断的特异性并减少RNAi干扰的脱靶效应。
优选地，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括上面所述的PLAC1基因和/或其表达产物的抑制剂。
本发明的药物组合物还包括药学上可接受的载体，载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。
本发明的药物组合物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
在本发明的上下文中，“PLAC1基因”包括人PLAC1基因以及人PLAC1基因的任何功能等同物的多核苷酸。PLAC1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中PLAC1基因(NC_000023.11)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
优选地，PLAC1基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列；
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70％、优选地，90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中，所述PLAC1基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中，PLAC1基因表达产物包括人PLAC1蛋白以及人PLAC1蛋白的部分肽。所述PLAC1蛋白的部分肽含有与骨关节炎相关的功能域。
“PLAC1蛋白”包括人PLAC1蛋白以及人PLAC1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人PLAC1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与人PLAC1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地，PLAC1蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性(又称为序列同一性)，更优选地，与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90％至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中，所述PLAC1蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PLAC1蛋白的融合蛋白。对于与PLAC1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PLAC1蛋白的生物学活性即可。
本发明的PLAC1蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PLAC1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
在本发明的上下文中，“诊断骨关节炎”既包括判断受试者是否已经患有骨关节炎、也包括判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险。
在本发明的上下文中，“治疗骨关节炎”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。
本发明使用体外培养的滑膜细胞来研究PLAC1基因对骨关节炎的治疗作用。本领域技术人员可知，骨关节炎发生的一个重要的生理特征在于滑膜细胞的增殖加快，分泌更多的因子存进骨关节炎的发生和发展，因此本发明利用滑膜细胞的增殖实验来研究PLAC1基因与骨关节炎治疗的关系。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了PLAC1基因表达与骨关节炎相关，通过检测受试者滑膜组织中PLAC1的表达，可以判断受试者是否患有骨关节炎、或者判断受试者是否存在患有骨关节炎的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-PLAC1基因，相比传统的检测手段，基因诊断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨关节炎的早期诊断，从而降低骨关节炎的死亡率。
附图说明
图1显示利用高通量测序检测PLAC1基因在滑膜组织中的表达情况；
图2显示利用QPCR检测PLAC1基因在滑膜组织中的表达情况；
图3显示利用Western blot检测PLAC1蛋白在滑膜组织中的表达情况；
图4显示利用QPCR检测siRNA对PLAC1基因的干扰效率。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 OA滑膜组织和正常滑膜组织中PLAC1基因的表达差异
8例OA患者的滑膜组织来自于北京协和医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的OA病人。所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准。8例正常滑膜组织来自于北京协和医院骨科，为外伤手术病人关节滑膜组织。OA患者滑膜液(SF)高速离心后取上清，-80℃储存待用。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。
1、滑膜组织总RNA的提取
利用QIAGEN公司的组织/细胞总RNA提取试剂盒提取OA患者滑膜组织细胞和正常滑膜组织细胞的总RNA。
2、RNA样品的质量分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品，RNA-seq测序的样品要求：OD260/OD280为1.8-2.2。
3、RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100Bioanalyzer检测RNA样品质量，观察28S rRNA和18SrRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求，可以用于文库构建及测序。
4、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
5、结果
RNA-seq结果显示(如图1所示)，正常人相比，骨关节炎患者滑膜组织中PLAC1基因的mRNA水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 大样本验证差异表达基因
40例OA患者的滑膜组织来自于北京协和医院骨科行膝关节置换或滑膜切除术的OA病人。所用病例符合Altam提出的关于OA的诊断标准。40例正常滑膜组织来自于北京协和医院骨科，为外伤手术病人关节滑膜组织。OA患者滑膜液(SF)高速离心后取上清，-80℃储存待用。本研究中所用临床样本，均对患者进行知情告知并经本院伦理委员会通过。
1、转录水平上检测PLAC1基因的差异表达
1.1提取滑膜组织总RNA
步骤同实施例1。
1.2逆转录
利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
1.3QPCR
(1)引物设计
根据Genbank中PLAC1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
PLAC1基因：
正向引物为5’-CTACCGTGTTACTGAATG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-CCTTAGAAGAGTAGTGTATC-3’(SEQ ID NO.4),
GAPDH基因：
正向引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；
反向引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。
(2)按照表1配制PCR反应体系：
其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
表1 PCR反应体系
试剂 体积
正向引物 1μl
反向引物 1μl
SYBR Green聚合酶链式反应体系 12.5μl
模板 2μl
去离子水 补足25μl
(3)PCR反应条件：95℃10min，(95℃20s，60℃55s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
1.4统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
1.5结果
结果如图2所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织PLAC1基因表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
2、蛋白水平上检测PLAC1基因的差异表达
2.1滑膜组织总蛋白的提取
使用北京普利莱基因技术有限公司的总蛋白提取试剂盒(货号：P1250)提取滑膜组织中的总蛋白，具体操作步骤参见说明书。
2.2Western blot
总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
2.3统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将PLAC1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
2.4结果
结果如图3所示，与正常滑膜组织相比，骨关节炎滑膜组织中PLAC1蛋白的表达量显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 OA成纤维样滑膜细胞抗体中和实验
1、步骤
1.1滑膜组织细胞体外培养
将无菌获取的滑膜组织用PBS清洗后，用无菌手术剪刀反复剪切成约1mm x1mm x1mm的组织块，加入胶原酶II(0.5mg/ml)37℃、消化2h后，经200目纱网过滤，离心去上清后，将细胞重悬于DMEM培养液，置于37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。当细胞长成梭形并成片后，进行传代培养。当细胞传至第3代后，分别加入FITC标记的小鼠抗人CD3、CD14、CD19和PE标记的小鼠抗人CD11b进行标记，流式细胞仪检测鉴定。上述4种标记均为阴性的细胞为成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like Synoviocytes，FLS)用于本研究。
1.3抗体中和实验
将OA成纤维样滑膜细胞接种至96孔培养板中，每孔200μl，将抗人PLAC1单抗按照1：25的比例加入滑膜液中混匀，同时设置无关单抗(1：25)为对照，每组设三个平行孔，经过与滑膜细胞培养24小时、48小时、72小时后，在每孔中加入MTT(5mg/m1)20μl，置培养箱中继续培养4h，小心弃上清液，加入二甲基亚砜150μl，振荡5min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm处读取吸光度值(OD值)。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如表2所示，与对照组相比，加入PLAC1单抗的实验组细胞增殖变慢。
表2 MTT实验测定OD值
时间 24h 48h 72h
实验组 OD值(光密度) OD值(光密度) OD值(光密度)
对照组 0.16±0.02 0.35±0.04 0.64±0.04
加入PLAC1单抗组 0.15±0.03 0.24±0.05* 0.37±0.01*
注：*代表与对照组比较，P<0.05
实施例4 干扰PLAC1基因的表达
1、siRNA设计合成
针对PLAC1的siRNA序列：
siRNA1-PLAC1：
正义链为5’-UUGAAAUGUGGCUUUGUGCUC-3’(SEQ ID NO.7)；
反义链为5’-GCACAAAGCCACAUUUCAAAG-3’(SEQ ID NO.8)，
siRNA2-PLAC1：
正义链为5’-AACUUAAAAACUUUCAUCCCU-3’(SEQ ID NO.9)；
反义链为5’-GGAUGAAAGUUUUUAAGUUCA-3’(SEQ ID NO.10)，
siRNA3-PLAC1：
正义链为5’-UAAUUCUAGAAAUAGCAUCUU-3’(SEQ ID NO.11)；
反义链为5’-GAUGCUAUUUCUAGAAUUAGU-3’(SEQ ID NO.12)
阴性对照siRNA序列(siRNA-NC)：
正义链为5’-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3’(SEQ ID NO.13)；
反义链为5’-UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3’(SEQ ID NO.14)。
将OA成纤维样滑膜细胞细胞按1×104/孔接种到24孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，在无双抗、含10％FBS的DMEM培养基中，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司)的说明书转染，实验分为、阴性对照组和实验组(20nM)，其中，阴性对照组siRNA与PLAC1基因的序列无同源性，浓度为20nM/孔，同时分别转染。
2、利用QPCR实验检测siRNA的干扰效率方法同实施例2。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰PLAC1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如图4显示，与siRNA2-PLAC1、siRNA3-PLAC1相比，siRNA1-PLAC1能够更有效的抑制PLAC1基因的表达，差异具有统计学意义(P<0.05)，使用siRNA1-PLAC1进行后续的实验。
实施例5 PLAC1基因对骨关节炎滑膜组织细胞增殖的抑制作用
1、细胞转染：按照实施例4的方法对OA成纤维样滑膜细胞进行siRNA1-PLAC1和siRNA-NC的转染。
2、转染24小时后将OA成纤维样滑膜细胞接种至96孔培养板中，每孔200μl，每组设三个平行孔，培养24小时、48小时、72小时后，在每孔中加入MTT(5mg/m1)20μl，置培养箱中继续培养4h，小心弃上清液，加入二甲基亚砜150μl，振荡5min，使结晶物充分溶解，用酶标仪在490nm处读取吸光度值(OD值)。
3、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，干扰PLAC1基因表达组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
结果如表3所示，与转染siRNA-NC的细胞组相比，转染siRNA1-PLAC1的细胞增殖变慢。
表3 MTT实验测定OD值
时间 24h 48h 72h
实验组 OD值(光密度) OD值(光密度) OD值(光密度)
siRNA-NC 0.12±0.01 0.21±0.03 0.35±0.01
siRNA1-PLAC1 0.10±0.01 0.14±0.02* 0.22±0.02*
注：*代表与对照组比较，P<0.05
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.检测PLAC1基因表达的产品在制备诊断骨关节炎的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测PLAC1基因表达以诊断骨关节炎的产品；所述用RT-PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PLAC1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PLAC1基因的引物；所述用免疫检测诊断骨关节炎的产品包括：与PLAC1蛋白特异性结合的抗体；所述用原位杂交诊断骨关节炎的产品包括：与PLAC1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断骨关节炎的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与PLAC1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与PLAC1基因的核酸序列杂交的探针。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断骨关节炎的产品至少包括一对特异扩增PLAC1基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述工具包括检测PLAC1基因表达的试剂；所述试剂包括检测PLAC1基因mRNA的引物和/或探针、检测PLAC1蛋白的抗体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测PLAC1基因mRNA的引物序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
6.PLAC1基因和/或其表达产物的抑制剂在制备治疗骨关节炎的药物中的应用；所述抑制剂包括抑制PLAC1基因表达的试剂、和/或抑制PLAC1基因表达产物的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制PLAC1基因表达产物的试剂包括抑制针对PLAC1基因的siRNA、和/或PLAC1蛋白的抗体。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述针对PLAC1基因的siRNA序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。
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母血中游离CRH、PLAC1、Selectin-P的mRNA表达水平;董迪荣;《海南医学院学报》;20091231;第15卷(第7期);711-713页
胎盘特异性基因PLAC1与肿瘤;闫光华等;《生命的化学》;20101231;第30卷(第3期);459-463页

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